Abstract
الأخضر بروتين فلوري (GFP) ومشتقاته وتستخدم على نطاق واسع أدوات لدراسة توطين البروتين وديناميكية الأحداث مثل إعادة هيكل الخلية والاتجار حويصلي في الخلايا الحية. وقد تم تطوير منهجيات الكمية باستخدام اندماج GFP خيالية للعديد من التطبيقات؛ ومع ذلك، GFP إلى حد ما على مقاومة التحلل البروتيني، وبالتالي استمرار مضان لها في يحلول / فجوة، والتي يمكن أن تعوق الكمي الاتجار البضائع في مسار التقامي. طريقة بديلة لقياس الإلتقام وبعد التقامي الأحداث الاتجار يجعل من استخدام superecliptic pHluorin، وهو البديل الحساسة درجة الحموضة من GFP أن تطفأ في البيئات الحمضية. الانصهار خيالية من pHluorin إلى ذيل حشوية من البضائع عبر الغشاء البروتينات النتائج في الملطف من مضان عند التأسيس من البضائع إلى الهيئات عديد الحويصلات (MVBs) ونقلهم إلى لمعة يحلول / فجوة. وهكذا، تبريد مضان فجوي يسهل quantifiالموجبة الإلتقام والأحداث في وقت مبكر في مسار التقامي. وتصف هذه الورقة طرق استخدام الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin لتقدير حجم الإلتقام عبر المجهر مضان، وكذلك فحوصات على أساس السكان باستخدام التدفق الخلوي.
Introduction
الاتجار حويصلي يلعب دورا هاما في الحفاظ على الهوية عضية وظيفة في الخلايا حقيقية النواة، وهو الآلية الرئيسية لتنظيم البروتين وغشاء تكوين الأجزاء الخلوية الفردية. في غشاء البلازما، والانصهار من الحويصلات exocytic يسلم البروتينات والأغشية جديدة إلى سطح الخلية، في حين الحويصلات الناتجة من خلال الإلتقام إزالة غشاء والبروتينات من سطح لإعادة التدوير لاحق أو استهداف لليحلول. وهكذا، الإلتقام مهم لامتصاص المواد الغذائية والردود على البيئة خارج الخلية. ومتوازنة إيماس والإلتقام لتنظيم مساحة غشاء البلازما، والسماح للدوران من البروتينات التالفة.
وقد حددت الدراسات في الخميرة وخلايا الثدييات عدد كبير من البروتينات المشاركة في الإلتقام، فضلا عن عدة مسارات التقامي التي تعزز استيعاب الشحنات محددة أو هذا الفعل ردا على مجموعة متنوعة من ENشروط vironmental. مسار أفضل درس هو بوساطة بالكلاذرين الإلتقام (CME)، الذي بالكلاذرين والاكسسوار عصاري خلوي البروتينات التجمع في بنية معطف لتحقيق الاستقرار في الحويصلة التقامي الوليدة. وقد أسفرت التجارب في مهدها خميرة خميرة الأفكار الرئيسية في ديناميات والنظام التجنيد للعديد من البروتينات التقامي 1-3. والجدير بالذكر أن آلية التعليم الطبي المستمر وحفظها للغاية من خلال تطور من هذا القبيل أن الغالبية العظمى من البروتينات المرتبطة التعليم الطبي المستمر في الخميرة لها orthologs الإنسان؛ وبالتالي، فقد كان في مهدها الخميرة أداة مهمة لفهم آليات الإلتقام أن يتم حفظها في حقيقيات النوى أعلى. على سبيل المثال، الدراسات التي تستخدم في مهدها الخميرة قرر أن تشكيل ونضوج هياكل التعليم الطبي المستمر (المشار إليها بقع الأكتين كما القشرية في الخميرة) ينطوي على تجنيد متتابعة من العديد من البروتينات، بدءا بالكلاذرين والبروتينات محول ملزم البضائع، تليها توظيف ملحق التقامي إضافية البروتينات،تفعيل بلمرة الأكتين بوساطة 3 Arp2 /، وتوظيف البروتينات المشاركة في 1،2 حويصلة انفصال. توظيف البروتينات الآلات التعليم الطبي المستمر لالقشرية بقع الأكتين هو عملية أمر غاية والنمطية، ولقد تم إنشاء نظام دقيق للتجنيد بالنسبة للعديد من البروتينات فيما يتعلق المكونات الأخرى للجهاز التعليم الطبي المستمر. الأهم من ذلك، وقد أكدت الدراسات الحديثة وجود أمر مماثل التوظيف للبروتينات التعليم الطبي المستمر في حفر المغلفة بالكلاذرين في خلايا الثدييات 4.
بالإضافة إلى التعليم الطبي المستمر، والعديد من أنواع الخلايا تمتلك واحدة أو أكثر التقامي (CIE) مسارات مستقلة بالكلاذرين التي تعتمد على آليات بديلة لتعزيز تشكيل الحويصلة واستيعاب من غشاء البلازما 5-7. في الخميرة، حددنا مؤخرا طريقا CIE التي تستخدم صغيرة GTPase Rho1 وتفعيل جوانين لها عامل الصرف النوكليوتيدات (GEF)، ROM1 8،9. Rho1 ينشط formin Bni1 لتعزيز الأكتين البلمرة 10،11، وهو مطلوب لهذا النوع من الإلتقام مستقلة بالكلاذرين في الخميرة 12. وعلاوة على ذلك، فإن الأسرة α arrestin من البروتينات توظيف يغاز اليوبيكويتين Rsp5 لتعزيز ubiquitination البضائع واستيعاب لاحق من خلال التعليم الطبي المستمر 13-17، وأيضا تعزيز استيعاب البضائع عبر مسار CIE، ربما من خلال التفاعل المباشر مع البروتينات المشاركة في CIE 18. مجموعة متنوعة من مسارات CIE توجد أيضا في خلايا الثدييات، بما في ذلك مسارات مستقلة بالكلاذرين وأكلة التي تعتمد على ortholog Rho1، RhoA 9،19. يساء فهمها دور RhoA في الثدييات CIE. وبالتالي، دراسات في مهدها الخميرة قد توفر رؤى الآلية الإضافية التي تنطبق على CIE الثدييات.
تقدير دقيق للأحداث التقامي يمكن أن توفر معلومات هامة حول دور بروتينات معينة في تنظيم الإلتقام، ويمكن أن تكشف عن آثار الطفرات على استيعاب البضائع أو بروجرسيون من خلال مسار التقامي. لهذا الغرض، ويمكن استخدام طرق البيوكيميائية لمراقبة امتصاص يجند أو لقياس معدلات تدهور البروتينات البضائع التقامي. في الخلايا الحية، مزيج من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ومشتقاته إلى الشحنات من الفائدة يسمح التصور المباشر لنقل البضائع. ومع ذلك، الشحنات GFP الموسومة ذات الاستخدام المحدود للالكمي من الإلتقام لأن GFP مقاوم للتحلل في يحلول (أو فجوة في الخميرة). وعلاوة على ذلك، GFP مضان ليست سوى حساسة جزئيا إلى التغيرات في الرقم الهيدروجيني، ويبقى اكتشافها داخل تجويف تجويف 20،21. ونتيجة لذلك، مضان من العلامة GFP استمر في فجوة بعد فترة طويلة قد تدهورت ما تبقى من البضائع، وكله الكمي القائم على خلية من كثافة الشحنة قد تكون غير دقيقة بسبب مضان GFP على المدى الطويل في فجوة.
من أجل التغلب على عيوب مضان فجوي GFP، التي قطعناها على أنفسنا قبل استخدام الرقم الهيدروجيني supereclipticluorin، وهو البديل الحساسة درجة الحموضة من GFP تتفلور الزاهية في الرقم الهيدروجيني محايدة، ولكن يفقد مضان في البيئات الحمضية مثل تجويف تجويف / يحلول 20،22،23. وضع علامة pHluorin على الذيل حشوية من الشحنات التقامي يسمح التصور من الشحنات في غشاء البلازما وعلى الإندوسومات في وقت مبكر، حيث لا يزال علامة pHluorin يتعرض إلى السيتوبلازم (الشكل 1A). كما الإندوسومات في وقت مبكر ناضجة، المطلوبة لحزم النقل (ESCRT) الأجهزة الشحنات مترجمة السطح إلى الحويصلات التي برعم في تجويف الاندوسوم endosomal الفرز المعقدة، وتوليد الهيئات عديد الحويصلات (MVBs) 24. لالشحنات التي تم إدراجها في الحويصلات MVB الداخلية، العلامة pHluorin تواجه نحو تجويف الحويصلة. ويحمض الحويصلات MVB الداخلية؛ وبالتالي، تفقد الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin مضان على الإندوسومات في وقت مبكر لأنها تنضج في MVBs 20. الانصهار لاحق من MVB مع فجوة يسلم محتويات MVB اللمعيةللتدهور، والعلامات وpHluorin تبقى مروي في البيئة الحامضية للالتجويف فجوة.
تقدم هذه الورقة وصفا تفصيليا لفحوصات التقامي الكمية باستخدام الشحنات مع به pHluorin هيولي في الخميرة. سلالات التعبير عن الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin ويمكن استخدامها في المقايسات الحركية و / أو نقطة النهاية، وهذا يتوقف على سلوك خصائص والاتجار في البضائع محددة. وبالإضافة إلى ذلك، بعض الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin-قابلة للطرق التحليل الإنتاجية العالية، بما في ذلك التدفق الخلوي. الأهم من ذلك، العلامة pHluorin هو أداة مرنة لدراسة الأحداث التقامي في الخلايا الحية، مما يسمح الكمي لالإلتقام والمقارنة وظيفة التقامي في البرية من نوع وسلالات متحولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. حلول والإعلام
- إعداد ما يلي الأرصدة والإعلام ولوحات:
- لإعداد 10X YNB، حل 67 غرام من الخميرة قاعدة النيتروجين تفتقر إلى الأحماض الأمينية في 1 لتر من الماء. تعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرون النيتروسليلوز.
- إعداد المتوسطة YNB باستخدام 1X YNB (من 10X الأسهم) مع 2٪ سكر العنب (من معقمة 50٪ ث / الأسهم ت) وخليط 1X الأحماض الأمينية / المغذيات (من 100X الأسهم، راجع الخطوة 1.1.4). لاختيار البلازميد، حذف الأحماض الأمينية الفردية أو العناصر الغذائية حسب الحاجة. لتحريض التعبير Mup1، بالإضافة إلى حذف ميثيونين من خليط الأحماض الأمينية / المغذيات.
- إعداد لوحات YNB باستخدام 1X YNB (من 10X الأسهم)، 2٪ سكر العنب (من معقمة 50٪ ث / الأسهم الخامس)، 0.7 غرام / لتر الأحماض الأمينية / المغذيات خليط (راجع الخطوة 1.1.5) و 2.5٪ أجار. إعداد لوحة المتوسط عن طريق التعقيم 25 غراما من أجار و 0.7 غرام من خليط الأمينية حمض / المغذيات في 860 مل من الماء. يسمح هذا المزيج ليبرد إلى 55 درجة مئوية، ثم يضاف 100 مل من 10X YNB و 40 مل سو 50٪ جلوكوز. صب لوحات (حوالي 30 مل من المتوسط في صحن 10 سم)، والسماح على المديين المتوسط ويصلب في درجة حرارة الغرفة، وألواح تخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد 100X حل الأحماض الأمينية / الأسهم المغذيات (المتوسطة السائل) عن طريق إذابة التالية في 100 مل من الماء منزوع الأيونات: 0.1 ز L-ميثيونين، 0.3 غرام لكل من L-ليسين ولام، ليسين، و 0.2 غرام لكل من L-الحامض الاميني (قد يتم تضمين الأحماض الأمينية والمواد المغذية الأخرى حسب الحاجة لسلالات معينة)، تريبتوفان، الأدينين واليوراسيل. استخدام الحرارة لطيف إذا لزم الأمر إلى حل، وتعقيم من خلال مرشح 0.45 ميكرون النيتروسليلوز. تخزين في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء. لاختيار البلازميد، وإعداد الحلول الأسهم التي تفتقر إلى عناصر محددة حسب الحاجة.
- إعداد الأحماض الأمينية / خليط المواد الغذائية (لوحات) عن طريق الجمع بين ما يلي: 0.5 غرام من الأدنين، 4 غرام من L-ليسين، و 2 غرام لكل من L-الحامض الاميني، L، ليسين، L-ميثيونين، ل تريبتوفان، L- التيروزين واليوراسيل. طحن مع هاون ومدقة، وتخزينها مع المواليةاحلماية من الضوء. لاختيار البلازميد، وإعداد الخلائط التي تفتقر إلى عناصر محددة حسب الحاجة، واستخدام 0.7 غرام من خليط من الأحماض الأمينية للتر الواحد من المتوسطة لوحة (راجع الخطوة 1.1.3).
- إعداد الشرائح غرفة 8-جيدا للفحص المجهري بواسطة طلاء سطح الشريحة مع كونكانافالين ألف (كونا). إلى كل بئر من الشريحة غرفة، إضافة 25 ميكرولتر من 2 ملغ / مل كونا المذاب في الماء. باستخدام طرف ماصة، وانتشار كونا عبر السطح السفلي من البئر، ثم السماح الشريحة في الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 4-8 على الأقل ساعة. من الناحية المثالية، واستخدام الشرائح غرفة خلال 24 ساعة من كونا الطلاء.
- توليد سلالات الخميرة مع اندماج في إطار GFP أو pHluorin إلى البضائع التقامي الاهتمام باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) طريقة التكامل المستندة إلى وصفها في Longtine وآخرون. وغولدشتاين ومكسكر 25،26.
ملاحظة: البلازميدات تحتوي على pHluorin علامات الأشرطة مع الجينات المقاومة لكانامايسين (KANMX6) وnourseothricin (20. - تضخيم GFP أو pHluorin الأشرطة التي تحتوي على علامات اختيار مع الاشعال تحتوي على تسلسل إضافية محددة لموقع التكامل الجيني 20،25.
- تحويل منتج PCR مما أدى إلى سلالة الخميرة المطلوب باستخدام الليثيوم طريقة خلات 27.
- حدد لدمج الكاسيت من خلال زراعة الخلايا على لوحات YPD التي تحتوي على المخدرات المناسبة. لإعداد لوحات، الأوتوكلاف 10 ز خلاصة الخميرة، و 20 غراما ببتون، 0.1 غرام التربتوفان و 25 غراما أجار في 960 مل من الماء. قبل صب لوحات، والسماح للخليط لتبرد إلى 55 درجة مئوية، ثم إضافة 40 مل من الجلوكوز 50٪ وإما G418 إلى التركيز النهائي من 200 ميكروغرام / مل لاختيار KANMX6، أو nourseothricin إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل ل اختيار NATMX4.
- تأكيد تكامل GFP أو علامة pHluorin في المستعمرات الفردية عن طريق PCR و / أو النشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP،وكذلك من خلال الكشف عن البروتين تصفها مضان المجهر 20.
ملاحظة: سلالات الخميرة محددة والبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة هي مدرجة في الجدولين 1 و 2 على التوالي.
2. نقطة النهاية الفحص لالإسفار ثابت للدولة بشكل جوهري المنضوية التقامي البضائع
- تطعيم الخلايا (~ 3 مستعمرات صغيرة) في 5 مل من YNB المتوسطة التي تفتقر إلى الأحماض الأمينية أو العناصر الغذائية على النحو المطلوب لصيانة بلازميد (إن وجدت). تنمو الخلايا لمدة 16-24 ساعة في حاضنة تهتز المدارية عند 30 درجة مئوية، مع 250 دورة في الدقيقة تهتز. بدلا من ذلك، خط ل~ مستعمرة مم 1-2 الخلايا على طبق من ذهب YNB تفتقر إلى الأحماض الأمينية أو العناصر الغذائية لاختيار البلازميد، وتنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
- قياس كثافة (OD 600) من كل ثقافة بين عشية وضحاها باستخدام مقياس الطيف الضوئي. إعداد التخفيف 5 مل في ،35-،4 OD 600 / مل في YNB المتوسطة التي تفتقر إلى الأحماض الأمينية أو العناصر الغذائية لجيش التحرير الشعبى الصينىصيانة SMID، وتنمو لمدة ما يقرب من 3 ساعات في 30 درجة مئوية مع الهز. إذا يشوبه باستخدام الخلايا على طبق من ذهب، تخطي هذه الخطوة والمضي قدما في خطوة 2.4 (أنظر أدناه).
- قياس كثافة (OD 600) من الخلايا، التي ينبغي أن تكون الآن بين 0،6-1،0 OD 600 / مل. نقل 1.5 مل من ثقافة إلى أنبوب microfuge، والخلايا بيليه في 8000 دورة في الدقيقة (6،800 x ج) لمدة 2 دقيقة. إزالة 1475 ميكرولتر من طاف.
- جلب الخلايا إلى مضان المجهر. قبل تصوير كل عينة، وإعداد الشرائح عن طريق إعادة التعليق الخلايا في المتوسط المتبقية، وجبل 3 ميكرولتر من تعليق خلية تحت زلة غطاء. بدلا من ذلك، وإعداد الشرائح غرفة 8-جيدا كما هو موضح أدناه في بروتوكول 3، وذلك باستخدام المتوسطة YNB بما يتناسب مع اختيار البلازميد. من الناحية المثالية، خلايا صورة مع 100X، 1.4 أو أعلى الفتحة العددية (NA) الغمر النفط عدسة الهدف، وكاميرا 12- أو 16 بت، والمرشحات الإثارة / الانبعاثات الأمثل لمضان GFP.
ملاحظة: إذا كنت تستخدم الخلايا المزروعة عن طريق تسليط الضوء على سنا لوحة، وإعداد الشريحة من خلال وضع 3 ميكرولتر من المتوسطة YNB جديدة على زلة غطاء. باستخدام طرف ماصة، وجمع مستعمرة صغيرة من الخلايا من لوحة، وتفريق الخلايا في المتوسط YNB، وجبل تعليق الناتجة على شريحة زجاجية مباشرة قبل التصوير. - الصورة 4-6 حقول عشوائية من الخلايا لكل حالة، وذلك باستخدام المعلمات نفس اقتناء (أي مجموعات مرشح وزمن التعرض) لجميع الصور داخل التجربة.
ملاحظة: يمكن جمع وbrightfield أو صورة مدينة دبي للإنترنت لكل حقل يكون من المفيد للخلايا حيث تطفأ إشارة pHluorin في MVB ومقصورات فجوي. - قياس كثافة مضان من 30-50 خلايا على الاقل لكل حالة (انظر بروتوكول 5).
3. الحركية الفحص لالكمي لالإلتقام من الشحنات التي تخضع للرقابة الإلتقام
- تطعيم 2-3 مستعمرات خلايا الخميرة (حوالي 2 مم في القطر في مستعمرة) في 5 مل من YNB المتوسطة التي تفتقر إلى ميثيونين وإضافةالأحماض الأمينية itional أو المواد الغذائية للحفاظ على اختيار البلازميد. تنمو الثقافات ل16-24 ساعة عند 30 درجة مئوية مع الهز.
ملاحظة: في هذه الورقة، وبروتوكولات لدراسة تنظيم البروتينات البضائع التقامي الاستفادة من بيرمياز ميثيونين، Mup1. الشحنات الأخرى التي تخضع لالإلتقام المنظم هي أيضا مناسبة لوضع علامات مع pHluorin (على سبيل المثال، واليوراسيل بيرمياز Fur4، الذي يتراكم في غشاء البلازما في غياب اليوراسيل، ويذوت ردا على تطبيقها خارجيا اليوراسيل)؛ لهذه الشحنات، يجب أن يتم تعديل الأوضاع وسائل الإعلام لتعكس الظروف المحددة التعبير، تحريض واستيعاب لهذه البضائع. - قياس كثافة (OD 600) من كل ثقافة بين عشية وضحاها تقريبا 3 ساعات قبل التصوير. إعداد التخفيف 5 مل في ،35-،4 OD 600 / مل في YNB المتوسطة التي تفتقر إلى الأحماض الأمينية الميثيونين والإضافي أو المواد الغذائية لصيانة البلازميد، وتنمو حتى 30 درجة مئوية مع الهز.
- قبل تتوازن ميكروالتعامل الغرفة البيئية أو مرحلة ساخنة (إن وجد) إلى 30 درجة مئوية خلال الحضانة 3 ساعات من الخطوة 3.2.
- نقل 1 مل من ثقافة الخلية إلى أنبوب microfuge، والخلايا بيليه في 8000 دورة في الدقيقة (6،800 x ج) لمدة 2 دقيقة. إزالة 975 ميكرولتر من طاف.
- إعداد تعامل كونا، 8 جيدا القاع الزجاجي شريحة غرفة للتصوير (بروتوكول 1.2).
- إضافة 200 ميكرولتر من YNB المتوسطة التي تفتقر إلى الأحماض الأمينية الميثيونين والإضافي أو المواد الغذائية لاختيار البلازميد كل بئر. Resuspend وبيليه الخلية من الخطوة 3.4 في طاف المتبقية، وإسقاط 2.5 ميكرولتر من تعليق خلية في وسط كل بئر. تفريق الخلايا عبر سطح البئر من قبل pipetting صعودا وهبوطا، وتسمح للخلايا ليستقر لمدة 5-10 دقائق.
- ضع الشريحة الغرفة على مجهر مضان مقلوب معايرتها إلى 30 درجة مئوية (راجع الخطوة 3.3). تحديد حقل من الخلايا باستخدام brightfield الإضاءة.
- إضافة 50 ميكرولتر من YNB متوسطة تحتوي على 100 ميكروغرام / مل ميثيونين(قبل تحسنت إلى 30 درجة مئوية) إلى 200 ميكرولتر من المتوسط في البئر للحصول على تركيز ميثيونين النهائي من 20 ميكروغرام / مل. تجنب تعطيل المتوسطة في البئر من أجل منع الخلايا من العائمة من القاع.
- السماح للخلايا لكي تتوازن لمدة 2 دقيقة قبل البدء في التصوير. على الفور قبل التقاط الصورة الأولى، وضبط المجهر لطائرة التنسيق المطلوب (عادة طائرة التنسيق الاستوائية يعمل بشكل أفضل).
- الحصول على صور GFP وbrightfield (أو DIC) في 5 فترات دقيقة عن 45-60 دقيقة، وذلك باستخدام المعلمات الاستحواذ متطابقة لجميع الصور ضمن سلسلة زمنية (على سبيل المثال، 100X 1.4 NA الهدف غمر النفط و 500 اكتساب الوقت مللي ثانية باستخدام فلتر GFP، 100 اكتساب الوقت مللي ثانية باستخدام فلتر DIC).
ملاحظة: إذا مرحلة المجهر والتصوير البرامج لا تسمح للتصحيح التلقائي للانحراف طائرة الوصل، فإنه قد يكون من الضروري إعادة ضبط التركيز قبل كل نقطة زمنية التصوير يدويا. وعلاوة على ذلك، سوف مدة التحصيلتختلف بين المجاهر بسبب الاختلافات في الإضاءة والمرشحات، وينبغي تحديد الظروف المثلى مسبق يدويا لبدء التجربة. إذا تم استخدام البضائع التقامي أخرى من Mup1، قد يكون من الضروري تعديل اكتساب الوقت والتصوير فترات، فضلا عن مدة التجربة، لتعكس حركية استيعاب تلك البضائع. - قياس كثافة مضان من الخلايا الفردية في كل نقطة زمنية (انظر بروتوكول 5)، والتعبير عن القيم كنسبة مئوية من شدة الأولية للصورة الأولى.
4. نقطة النهاية الفحص لالكمي لالتقامي الشحنات التي تخضع للرقابة الإلتقام
- إعداد الخلايا للتصوير كما هو موضح في البروتوكول 3 (الخطوات 3.1 خلال 3.6).
- الصورة 4-5 حقول عشوائية من الخلايا لكل حالة على الفور قبل إضافة الميثيونين، وذلك باستخدام brightfield ومرشح GFP مجموعات.
- إضافة 50 ميكرولتر من YNB متوسطة تحتوي على 100 ميكروغرام / مل ميثيونين (ما قبل الحربميد إلى 30 درجة مئوية) إلى 200 ميكرولتر من المتوسط في البئر للحصول على تركيز ميثيونين النهائي من 20 ميكروغرام / مل. تجنب تعطيل المتوسطة في البئر من أجل منع الخلايا من العائمة من القاع.
- الصورة 4-5 حقول عشوائية من الخلايا 30 دقيقة بعد إضافة الميثيونين، وذلك باستخدام نفس المعلمات الحيازة وفقا لنقطة زمنية 0 دقيقة (الخطوة 4.2).
- قياس كثافة مضان من 30-50 خلايا على الاقل لكل نقطة زمنية (انظر بروتوكول 5). قيم صريحة كنسبة مئوية من Mup1-pHluorin المنضوية بعد 30 دقيقة باستخدام المعادلة التالية: [أن يعني كثافة في 0 دقيقة - يعني كثافة في 30 دقيقة] / [متوسط كثافة في 0 دقيقة] × 100٪.
ملاحظة: من الممكن إجراء في وقت واحد ما يصل الى ثمانية نقاط النهاية المقايسات التي كتبها مذهلة وقت بدء كل فحص ويقدم الجدول 3 سير عمل المثال لمدة ثمانية فحوصات في وقت واحد.
5. بعد اكتساب تحليل
- تصدير الصور من برنامج الحصول على أنها 16-بت تنسيق ملف الموسومة صورة (. TIF أو تنسيق TIFF.).
ملاحظة: قد يكون تنسيقات الملفات الأخرى أيضا مناسبة، وينبغي من الناحية المثالية تستخدم خوارزميات ضغط ضياع. الصور 8 بت هي عموما ليست مناسبة لأغراض القياس الكمي. - فتح الملفات باستخدام برنامج ImageJ (متاحة بحرية الخيار 'فتح' في في القائمة 'ملف'. استخدم صورة مضان لتقدير، وbrightfield / صورة مدينة دبي للإنترنت كمرجع لتحديد موقع الخلايا وشاملة جميع الخلايا الميتة (إذا كان موجودا )، والتي تظهر أكثر قتامة من الخلايا الحية عندما ينظر إليها من قبل مدينة دبي للإنترنت وautofluorescent عندما ينظر اليها مع المرشحات GFP الإثارة / الانبعاثات.
- إجراء خلفية الطرح على الصورة مضان. للصور مع إشارة الخلفية متفاوتة، استخدام 'خلفية الطرح "خوارزمية العثور عليها في" القائمة العملية ". استخدام الإعداد الافتراضي (المتداول الكرة دائرة نصف قطرها 50 بكسل)، وهو ما يكفي عادة لأغراض القياس الكمي.
ملاحظة: إن backgro البديليوصف أسلوب الطرح اوند للصور مع خلفية موحدة في خطوة 5.3.1.-5.3.2. ومع ذلك، يعمل الأسلوب أعلاه أيضا عن خلفية موحدة.- للصور مع خلفية موحدة (أي شدة خلفية ثابتة تقريبا في جميع الحواف وفي وسط الصورة)، إجراء خلفية الطرح اليدوي. انقر على زر "التحديدات مرفوعة" وجدت في نافذة يماغيج الرئيسي، وحدد 3-5 المناطق العشوائية داخل الصورة التي لا تحتوي على خلايا.
- فتح وظيفة 'مجموعة القياسات "الموجود في قائمة" تحليل "، حدد المعلمة" يعني رمادي القيمة، وقياس قيم الكثافة باستخدام وظيفة "قياس" (كما وجدت في القائمة' تحليل '). حساب متوسط قيمة من المناطق قياس 3-5، وطرح من جميع القياسات اللاحقة في هذه الصورة.
- لالكمي من المقايسات الحركية (بروتوكول 3)، تولد، صورة واحدة مكدسة لتيمسلسلة ه. فتح الصور مضان من كل نقطة زمنية في الترتيب الزمني، وتوليد كومة باستخدام "الصور إلى كومة 'وظيفة (وجدت في القائمة" صورة "، تحت القائمة الفرعية الأكوام).
- الخطوط العريضة لخلية باستخدام أداة التحديد اليدوي، مع التأكد من تضمين الخلية بأكملها ولكن المنطقة كما تذكر خارج الخلية ممكن.
- قياس المعلمات التالية: "المنطقة، الكثافة المتكاملة" و "متوسط رمادي القيمة. حدد المعلمات باستخدام وظيفة "تعيين القياسات"، وتقع في القائمة 'تحليل'.
ملاحظة: المتكاملة كثافة يتوافق مع مجموع كل شدة بكسل داخل المنطقة المحددة، ومتوسط رمادي القيمة يتوافق مع [المتكاملة الكثافة / المنطقة]، الذي يصحح قيم الكثافة لحجم الخلية. - فتح "مدير العائد على الاستثمار" الموجود في قائمة "تحليل"، تحت القائمة الفرعية لل'أدوات'. في إطار إدارة العائد على الاستثمار، انقر فوق الزر 'إضافة' لدخول رجو الضوءن كمنطقة جديدة من الاهتمام (ROI).
- كرر الخطوات من 5.4 خلال 5.6 للحصول على الخلايا المتبقية في الصورة. استبعاد أي خلايا ميتة وفقا لتقييم brightfield / مدينة دبي للإنترنت ومضان (الخلايا الميتة تبدو أغمق في صور مدينة دبي للإنترنت، ويكون إشارة هيولي autofluorescent عندما ينظر اليها مع GFP الإثارة / الانبعاثات؛ انظر الشكل 2F)، وأي الخلايا التي تلمس حافة الصورة. حفظ رويس المحددة كملف الرمز البريدي عن طريق النقر على زر "المزيد" في نافذة "مدير العائد على الاستثمار، وتصدير جميع القياسات إلى جدول بيانات أو برامج التحليل الإحصائي.
- لالكمي من المقايسات الحركية (بروتوكول 3)، الخطوط العريضة وقياس خلية من نقطة زمنية الأولية كما هو موضح في الخطوات 5.4 و 5.5. استخدام نفس العائد على الاستثمار لقياس كل نقطة زمنية لاحقة في التجربة.
- لفحوصات نقطة النهاية (بروتوكولات 2 و 4)، وقياس ما لا يقل عن 30-50 خلايا لكل حالة. أداء الكمي لمدة 2-3 على الأقل الصور، وتشمل جميع الخلايا في كلالصورة التي تلبي المعايير المحددة في الخطوة 5.8 في التحليل.
- تقييم دلالة إحصائية بين العينات باستخدام في اتجاه واحد أنوفا، تليها التجارب المقارنة متعددة توكي للالتحليل اللاحق.
6. تحليل السكان من Mup1-pHluorin الإلتقام بواسطة التدفق الخلوي
- تطعيم 2-3 مستعمرات خلايا الخميرة (حوالي 2 مم في القطر في مستعمرة) في 0.5 مل من YNB المتوسطة التي تفتقر إلى ميثيونين والأحماض الأمينية إضافية أو المواد الغذائية للحفاظ على اختيار البلازميد. زراعة خلايا في 5 مل أنابيب جولة القاع ل16-24 ساعة عند 30 درجة مئوية على طبل الدوارة.
- إضافة 1.5 مل من YNB المتوسطة التي تفتقر إلى الأحماض الأمينية الميثيونين والإضافي أو المواد الغذائية لصيانة البلازميد، وتنمو عند 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات إضافية على طبل الدوارة.
- نقل 1 مل من الخلايا في كل واحد منهما 5 مل أنابيب جولة القاع. إضافة 0.25 مل من YNB -Met المتوسطة إلى الأنبوب الأول (حالة -Met)، و 0.25 مل من YNB متوسطة تحتوي على 100 ميكروغرام/ مل ميثيونين في أنبوب الثاني لإعطاء تركيز ميثيونين النهائي من 20 ميكروغرام / مل (حالة + الحد). احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة على طبل الدوارة.
- تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي، واختيار قدما مبعثر (FS) كمقياس لحجم الخلية، وMup1-pHluorin كثافة مضان من ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) مرشح كمقياس لاستيعاب البضائع.
- استخدام أزرار التمرير لضبط الجهد للFS وقنوات FITC لتحسين الكشف عن مدى حجم ومضان كثافة خلايا الخميرة المستخدمة (لهذه التجارب، كانت الإعدادات المستخدمة 50 V لFS و 400 V لFITC).
ملاحظة: سوف الجهد لكل من قنوات تختلف تبعا لقياس التدفق الخلوي المستخدمة. وينبغي أن يتم هذه الخطوة قبل أو أثناء فترة العلاج 45 دقيقة مع ميثيونين (الخطوة 6.3). - قياس FS وكثافة مضان ل 10،000 الخلايا من كل حالة، وذلك باستخدام إعداد معدل تدفق عالية. توليد مؤامرة مبعثر من FS ضد فلووrescence كثافة: انقر فوق "إضافة الرسم البياني"، حدد FITC (محور س) وFS (المحور الصادي)، والرسم البياني 1000 نقطة (يقوم البرنامج بعرض قيم 1000 الخلايا، حتى ولو تم قياس 10000 الخلايا).
ملاحظة: للحصول على تناسق القصوى وتحليل خلايا 45-50 دقيقة بعد إضافة الميثيونين. للتجارب التي تشمل عددا كبيرا من العينات، ارباك إضافة الميثيونين لاستيعاب الوقت اللازم لتحليل التدفق الخلوي. - وتشمل الشروط -Met و+ الأرصاد لالبرية من نوع (WT) خلايا كمجموعة تحكم. باستخدام وظيفة البوابة، تعيين بوابة العمودية باستخدام حالة WT + الأرصاد الجوية، مثل أن ما يقرب من 5٪ من ألمع خلايا تقع على يمين البوابة. استخدام هذا النابضة لجميع الشروط الأخرى في التجربة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توطين حالة استقرار وتقدير من البروتين البضائع التقامي المنضوية جوهري Ste3
لإثبات أن الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin-يمكن استخدامها لتقدير حجم الإلتقام في الخلايا الحية، توطين GFP خيالية واندماج pHluorin مع الذيل حشوية C-محطة من Ste3، ومستقبلات فرمون على عامل في الخميرة، وتمت مقارنة. Ste3 هو G البروتين يقترن مستقبلات (GPCR) التي تنقل بشكل جوهري إلى غشاء البلازما، المنضوية، وتستهدف فجوة لتدهور 28. وهكذا، في ظل ظروف الحالة المستقرة، فإن غالبية Ste3 يموضع إلى التجويف فجوة، كما رأينا في البرية من نوع (WT) الخلايا معربا عن Ste3-GFP (الشكل 2A). في المقابل، فإن الخلايا التي تفتقر إلى الجينات التي تشفر أربعة بروتينات محول ملزم بالكلاذرين Ent1، Ent2، Yap1801 وYap1802 (ent1 Δent2 Δ Δ yap1801 yap1802 Δ، التي يشار إليها فيما 4Δ) تفشل في تحقيق الاستقرار بالكلاذرين في مواقع الإلتقام 29، ومعيب بشدة في التعليم الطبي المستمر 30. تتطلب خلايا 4Δ تعبير عن N-محطة التماثل (enth و) مجال إما Ent1 أو Ent2 وepsin لل30،31 جدوى. المجال enth وليس كافيا لالإلتقام في 4Δ الخلايا، كما يتضح من الاحتفاظ Ste3-GFP في الغشاء البلازمي في الخلايا 4Δ + ENTH1 معربا عن المجال enth ومن Ent1 (الشكل 2A) 8،30. وقد لوحظ مماثل الاحتفاظ غشاء البلازما في الخلايا 4Δ + ENTH1 عن الشحنات التقامي الأخرى، بما في ذلك Ste2-GFP (وα عامل فرمون مستقبلات) وMup1-GFP أو Mup1-pHluorin (أ بيرمياز ميثيونين) 8،18. في المقابل، تعبيرا عن كامل طول Ent1 من البلازميد في الخلايا 4Δ (4Δ + Ent1) يعيد الإلتقام وتوطين Ste3-GFP إلى فجوة. استخدمت خلايا 4Δ + ENTH1 مؤخرا طنا شاشة الوراثية لتحديد مسار CIE في الخميرة التي تعتمد على GTPase Rho1 ومرفق البيئة العالمية لها، ROM1، فضلا عن formin Bni1 وأعضاء الأسرة α arrestin من البروتينات المشاركة في البضائع فرز 8،18 تحوير الأكتين. وانسجاما مع دوره في CIE، تعبيرا عن ROM1 أو LDB19 α-arrestin من البلازميدات نسخة عالية في خلايا 4Δ + ENTH1 تحسين استيعاب Ste3-GFP (الشكل 2A).
الخلايا معربا عن Ste3-GFP أو غيرها من الشحنات التقامي GFP الموسومة لها فجوات مشرقة بسبب تراكم ومقاومة بروتين العلامة GFP. في المقابل، الخلايا معربا عن Ste3-pHluorin لديهم مستويات منخفضة جدا من مضان فجوي بسبب التبريد العلامة pHluorin في البيئات الحمضية 20. كما رأينا سابقا، وأظهرت خلايا WT و4Δ + Ent1 كشف القليل جدا Ste3-pHluorin بواسطة المجهر مضان (الشكل 2B). في المقابل، Ste3-pHluorinكان يمكن كشفها بسهولة في الغشاء البلازمي للخلايا 4Δ + ENTH1، في حين بقي فجوي Ste3-pHluorin لا يمكن الكشف عنها تقريبا في جميع الحالات. نسخة عالية في التعبير عن ROM1 أو LDB19 تخفيض كمية من اكتشاف Ste3-pHluorin على سطح الخلية، على غرار النتائج مع Ste3-GFP، على الرغم من فجوي Ste3-pHluorin بقي لا يمكن الكشف عنها تقريبا في جميع الحالات.
لمقارنة فعالية GFP- والشحنات كأدوات pHluorin الكلمات الدلالية لقياس التغيرات في قدرة التقامي من الخلايا، وقد تم قياس مضان خلية كاملة من Ste3-GFP وSte3-pHluorin في WT و4Δ الخلايا. على الرغم من التغيرات في توطين Ste3-GFP كانت اكتشافها بسهولة بواسطة المجهر (الشكل 2A)، وكانت الفروق في كثافة مضان الشاملة لا دلالة إحصائية بين WT، 4Δ + Ent1 والخلايا 4Δ + ENTH1 تحولت مع ناقلات فارغة (الشكل 2C) 20. Likewisه، لديها خلايا 4Δ + ENTH1 تحولت مع ناقلات، ROM1 وLDB19 كثافة مضان خلية كاملة مماثلة. والجدير بالذكر، أن الخلايا 4Δ + ENTH1 تحولت مع ROM1 أو LDB19 باهتة إلى حد كبير من خلايا WT (الشكل 2C) 8،18. ومع ذلك، كانت مستويات البروتين Ste3-GFP مماثلة وفقا لتقييم immunoblotting (الشكل 2E). في حين أن الفرق في الكثافة قد يكون راجعا في جزء منه إلى التغيرات في حجم فجوة أو التشكل، أو الاختلافات في الإبقاء على علامة GFP في فجوة، وتحديد حجم مضان Ste3-GFP لا يعكس التغيرات في توطين لوحظ من قبل المجهر مضان (الشكل 2A). في المقابل، أظهرت الكمي لشدة Ste3-pHluorin أن الخلايا 4Δ + ENTH1 تحولت مع ناقلات كانت أكثر إشراقا بكثير من خلايا WT أو 4Δ + Ent1، ونسخة عالية في التعبير عن ROM1 أو LDB19 في خلايا 4Δ + ENTH1 تخفيض Ste3-pHluorin كثافة لالمستويات التي كانت مشابهة لWT و4Δ + Ent1 (الشكل 2D). وهكذا، وتحديد حجم ثابت للدولة Ste3-pHluorin كثافة تعكس بدقة الخلافات في التعريب لوحظ من قبل المجهر مضان.
المقايسات استيعاب الحركية باستخدام البضائع التقامي ينظم، Mup1
تقدير حجم كثافة مضان لالشحنات المنضوية جوهري في الحالة المستقرة يمكن أن تكشف عن الاختلافات في قدرة التقامي من خلايا متحولة مقارنة مع خلايا WT. ومع ذلك، فمن الممكن أن بعض الشحنات قد تصل إلى نفس توزيع ثابتة للدولة وكثافة في خلايا متحولة WT والتقامي، على الرغم من أن خلايا متحولة لديها تأخير في الإلتقام أو أبطأ حركية لاستيعاب البضائع. الشحنات بدلا من ذلك، pHluorin الموسومة التي تخضع الإلتقام منظم في استجابة لحافز أو يجند محددة يمكن استخدامها لمراقبةحركية الإلتقام. لهذا الغرض، تم رصد الداخلي للبيرمياز ميثيونين عالية تقارب، Mup1، 32. في غياب ميثيونين خارج الخلية، وupregulated Mup1 التعبير، ويتم الاحتفاظ بيرمياز في غشاء البلازما. على إضافة الميثيونين إلى المتوسطة، Mup1 يخضع لاستيعاب سريع واستهداف لفجوة 13.
لمراقبة حركية Mup1 الداخلي، كانت تزرع سلالات WT معربا عن Mup1-GFP أو Mup1-pHluorin من موضع الجيني في غياب الميثيونين من أجل مراكمة Mup1 فلوري في غشاء البلازما (الشكل 3A، 0 دقيقة نقطة زمنية). ثم تم إجراء الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا في 5 فترات دقيقة في غياب أو وجود ميثيونين لمراقبة استيعاب البضائع والتغيرات في مضان. كما هو متوقع، بقي GFP- وpHluorin الموسومة Mup1 تصويرها في غياب ميثيونين في غشاء البلازما وأو 45 دقيقة كامل فترة الملاحظة 20. في المقابل، الخلايا المصورة في وجود الميثيونين أظهرت نضوب التدريجي للإشارة مضان من سطح الخلية، بما يتفق مع استيعاب البضائع. والجدير بالذكر أن Mup1-GFP مضان تراكمت في الهياكل الداخلية (أي الإندوسومات وفجوة)، في حين Mup1-pHluorin المترجمة إلى punctae الداخلي التي تتوافق مع المرجح أن الإندوسومات في وقت مبكر، ولكن لم أر في فجوة.
عندما كان كميا مضان في جميع نقاط الوقت لالخلايا الفردية، وأظهرت Mup1-GFP وMup1-pHluorin كثافة تغيير يذكر في غياب ميثيونين تطبيقها خارجيا خلال التجربة 45 دقيقة، بما يتفق مع البروتين المتبقية محلية مستقر إلى غشاء البلازما (الشكل 3B). في المقابل، انخفض خلية كاملة Mup1-pHluorin كثافة بسرعة في وجود ميثيونين، مثل أن تخفيض 50٪ في fluorescencوقد لوحظ ه شدة بعد حوالي 20-25 دقيقة، ولوحظ تخفيض بنسبة 80٪ بعد ما يقرب من 40 دقيقة 20. أظهر خلايا Mup1-GFP أيضا انخفاض في كثافة مضان على إضافة الميثيونين. ومع ذلك، تم تأجيل حركية فقدان مضان مقارنة مع تلك التي Mup1-pHluorin، بحيث انخفاضا بنسبة 50٪ في كثافة وحظ إلا بعد 40 دقيقة. كما رأينا في الشكل 3A، كان Mup1-GFP اكتشاف بالكاد في غشاء البلازما في هذا الوقت، مشيرا إلى أن استمرار فجوي GFP مضان منع التقدير الدقيق للأحداث التقامي على سطح الخلية.
المقايسات نقطة النهاية باستخدام البضائع التقامي ينظم، Mup1
بالإضافة إلى الكمية، المقايسات الحركية للالإلتقام كما هو موضح أعلاه، الشحنات التقامي المنظمة مثل Mup1 يمكن أن تستخدم أيضا لفحوصات نقطة النهاية، على غرار الكميفي الحالة الثابتة Ste3-pHluorin كثافة. لهذا الغرض، تم تعديل مقايسة لتقدير حجم Mup1-pHluorin الداخلي للسماح للمقارنة بين كثافة مضان متوسط من السكان من الخلايا تصويرها مباشرة قبل أو 30 دقيقة بعد إضافة الميثيونين 8،18. هذا النهج يتيح المقارنة بين نسبة Mup1 المنضوية بين خلايا متحولة WT والتقامي.
بالاتفاق مع نتائج الفحص الحركي (الشكل 3)، وMup1-pHluorin المنضب بسرعة من غشاء البلازما في خلايا WT (الشكل 4A)، مثل أن ما يقرب من 60٪ من Mup1-pHluorin كان المنضوية 30 دقيقة بعد إضافة الميثيونين ( الشكل 4B). كما هو متوقع، كان Mup1-pHluorin استيعاب كفاءة بالمثل في 4 + Ent1 الخلايا، في حين تم تخفيض الداخلي بشكل كبير في الخلايا 4Δ + ENTH1، بما يتفق مع وجود خلل شديد في الإلتقام. التعبير نسخة عالية،من ROM1 أو LDB19-α arrestin، وهو مطلوب على وجه التحديد لMup1 استيعاب سواء عن طريق التعليم الطبي المستمر وCIE مسارات 13،18، وتحسين استيعاب Mup1-pHluorin، بما يتفق مع قدرتها على تعزيز الإلتقام في الخلايا 4Δ + ENTH1 18. والجدير بالذكر، على الرغم من حالة استقرار Ste3-pHluorin كثافة في الخلايا 4Δ + ENTH1 معربا عن نسخة عالية-ROM1 أو كان LDB19 يمكن تمييزه من خلايا WT أو 4Δ + Ent1، تم تحسين استيعاب Mup1-pHluorin جزئيا فقط في الخلايا 4Δ + ENTH1 معربا عن نسخة عالية، ROM1 أو LDB19 (الشكل 4C). وهكذا، وتشير هذه البيانات إلى أن المقايسات الحركية و / أو نقطة النهاية يمكن أن تكشف عن الاختلافات في معدلات التقامي بين WT وسلالات متحولة لبعض الشحنات، على الرغم من توزيع ثابتة للدولة مماثل من الشحنات الأخرى قد يتحقق في نفس السلالات.
التحليل القائم على سكان Mup1-الفلبينuorin استيعاب باستخدام التدفق الخلوي
تحليل الإنتاجية العالية من السكان أكبر من الخلايا باستخدام التدفق الخلوي يمكن أن توفر بديلا للأداء المقايسات الحركية ونقطة النهاية لاستيعاب البضائع بواسطة المجهر. لهذا الغرض، وتمت مقارنة كثافة مضان من Mup1-pHluorin في خلايا WT من ثقافة نمت في غياب ميثيونين (WT -Met، الذي يجب أن يكون "مشرق") أو في وجود ميثيونين لمدة 45 دقيقة (WT + الأرصاد الجوية، الذي يجب أن يكون "قاتمة" بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة على أساس تخفيض بنسبة 80٪ في كثافة مضان رأينا في الشكل 3B). بعد تحليل التدفق الخلوي، تم تطبيق البوابة العمودية إلى حالة WT + الأرصاد الجوية، حيث تم احتواء ~ 5٪ من الخلايا على الجانب الأيمن من البوابة، ويتفق مع ألمع الخلايا داخل السكان (الشكل 5A و5B والسكان الأحمر). عندما تم تطبيق البوابة نفسهاإلى حالة WT -Met، انخفضت حوالي 65٪ من الخلايا في فئة مشرق، مما يدل على أن التدفق الخلوي يمكن استخدامها لمراقبة بسهولة الاختلافات في Mup1-pHluorin كثافة مضان بين السكان من الخلايا قبل وبعد إضافة الميثيونين. في المقابل، كان توزيع مشرق مقابل الخلايا قاتمة لا يمكن تمييزها في ظروف 4Δ + ENTH1 -Met و+ الارصاد باستخدام نفس البوابة تطبيقها على السكان WT + الأرصاد الجوية، بما يتفق مع الإلتقام معيب. وهكذا، التدفق الخلوي يمكن الكشف عن التغييرات في قدرة التقامي من الخلايا، ويسمح التحليل السريع لأعداد كبيرة من الخلايا. والأهم من ذلك التدفق الخلوي يمكن أن تستخدم أيضا في شاشات الوراثية كأداة للفرز واختيار خلايا متحولة مع الإلتقام معيب (ك Wrasman وباء. ندلاند، مخطوطة في الإعداد) 33.
شكل 1:
الشكل 2: التعريب وتقدير من Ste3-GFP وSte3-pHluorin في البرية من نوع وخلايا متحولة التقامي (A) WT، 4Δ + Ent1 و4Δ + ENTH1 الخلايا معربا عن ترميز genomically Ste3-GFP وتحولت مع ناقلات، نسخة عالية-ROM1 أو نسخة عالية-LDB19 كما هو مبين كانت تصور بواسطة المجهر مضان (الصف العلوي) أو مدينة دبي للإنترنت (الصف السفلي). تم تعديل الصور Ste3-GFP لنفس الحد الأقصى والحد الأدنى من شدة السماح المقارنة المباشرة من Ste3 التعريب. تم تحويل (ب) WT، 4Δ + Ent1 و4Δ + ENTH1 الخلايا معربا عن المشفرة genomically Ste3-pHluorin وتصوير كما هو موضح في لوحة A. شريط مقياس = 2 ميكرون. (C، D) الكمي لكثافة مضان لSte3-GFP (C) وSte3-pHluorin (D) السلالات المستخدمة في لوحات ألف وباء بالنسبة لكل حالة، تم كميا مضان خلية كاملة لمدة لا تقل عن 40 الخلايا. تم تصحيح القيم لحجم الخلية، وأعرب في وحدات التعسفي (الاتحاد الافريقي) كما يعني ± SEM (*** P <0.001 مقارنة WT، ††† ع <0.001 مقارنة 4Δ + ENTH1 + ناقلات). (E) اقاربهمالبريد تعبير عن Ste3-GFP تقييمها في WT، 4Δ + Ent1 والخلايا 4Δ + ENTH1 تتحول مع ناقلات، ROM1 نسخة عالية أو عالية نسخ LDB19 كما هو محدد. تم استخلاص الخلايا كما هو موضح سابقا 20، وحلت كميات متساوية من كل عينة من SDS-PAGE. تم تقييم التعبير Ste3-GFP بواسطة immunoblotting مع الأجسام المضادة ضد GFP، وجرى تقييم تحميل بروتين استخدام الألغام المضادة للGAPDH. (F) من النوع البري الخلايا معربا عن المشفرة genomically Ste3-GFP ينظر بواسطة المجهر مضان (لوحة Ste3-GFP) والبصريات مدينة دبي للإنترنت، مع خلية ميتة المشار إليها السهام. تظهر الخلايا الميتة autofluorescent في تصفية GFP، وأكثر قتامة عندما ينظر إليها من قبل مدينة دبي للإنترنت. مقياس شريط = 2 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: فحص الحركية من Mup1-GFP وMup1-pHluorin استيعاب (أ) الخلايا من النوع البري معربا عن ترميز genomically Mup1-GFP (العليا فريقين) أو Mup1-pHluorin (أقل فريقين) كانت تزرع في مرحلة منتصف لوغاريتمي في YNB المتوسطة التي تفتقر إلى ميثيونين للحث على التعبير Mup1 والاحتفاظ بها في غشاء البلازما. ثم تم تصوير الخلايا بواسطة المجهر مضان كل 5 دقائق في غياب (- الحد) أو وجود (+ الحد) من 20 ميكروغرام / مل ميثيونين. لكل نقطة زمنية في حالة تم تطبيق القيم القصوى والدنيا كثافة مماثلة للسماح للمقارنة بين كثافة مضان والتعريب. وتظهر 0، 5، 10، 20 و 40 نقطة الساعة مين كما هو مبين لجميع الظروف. شريط مقياس = 2 ميكرون. (ب) الكمي لMup1-GFP وMup1-pHluorin الداخلي في الخلايا من النوع البري من لوحة A. خلية كاملة كثافة مضان من Mup1-GFP (- اجتمع والساحات الأرجواني، + الأرصاد الجوية، الماس الأزرق) أو Mup1-pHluoرين (- الأرصاد الجوية، مثلثات خضراء. + الأرصاد الجوية، الدوائر الحمراء) وقد تم قياس الخلايا الفردية تصويرها في 5 فترات دقيقة، وكنسبة مئوية من كثافة مضان الأولية (يعني ± SEM، ن = 6 خلايا لكل حالة). نقلا عن بروسر وآخرون. (2010) 20 بإذن من الناشر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: فحص نقطة النهاية من Mup1-pHluorin الداخلي (A) WT، 4Δ + Ent1 و4Δ + ENTH1 الخلايا معربا عن ترميز genomically Mup1-pHluorin وتحولت مع ناقلات، نسخة عالية-ROM1 أو نسخة عالية-LDB19 كما هو مبين كانت تزرع في منتصف المرحلة -logarithmic في YNB المتوسطة التي تفتقر إلى ميثيونين. تم تصوير حقول عشوائية من الخلايا عن طريق fluorescenc البريد المجهر على الفور من قبل (- الحد) أو 30 دقيقة بعد (+ الحد) إضافة 20 ميكروغرام / مل ميثيونين. تم تعديل جميع الصور لنفس قيم الكثافة القصوى والدنيا. شريط مقياس = 2 ميكرون. (ب) الكمي لMup1-pHluorin الداخلي في الخلايا من لوحة A. لكل حالة، وقد تم قياس خلية كاملة كثافة مضان مدة لا تقل عن 40 الخلايا وتصحيح لحجم الخلية. تم حساب النسبة المئوية للMup1-pHluorin المنضوية بمقارنة يعني قيم الكثافة قبل وبعد العلاج 30 دقيقة مع الميثيونين. وتظهر القيم كما يعني ± SEM (ن = 4؛ *** ع <0.001 مقارنة WT، † ف <0.05 مقارنة 4Δ + ENTH1 + ناقلات). تم تعديل هذا الرقم من بروسر وآخرون. (2015) 18 بإذن من الناشر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: تحليل للسكان من Mup1-pHuorin استيعاب التدفق الخلوي كانت تزرع (A) خلايا WT و4Δ + ENTH1 إلى مرحلة منتصف لوغاريتمي في YNB المتوسطة التي تفتقر إلى ميثيونين. ثم تم تحضين الخلايا في غياب (- الحد) أو وجود (+ الحد) من 20 ميكروغرام / مل ميثيونين لمدة 45 دقيقة قبل تحليل التدفق الخلوي. لكل حالة، تم رسم مبعثر إلى الأمام (في وحدات التعسفي، والاتحاد الافريقي) ضد كثافة مضان (الاتحاد الافريقي، باستخدام فلتر FITC) عن 1000 الخلايا من أصل ما مجموعه 10،000 خلايا قياسها. وقد تم تحليل السكان من جراء تطبيق البوابة العمودية (السهم الأزرق) إلى حالة WT + الأرصاد الجوية، حيث انخفضت ما يقرب من 5٪ من ألمع الخلايا (كما هو موضح باللون الأحمر) على الجانب الأيمن من البوابة. والنابضة الناتجة عن حالة WT + الأرصاد ثم تطبيقها على بقية الشروط للسماح للمقارنةمن توزيعات العينة. (ب) ملخص النسبة المئوية للخلايا الخافتة (النقاط السوداء، على يسار البوابة) والخلايا مشرقة (النقاط الحمراء، على يمين البوابة) لWT و4Δ + ENTH1 ± المحاكمات اجتمع هو مبين في لوحة و. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| سلالة | الطراز العرقى | مصدر |
| SEY6210 ل | MAT α HIS3-Δ200 trp1-Δ901 leu2-3،112 ura3-52 lys2-801 suc2-Δ9 | مختبر البلازميد |
| BWY2858 | STE3-GFP :: KANMX6 | بروسر وآخرون (2010) 16 |
| BWY2995 | STE3-pHluorin :: KANMX6 | Pروسر وآخرون (2010) 16 |
| BWY3036 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | بروسر وآخرون (2010) 16 |
| BWY3037 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | بروسر وآخرون (2010) 16 |
| BWY3399 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | بروسر وآخرون (2010) 16 |
| BWY3400 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | بروسر وآخرون (2010) 16 |
| BWY3817 | MUP1-GFP :: KANMX6 | العلاقات العامةosser وآخرون (2010) 16 |
| BWY3818 | MUP1-pHluorin :: KANMX6 | بروسر وآخرون (2010) 16 |
| BWY4153 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | بروسر وآخرون (2011) 7 |
| BWY4154 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | بروسر وآخرون (2011) 7 |
| على جميع السلالات المستخدمة في هذه الدراسة هي إسوي إلى SEY6210 إلا في مواضع المشار إليه. | ||
الجدول 1: سلالات الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة.
| البلازميد | وصف | مصدر |
| pRS426 | 2μ URA3 | سيكورسكي وHieter، 1989 |
| pBW0768 | pRS414 :: ENT1 [CEN TRP1] | pEnt1، مختبر البلازميد |
| pBW0778 | pRS414 :: ent1 (aa1-151) [CEN TRP1] | pENTH1، مختبر البلازميد |
| pBW1571 | pFA6a-pHluorin-KANMX6 | بروسر وآخرون (2010) 16 |
| pBW2053 | YEp24 :: ROM1 [2μ URA3] | pROM1 (بروسر وآخرون، 2011) 7 |
| pRS426-Ldb19 | LDB19prom-LDB19 [2μ URA3] | بروسر وآخرون (2015) 15 |
| pFA6a-GFP (S65T) -kanMX6 | البلازميد دمج المستندة إلى PCR pFA6a-GFP-KANMX6، لGFP وضع العلامات في الخميرة | Longtineوآخرون (1998) 21 |
الجدول 2: البلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة.
| الوقت (دقيقة) | الإجراء (الإجراءات) |
| -5 | صورة نموذج 1 (-Met) |
| 0 | إضافة الميثيونين لعينة 1 |
| صورة نموذج 2 (-Met) | |
| 5 | إضافة الميثيونين لعينة 2 |
| صورة عينة 3 (-Met) | |
| 10 | إضافة الميثيونين لعينة 3 |
| صورة نموذج 4 (-Met) | |
| 15 | إضافة الميثيونين لعينة 4 |
| صورة عينة 5 (-Met) | |
| 20 | إضافةميثيونين لعينة 5 |
| صورة عينة 6 (-Met) | |
| 25 | إضافة الميثيونين لعينة 6 |
| صورة عينة 7 (-Met) | |
| 30 | إضافة الميثيونين لعينة 7 |
| عينة صورة 8 (-Met) | |
| صورة نموذج 1 (+ الحد) | |
| 35 | إضافة الميثيونين لعينة 8 |
| صورة نموذج 2 (+ الحد) | |
| 40 | صورة عينة 3 (+ الحد) |
| 45 | صورة نموذج 4 (+ الحد) |
| 50 | صورة عينة 5 (+ الحد) |
| 55 | صورة عينة 6 (+ الحد) |
| 60 | صورة عينة 7 (+ الحد) |
| 65 | عينة صورة 8 (+ الحد) |
الجدول 3: العمل مثال لمذهلة 8 المقايسات نقطة النهاية Mup1-pHluorin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تطبيقات pHluorin لتقدير الأحداث التقامي في خلايا الخميرة يجعل من استخدام الشحنات عبر الغشاء الذي هو تنصهر علامة فلوري إلى ذيل حشوية من البروتين (الشكل 1A). لفحوصات وصفها هنا، الشحنات هي فلوري الزاهية عندما يتعرض العلامة pHluorin إلى بيئات محايدة، ولكن أصبح مروي عندما يصادف العلامة pHluorin الظروف الحمضية. وهكذا، تم الكشف عن البضائع التقامي الموسومة pHluorin-بسهولة في مواجهة حشوية من غشاء البلازما وعلى الإندوسومات في وقت مبكر، ولكن يصبح "قاتمة" عندما تدمج الحويصلات MVB اللمعية أو عند تسليم إلى التجويف فجوة. بشكل عام، الشحنات التقامي تصنيعه حديثا من المرجح ترك الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) وتصل إلى غشاء البلازما قبل GFP والعديد من مشتقاته قد نضجت تماما. وبالتالي، الشحنات التي لم تصل بعد إلى سطح الخلية ومن المتوقع pHluorin الموسومة أن تبقى غير قابلة للكشف ما لم خروج من لائحة أو جولجي هو أننيmpaired.
وقد سهلت استخدام الشحنات التقامي الموسومة pHluorin مثل Ste3 وMup1 توصيف عدد من البروتينات المشاركة في مسار الخميرة CIE (الشكل 1B) 8،18. على وجه التحديد، وقد استخدمت الأساليب المذكورة في هذه الورقة لإثبات أن زيادة الإنتاج من GTPase Rho1 ومرفق البيئة العالمية ROM1 تعزيز الإلتقام في مجموعة متنوعة من المسوخ الخميرة مع عيوب في التعليم الطبي المستمر 8 تحوير الأكتين. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin في الآونة الأخيرة لإثبات الكمية التي α-arrestins، التي أدوار راسخة في التعليم الطبي المستمر 13-15،34-36، لعب الأدوار البضائع انتقائية في كل من التعليم الطبي المستمر وCIE، ولها وظائف متميزة ميكانيكيا في اثنين من مسارات 18.
لبروتوكولات المبينة في هذه الورقة، وينبغي النظر في عدة عوامل هامة من أجل الحصول على نتائج كمية مماثلة. أولا، Mup1-GFP أو Mup1-pHluorin التعبير وfluorescence قد ينخفض مع اقتراب خلايا الخميرة أو تدخل مرحلة نمو ثابتة (نتائج غير منشورة). وبالتالي، الخلايا المزروعة من الثقافة بين عشية وضحاها ويجب تخفيفه وإعادة نمت ل3 ساعة إضافية (انظر الخطوات 3،1-3،2 و6،1-6،2). وبالإضافة إلى ذلك، عندما مذهلة ظروف تجريبية متعددة أو سلالات في المقايسات نقطة النهاية أو لتحليلها من قبل التدفق الخلوي، فمن المهم لجمع البيانات لجميع العينات بعد نفس المدة من العلاج الميثيونين من أجل السماح بإجراء مقارنات بين الظروف الفردية. لتحليل ما بعد الشراء، يجب أن يتم تنفيذ الكمي باستخدام صور 16 بت، منذ تحويل إلى تنسيق 8 بت يسبب فقدان البيانات التي يمكن أن تؤثر على قيم الكثافة مضان. وعلاوة على ذلك، يجب أن يتم تنفيذ الطرح الخلفية قبل الكمي (الخطوة 5.3)، منذ إشارة الخلفية يمكن أن تسد بشكل كبير اختلافات في كثافة بين العينات.
في حين pHluorin الموسومة-أثبتت Ste3 وMup1 قابلة للتقدير، وليسفإن جميع الشحنات تكون مناسبة تماما لpHluorin وضع العلامات. على سبيل المثال، محاولات لوضع علامة على α-مستقبلات عامل Ste2 وقد أسفرت النتائج الكمية متناسقة، وربما يعود ذلك إلى انخفاض كثافة مضان من Ste2-pHluorin مقارنة بما كان عليه من Ste3 أو Mup1 (نتائج غير منشورة)، على الرغم من أنه من الممكن أن علامات جنبا إلى جنب pHluorin يمكن أن تحسن كثافة إشارة. وبالإضافة إلى ذلك، الشحنات بمعدلات بطيئة جدا من الإلتقام التي يسببها يجند قد لا تكون قابلة للpHluorin وضع علامات لتقدير، وخاصة إذا كان الوقت غير الشقيق لاستيعاب أطول من دورة الخلية الخميرة (حوالي 90 دقيقة). لمثل هذه الشحنات، ويمكن أن تنشأ انخفاض في مضان من الإلتقام و / أو من تقسيم البضائع بين الخلايا الأم وابنتها أثناء انقسام. وهكذا، واختبار الشحنات الفردية للمصلحة ينصح من أجل تحديد ما إذا كان التعبير عنها وحركية هي مناسبة لpHluorin وضع العلامات وتقدير.
على الرغم من أن الدراسات الحديثة باستخدام الفلبينuorin ركزت بشكل رئيسي على الأحداث التقامي في غشاء البلازما، والشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin ويمكن استخدامها لدراسة الأحداث الاتجار في وقت لاحق في مسار التقامي. على سبيل المثال، تم استخدام Mup1-pHluorin بنجاح في تدفق المقايسات مقرها الخلوي من البضائع بوساطة ESCRT الفرز في MVBs 37، منذ العلامة pHluorin يصبح تطفأ عند التأسيس إلى MVB الحويصلات اللمعية 20. هذا النهج هو مماثل لمراسل وسيفيراز أكثر وصف مؤخرا من ترسب داخل اللمعة (سيد) الفحص، مما يجعل استخدام الشحنات مع علامة وسيفيراز هيولي لتوليد إشارة للإضاءة الحيوية في وجود وسيفيرين 38،39. مماثلة لإخماد pHluorin مضان عند التأسيس إلى MVB الحويصلات اللمعية، والموهن تلألؤ بيولوجي في فحص واضح عند التأسيس العلامة وسيفيراز إلى الحويصلات MVB. في حين pHluorin والمقايسات واضح تتشابه من الناحية النظرية، الشحنات ذات الكلمات الدلالية pHluorin ويمكن استخدامها لدراسة الإلتقام وMVB نضوج طخلايا ن سليمة.
توجد طرق بديلة لتقدير حجم الإلتقام، وقدمت معلومات قيمة عن معدلات استيعاب البضائع في البرية من نوع وخلايا متحولة التقامي. ومن الأمثلة على ذلك مراقبة امتصاص بروابط رديولبلد مثل α عامل (التي تربط لمستقبلات فرمون Ste2) واليوراسيل (والتي يتم داخليا من قبل بيرمياز Fur4) 40،41، أو مراقبة معدل تدهور للالشحنات التقامي مثل Ste3 لأنها والمنضوية ونقلها إلى فجوة 42. تتطلب هذه النهج البيوكيميائية تحلل الخلية، وبالتالي فهي ليست مناسبة لتقدير المباشر في الخلايا الحية. بدلا من ذلك، fluorescently المسمى α عامل، السائل المرحلة صبغ لوسيفر صفراء، أو الصبغة styryl يمكن استخدامها FM4-64 لتصور الإلتقام في الخلايا الحية، ولكن لا تسمح الرصد المباشر للبروتينات البضائع أعرب التطور الطبيعي 40،43،44. لهذه المناهج، استمرار مضان في فاالتجويف cuole قد تعقد الكمي، كما رأينا مع GFP. ومن الممكن أيضا استخدام الشحنات الموسومة GFP لتقدير حجم الإلتقام عن طريق قياس خلية كاملة كثافة مضان وطرح إشارة من المقصورات حشوية وendosomal / فجوي، ومع ذلك، الإندوسومات وفجوات في كثير من الأحيان على مقربة من غشاء البلازما. في المقابل، مروي الشحنات التقامي الموسومة pHluorin في MVB / مقصورات فجوة، التي يمكن أن تكون ميزة واضحة لتقدير الأحداث الاتجار بالمقارنة مع العلامة GFP أكثر تستخدم على نطاق واسع. والدراسات المستقبلية توسيع بناء على المعرفة الحالية للمسارات التقامي والفرز البضائع في الخميرة لتحديد العوامل الإضافية التي تساهم في التعليم الطبي المستمر وCIE، وفهم الآليات التي تنظم القرارات وفرز البضائع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
- Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604 (2011).
- Hansen, C. G., Nichols, B. J.
- Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
- Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
- Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
- Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
- Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
- Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
- Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
- Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
- Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
- Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
- O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
- O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
- Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
- Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
- Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
- Bokman, S. H., Ward, W. W.
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
- Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
- Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
- Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
- Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
- Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
- Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
- Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
- Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
- Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
- Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
- Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
- Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
- Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H.
- Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
- Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
- Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).
