Abstract
Kjennetegnet av humoral immunitet er å generere funksjonelle ASCer, som syntetiserer og utskiller Abs spesifikk for et antigen (Ag), slik som en patogen, og blir brukt til vertens forsvar. For kvantitativ bestemmelse av den funksjonelle status av den humorale immunresponsen til et individ, både serum Abs og sirkulerende ASCer blir ofte målt som funksjonelle avlesninger. Hos mennesker er perifert blod den mest praktiske og lett tilgjengelige prøve som kan brukes for bestemmelse av den humorale immunrespons fremkalt ved verten B-celler. Forskjellige B-celleundergrupper, inkludert ASCer, kan bli isolert direkte fra perifert blod via utvalg med avstamning-spesifikk Ab-konjugerte mikroperler eller via cellesortering med flowcytometri. Videre kan rensede naive og minne B-celler aktiveres og differensiert i ASCs i kultur. De funksjonelle aktivitetene av ASCer for å bidra til Ab sekresjon kan kvantifiseres ved ELISPOT, som er en metode som konvergerer enzym-koblet immunoabsorbance assay (ELISA) og Western blotting teknologi for å muliggjøre bestemmelse av de enkelte ASC ved enkeltcellenivå. I praksis har ELISPOT-analysen blitt stadig mer brukt for å evaluere vaksineeffektivitet på grunn av den enkle håndtering av et stort antall blodprøver. Fremgangsmåtene for isolering av humane B-celler fra perifert blod, vil differensiering av B-celler til ASCer in vitro, og anvendelse av ELISPOT for kvantifisering av total IgM- og IgG-ASCer bli beskrevet her.
Introduction
B-celler spiller en sentral rolle i utviklingen av humoral immunitet. De i utgangspunktet utvikle seg i benmargen og inn i blodstrømmen som naive B-celler, som kan migrere inn i lymfevev, slik som milt, lymfeknuter, og mandlene, for videre utvikling. Ved Ag møte, noen naive B-celler vandrer inn lymfoide follikler, hvor Germinal senter B-celler kan differensiere til minne B-celler og plasmablasts (PBS) / plasmaceller (PC). Mens de fleste PBS / PC-utgang inn i blodstrømmen, noen til slutt ligge i benmargen til å gjennomgå terminal differensiering i langlivede PCer 1. B-celler i omløp er heterogene, og ved steady state, PBS / PC-er sjeldne i perifert blod 2. Som følge av tilgjengeligheten av avstamning-spesifikke overflatemarkører, strømningscytometri har blitt en populær metode for identifisering og karakterisering av B-celleundergrupper i perifert blod. En utvidet bruk av flyt cytometry er tilsetningen av et cellesorteringsfunksjon, som tillater separering og isolering av de enkelte delmengder av B-celler med høy renhet. På bakgrunn av ekspresjonen av spesifikke overflatereseptorer på forskjellige utviklingsstadier, humane sirkulerende B-celler er generelt klassifisert i tre hoved subpopulasjoner: naive B-celler (CD19 + CD27 - CD38 -), minne-B-celler (CD19 + CD27 + CD38 -) og PBS / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (figur 1). Naive B-celler av natur har ikke møtt Ags. Imidlertid kan de bli differensiert i IgM + CD27 + minne-B-celler. Selv naive B-celler er homogene i å uttrykke B-celle antigen reseptor (BCR) -associated molekyler (f.eks CD19, CD20 og CD22) de er heterogene i sin immunoglobulin repertoar 5. Flertallet av CD27 + minne-B-celler kan differensieres til CD27+ / hi CD38 + PBS / PC-6. I tillegg minne B-celler og PBS / PCer er polyklonale og vise utviklings og funksjonell heterogenitet 4-7. PBS / PC-er i omløp er normalt kortvarig og uttrykker ikke CD138, men de som er laget for å slå seg ned i benmargen vil terminalt differensiere og bli langvarige. Terminalt differensiert PCer uttrykke CD138 og ned-regulere CD27 molekyler på overflaten 8. Siden både PBS og PC-er i stand til å skille ut Abs, i mange tilfeller de er kollektivt betegnet som ASCs. I kontrast, kan verken naive B-celler eller minne B-celler produsere betydelige mengder Abs 9-10. Likevel, når isolert, både naive og minne B-celler kan differensieres i ASCs i 3 - 10 dager når den plasseres i de riktige dyrkingsforhold 6, 11-15. Faktisk ASCs avledet fra in vitro differensiering dele lignende overflate uttrykk for CD27 og CD38 med dem direkte isolert from perifert blod 6. I tillegg ASCer differensierte in vitro uttrykker et lavt nivå av overflate CD20, lignende den av sirkulerende PBS / PC 6. Selv om dyrknings-avledede ASCer er alle kortvarig, kan de utskiller Abs, noe som indikerer at de er funksjonelt kompetente og i stand til å bidra til den humorale immunitet.
Både ELISA og ELISPOT er langt de mest anvendt metoder som å skaffe funksjonell informasjon om humoral immunrespons. ELISA er en 96-brønners plate-baserte analysen, og det er ofte brukt for å måle titere av serum Ag-spesifikke Abs og andre analytter (f.eks cytokiner). Det er praktisk og skalerbar. ELISA er utformet for å bruke et fast-fase enzym-analyse for å påvise tilstedeværelse av ABS eller andre stoffer, slik som serum, i en væskeprøve 16. De avlesninger fra serum ELISA har blitt mye brukt for å representere den immunrespons i kroppen. Et verktøy er nødvendig for kjøp av readouts fra ELISA-analyser er en spektrofotometrisk mikroplateleser. Leseren kan bestemme den optiske tetthet (OD) av sluttproduktene vanligvis resulterer fra reaksjonen av pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert deteksjon Abs og deres spesifikke substrater 17. Med hensyn til å rapportere den humorale immunrespons, serumnivåer Ab bestemt ved ELISA betegne kollektivt, men ikke individuell, utførelse av ASCer i kroppen. I tillegg klarer ELISA for å ta hensyn til deltakelse av minne-B-celler, som ikke skiller ut Abs.
Som ELISA, er ELISPOT en mye brukt metode for påvisning og overvåking av immunrespons i perifere blodprøver 17-18. ELISPOT er en teknikk som er relatert til en sandwich ELISA. I det blir cellene plassert i polyvinylidendifluorid (PVDF) membran-sikkerhets brønner av 96-brønners mikroplater for en kortvarig kultur. ELISPOT-analysen er analog til å utføre Western-blotting på en mikroplate og utvikle ferdigg flekker på PVDF-membran i hver brønn. Et automatisert ELISPOT-lesersystem eller et stereomikroskop for manuell telling er nødvendig. Den største fordelen med ELISPOT i å oppdage en immunrespons er den suverene følsomhet i kvantifisering av ASCs og cytokin-sekresjon celler. Den rapporterer sine funksjonelle aktiviteter i humoral og cellulær immunitet, henholdsvis. I måling av humorale immunfunksjon, blir serumnivåer Ab bestemt ved hjelp av ELISA og antallet ASC oppregnet av ELISPOT ofte korrelert, men dataavlesninger fra disse to analyser har noen forskjeller i funksjonelle konsekvenser 19-20. Den største fordelen med ELISPOT er dens følsomhet for metoden. Nivået av serum-Ab titere som rapportert av ELISA er presentert semi-kvantitativt som OD-avlesninger, betegner den relative Ab nivå, eller mer kvantitativt, som konsentrasjonsavlesninger når en kjent mengde av de riktige isotyper av Abs er tatt med for referanse. I kontrast til resultatene av ELISPOT er presented som det absolutte antall av ASCer i en celle pool av interesse (for eksempel, ikke-fraksjonerte perifere mononukleære blodceller (PBMC) og rensede B-celler fra PBMC). ELISPOT kan oppdage en enkelt ASC, men ELISA krever Ab mengder fra ASCs å nå optimalisert analyseavhengig konsentrasjoner før måling. Derfor er ELISPOT åpenbart bedre enn ELISA i følsomhet for mengdebestemmelse. Videre er ELISPOT også egnet for å kvantifisere de in vitro differensierte ASCer fra aktiverte minne-B-celler. Memory B-celler ikke utskiller Abs men kan differensiere til ASCs ved aktivering; de har derfor ikke bidrar til serum Abs detektert ved ELISA. Således er ELISPOT-metoden for valg ved måling av immunresponsen av sirkulerende hukommelses-B-celler etter aktivering i kultur. Det gir mulighet for overvåking av opprettholdelse av langvarig humoral immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humant perifert blod må innhentes fra friske donorer i henhold til informert samtykke, og bruk av blodprøver må følge de vedtatte retningslinjer fastsatt av private institusjonelle gjennomgang boards. I denne studien til protokollen bruke menneskeblod i en demonstrasjon av resultatene av flowcytometri (figur 1) og ELISPOT-analyser (figur 3) ble godkjent av Internal Review Board of National Taiwan University Hospital (protokoll nummer 201307019RINB).
1. Isolering og rensing av humant perifert blod B-cellene
- Tegn ~ 10 ml blod fra medianen cubital vene (i cubital fossa anterior til albuen) inn i et 15-ml rør inneholdende K 2 EDTA (1,5 til 2,0 mg / ml blod) og umiddelbart invertere røret flere ganger for å hindre klump formasjon.
- Legg 35 ml autoklavert (121 ° C, 15 min) av røde blodceller (RBC) lysebuffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3, og 1 mM EDTA; pH 7,4) til røret som inneholder den friske blodprøven (≥ 3: 1 vol / vol) og inkuberes ved romtemperatur (RT) for ikke lenger enn 5 min.
MERK: Utseendet av lystransmisjon gjennom røret indikerer fullførelsen av RBC lysis. - Sentrifuge ved 600 x g ved romtemperatur i 5 min. Sørg for at pellet er hvit i fargen.
- Resuspender pelleten med 10 ml autoklaveres fosfat-bufret saltløsning (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na HPO 2 til 4, og 1,47 mM KH 2PO 4; pH 7,4) og sentrifuger som i trinn 1.3.
- Kast supernatanten, resuspender pelleten med 10 ml RPMI 1640 medium (kosttilskudd: 10% føtalt kalveserum, 100 U / ml penicillin / streptomycin, 0,25 ug / ml amfotericin B, og 2 mM L-glutamin), og deretter porsjon celler i en 10-cm kulturskål (10 ml blod pr tallerken). Plassere formen i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 30 minutter.
- Forsiktig virvel kulturen fatet et par ganger og plasserdyrkingsmedium (suspensjonsceller) i 15 ml plast koniske rør. Kast heftende celler (for det meste makrofager) på kultur retter.
- Sentrifuge ved 600 x g ved romtemperatur i 5 min. Kast supernatanten.
- Resuspender pellet med 1 ml RPMI 1640 medium. Telle celle nummer med en hemocytometer eller en automatisert celleteller.
MERK: Levedyktigheten av isolerte leukocytter er vanligvis større enn 90% ved trypanblått-eksklusjon. - Sentrifuger som i trinn 1.7 og resuspender cellene i ~ 200 ul kald PBS-buffer (0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA) ved en konsentrasjon på 5 - 10 x 10 6 celler / ml.
- Tilsett 5 ul biotinylert anti-human Ab cocktail spesifikke for blodceller (for negativ seleksjon av B-celler) per 10 6 celler og inkuber på is i 30 min 21.
MERK: anti-human Ab cocktail bør minst omfatte Abs spesifikke for CD2 (eller CD3), CD14, og CD16. - Legg en 10-ganger overskudd volumsterilt PBS til cellene, sentrifuge ved 600 xg i 5 minutter, og supernatanten kastes.
- Legg like mengder streptavidin-konjugert mikroperler (5 mL per 10 6 celler) til pelleten og bland godt.
- Inkuber på is i 30 min i et 15 ml konisk rør av plast.
- Tilsett 2 ml PBS-buffer inn i røret.
- Plasser røret i et magnetisk stativ og inkuber ved romtemperatur i 8 min. Den brune mikro vil gradvis legge til rørveggen ved siden av magneten 22.
- Med røret igjen i det magnetiske stand, overføres forsiktig supernatanten til et nytt sterilt 15 ml rør 22.
- Gjenta trinn 01.14 til 01.16, og kombinere de to supernatanter som inneholder de uberørte B-celler. Kast mikroperler.
- Sentrifuge ved 600 x g ved romtemperatur i 5 min. Kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i RPMI 1640-medium for nedstrøms eksperimenter.
MERK: Vanligvis 1 - 5 x 10 5 B-celler viddha renhet større enn 95% fra 10 ml perifert blod kan isoleres 23.
2. rensing og separering av minne og naive B-celler fra isolerte B-celler
- Bruk celler renset fra trinn 1 og bestemme celle nummer ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisk celleteller.
- Resuspender cellene i 100 pl kald PBS-buffer etter sentrifugering ved 600 x g og RT i 5 min.
- Legg 1 - 2 mikrogram av biotinylert CD27 mAb per 10 6 celler og inkuber på is i 30 min.
- Tilsett 10 ml PBS-buffer til røret og sentrifuger ved 600 xg i 5 minutter.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 50 ul PBS-buffer.
- Legg like mengder av streptavidin magnetiske mikrokuler (1 - 2 ug / 10 6 celler) til cellene i et 15 ml konisk rør av plast.
- bland forsiktig brønn og inkuber på is i 30 min.
- Tilsett 2 - 3 ml av PBS-buffer til røret.
- Plasserrør inn i et magnetisk stativ og inkuber ved romtemperatur i 8 minutter for å tillate de brune mikroperlene for å feste til den siden som er nærmest magneten.
- Med røret i den magnetiske stand, overføres forsiktig supernatantfraksjonen inn i en ny sterilt rør. Denne fraksjonen inneholder den anrikede CD27 - naive B-celler.
- Tilsett 5 ml til røret som inneholder mikroperlene og forsiktig resuspendere mikroperlene (dvs. den anrikede fraksjon av CD27 + minne-B-celler) 24-25.
- Sentrifuge ved 600 x g ved romtemperatur i 5 min. Resuspender pelleten med RPMI 1640-medium for nedstrøms eksperimenter.
MERK: Vanligvis ~ 30 - 60% av B-celler kan bli renset som CD27 + minneceller fra PBMC av en frisk donor 7, 25-26.
3. Cell Sorting for innsamling av naive B-celler, Memory B-celler og PBS / PC-er
- Ved hjelp av cellene renset fra trinn 1, bestemme celle nummer ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisk celleteller.
- Resuspender cellene i kald PBS-buffer ved en konsentrasjon på 10 7 per ml i en 5 ml polystyrenrør.
- Legg 1 - 2 ug av humant IgG pr 10 6 celler og inkuber på is i 10 min for Fc-blokken.
- Tilsett 1 ug av hver av anti-CD19-APC (klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (klon: O323), og anti-CD38-PE (klon: HIT2) per 10 6 celler; Bland godt og inkuber på is i 30 min 4, 27.
- I den siste 5 min i trinn 3.4, tilsett 5 mL av den kommersielle 7-Aminoactinomycin D (7-AAD).
- Tilsett 2 ml PBS til røret, vortex, og sentrifuger ved 600 xg i 5 minutter.
- Resuspender cellene i sorteringsbuffer (steril PBS med 2% BSA og 2 mM EDTA) ved en konsentrasjon på 1 - 5 x 10 7 celler per ml i en 15-ml tube.
- Filtrere cellene gjennom en nylonduk cellefilter (40 um porestørrelse) for å fjerne celleklumper.
- Separer cellene med en flowcytometrisk sorter utstyrt med tre lasere: Violet (405 nm), blå (488 nm) og rød (640 nm).
MERK: Den blå laser alene er tilstrekkelig for tre-farge flowcytometri 27-28. - Sortering av cellene inn i tre 15-ml rør (inneholdende 5 ml RPMI-medium) for samtidig innsamling av naive B-celler (CD19 + CD27 -), hukommelses-B-celler (CD19 + CD27 +) og PBS / PC (CD19 + CD27 + / hi CD38 +) 3-4, 28.
MERK: Sortert naive og minne B-celler kan bli dyrket som beskrevet i trinn 4.
4. In Vitro Differensiering av isolert human CD19 + B-celler, CD19 + CD27 + Memory B-celler og CD19 + CD27 - Naive B-celler
- Ved hjelp av cellene renset i trinn 1.19, 2.10, 2.11 og 3.10, bestemme celle nummer med en hemocytometer eller en automatisk celleteller.
- Resuspender cellene med RPMI 1640 mediumved en konsentrasjon på 1 - 10 x 10 5 per mL og delmengde dem inn i brønnene til en 12-brønns plate.
- Legg CpG (ODN 2006) ved 5 ug / 10 6 celler / ml 18, 29.
- Kultur av cellene i et 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 5 dager.
- Høste celler fra hver brønn, plassere dem hver for seg i 15 ml rør, tilsett 5 ml PBS til hvert rør, og sentrifuger dem ved 600 xg og RT i 5 min.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisk celleteller. Resuspender cellene i en konsentrasjon på 1 - 10 x 10 5 per ml med RPMI 1640 medium.
5. ELISPOT-analyse
- Tilsett 30 ul av 35% etanol i destillert vann til hver brønn av ELISPOT platene i 30 sek.
MERK: Når pipettering, unngå å berøre membranen i brønnene til alle tider. - Invert ELISPOT platene for å fjerne etanolen.
- Sett 150 mL av autoklaveres DDH 2 O i hver brønn og inkuberdem ved RT i 5 minutter for å spyle ut den gjenværende etanol; følger med en vask med sterilt PBS ved RT i 3 min.
MERK: Trinn 5.1 til 5.3 kan være valgfrie, avhengig av fremstillingen av platene. - Satt 50 ul av 5 ug / ml polyklonalt F (ab ') 2-fragment av anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) (i PBS) i hver brønn av ELISPOT platene og inkuber dem ved 4 ° C over natten (foretrukket) eller 37 ° C i 2 timer 11.
MERK: Forsegle kantene av platene med Parafilm til bruk. - Invertere platene for å fjerne ubundet Abs, tilsett 200 ul PBS til hver brønn og inkuber dem to ganger ved RT i 3 min hver gang.
- Tilsett 200 ul PBS med 5% BSA (eller RPMI 1640 medium) til hver brønn for å blokkere, og inkuber dem ved romtemperatur i 2 timer.
- Invertere platene for å fjerne den blokkerende buffer. Vask to ganger hver brønn med 200 ul av PBS, som i trinn 5.5.
- Tilsett 100 ul av RPMI 1640-medium til hver brønn og inkuber dem ved 37 ° C.
- Når du er klar til frø cellene, snu platene for å fjerne RPMI 1640 medium.
- Seed 100 pl (5 x 10 4), 50 ul (2,5 x 10 4), og 25 ul (1,25 x 10 4) av cellene (fra trinn 1.19, 2.10, 2.11, 3.10, og 4.6) i brønnene til en ELISPOT plate. Med RPMI 1640 medium, bringe volumet til 150 pl / brønn.
NB: Et minimum av ett eller to to-gangers seriefortynninger for plating av cellene er anbefalt. - Inkuber platene i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 for 8 - 14 timer 18. Unngå å flytte platene under inkubasjon.
- Invertere platene for å fjerne celler og RPMI 1640 medium.
- Tilsett 200 pl / brønn med PBS-T (PBS med 0,05% Tween 20) og inkuber dem 5 ganger ved romtemperatur, hver gang i 3 min. Snu platen for å fjerne vaskebuffer mellom hvert av de 5 gangers vask.
- Tilsett enten geite-anti-humant IgG-alkalisk fosfatase (AP), Fcy-spesifikk Abs (for IgG-deteksjon, 1: 5000 i PBS-T) Eller geite anti-humant IgM-AP, Fcμ fragment-spesifikk Abs (for IgM deteksjon, 1: 5000 i PBS-T) inn i de angitte brønner og inkuber ved romtemperatur i 2 timer i mørket.
- Vask to ganger hver brønn med 200 ul av PBS, som i trinn 5.5.
- Tilsett 50 pl / brønn av bromochloroindolyl fosfat-nitro blå tetrazolium (BCIP / NBT) substratløsning. Purple-fargede flekker opptrer vanligvis i 5-15 min.
- Tilsett 100 pl / brønn med DDH 2 O for å hindre over-utvikling av flekker.
- Skyll platene med rennende vann fra springen etter at fullstendig utvikling av alle stedene.
- Fjern det drenerings av platene og tillate dem å lufttørke i mørket.
- Tell flekker ved hjelp av en automatisert plateleser med et bilde oppkjøp / analyseenhet (for eksempel en automatisk skanner eller manuelt via en dissekere mikroskop).
MERK: Platene kan lagres ved romtemperatur i mørket og analysert senere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PBMC ble tappet for RBC og adherente celler (trinn 1,2 til 1,7). En alikvot (2 x 10 6) av cellene ble utsatt for en strømningscytometrisk analyse for å illustrere de populasjoner av naive B-celler, minne-B-celler, og PBS / PC i perifert blod (figur 1). I denne donors PBMC, omtrent 10% av lymfocyttene var CD19 + B-celler. I B-celle rommet, hvor mange prosent av CD19 + CD27 - naive B-celler var rundt 50%. På den annen side, omtrent 50% av de CD19 + B-celler var CD27 + minne-B-celler 7, 25-26. Av notatet, kan CD27 + minne B-celler bli ytterligere separert med inkluderingen av IgD 4. Fenotypen av sirkulerende PBS kan bedre definert med lav eller ingen overflate uttrykk for CD20 (CD19 + CD27 + / hi CD38 + CD20 lo / -) 2, 30-31. For å utelukke døde celler, 7-AADkan inkluderes i cellefarging (trinn 3.5), og et plott for FSC versus 7-AAD gjør det mulig for portstyring bestanden av levende celler (7-AAD -).
De viktigste trinn i ELISPOT-analysen er vist i figur 2. Begge rensede humane B-celler og CD19 + CD27 + minne-B-celler ble dyrket i nærvær av CpG med RPMI 1640 medium i 5 dager. Cellene ble høstet for ELISPOT-analysen for å kvantifisere de nylig oppståtte ASCs. Hvis den finnes, pre-eksisterende PBS isolert fra perifert blod vil dø ut i 48 h 11. ELISPOT-analysen ble utført, og spot bildene kjøpt opp av en automatisk plateskanner er vist i Figur 3. Resultatene av ELISPOT vil typisk vise 50 - 200 IgM-ASCer fra 10 4-B-celler som ble behandlet med CpG i 5 dager, mens antallet IgG-ASC er 10 - 50 i 10 fire celler 11.
Figur 1. Illustrasjon av gating strategi for å skille den naive B-celler, Memory B-celler, og PBS i PBMC. (A) Cells (2 x 10 6) ble farget med to mikrogram hver av CD19-APC, CD27-eFluor450, og CD38-PE mAbs (trinn 3.4). Lymfocyttpopulasjonen rommet var gated (G1) på prikkplott for videre spredning (FSC) versus side spredning (SSC). (B) Celle dubletter, som er dannet av to celler henger sammen, ble ekskludert (de utenfor G2) på tomten for FSC-W (bredde) versus FSC-H (høyde). (C) CD19 + B-celler ble inngjerdet som G3 på tomten for SSC-A (område) og CD19-APC. (D) i CD19 + -celler, er dot plot av CD27 og CD38 parametere viste naive B-celler (CD19 + CD27 -; Q1 og Q4), minne-B-celler (CD19 + CD27 +;Q2 og Q3), og PBS (CD19 + CD27 + / hi CD38 +, G4, 0,6% av Q2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Illustrasjon av de viktigste trinnene i ELISPOT analysen. (A) Sett 50 pl / brønn (5 ug / ml) av F (ab ') 2-fragment av anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) inn i en ELISPOT plate i 2 timer ved 37 ° C eller over natten ved 4 ° C (foretrukket) (trinn 5.4). Seed cellene i brønnene av ELISPOT platen. La de ASCs å feste til PVDF membran og til å skille ut Abs for 8 - 14 h (trinn 5.11). (B) Vask cellene med PBS (med 0,05% Tween 20). (C) Tilsett AP- eller HRP-conjugated deteksjon Abs spesifikke for enten IgG eller IgM. (D) Vask av påvisning Abs som er ubundet. (E) Utvikle flekker med et substrat løsning av AP eller HRP å matche deteksjon Abs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. ELISPOT Resultater fra en representant Plate. (A) Renset CD19 + B-celler ble plassert i tre tilstøtende brønner (50.000 celler i brønn # 1, 25.000 celler i brønn # 2, og 12.500 celler i brønn # 3, henholdsvis) av ELISPOT platen. Celler ble deretter dyrket i RPMI 1640-medium over natten (~ 14 timer). ELISPOT-analysen ble utført etter endt kultur (trinn 05.12 til 05.18). til analyze resultatene ble ELISPOT plate skannet for å hente bilder via en automatisk analysator utstyrt med skanner og programvare. (B) Renset CD19 + CD27 + minneceller (10 6 / ml) ble dyrket i nærvær av 5 ug / ml av CpG i 5 dager. Cellene ble behandlet som i (A) for ELISPOT-analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering og rensing av humant perifert blod B-cellene
Normalt kan RBC effektivt sprengt og klarert av lysis buffer (trinn 1.2). Det er viktig ikke å inkubere PBMC med RBC lysis buffer lenger enn 5 minutter, som celleviabilitet kan bli påvirket av ammoniumklorid. Alternativt kan RBC og blodplater samtidig bli fjernet av den følgende protokoll.
Blande friskt fullblod med syre-citrat-dextrose (ACD) buffer (39 mM sitronsyre, 75 mM natriumcitrat, og 135 mM dekstrose, pH 7,4) i et volumforhold på 9: 1, blod-til-buffer. Sentrifuger ved 250 xg i 10 min ved RT. Vær oppmerksom på dannelsen av lag, tyder på separasjon. Aspirer og kast det øvre lag, som inneholder blodplater og blodplaterikt plasma (gul farge). Fjerne det tynne midtlaget ved grenseflaten, som inneholder PBMC (d.v.s.., Buffy coat). Unngå forurensning av RBCs i bunnlaget (darken rød farge). Legg lysis buffer til PBMC for å fjerne rester av RBC, og deretter følger du trinn 01.02 til 01.19.
To fremgangsmåter kan anvendes for å isolere B-celler fra PBMC: positiv og negativ seleksjon 21. Fremgangsmåten for negativ seleksjon (trinn 1.1 til 1.19) blir anvendt for å oppnå urørt, funksjonelle B-celler, uten bundet Abs eller mikroperler, til nedstrøms eksperimenter. Det er viktig å ta hensyn til dette ved aktivering og / eller differensieringen av rensede B-celler forekommer i kultur. Bekymringen er at celler renset ved positiv seleksjon kan være utilsiktet påvirket av mAb-konjugerte mikroperler (0,2 til 5 mikrometer i diameter). mAbs kan binde seg til spesifikke reseptorer på B-celler og derfor kan tverrbinde reseptorene for aktivering. Videre kan mikroperler kan endocytose ved B-celler gjennom bundne reseptorer. Selv biologisk nedbrytbare, kan mikro bo inne celler i mer enn en uke. Enten oppbevaring av mikro vil påvirke opplemental resultater må bestemmes empirisk. Ved rensingen av humane B-celler via positiv utvelgelse, anti-CD19 (kloner: 4G7 eller HIB19) mikroperler blir ofte brukt fordi CD19 er allment uttrykt i hele utviklingsstadier av B-celler. Renheten av B-celler etter separasjonen kan bli bestemt ved flow-cytometri med anti-CD19 mAb (kloner: SJ25C1 eller LT19), som gjenkjenner distinkte epitoper fra anti-CD19-mikroperler.
Rensing og separering av minne og naive B-celler fra isolerte B-celler
CD27 er et allment akseptert overflate markør for menneskelige hukommelse og naive B-celle skillet 24. Den CD27-molekylet hører til tumor nekrose faktor reseptor (TNFR) familien. Fordi CD27 uttrykkes på de fleste humane minne-B-celler, er det som vanligvis brukes for å diskriminere dem fra CD27 - naive B-celler. Imidlertid, fordi CD27 uttrykkes også på T-celler og NK-celler, ved bruk av anti-CD27 microbeads (klone: O323) i positivt å velge minne B-celler krever forutgående rensing av B-celler (trinn 01.01 til 01.19). For en renhet sjekk etter separasjon, mAbs spesifikke for human CD27: er (kloner L128 eller LG.3A10) anbefales (trinn 2.12). Fordi CD27 + minne B-celler er heterogen, ekstra overflatemarkører som IgD og FCRL4, kan bli vurdert for videre separasjon i celle sortering 4, 7.
Cell Sorting henter naive B-celler, Memory B-celler og PBS / PC-er
Fordi B-celler uttrykker FcγRIIB er en Fc blokk (trinn 3.3) anbefales før farging cellene med mAbs for flowcytometri. Fc-fragmenter av det humane IgG alene kan blokkere like godt som hele human IgG 1 ug / 10 6 celler. Anti-human CD32 mAb (kloner: 3D3 eller at10) er et annet alternativ for Fc blokken. Av notatet, hvis FcγRIIB er en overflate markør for å være farget i renset B-celler, fluoroforen-konjugert anti-CD32 mAb shOuld bli lagt til frafalle Fc blokken, etterfulgt av farging med andre mAb'er uten PBS vask.
For tre-farge flowcytometri, CD38-FITC (Fluorescein), CD27-PE (Phycoerythrin), og CD19-APC (allofykocyanin) er en typisk kombinasjon av fluorophores. Ikke desto mindre, hvis strømningscytometrisk sortereren er utstyrt med tre lasere, slik som de på 405 nm, 488 nm og 640 nm, forskerne så har råd til å velge fluoroforer eksitert av forskjellige lasere for cellesortering. Som illustrert i figur 1, ble cellene farget med CD19-APC (klon: HIB19), CD27-eFluor450 (ekvivalent til Pacific Blue, klone: O323), og CD38-PE (klon: HB7) for å separere de naive B-celler, hukommelse B-celler og PBS. Av notatet, noen forskere foretrekker inkluderingen av CD45 (klon: HI30) som en leukocytt avstamning markør og gate B-celler som CD45 + CD19 + befolkningen. Fordi påvisning av PBS i omløp ved steady state er en sjelden event hos friske individer, lav eller ingen overflate uttrykk av CD20 på PBS (CD19 + CD27 + / hi CD38 + CD20 lo / -) begrunner sin bona fide eksistens 2, 30-31. Dette er nyttig når kvantifisering resultatene av PBS av overflate fenotyper og ASCs av ELISPOT-analyser blir sammenlignet. I løpet av perioden før celle-sortering, blir 7-AAD foretrukket å propidiumjodid for utelukkelse av døde celler, på grunn av sin smalere emisjonsspektrum og nedre ringvirkninger i flerfarget flowcytometri.
In vitro stimulering og Differensiering av isolerte humane B-celler
Den type B CpG (ODN 2006) alene kan indusere begrenset differensiering av både IgM- og IgG-ASCs fra minnet B-celler. Videre naive B-celler er bare svakt responsive til CpG og hovedsakelig gir opphav til IgM-ASCer 6, 11. Konsentrasjonen av CpG i kultur er i området fra 2,5 til 5 mikrogram / ml per 10 6 B-cellereller PBMC 11, 18. Annet enn CpG kan rensede B-celler og PBMC dyrkes i nærvær av kombinasjoner av CpG med mitogener, cytokiner, og BCR-agonister, for å skille mellom humane B-celler til ASCer i kultur (trinn 4.3). For eksempel, som vanligvis brukes oppskrifter for 10 seks celler per mL omfatter (a) CpG (5 ug / ml), rekombinant humant IL-2 (10 ng / ml) og rekombinant, humant IL-10 (10 ng / ml) 15, 34; (b) CpG (5 ug / ml) og F (ab ') 2-fragmenter av anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) (20 ug / ml) 11; (c) CpG (5 ug / ml), protein A fra S. aureus Cowan (SAC) (1: 10.000 fortynning), og kermesbær-mitogen (PWM) (1: 100.000 fortynning) 18; (d) rekombinant humant IL-21 (100 ng / ml) og rekombinant sCD40L (1 pg / ml) 12, 15, 33; og (e), rekombinant humant IL-2 (10 ng / ml) og R848 (1 pg / ml), en TLR7 agonist 33-34. Selv om B-celler kan bli differensiert i ASCer i tre dager 11, celler er vanligvis pre-stimulated for 5 til 6 dager før den ble tilsatt til ELISPOT-plate for kvantifisering av ASC 11, 18. I løpet av dyrkningsperioden, er det vanligvis ingen etterfylling av utgangsdifferensieringsmidler.
Tilsetningen av IL-2 og IL-10 til CpG-inneholdende kulturer i betydelig grad kan øke antall differensiert IgM- og IgG-ASCer 15, 35. Tilstedeværelsen av IL-2 i kultur kan gi mitogen stimulering for å lette utvidelsen av differensierte B-celler ved CpG. IL-10 i området fra 10-25 ng / ml i stor grad kan øke produksjonen av ASC (~ 3 til 10 ganger) i nærvær av CpG 35. BCR-agonister, inkludert anti-BCR og SAC, og PWM kan også stimulere proliferasjon av primære humane B-celler 18. Inkubering av minne-B-celler med CpG og polyklonalt anti-BCR hovedsakelig resulterer i en økning i IgM-ASCer, men ikke i IgG-ASCer 28. For forebygging av hemmingen av signalisering gjennom BCR ved FcγRIIB, et F (ab39 #) 2-fragmentet av anti-Ig (minst 10 - 20 ug / ml per 10 6 celler) anbefales ved kryssbinding BCR 11. I stedet for polyklonalt anti-Ig, bør anti-BCR-mAb'er som er spesifikke for enten IgM + IgG eller + B-celler anses å målrette isotype-spesifikke B-celle-undergrupper for differensiering til ASCer. En kombinasjon av CpG, SAC (1: 10.000 fortynning), og PWM (1: 100.000 fortynning) kan effektivt aktivere minne-B-celler til å differensiere til IgM- og IgG-ASCer 18, 24. Videre kan CpG moderat indusere klasse veksling av Ig in vitro 28-29. I motsetning til IL-21 (100 ng / ml) og sCD40L (1 pg / ml) effektivt induserer minne B-celledifferensiering utelukkende til byttet IgG-ASCer 12, 30. Den sCD40L kan aktivere B-celler ved å etterligne T-celle hjelp gjennom CD40 på B-celler, å påvirke deres differensiering til PC-er i vivo. Av notatet, anti-CD40 (kloner: 89 eller G28,5) kan erstatte sCD40L i kultur 15. However, hverken sCD40L eller anti-CD40 alene er i stand til å indusere differensieringen av minne-B-celler. Således er CD40 aktiveringen av dyrkede B-celler ofte kombinert med en differensieringsmiddel, slik som IL-4, CpG, R848, eller IL-21, noe som kan fremme Ig-klasse veksling. IL-4 har en sentral rolle i differensieringen av Th2 CD4-celler, slik at induksjon av de fleste IgM + B-celler for å bytte til lgG1 + B-celler i kultur. På samme måte, i nærvær av IL-21, begge minne-B-celler og naive B-celler differensierer utelukkende inn i klasse slått ASCer 12, 32. Som CpG, kan R848 indusere en marginal klasse bryter av B-celler 34. Til slutt er det verdt å nevne at selv om lipopolysakkarid (LPS) effektivt kan indusere differensiering av mus-B-celler i ASCer, humane B-celler uttrykker lave nivåer av CD14 og TLR4 29. På grunn av at tilsetningen av et middel differensiering i kultur fremmer dannelsen av svitsjede B-celler, bør denne tilsetning unngåsNår pre-eksisterende PBS / PC-er eller unswitched minne-B-celler skal måles.
ELISPOT-analyse
ELISPOT-analysen kombinerer platebasert ELISA med membranbaserte Western blotting-teknologi, noe som åpner for deteksjon av Abs utskilt av en enkelt B-celle 18. ELISPOT har også blitt tilpasset til å kvantifisere Ag-spesifikke T-celler som utskiller cytokiner 17, 36. I en ELISPOT-analyse, kan enten rensede celler eller fraksjonerte PBMC (uten RBC) anvendes. Imidlertid ~ 10 ganger mer PBMC-er nødvendig enn rensede celler for å oppnå konsistente resultater i ELISPOT analyser. Et godt utgangspunkt er 1 - 2 x 10 5 celler per brønn for å påvise sirkulasjons ASCs i PBMC. I påvisning av Ag-spesifikke ASCer, anti-Ig blir vanligvis erstattet med Ag (5 - 10 ug / ml i PBS) for å fange opp Ag-spesifikke ACSS (trinn 5.4). Bruken av isotype-spesifikk påvisning Abs tillater skille mellom Ag-spesifikke IgM-ASCs og IgG isotype-ASCs (trinn 5.14). Av notatet, uavhengig av om anti-Ig eller Ag brukes til å fange ASCs, deteksjons Abs brukes for ELISA kanskje ikke alltid egnet for ELISPOT. På samme måte, ikke alle farge substrater for ELISA fungere på riktig måte i ELISPOT. AP- og HRP-konjugert Abs er mest brukt for spot deteksjon i ELISPOT. Den BCIP / NBT substrat løsning er et populært valg for AP-basert gjenkjenning, mens 3,3 ', 5,5'-tetra-benzidin (TMB) og 3-amino-9-etylkarbazol (AEC) løsninger er vanlige substrater for HRP i ELISPOT. Hvis AP eller HRP er direkte konjugert til detektor Abs, er bare ett trinn er nødvendig for deteksjon, slik som beskrevet i protokollen (trinn 5.14). I motsetning til dette er påvisningen Abs biotinylert og krever påfølgende inkubasjon med AP- eller HRP-konjugert streptavidin før omsetning med substratene i en to-trinns metode. Begge ett-trinns og to-trinns metodene fungerer effektivt for å oppdage flekker i ELISPOT.
ELISPOT-analysen kan kvantifisere ikke bare circulating, men også differensiert ASCs i kultur (trinn 1.19 versus 4,6). Hvis til stede, sirkulerende ASCer, som normalt lever lenger enn to dager i kultur, kan være direkte dyrket i ELISPOT plate, med eller uten rensing fra PBMC 11. I motsetning til dette differensiering av minne-B-celler krever 5 dager. Derfor er direkte dyrking i ELISPOT-plater etter celleisolasjon (trinn 1.19) ikke anbefalt; de døde cellerester som følge av den forlengede kulturperiode kan øke bakgrunnen i stedet deteksjon. I stedet kan begge rensede B-celler og totalt PBMC først dyrkes i en 6-brønn eller 12-brønners plate i nærvær av mitogener og differensieringsmidler (trinn 4.3). Under kulturprosessen, er den gjentatte tilsetning av stimuleringsmidler unødvendig (trinn 4.3). Mens platene er i kuvøse, bør døren til inkubatoren være forsiktig åpnes og lukkes for å hindre seeded ASCs fra å flytte, for de kan diffundere utskilte Abs langs de bevegelige spor, genererer flekkermed haler (de såkalte "kometlignende" prikker) (trinn 5.11). Inkubasjonstiden i ELISPOT-plater bestemmes av den tiden som er nødvendig for at cellene skal utskille påvisbare mengder av Abs uten å tillate cellene å dele seg, noe som vil skape vanskeligheter i stedet telling. Således celler er vanligvis dyrket i området fra 8 timer til over natten (trinn 5.11).
ELISPOT-analysen er den mest brukte metode for å kvantifisere minne-B-celleresponser. Det har blitt en populær, uavhengig avlesning av humoral immunrespons og immunologisk hukommelse. I praksis blir den foregående mitogen kulturen som kreves for å aktivere minne-B-celler for differensiering til ASCer (trinn 4.3). Men den frekvens ved hvilken minne-B-celler ekspandere og differensiere til ASCer varierer i forskjellige kulturmiljøet, slik som beskrevet ovenfor. Selv uten konsensus, de fleste forskere vedta induksjons tilstand som kan maksimere produksjonen av ASCs. I forhold til middel som brukes for spot deteksjon, kan en løselig biotinylert Ag erstatte utilfredsstillende oppdagelse Ab uten at følsomheten 37. Dette er av særlig viktighet når tilgjengeligheten av Ag er begrenset fordi en mye lavere mengde av Ag er nødvendig for deteksjon enn for belegging av platene. Endelig tillater ELISPOT ikke tillate fenotypisk analyse av cellulær heterogenitet, og derved krever forutgående fraksjonering av celle-subpopulasjoner. Nylig har et flerfarget ELISPOT-analyse, hvor deteksjons Abs er merket med forskjellige fluoroforer, har blitt utviklet for å detektere flere typer av cytokin-utsondrende celler i en enkelt brønn 38-39. Denne nye teknologien vil være av spesiell interesse for påvisning av lavfrekvente celler i PBMC og for en storstilt analyse av vaksineinduserte B-celle responser.
Fordi ELISPOT-analysen er rask og effektiv i å kvantifisere ASCer og cytokin-utsondrende celler, har det blitt utvidet for å måle funksjonaliteten ikke bare sirkullating lymfocytter, men også vev immunceller som intrahepatic leukocytter 40. På grunn av sin følsomhet nådde nivået for detektering av en eneste ASC har ELISPOT-analysen i økende grad blitt brukt for å måle humane immunresponser mot vaksine efficacies mot eksisterende og nye patogener. Selv om høy gjennomstrømming ytelse og robusthet av ELISPOT-analyse er ypperlig for store vurderinger av immunresponser ved hjelp av PBMC, kan resultatene av analysene være påvirket av forskjellige faktorer, slik som den behandlingsforsinkelse av prøver, enten cellene er fersk eller frossen serumkomponenter i dyrkningsmediet, og antall celler som er lagt til ELISPOT platen 41. Derfor bør normaliser inngå i ELISPOT protokollen for å minimere intra- og inter-assay variasjoner i stor skala og langsgående oppfølgingsstudier (f.eks vaksineforsøk). Normaliseringsfremgangsmåten for plate lesing er også kritisk for linearitet, nøyaktighet og ulemperistency i analyseresultatene 41-42. En måte å utføre platen lesing normalisering er å utvide fremgangsmåten i den seriefortynning av celler sådd til ELISPOT-plater (trinn 5.10). Ved å opprette en referanseplate, bør flere serielle fortynninger viser en lineær sammenheng mellom de celletallene belagt per brønn og spot-tellinger per brønn. Gjentatte skanninger av ELISPOT Platen kan brukes til å validere malen av flekk telling, både automatisk og manuelt. Minimal intra godt variasjon i spot-teller er forventet etter disse normaliser 43. Til slutt kan anvendelsen av ELISPOT forlenges på mange måter, for eksempel til overvåking av behandlingen responser hos pasienter med infeksjoner og tar kreftimmunterapier, så vel som til evaluering av immunotoxicity (f.eks, immunsuppresjon og legemiddelindusert autoimmunitet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 mL tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 mL Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-043 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
References
- Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
