Abstract
Das grün fluoreszierende Protein (GFP) und seine Varianten sind Werkzeuge zur Untersuchung von Proteinlokalisierung und Dynamik von Ereignissen wie Zytoskelett-Umbau und Vesikeltransport in lebenden Zellen weit verbreitet. Quantitative Methoden unter Verwendung von chimären GFP-Fusionen wurden für viele Anwendungen entwickelt; jedoch GFP ist etwas resistent gegen Proteolyse, wodurch seine Fluoreszenz bleibt im Lysosom / Vakuole, die Quantifizierung von Frachthandels in der endocytischen behindern können. Ein alternatives Verfahren zur Quantifizierung Endozytose und post-endocytic Handel Ereignisse nutzt superecliptic pHluorin, eine pH-sensitive Variante von GFP, die in sauren Umgebungen abgeschreckt wird. Chimäre Fusion von pHluorin zum Zytoplasmaschwanz von Transfracht-Proteine führt zu einer Dämpfung der Fluoreszenz bei der Gründung der Ladung in multivesicular Körper (MVBs) und Auslieferung an die Lysosomen / Vakuole Lumen. Somit Löschung der Vakuole Fluoreszenz erleichtert quantifiKation der Endozytose und der frühen Ereignisse im endocytischen. Dieses Papier beschreibt Methoden pHluorin-markierte Frachten für die Quantifizierung der Endozytose über Fluoreszenzmikroskopie sowie populationsbasierten Assays Durchflusszytometrie verwendet wird.
Introduction
Vesikeltransport spielt eine wichtige Rolle Organell Identität und Funktion in eukaryontischen Zellen beibehalten wird, und ist ein Schlüsselmechanismus Protein und Membranzusammensetzung der einzelnen zellulären Kompartimenten zur Regulierung. An der Plasmamembran, Fusion von Vesikeln Exozytose liefert neue Proteine und Membranen auf der Oberfläche der Zelle, während die erzeugten Bläschen durch Endozytose Membran und Proteine von der Oberfläche zum Lysosom zur anschließenden Wiederverwertung oder Targeting entfernen. Somit ist Endozytose wichtig für die Nährstoffaufnahme und für Reaktionen auf die extrazelluläre Umgebung. Exozytose und Endozytose werden ausgewogen Plasmamembranoberfläche zu regulieren, und der Umsatz von beschädigten Proteinen zu ermöglichen.
Studien in Hefe und Säugerzellen haben eine große Anzahl von Proteinen in der Endozytose, sowie mehrere endocytic Wegen beteiligt identifiziert, die zu einer Vielzahl von en Internalisierung spezifischer Frachten oder diese Handlung als Reaktion fördernbungsbedingungen. Die am besten untersuchten Weg ist Clathrin-vermittelte Endozytose (CME), in der Clathrin und zytosolischen akzessorischen Proteine in einer Schichtstruktur zusammenstellen, die im Entstehen begriffenen endocytic Vesikel zu stabilisieren. Experimente in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae haben wichtige Einblicke in die Dynamik und die Reihenfolge der Rekrutierung ergab für viele endocytic Proteine 1-3. Bemerkenswerterweise wird die CME Maschinen stark durch die Evolution konserviert, so dass die Mehrheit der CME-verwandten Proteinen in Hefe menschliche Orthologe haben; Somit Hefe Knospung hat ein wichtiges Werkzeug für das Verständnis der Mechanismen der Endozytose gegeben, die in höheren Eukaryonten konserviert sind. Zum Beispiel Studien Bäckerhefe mit bestimmt, dass die Bildung und Reifung von CME-Strukturen (als kortikalen Aktin-Patches in Hefe bezeichnet) umfasst die schrittweise Einstellung vieler Proteine, beginnend mit Clathrin und Fracht-bindenden Adapterproteine, gefolgt von Einstellung zusätzlicher endocytic Zubehör Proteine,Aktivierung von Arp2 / 3-vermittelte Aktin - Polymerisation und die Rekrutierung von Proteinen in Vesikel scission 1,2 beteiligt. Die Rekrutierung von CME Maschinen Proteine Aktin-Patches zu kortikalen ist eine hoch geordnete und stereotypisch Prozess, und die genaue Reihenfolge der Rekrutierung für viele Proteine in Bezug auf andere Komponenten der CME Maschinen etabliert. Wichtig ist , dass die jüngsten Studien haben eine ähnliche Reihenfolge der Rekrutierung für CME Proteine bei Clathrin beschichteten Gruben in Säugetierzellen 4 bestätigt.
Neben CME besitzen viele Zelltypen eine oder mehrere Clathrin-unabhängige endocytic (CIE) Wege , die auf alternative Mechanismen beruhen Vesikelbildung und Internalisierung von der Plasmamembran 5-7 zu fördern. In Hefe identifizierten wir vor kurzem eine CIE - Weg, der die kleine GTPase Rho1 und seine Aktivierung Guaninnukleotidaustauschfaktor (GEF), Rom1 8,9 verwendet. Rho1 aktiviert die formin Bni1 Actinpolymerisation 1 zu fördern0,11, die für diese Form der Clathrin-unabhängige Endozytose in Hefe 12 erforderlich ist. Außerdem rekrutieren die α-Arrestin Familie von Proteinen , die Ubiquitin - Ligase Rsp5 zur Ladung Ubiquitinierung und anschließende Internalisierung durch CME 13-17, und auch fördern Ladung Internalisierung über den CIE - Weg, möglicherweise durch direkte Interaktion mit Proteinen beteiligt in CIE 18 fördern. Eine Vielzahl von CIE Wege existieren auch in Säugerzellen, einschließlich Clathrin-unabhängige und phagozytischen Bahnen , die auf der Rho1 Ortholog verlassen, RhoA 9,19. Die Rolle von RhoA in Säuger CIE ist wenig bekannt; also Studien in Bäckerhefe kann zusätzliche mechanistische Erkenntnisse liefern, die auf Säugetier CIE anwendbar sind.
Eine genaue Quantifizierung von endocytic Ereignisse können, Endozytose bei der Regulierung der wichtige Informationen über die Rollen von spezifischen Proteinen liefern und die Auswirkungen der Mutationen auf die Ladung Verinnerlichung oder progressio offenbarenn durch den endocytischen. Zu diesem Zweck können biochemische Verfahren verwendet werden, Liganden-Aufnahme zu überwachen oder Abbauraten von endocytischen Frachtproteinen zu messen. In lebenden Zellen Fusion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und dessen Varianten Frachten von Interesse ermöglicht die direkte Visualisierung von Frachtverkehr. Allerdings GFP-markierten Frachten sind von begrenztem Nutzen für die Quantifizierung der Endozytose, weil GFP zu einem Abbau in den Lysosomen (oder Vakuole in Hefe) resistent ist. Außerdem ist GFP - Fluoreszenz nur teilweise empfindlich gegenüber Änderungen in pH und bleibt innerhalb der Vakuole Lumen 20,21 nachweisbar. Folglich Fluoreszenz des GFP-Tag besteht in der Vakuole, lange nachdem der Rest der Ladung abgebaut worden ist, und ganze zellbasierten Quantifizierung von Ladungsintensität kann durch langfristige GFP-Fluoreszenz in die Vakuole ungenau sein.
Um die Nachteile von vakuolären GFP-Fluoreszenz zu überwinden, wir zuvor Verwendung superecliptic pH gemachtluorin, eine pH-sensitive Variante von GFP , die hell bei neutralem pH fluoresziert, verliert aber Fluoreszenz in sauren Umgebungen , wie beispielsweise das Lumen der Vakuole / Lysosomen 20,22,23. Eine pHluorin Tag auf der zytoplasmatischen Schwanz von endocytischen cargos Platzierung erlaubt die Visualisierung der Frachten an der Plasmamembran und am frühen Endosomen, in denen die pHluorin Tag in das Zytoplasma (1A) ausgesetzt bleibt. Bereits Endosomen reifen, die Endosomen Sortierkomplexe , die für Transport (ESCRT) Maschinen - Pakete oberflächen lokalisierte Frachten in Vesikeln, die in das Lumen des Endosomen Knospe, Erzeugung multivesicular Körper (MVBs) 24. Für Frachten, die in interne MVB Vesikel aufgenommen wurden, steht die pHluorin Tag in Richtung der Vesikel Lumen. Interne MVB Vesikel werden angesäuert; so verlieren pHluorin-markierte Frachten Fluoreszenz auf frühe Endosomen , wie sie reifen in MVBs 20. Die anschließende Verschmelzung der MVB mit der Vakuole liefert die MVB luminalen Inhaltefür den Abbau und pHluorin Tags bleiben in der sauren Umgebung der Vakuole Lumen gequencht.
Dieses Dokument enthält detaillierte Beschreibungen der quantitativen endocytic Assays Cargos mit zytoplasmatischen pHluorin Tags in Hefe verwendet. Die Stämme pHluorin-markierte Frachten exprimieren, können in kinetische und / oder Endpunkt-Assays verwendet werden, abhängig von den Eigenschaften und den Handel Verhalten der spezifischen Ladung. Darüber hinaus sind einige pHluorin-tagged cargos zugänglich Hochdurchsatz-Analyseverfahren, einschließlich Durchflusszytometrie. Wichtig ist, dass die pHluorin Tag ein vielseitiges Werkzeug für die in lebenden Zellen endocytic Ereignisse zu studieren, so dass eine Quantifizierung der Endozytose und den Vergleich von endocytic Funktion in Wildtyp und Mutantenstämmen.
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Protocol
1. Lösungen und Medien
- Bereiten Sie die folgenden Aktien, Medien und Platten:
- Zur Vorbereitung 10x YNB, lösen sich 67 g Hefe-Stickstoffbasis Aminosäuren in 1 l Wasser fehlt. Sterilisieren durch Filtration durch ein 0,22 um-Nitrocellulosefilter.
- Bereiten Sie YNB-Medium mit 1x YNB (von 10fach) mit 2% Dextrose (aus einer sterilen 50% w / v Lager) und 1x Aminosäure / Nährstoffmischung (von 100x Lager, siehe Schritt 1.1.4). Für Plasmid-Selektion, lassen Sie einzelne Aminosäuren oder Nährstoffe nach Bedarf. Zur Induktion der Expression MUP1 zusätzlich Methionin aus der Aminosäure / Nährstoffmischung auszulassen.
- Bereiten Sie YNB-Platten mit 1x YNB (von 10fach), 2% Dextrose (aus einer sterilen 50% w / v Lager), 0,7 g / l Aminosäure / Nährstoffmischung (siehe Schritt 1.1.5) und 2,5% Agar. Bereiten Plattenmedium durch 25 g Agar Autoklavierung und 0,7 g Aminosäure / Nährstoffmischung pro 860 ml Wasser. Lassen Sie die Mischung auf 55 ° C abkühlen, fügen dann 100 ml 10x YNB und 40 ml of 50% Glucose. Platten gießen (etwa 30 ml Medium pro 10 cm Schale), ermöglichen es dem Medium bei Raumtemperatur, und speichern Platten bei 4 ° C zu verfestigen.
- Bereiten 100x Aminosäure / Nährstoff-Stammlösung (für flüssiges Medium), indem die folgende in 100 ml deionisiertem Wasser gelöst: 0,1 g L-Methionin, 0,3 g jeweils von L-Leucin und L-Lysin und 0,2 g jeweils von L-Histidin , L-Tryptophan, Adenin und Uracil (andere Aminosäuren und Nährstoffe können als für bestimmte Stämme erforderlich enthalten sein). Verwenden Sie sanfte Wärme bei Bedarf zu lösen und sterilisieren durch einen 0,45 um Nitrocellulosefilter. Bei einer Raumtemperatur unter Lichtschutz. Für Plasmid-Selektion, Stammlösungen fehlen spezifische Komponenten herzustellen, wie benötigt wird.
- Bereiten Aminosäure / Nährstoffmischung (für Platten) durch Vereinigen der folgenden: 0,5 g Adenin, 4 g L-Leucin und 2 g jeweils L-Histidin, L-Lysin, L-Methionin, L-Tryptophan, L- Tyrosin und Uracil. Grind mit einem Mörser und Stößel, und speichern Sie mit ProSchutz vor Licht. Für Plasmid-Selektion, bereiten Mischungen bestimmte Komponenten nach Bedarf fehlt, und verwenden Sie 0,7 g Mischung Aminosäure pro Liter Plattenmedium (siehe Schritt 1.1.3).
- Bereiten 8-Well-Kammerobjektträger für die Mikroskopie durch Beschichten der Oberfläche des Schiebers mit Concanavalin A (ConA). Zu jeder Vertiefung der Kammer Rutsche, werden 25 & mgr; l von 2 mg / ml ConA in Wasser gelöst. Mit Hilfe einer Pipettenspitze, verbreiten sie das ConA über die Bodenfläche des Bohrlochs, erlauben dann die Folie an der Luft trocknen bei Raumtemperatur für mindestens 4-8 Stunden. Idealerweise verwenden Kammer gleitet innerhalb von 24 Stunden von ConA-Beschichtung.
- Generieren Sie Hefestämme mit in-frame - Fusionen von GFP oder pHluorin zum endocytic Ladung von Interesse unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) basierenden Integrationsverfahren in Longtine et al. und Goldstein und McCusker 25,26.
HINWEIS: Plasmide , die pHluorin Kassetten mit Resistenzgenen für Kanamycin - Tagging (KANMX6) und Nourseothricin (- Amplifizieren GFP oder pHluorin Kassetten enthält selektierbare Marker mit Primern , die zusätzliche Sequenzen spezifisch zu der Stelle der genomischen Integration 20,25.
- Transformieren des resultierenden PCR - Produkts in die gewünschte Hefestamm mit dem Lithiumacetat - Verfahren 27.
- Auswählen, für die Integration der Kassette von Zellen auf YPD-Platten, die die geeignete Arzneimittel wächst. Zur Herstellung von Platten, Autoklaven 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 0,1 g Tryptophan und 25 g Agar-Agar in 960 ml Wasser. Bevor Platten gießt, erlauben die Mischung auf 55 ° C abkühlen, dann werden 40 ml 50% Glucose und entweder G418 in einer Endkonzentration von 200 ug / ml für KANMX6 Selektion oder Nourseothricin bis zu einer Endkonzentration von 100 ug / ml für NATMX4 Auswahl.
- Bestätigen Integration des GFP oder pHluorin Tag in einzelnen Kolonien durch PCR und / oder Western-Blotting unter Verwendung von Anti-GFP-Antikörper,sowie durch die Detektion des markierten Proteins durch Fluoreszenzmikroskopie 20.
HINWEIS: Specific Hefestämme und Plasmide in dieser Studie verwendet werden in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt sind.
2. Endpunkttest für Steady-State-Fluoreszenz von konstitutiv internalisierten endocytische Fracht
- Impfen Zellen (~ 3 kleine Kolonien) in 5 ml YNB Medium ohne Aminosäuren oder Nährstoffe wie für Plasmid Wartung erforderlich (falls zutreffend). Wachsen Zellen für 16-24 Stunden in einem Orbital Schüttelinkubator bei 30 ° C, mit 250 Umdrehungen pro Minute schütteln. Alternativ Streifen a ~ 1-2 mm Kolonie von Zellen auf einer YNB Platte Aminosäuren oder Nährstoffe, die für Plasmid-Selektion fehlt und die Zellen wachsen über Nacht bei 30 ° C.
- Messung der Dichte (OD 600) jeder Übernachtkultur unter Verwendung eines Spektrophotometers. Bereiten Sie eine 5 ml Verdünnung bei 0,35-0,4 OD 600 / ml in YNB Medium ohne Aminosäuren oder Nährstoffe für plaSmid Wartung und unter Schütteln bei 30 ° C für etwa 3 h wachsen. Bei der Verwendung von Zellen auf einer Platte ausgestrichen, überspringen Sie diesen Schritt und fahren Sie mit Schritt 2.4 (siehe unten).
- Messung der Dichte (OD 600) von Zellen, die nun zwischen 0,6-1,0 OD 600 / ml liegen. Übertragung von 1,5 ml der Kultur zu einem Mikrozentrifugenröhrchen und Pellet-Zellen bei 8000 rpm (6800 × g) für 2 min. Entfernen 1475 ul Überstand.
- Bringen Zellen einem Fluoreszenzmikroskop. Vor jeder Probe Bildgebung, bereiten eine Folie, indem die Zellen im verbleibenden Medium resuspendieren und montieren 3 ul Zellsuspension unter einem Deckglas. Alternativ bereiten 8-Well-Kammerobjektträger wie in Protokoll 3, mit YNB-Medium als geeignet für das Plasmid weiter unten beschrieben. Idealerweise Bildzellen mit einem 100X, 1.4 oder höhere numerische Apertur (NA) -Ölimmersionsobjektiv Objektiv, ein 12- oder 16-Bit-Kamera und Anregung / Emissionsfilter für GFP-Fluoreszenz optimiert.
HINWEIS: Bei der Verwendung von Zellen durch Ausstreichen o gewachsenna Platte, bereiten Sie die Folie, indem 3 ml frisches YNB-Medium auf einem Deckglas. Mit Hilfe einer Pipettenspitze, sammeln eine kleine Kolonie von Zellen von der Platte, verteilen die Zellen in das YNB-Medium, und montieren Sie die resultierende Suspension auf einen Glasobjektträger unmittelbar vor der Belichtung. - Bild 4-6 Zufallsfelder von Zellen für jede Bedingung, die gleichen Erfassungsparameter verwendet (dh Filtersätzen und Belichtungszeit) für alle Bilder in einem Experiment.
HINWEIS: für jedes Feld ein Hell- oder DIC Bild Sammeln kann für Zellen nützlich sein, wo das pHluorin Signal in MVB und vacuolar Fächer gelöscht wird. - Quantifizieren Fluoreszenzintensität von mindestens 30 bis 50 Zellen für jede Bedingung (siehe Protokoll 5).
3. Kinetic Assay zur Quantifizierung der Endozytose von Cargos, die Regulated Endozytose unterziehen
- Impfen 2-3 Kolonien von Hefezellen (etwa 2 mm Durchmesser pro Kolonie) in 5 ml YNB-Medium Methionin fehlt und fügenitional Aminosäuren oder Nährstoffe, die für Plasmid-Selektion erhalten bleibt. Wachsen Kulturen für 16-24 h bei 30 ° C unter Schütteln.
HINWEIS: In diesem Papier, Protokolle für regulierte endocytic Cargoproteine zu studieren wird Verwendung des Methionin-Permease, MUP1 machen. Andere Ladungen, die regulierte Endozytose unterziehen, sind ebenfalls geeignet für mit pHluorin Tagging (beispielsweise das Uracil-Permease Fur4, die an der Plasmamembran in Abwesenheit von Uracil ansammelt, und internalisiert in Reaktion auf extern angelegte uracil); für diese Frachten, sollten Medienbedingungen die spezifischen Ausdruck, Induktion und Internalisierung Bedingungen für die Fracht zu reflektieren modifiziert werden. - Messung der Dichte (OD 600) jeder Übernachtkultur etwa 3 Stunden vor der Bildgebung. Bereiten Sie eine 5 ml Verdünnung bei 0,35-0,4 OD 600 / ml in YNB Medium ohne Methionin und zusätzliche Aminosäuren oder Nährstoffe für Plasmiderhalt und wachsen bei 30 ° C unter Schütteln.
- Pre-äquilibrieren die MikrosCopes Klimakammer oder erwärmt Stufe (falls vorhanden) auf 30 ° C während der 3-stündigen Inkubation von Schritt 3.2.
- 1 ml der Zellkultur zu einem Mikrozentrifugenröhrchen und Pellet-Zellen bei 8000 rpm (6800 × g) für 2 min. Entfernen 975 & mgr; l Überstand.
- Bereiten Sie eine ConA-behandelt, 8-Well Glasbodenkammer Rutsche für die Bildgebung (Protokoll 1.2).
- In 200 ul YNB Medium ohne Methionin und zusätzliche Aminosäuren oder Nährstoffe, die für Plasmid-Selektion zu jeder Vertiefung. Resuspendieren des Zellpellets aus Schritt 3.4 in dem verbleibenden Überstand, und fallen auch 2,5 ul der Zellsuspension in der Mitte von jedem. Disperse Zellen über die Oberfläche des Bohrlochs durch Pipettieren von oben und unten, und lassen Sie Zellen für 5-10 Minuten absetzen.
- Legen Sie die Kammer gleiten auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop ins Gleichgewicht gebracht zu 30 ° C (siehe Schritt 3.3). Suchen Sie ein Feld von Zellen unter Verwendung von Hellfeldbeleuchtung.
- Je 50 ul YNB-Medium, enthaltend 100 ug / ml Methionin(Vorgewärmt auf 30 ° C) zu den 200 ul Medium in das Bohrloch eine endgültige Methionin-Konzentration von 20 & mgr; g / ml zu erhalten. Vermeiden Sie das Medium in das Bohrloch, um Aufbrechen der Zellen ein Aufschwimmen von unten zu verhindern.
- Lassen Sie die Zellen für 2 min äquilibrieren vor der Bilderzeugung begonnen wird. Unmittelbar vor dem ersten Bild aufzeichnen, das Mikroskop auf die gewünschte Fokusebene einzustellen (typischerweise ein äquatoriales Fokalebene funktioniert am besten).
- Erwerben GFP und Hellfeld- (oder DIC) Bilder in 5 min Abständen für 45-60 min, für alle Bilder in einer Zeitreihe identische Akquisitionsparameter (zum Beispiel 100 × 1,4 NA Öl-Immersionsobjektiv und 500 msec Akquisitionszeit unter Verwendung von GFP-Filter, 100 ms Erfassungszeit unter Verwendung von DIC-Filter).
Hinweis: Wenn die Bühne und Imaging-Software des Mikroskops nicht zur automatischen Korrektur der Fokusebene Drift ermöglichen, kann es notwendig sein, manuell vor jeder Bildgebungs Zeitpunkt den Fokus neu einzustellen. Darüber hinaus wird Akquisitionszeitenvariieren zwischen Mikroskopen aufgrund der Unterschiede in der Beleuchtung und Filter und optimalen Bedingungen sollten manuell vor dem Beginn des Experiments bestimmt werden. Wenn ein endocytic Ladung andere als MUP1 verwendet wird, kann es notwendig sein, die Erfassungszeit und Imaging-Intervalle zu ändern, sowie die Dauer des Experiments, die Internalisierung Kinetik der Güter zu reflektieren. - Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von einzelnen Zellen zu jedem Zeitpunkt (siehe Protokoll 5) und Express-Werte als Prozentsatz der anfänglichen Intensität des ersten Bildes.
4. Endpunkttest zur Quantifizierung von endocytische Cargos, die Regulated Endozytose unterziehen
- Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung wie in Protokoll 3 beschrieben (Schritte 3.1 bis 3.6).
- Bild 4-5 Zufallsfelder von Zellen für jede Bedingung unmittelbar vor Methionin Zugabe Hellfeld- und GFP-Filter-Sets.
- In 50 ul YNB-Medium, das 100 ug / ml Methionin (Vorkriegsmed bis 30 ° C) zu den 200 ul Medium in das Bohrloch eine endgültige Methionin-Konzentration von 20 & mgr; g / ml zu erhalten. Vermeiden Sie das Medium in das Bohrloch, um Aufbrechen der Zellen ein Aufschwimmen von unten zu verhindern.
- Bild 4-5 Zufallsfelder der Zellen 30 min nach Zugabe von Methionin, unter Verwendung der gleichen Erfassungsparameter wie für die 0 Minuten-Zeitpunkt (Schritt 4.2).
- Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von mindestens 30-50 Zellen für jeden Zeitpunkt (siehe Protokoll 5). Express-Werte als Prozentsatz der MUP1-pHluorin nach 30 min internalisiert unter Verwendung der Formel: [mittlere Intensität bei 0 min - mittlere Intensität bei 30 min] / [mittlere Intensität bei 0 min] x 100%.
. HINWEIS: Es ist möglich, gleichzeitig durch eine Staffelung der Startzeit von jedem Test bis zu acht Endgeräte - Tests durchführen Tabelle 3 zeigt ein Beispiel - Workflow für acht gleichzeitige Assays.
5. Post-Akquisition-Analyse
- Export Bilder von Erfassungssoftware als 16-Bit-tagged-Bilddateiformat (.tif oder .tiff-Format).
HINWEIS: Andere Dateiformate können ebenfalls geeignet sein, und idealerweise lossless Komprimierungsalgorithmen verwenden. 8-Bit-Bilder sind in der Regel nicht geeignet für die Quantifizierung. - Öffnen Sie Dateien ImageJ Software (frei verfügbar auf 'Open' Option im Menü "Datei" verwenden. Verwenden Sie das Fluoreszenzbild für die Quantifizierung und die Hell- / DIC Bild als Referenz die Position von Zellen zu identifizieren und tote Zellen auszuschließen (falls vorhanden ), die dunkler als lebende Zellen erscheinen, wenn sie von DIC gesehen und sind autofluoreszenten, wenn sie mit GFP Anregungs- / Emissionsfiltern betrachtet.
- Führen Sie eine Untergrundsubtraktion auf dem Fluoreszenzbild. Für Bilder mit einem unebenen Hintergrundsignal, verwenden Sie den 'Untergrundsubtraktion' Algorithmus im "Process Menü 'gefunden. Verwenden Sie die Standardeinstellung (Rollkugelradius von 50 Pixel), die für die Quantifizierung der Regel ausreichend ist.
HINWEIS: Eine alternative background Subtraktionsverfahren für Bilder mit einheitlichen Hintergrund wird in Schritt 5.3.1.-5.3.2 beschrieben; funktioniert jedoch das obige Verfahren auch für einheitlichen Hintergrund.- Für Bilder mit einheitlichen Hintergrund ( das heißt, Hintergrundintensität an allen Kanten annähernd konstant und in der Mitte des Bildes), führen Sie eine manuelle Untergrundsubtraktion. Klicken Sie auf die Schaltfläche im Haupt ImageJ Fenster gefunden "freihändig Auswahl" und wählen 3-5 zufälligen Regionen innerhalb des Bildes, die Zellen nicht enthalten.
- Öffnen Sie die 'Set-Messungen "Funktion befindet sich in der" Analysieren "Wählen Sie im Menü" mittleren Grauwert' Parameter, und messen Intensitätswerte mit Hilfe der "Maßnahme" Funktion (auch im "Analysieren" Menü). Berechnen Sie den Mittelwert aus den 3-5 gemessen Regionen und aus allen nachfolgenden Messungen in diesem Bild zu subtrahieren.
- Zur Quantifizierung der kinetischen Assays (Protokoll 3), erzeugen eine einzelne, gestapelte Bild für die timE-Serie. Öffnen Sie die Fluoreszenzbilder von jedem Zeitpunkt in chronologischer Reihenfolge und erzeugen einen Stapel, die "Bilder zu Stack 'mit der Funktion (im Menü' Bild 'gefunden, unter dem Stapel Untermenü).
- Skizzieren Sie eine Zelle, die die freihändige Auswahlwerkzeug verwenden, um sicherzustellen, die gesamte Zelle zu schließen, aber so wenig Fläche außerhalb der Zelle wie möglich.
- Messen Sie die folgenden Parameter: 'Area, Integrierte Dichte "und" mittleren Grauwert'. Wählen Sie die Parameter, die 'Set-Messungen "Funktion, die sich im" Analysieren "Menü.
HINWEIS: Integrierte Dichte entspricht der Summe aller Pixelintensitäten innerhalb der gewählten Region und mittleren Grauwert entspricht [Integrierte Dichte / Area], die Intensitätswerte für die Zellgröße korrigiert. - Öffnen Sie die "ROI-Manager" befindet sich in der "Analysieren" im Menü unter dem "Extras" Untermenü. Im ROI-Manager-Fenster klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen" den markierten regio eingebenn als neue Region von Interesse (ROI).
- Wiederholen Sie die Schritte 5.4 bis 5.6 für die verbleibenden Zellen in dem Bild. Schließen Sie alle toten Zellen wie beurteilt durch Hell- / DIC und Fluoreszenz (tote Zellen dunkler erscheinen in DIC Bilder und haben autofluoreszenten Cytoplasma - Signal , wenn sie mit GFP Anregung / Emission gesehen; siehe Abbildung 2F), und alle Zellen, die den Rand des Bildes berühren. Speichern Sie die ausgewählten ROIs als ZIP-Datei, indem Sie auf den Button 'Mehr' in der 'ROI-Manager "Fenster, und exportieren Sie alle Messungen in eine Tabelle oder statistische Analyse-Software.
- Zur Quantifizierung der kinetischen Assays (Protokoll 3) umreißen und eine Zelle von dem Anfangszeitpunkt gemessen werden, wie in den Schritten 5.4 und 5.5 beschrieben. Verwenden Sie den gleichen ROI für die Messung aller späteren Zeitpunkten in das Experiment.
- Für Endpunkt-Assays (Protokolle 2 und 4), für jede Bedingung ein Minimum von 30 bis 50 Zellen messen. Führen Sie die Quantifizierung für mindestens 2-3 Bilder und beinhalten alle Zellen in jedemBild, das die Kriterien umrissen in Schritt 5.8 in der Analyse erfüllen.
- Beurteilen Sie die statistische Signifikanz zwischen den Proben unter Verwendung von Einweg-ANOVA, gefolgt von Tukey-Mehrfachvergleichstest für die Post - hoc - Analyse.
6. Populationsanalyse von MUP1-pHluorin Endozytose von Flow Cytometry
- Beimpfen 2-3 Kolonien von Hefezellen (ungefähr 2 mm Durchmesser pro Kolonie) in 0,5 ml YNB Medium ohne Methionin und zusätzliche Aminosäuren oder Nährstoffe für Plasmidselektion beibehalten wird. Wachsen Zellen in 5-ml-Rundbodenröhrchen für 16-24 h bei 30 ° C auf einer Rolltrommel.
- 1,5 ml YNB-Medium ohne Methionin und zusätzliche Aminosäuren oder Nährstoffe für Plasmiderhaltung und wachsen bei 30 ° C für weitere 3 h auf einer Walzentrommel.
- 1 ml der Zellen in die jeweils zwei 5-ml-Rundbodenröhrchen. Zugabe von 0,25 ml YNB -Met Mediums mit dem ersten Rohr (-Met condition) und 0,25 ml YNB-Medium, enthaltend 100 ug/ Ml Methionin mit dem zweiten Rohr eine endgültige Methionin-Konzentration von 20 & mgr; g / ml (+ Met Zustand) zu ergeben. Inkubiere Zellen bei 30 ° C für 45 min auf einer Walzentrommel.
- Analysieren Zellen mittels Durchflusszytometrie, Auswählen Vorwärtsstreuung (FS) als Maß für die Zellgröße und MUP1-pHluorin Fluoreszenzintensität von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Filter als Maß für die Ladung Internalisierung.
- Verwenden Sie den Schiebetasten, um die Spannung der FS und FITC Kanäle einstellen zu optimieren Erkennung für den Größenbereich und die Fluoreszenzintensität der Hefezellen verwendet werden (für diesen Experimenten verwendeten Einstellungen waren 50 V für FS und 400 V für FITC).
HINWEIS: Spannung für beide Kanäle in Abhängigkeit von der Strömungs variieren Zytometer verwendet wird. Dieser Schritt sollte mit Methionin (Schritt 6.3) vor oder während der 45 min-Behandlung durchgeführt werden. - Messen Sie FS und die Fluoreszenzintensität für 10.000 Zellen aus jedem Zustand, die hohe Strömungsgeschwindigkeit Einstellung. Generieren Sie ein Streudiagramm von FS gegen Fluozenz-Intensität: klicken Sie auf "hinzufügen Graph ', wählen Sie FITC (x-Achse) und FS (y-Achse) und der Graph 1000 Punkte (die Software Werte für 1000 Zellen angezeigt werden, obwohl wurden 10.000 Zellen gemessen).
HINWEIS: Für eine maximale Konsistenz, zu analysieren Zellen 45-50 min nach der Zugabe von Methionin; für Experimente große Anzahl von Proben beteiligt, taumeln Zugabe von Methionin, die Zeit für die Durchflusszytometrie-Analyse erforderlich aufzunehmen. - Fügen Sie -Met und + Met Bedingungen für Wildtyp (WT) Zellen als Kontrolle. Mit Hilfe der Gate-Funktion, weisen eine vertikale Gate des WT + Met Zustand verwenden, so dass etwa 5% der hellsten Zellen rechts des Tores fallen. Verwenden Sie diese Gating für alle anderen Bedingungen im Experiment.
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Representative Results
Steady-State - Lokalisierung und Quantifizierung des konstitutiv internalisiert endocytic Fracht Protein STE3
Um zu demonstrieren, dass pHluorin-tagged cargos kann zur Quantifizierung von Endozytose in lebenden Zellen, Lokalisierung von chimären GFP und pHluorin Fusionen mit der zytoplasmatischen C-terminalen Schwanz von STE3 verwendet werden, die a-Faktor-Pheromon-Rezeptor in Hefe, wurden verglichen. STE3 ist ein G - Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) , die konstitutiv zur Plasmamembran transportiert, internalisiert und zum Abbau 28 zur Vakuole abgezielt. So wird unter stationären Bedingungen, lokalisiert die Mehrheit der STE3 auf die Vakuole Lumen, wie in Wildtyp (WT) Zellen gesehen exprimieren STE3-GFP (2A). Im Gegensatz dazu Zellen , die Gene fehlen kodieren , die vier Clathrin-bindenden Adapterproteine Ent1, Ent2, Yap1801 und Yap1802 (ent1 Δent2 Δ yap1801 Δ yap1802 Δ, nachstehend als 4Δ) scheitern Clathrin an Standorten von 29, Endozytose zu stabilisieren und in CME 30 stark defekt sind. 4Δ Zellen erfordern die Expression des Epsin N-terminale Homologie (ENTH) Domäne entweder Ent1 oder Ent2 für die Lebensfähigkeit 30,31. Die ENTH Domäne ist nicht ausreichend für die Endozytose in 4Δ Zellen, wie durch Retention von STE3-GFP an der Plasmamembran in 4Δ + ENTH1 exprimierenden Zellen die ENTH Domäne von Ent1 (2A) 8,30 dargestellt ist ; ähnliche Retentionsplasmamembran in 4Δ + ENTH1 Zellen wurde für andere endocytic Frachten beobachtet, einschließlich Ste2-GFP (der α-Faktor - Pheromon - Rezeptor) und MUP1-GFP oder MUP1-pHluorin (ein Methionin - Permease) 8,18. Im Gegensatz dazu ist die Expression von Volllängen-Ent1 aus einem Plasmid in 4Δ Zellen (4Δ + Ent1) stellt Endozytose und Lokalisierung von STE3-GFP in die Vakuole. 4Δ + ENTH1 Zellen wurden ich vor kurzem verwendetna genetischen Screen einen CIE - Weg in Hefe zu identifizieren , die auf das Actin-modulierende GTPase Rho1 und seine GEF, Rom1 sowie die formin Bni1 und Mitgliedern der α-Arrestin - Familie von Proteinen beteiligt in cargo Sortier 8,18 beruht. In Übereinstimmung mit einer Rolle in der CIE, die Expression von ROM1 oder der α-Arrestin LDB19 von hoher Kopienzahl Plasmide in 4Δ + ENTH1 Zellen verbessert Internalisierung von STE3-GFP (2A).
Die Zellen STE3-GFP oder andere GFP-markierten endocytic Frachten haben helle Vakuolen aufgrund der Ansammlung und proteolytischen Widerstand des GFP-Tag exprimiert. Im Gegensatz dazu haben STE3-pHluorin exprimierenden Zellen sehr geringe Mengen an vakuolären Fluoreszenz aufgrund Abschrecken des pHluorin Tag in sauren Umgebungen 20. Wie zuvor gesehen, zeigten WT und 4Δ + Ent1 Zellen sehr wenig nachweisbares STE3-pHluorin durch Fluoreszenzmikroskopie (2B). Im Gegensatz dazu STE3-pHluorinwurde auf der Plasmamembran von 4Δ + ENTH1 Zellen leicht nachweisbar, während vakuolären STE3-pHluorin in allen Fällen nahezu nicht nachweisbar blieben. High-copy Expression von ROM1 oder LDB19 reduzierte die Menge an nachweisbarer STE3-pHluorin an der Zelloberfläche, ähnlich zu den Ergebnissen mit STE3-GFP, obwohl vakuolären STE3-pHluorin in allen Fällen nahezu nicht nachweisbar blieben.
Um die Wirksamkeit der GFP- und pHluorin-tagged cargos als Werkzeuge für die Quantifizierung von Veränderungen in der endocytischen Kapazität von Zellen, Ganzzellfluoreszenz von STE3-GFP und STE3-pHluorin vergleichen, wurde in WT und 4Δ Zellen gemessen. Obwohl Änderungen in der Lokalisierung STE3-GFP leicht nachweisbar durch Mikroskopie (2A) waren die Unterschiede in der Intensität Gesamtfluoreszenz waren statistisch nicht signifikant zwischen WT, 4Δ + Ent1 und 4Δ + ENTH1 mit leerem Vektor (Abbildung 2C) 20 transformierte Zellen. Likewise, transformiert 4Δ + ENTH1 Zellen mit dem Vektor, ROM1 und LDB19 hatten ähnliche Fluoreszenzintensitäten whole-cell. Bemerkenswert ist , mit ROM1 oder LDB19 transformierte 4Δ + ENTH1 Zellen waren signifikant schwächer als WT - Zellen (2C) 8,18; jedoch waren STE3-GFP - Proteinspiegel ähnlich wie durch Immunoblotting (Abbildung 2E) bewertet. Während die Differenz in der Intensität auf Veränderungen in Vakuole Größe oder Morphologie oder auf Unterschiede in der Retention des GFP - Tag in die Vakuole, Quantifizierung von STE3-GFP - Fluoreszenz zurückzuführen sein kann spiegelt nicht die Veränderungen in Teil in Lokalisation durch Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung beobachtet 2A). Deutlich heller als WT oder 4Δ + Ent1 Zellen hingegen zeigte Quantifizierung von STE3-pHluorin Intensität dass 4Δ + ENTH1 mit dem Vektor transformierten Zellen waren und hoher Kopien Expression von ROM1 oder LDB19 in 4Δ + ENTH1 Zellen reduziert STE3-pHluorin IntensitätEbenen , die ähnlich wie WT und 4Δ + Ent1 (2D) waren. So Quantifizierung der Steady-State-STE3-pHluorin Intensität spiegelt genau die Unterschiede in der Lokalisation mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet.
Kinetic Internalisierung Assays , die die geregelte endocytic Ladung mit, MUP1
Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität für konstitutiv internalisiert Frachten im stationären Zustand können Unterschiede in der endocytic Kapazität von mutierten Zellen zeigen im Vergleich zu WT-Zellen. Es ist jedoch möglich, dass einige cargos die gleiche Stationärzustandsverteilung und Intensität in WT und endocytic mutanten Zellen erreichen kann, auch wenn die mutierten Zellen eine Verzögerung in Endozytose oder langsamer Kinetik für Fracht Internalisierungsfähigkeit. Stattdessen kann pHluorin-tagged cargos die regulierte Endozytose in Reaktion auf einen bestimmten Reiz oder Liganden zu unterziehen verwendet werden, die zu überwachenKinetik der Endozytose. Hierzu Internalisierung des hochaffinen Methionin Permease, MUP1 wurde 32 überwacht. In Abwesenheit von extrazellulärem Methionin wird MUP1 Expression hochreguliert und die Permease wird an der Plasmamembran zurückgehalten wird; bei Zugabe von Methionin zu dem Medium erfährt MUP1 schnelle Internalisierung und Targeting zur Vakuole 13.
Um die Kinetik der Internalisierung MUP1 überwachen exprimierenden Stämme WT MUP1-GFP oder MUP1-pHluorin aus der genomischen Locus wurden in Abwesenheit von Methionin in Reihenfolge aufgewachsen fluoreszierendes MUP1 an der Plasmamembran (3A, 0 min Zeitpunkt) zu akkumulieren. Zeitraffer-Bildgebung von Zellen wurde dann in 5 min-Intervallen in Abwesenheit oder in Gegenwart von Methionin durchgeführt, um Ladung Internalisierung und Veränderungen in der Fluoreszenz zu überwachen. Wie erwartet, GFP- und pHluorin-tagged MUP1 in Abwesenheit von Methionin abzubildenden blieb an der Plasmamembran foder die gesamte 45 - minütigen Beobachtungszeitraum 20. Im Gegensatz dazu ist in Gegenwart von Methionin abzubildenden Zellen zeigten progressive Verarmung des Fluoreszenzsignals von der Zelloberfläche, die mit Ladungs Internalisierung. Bemerkenswert ist , akkumulierte MUP1-GFP - Fluoreszenz in internen Strukturen (dh Endosomen und die Vakuole), während MUP1-pHluorin internen Tränenpünktchen lokalisiert , die wahrscheinlich zu früh Endosomen entsprechen, war aber nicht in der Vakuole gesehen.
Wenn Fluoreszenz über alle Zeitpunkte für die einzelnen Zellen wurde quantifiziert, MUP1-GFP und MUP1-pHluorin Intensität zeigten wenig Veränderung in der Abwesenheit von von außen angelegten Methionin im Verlauf des 45 min Experiment im Einklang mit dem Protein bleibt an der Plasmamembran stabil lokalisierten (3B). Im Gegensatz dazu verringerte whole-cell-MUP1 pHluorin Intensität rasch in Gegenwart von Methionin, derart, dass eine 50% ige Reduktion in fluorescencE - Intensität wurde nach ca. 20-25 Minuten beobachtet, und eine 80% ige Reduktion wurde nach ca. 40 min 20 beobachtet. MUP1-GFP-Zellen zeigten auch eine Abnahme der Fluoreszenzintensität bei Zugabe von Methionin; jedoch wurden die Kinetiken der Fluoreszenzverlust verzögert im Vergleich zu denen von MUP1-pHluorin, so dass eine 50% ige Abnahme der Intensität erst nach 40 min beobachtet wurde. Wie in 3A zu sehen ist , war MUP1-GFP an der Plasmamembran zu diesem Zeitpunkt kaum nachweisbar, was darauf hinweist , daß persistent vakuolären GFP Fluoreszenz genaue Quantifizierung von endocytischen Ereignissen an der Zelloberfläche verhindert.
Endpunkt - Assays die geregelte endocytic Ladung mit, MUP1
Zusätzlich zur quantitativen kinetischen Assays der Endozytose, wie oben beschrieben, reguliert endocytic cargos wie MUP1 kann auch für Endpunktassays ähnlich Quantifizierung verwendet werden,von Steady-State-STE3-pHluorin Intensität. Zu diesem Zweck wurde der Assay zur Quantifizierung von MUP1-pHluorin Internalisierung modifiziert Vergleich der mittleren Fluoreszenzintensitäten von Populationen von Zellen unmittelbar vor oder 30 min nach der Zugabe von 8,18 Methionin abzubildenden ermöglichen. Dieser Ansatz ermöglicht einen Vergleich des Prozentsatzes der MUP1 internalisiert zwischen WT und endocytic mutanten Zellen.
In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der kinetischen Assay (Abbildung 3) wurde MUP1-pHluorin aus der Plasmamembran in WT - Zellen (4A) schnell aufgebraucht, so dass etwa 60% der MUP1-pHluorin 30 min nach Zugabe von Methionin internalisiert wurde ( Figur 4B). Wie erwartet, war MUP1-pHluorin Internalisierung in 4 + Ent1 Zellen ähnlich effizient, während die Internalisierung deutlich in 4Δ + ENTH1 Zellen reduziert wurde, im Einklang mit einem schweren Defekt an der Endozytose. Hoch Kopie Ausdruckvon ROM1 oder der α-Arrestin LDB19, die für MUP1 Internalisierung sowohl über CME und CIE Pfade 13,18 verbesserte Internalisierung von MUP1-pHluorin, im Einklang mit ihrer Fähigkeit zur Förderung der Endozytose in 4Δ + ENTH1 Zellen 18 speziell erforderlich ist. Bemerkenswert ist , obwohl Steady-State - STE3-pHluorin Intensität in 4Δ + ENTH1 Zellen mit hoher Kopien ROM1 auszudrücken oder LDB19 war nicht zu unterscheiden von WT oder 4Δ + Ent1 Zellen, Internalisierung von MUP1-pHluorin wurde nur teilweise Verbesserung in 4Δ + ENTH1 Zellen mit hoher Kopienzahl exprimiert ROM1 oder LDB19 (4C). Somit zeigen diese Daten, dass die kinetische und / oder Endpunkt-Assays Unterschiede in endozytischen Raten zwischen WT und Mutanten-Stämme für einige cargos offenbaren kann, obwohl ähnliche steady-state Verteilung anderer Frachten kann in den gleichen Stämmen erreicht werden.
Population-based Analyse von MUP1-PHLuorin Internalisierung mit Durchflusszytometrie
Hochdurchsatzanalyse von größeren Zellpopulationen Durchflusszytometrie unter Verwendung kann durch Mikroskopie eine Alternative zur Durchführung kinetischer und Endpunktassays für Ladung Internalisierung bereitzustellen. Zu diesem Zweck wird die Fluoreszenzintensität von MUP1-pHluorin wurde verglichen in WT-Zellen aus einer Kultur, in der Abwesenheit von Methionin (WT -Met, der sollte "hell" sein) gezüchtet oder in Gegenwart von Methionin für 45 min (WT + Met, was sollte "dimmen" im Vergleich zu unbehandelten Zellen auf der Basis der 80% ige Reduktion der Fluoreszenzintensität in 3B zu sehen ist ). Nach der Analyse durch Durchflusszytometrie, ein vertikales Gate mit dem WT + Met Zustand angelegt wurde, wobei ca. 5% der Zellen auf der rechten Seite des Gate enthalten waren, und entsprach den hellsten Zellen innerhalb der Population (5A und 5B , rot Bevölkerung). Wann wurde das gleiche Gateleicht verwendet werden können, zu beobachten, Unterschiede in MUP1-pHluorin Fluoreszenzintensität zwischen den Populationen von Zellen vor und nach Zugabe von Methionin zu dem WT -Met Zustand, fiel in etwa 65% der Zellen in der hellen Kategorie, dass die Durchflusszytometrie zu demonstrieren. Im Gegensatz dazu war die Verteilung von hell im Vergleich zu dim Zellen nicht zu unterscheiden in 4Δ + ENTH1 -Met und + Met Bedingungen das gleiche Tor zum WT + Met Bevölkerung, im Einklang mit defekten Endozytose angewendet werden. So Durchflusszytometrie Veränderungen in der endocytic Kapazität von Zellen detektieren kann, und ermöglicht eine schnelle Analyse von großen Populationen von Zellen. Wichtig ist , Cytometry auch in genetischen Screens als Werkzeug für die Sortierung und Auswahl der mutierten Zellen mit defekten Endozytose (K. Wrasman und B. Wendland, Manuskript in Vorbereitung) 33 verwendet werden , fließen kann.
Abbildung 1:
Abbildung 2:. Lokalisierung und Quantifizierung von STE3-GFP und STE3-pHluorin in Wildtyp und endocytic mutierten Zellen (A) WT, 4Δ + Ent1 und 4Δ + ENTH1 exprimierenden Zellen genomisch STE3-G codiertFP und mit Vektor, High-Kopie ROM1 oder hoher Kopien LDB19 transformiert , wie durch Fluoreszenzmikroskopie (obere Reihe) oder DIC (untere Reihe) sichtbar angegeben wurden. STE3-GFP Bilder wurden eingestellt, um den gleichen maximalen und minimalen Intensitäten direkten Vergleich der STE3 Lokalisierung zu ermöglichen. (B) WT, 4Δ + Ent1 und 4Δ + ENTH1 exprimierenden Zellen genetisch kodierter STE3-pHluorin wurden transformiert und abgebildet wie in Feld A beschrieben. Maßstabsbalken = 2 & mgr; m. (C, D) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität für STE3-GFP (C) und STE3-pHluorin (D) in Platten A und B. Für jede Bedingung wurden Ganzzellfluoreszenz für ein Minimum von 40 Zellen quantifiziert verwendeten Stämme. Die Werte wurden für die Zellgröße korrigiert und in willkürlichen Einheiten (au) als Mittelwert ± SEM ausgedrückt (*** p <0,001 im Vergleich zu WT; ††† p <0,001 im Vergleich zu 4Δ + ENTH1 + Vektor). (E) Relativ-e Expression von STE3-GFP in WT beurteilt, transformiert 4Δ + Ent1 und 4Δ + ENTH1 Zellen mit dem Vektor, LDB19 hoher Kopien ROM1 oder High-Kopie , wie angegeben. Zellextrakte wurden wie zuvor 20 und gleiche Mengen von jeder Probe durch SDS-PAGE aufgetrennt wurden , beschrieben , hergestellt. STE3-GFP-Expression wurde durch Immunoblotting mit anti-GFP-Antikörper untersucht, und die Proteinbeladung wurde anti-GAPDH beurteilt werden. (F) Wildtyp - Zellen exprimieren genomisch codierten STE3-GFP durch Fluoreszenzmikroskopie betrachtet (STE3-GFP - Panel) und DIC Optik, mit einer toten Zelle durch Pfeile angedeutet. Tote Zellen erscheinen autofluoreszenten in der GFP-Filter und sind dunkler, wenn sie von DIC gesehen. Maßstabsbalken = 2 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 3: Kinetische Assays von MUP1-GFP und MUP1-pHluorin Internalisierung (A) Wildtyp - Zellen, die genomisch MUP1-GFP (obere zwei Tafeln) oder MUP1-pHluorin (untere zwei Platten) wurden gezüchtet bis mittleren logarithmischen Phase codiert YNB Medium ohne Methionin MUP1 Expression und -bindung an der Plasmamembran zu induzieren. (- Met) oder Anwesenheit (+ Met) von 20 ug / ml Methionin-Zellen wurden dann durch Fluoreszenzmikroskopie alle 5 min in Abwesenheit abgebildet. Für jeden Zeitpunkt in einem Zustand wurden identische maximale und minimale Intensitätswerte angewendet Vergleich der Fluoreszenzintensität und Lokalisierung zu ermöglichen. 0, 5, 10, 20 und 40 min Zeitpunkte sind für alle Bedingungen, wie angegeben gezeigt. Maßstabsbalken = 2 & mgr; m. (B) Quantifizierung der MUP1-GFP und MUP1-pHluorin Internalisierung in Wildtyp - Zellen von der Platte A. Ganzzellfluoreszenzintensität von MUP1-GFP (- Met, lila Quadrate; + Met, blaue Diamanten) oder MUP1-pHluorin (- Met, grüne Dreiecke; + Met, rote Kreise) wurde für einzelne Zellen in 5-Minuten-Intervallen abgebildet gemessen und ausgedrückt als Prozentsatz der Anfangsfluoreszenzintensität (Mittelwert ± SEM, n = 6 Zellen pro Bedingung). Nachdruck aus Prosser et al. (2010) 20 mit freundlicher Genehmigung des Verlags. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Endpunkt - Assay von MUP1-pHluorin Internalisierung (A) WT, 4Δ + Ent1 und 4Δ + ENTH1 exprimierenden Zellen genomisch MUP1-pHluorin und transformiert mit Vektor, High-Kopie ROM1 oder hoher Kopien LDB19 codiert als bis Mitte angebaut wurden angezeigt -logarithmic Phase in YNB Medium ohne Methionin. Zufallsfelder Zellen wurden durch fluorescenc abzubildenden e Mikroskopie unmittelbar vor (- Met) oder 30 min nach (+ Met) Zugabe von 20 ug / ml Methionin. Alle Bilder wurden auf die gleichen maximalen und minimalen Intensitätswerte eingestellt. Maßstabsbalken = 2 & mgr; m. (B) Quantifizierung der MUP1-pHluorin Internalisierung in Zellen von der Platte A. Für jede Bedingung wurden Ganzzellfluoreszenzintensität für ein Minimum von 40 Zellen und korrigiert für Zellgröße gemessen. Der Anteil der MUP1-pHluorin internalisiert wurde durch einen Vergleich bedeuten Intensitätswerte berechnet vor und nach 30 min Behandlung mit Methionin. (; *** P <0,001 im Vergleich zu WT; † P <0,05 im Vergleich zu 4Δ + ENTH1 + Vektor n = 4) Die Werte sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Diese Zahl wurde von Prosser et al modifiziert. (2015) 18 mit freundlicher Genehmigung des Verlags. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:. Population Analyse von MUP1-pHuorin Internalisierung mittels Durchflusszytometrie (A) WT und 4Δ + ENTH1 Zellen wurden bis Mitte logarithmischen Phase in YNB - Medium Methionin fehlt. (- Met) oder Anwesenheit (+ Met) von 20 ug / ml Methionin für 45 min vor der Analyse durch Durchflusszytometrie Die Zellen wurden dann in Abwesenheit inkubiert. Für jede Bedingung Vorwärtsstreuung (in beliebigen Einheiten, au) wurde gegen die Fluoreszenzintensität aufgetragen (au, ein FITC-Filter) für 1000 Zellen aus insgesamt 10.000 Zellen gemessen. Populationen wurden durch Anlegen eines vertikalen Gate (blauer Pfeil) zu dem WT + Met Zustand analysiert, wobei etwa 5% der hellsten Zellen (in rot dargestellt) auf der rechten Seite des Tores fiel. Die Gating erzeugt für den WT + Met Zustand wurde dann auf die übrigen Bedingungen angewandt Vergleich zu ermöglichenProbenverteilungen. (B) Zusammenfassung der Prozentsatz der dim Zellen (schwarze Punkte, auf der linken Seite des Tores) und hellen Zellen (rote Punkte, auf der rechten Seite des Tores) für WT und 4Δ + ENTH1 ± Met Versuche in Feld A gezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Belastung | Genotyp | Quelle |
| SEY6210 ein | MAT α HIS3-Δ200 TRP1-Δ901 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 suc2-Δ9 | Labor Plasmid |
| BWY2858 | STE3-GFP :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY2995 | STE3-pHluorin :: KANMX6 | PRosser et al. (2010) 16 |
| BWY3036 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3037 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3399 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3400 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3817 | MUP1-GFP :: KANMX6 | PrOsser et al. (2010) 16 |
| BWY3818 | MUP1-pHluorin :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY4153 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| BWY4154 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| a Alle in dieser Studie verwendeten Stämme sind isogene zu SEY6210 außer bei der angegebenen loci. | ||
Tabelle 1: Hefestämme in dieser Studie verwendet.
| Plasmid | Beschreibung | Quelle |
| pRS426 | 2μ URA3 | Sikorski und Hieter 1989 |
| pBW0768 | pRS414 :: ENT1 [CEN TRP1] | pEnt1, Labor-Plasmid |
| pBW0778 | pRS414 :: ent1 (aa1-151) [CEN TRP1] | pENTH1, Labor-Plasmid |
| pBW1571 | pFA6a-pHluorin-KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| pBW2053 | YEp24 :: ROM1 [2μ URA3] | PROM1 (Prosser et al., 2011) 7 |
| pRS426-Ldb19 | LDB19prom-LDB19 [2μ URA3] | Prosser et al. (2015) 15 |
| pFA6a-GFP (S65T) -kanMX6 | pFA6a-GFP-KANMX6, PCR-basierte Integration von Plasmid für die GFP-Tagging in Hefe | Longtineet al. (1998) 21 |
Tabelle 2: Die Plasmide in dieser Studie verwendet.
| Zeit (min) | Maßnahme (n) |
| -5 | Bild Probe 1 (Met) |
| 0 | Hinzufügen Methionin Probe 1 |
| Bild Probe 2 (-Met) | |
| 5 | Hinzufügen Methionin 2 abzutasten |
| Bild Probe 3 (Met) | |
| 10 | Hinzufügen Methionin 3 abzutasten |
| Bild Probe 4 (Met) | |
| 15 | In Methionin 4 zur Probe |
| Bild Probe 5 (Met) | |
| 20 | HinzufügenMethionin 5 zur Probe |
| Bild Probe 6 (Met) | |
| 25 | In Methionin 6 zur Probe |
| Bild Probe 7 (Met) | |
| 30 | In Methionin 7 zur Probe |
| Bild Probe 8 (Met) | |
| Bild Probe 1 (+ Met) | |
| 35 | In Methionin 8 Probe |
| Bild Probe 2 (+ Met) | |
| 40 | Bild Probe 3 (+ Met) |
| 45 | Bild Probe 4 (+ Met) |
| 50 | Bild Probe 5 (+ Met) |
| 55 | Bild Probe 6 (+ Met) |
| 60 | Bild Probe 7 (+ Met) |
| 65 | Bild Probe 8 (+ Met) |
Tabelle 3: Beispiel-Workflow für Staffelung 8 MUP1-pHluorin Endpunkt-Assays.
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Discussion
Anwendungen von pHluorin zur Quantifizierung von endocytischen Ereignisse in Hefezellen macht von Transmembran- cargos in der die fluoreszierende Markierung an den zytoplasmatischen Schwanz des Proteins (1A) fusioniert ist. Für die Tests hier beschriebenen Frachten sind hell fluoreszierende, wenn die pHluorin Tag neutralen Umgebungen ausgesetzt ist, aber abgeschreckt werden, wenn die pHluorin Tag sauren Bedingungen trifft. So a pHluorin-markierte endocytic Ladung leicht an der zytoplasmatischen Gesicht der Plasmamembran detektiert und auf frühe Endosomen, aber "dim", wenn sie in luminalen MVB Bläschen oder bei der Lieferung an die Vakuole Lumen eingebaut wird. In der Regel neu synthetisierten endocytic Frachten wahrscheinlich Endoplasmatischen Retikulum (ER) verlassen und in die Plasmamembran vor GFP erreichen und viele seiner Varianten voll ausgereift sind; Somit cargos-pHluorin markiert, die noch nicht an die Zelloberfläche erreicht wird vorhergesagt, nicht detektierbar zu bleiben, es sei denn Austritt aus dem ER oder Golgi i istmpaired.
Verwendung pHluorin-tagged endocytic cargos wie STE3 und MUP1 wurde in den Hefe - CIE - Weg (1B) 8,18 beteiligt Charakterisierung einer Anzahl von Proteinen erleichtert. Genauer gesagt, der in dieser Veröffentlichung beschriebenen Verfahren verwendet wurden mit Defekten in CME 8 auf, die erhöhte Produktion des Aktin-modulierende GTPase Rho1 und seine GEF Rom1 fördern Endozytose in einer Vielzahl von Hefemutanten zu demonstrieren. Darüber hinaus wurden pHluorin-getaggt Frachten vor kurzem , dass α-Arrestine quantitativ zu demonstrieren verwendet, die haben gut etablierte Rolle in der CME 13-15,34-36, Fracht selektive Rollen sowohl in der CME und CIE und haben mechanistisch unterschiedliche Funktionen spielen in den beiden Bahnen 18.
Für die Protokolle in diesem Papier dargelegt, mehrere wichtige Faktoren sollten berücksichtigt werden, um zu erhalten, konsistente, quantitative Ergebnisse. Zunächst MUP1-GFP oder MUP1-pHluorin Expression und Fluores-zenz abnehmen kann, wenn Hefezellen nähern oder die stationäre Wachstumsphase (nicht veröffentlichte Ergebnisse) eingeben; So wird aus einer Übernachtkultur gezüchtete Zellen sollte verdünnt werden, und für weitere 3 h (siehe Schritte 3,1-3,2 und 6,1-6,2)-re gezüchtet. Darüber hinaus, wenn mehrere experimentelle Bedingungen oder Dehnungen in Endpunkt-Assays oder für die Analyse durch Durchflusszytometrie Staffelung ist es wichtig, Daten für alle Proben nach der gleichen Dauer von Methionin Behandlung zu sammeln, um Vergleiche zwischen den individuellen Gegebenheiten zu ermöglichen. Für Post-Akquisitions-Analyse sollte Quantifizierung durchgeführt werden, um 16-Bit-Bilder verwenden, da Umwandlung in 8-Bit-Format zu Datenverlust führt, der die Fluoreszenzintensität Werte beeinflussen können. Außerdem sollte Hintergrundsubtraktion (Schritt 5.3) vor der Quantifizierung durchgeführt werden, da das Hintergrundsignal wesentlich Intensitätsunterschiede zwischen den Proben okkludieren kann.
Während pHluorin-getaggt STE3 und MUP1 haben zugänglich Quantifizierung bewiesen, nichtalle Frachten werden pHluorin Tagging gut geeignet sein. Zum Beispiel versucht, den α-Faktor-Rezeptor Ste2 ergeben haben inkonsistent quantitative Ergebnisse zu markieren, möglicherweise aufgrund einer geringeren Fluoreszenzintensität von Ste2-pHluorin im Vergleich zu der STE3 oder MUP1 (nicht veröffentlichte Ergebnisse), obwohl es möglich ist, dass Tandem pHluorin Tags verbessern könnte die Signalintensität. Zusätzlich cargos mit sehr langsamen Raten von Liganden-induzierte Endozytose sein kann nicht zugänglich pHluorin zur Quantifizierung etikettieren, vor allem, wenn die Halbwertszeit der Internalisierung ist länger als die Hefezelle Zyklus (ca. 90 min). Für solche cargos könnte eine Abnahme der Fluoreszenz ergeben sich aus Endocytose und / oder aus Unterteilung der Fracht zwischen Mutter- und Tochterzellen bei der Zellteilung. So testet einzelne Frachten von Interesse empfohlen, um zu bestimmen, ob ihre Expression und Kinetik geeignet sind für pHluorin-Tagging und Quantifizierung.
Obwohl die jüngsten Studien unter Verwendung von PHLuorin konzentriert sich hauptsächlich auf endocytic Ereignisse an der Plasmamembran, pHluorin-markierte Frachten können später Handel Ereignisse zu studieren im endocytischen verwendet werden. Zum Beispiel hat MUP1-pHluorin wurde in Durchflusszytometrie basierenden Assays von ESCRT-vermittelter Ladungs Sortierung in MVBs 37, da die pHluorin tag gequencht wird beim Einarbeiten in MVB luminalen Vesikel 20 erfolgreich eingesetzt. Dieser Ansatz ist ähnlich wie die in jüngerer Zeit beschriebenen Luciferase - Reporter der intraluminale Ablagerung (LUCID) Assay, der ein Biolumineszenz - Signal in Gegenwart von 38,39 Verwendung von Frachten mit einem zytoplasmatische Luciferase - Tag macht Luciferin zu erzeugen. Ähnlich wie bei der Abschreckung pHluorin Fluoreszenz bei der Einarbeitung in MVB luminalen Vesikeln, Biolumineszenz im LUCID Test wird bei der Gründung der Luciferase-Tag in MVB Vesikel gedämpft. Während pHluorin und LUCID Assays konzeptionell ähnlich sind, können pHluorin-markierte Frachten eingesetzt werden Endozytose und MVB Reifung zu studieren in intakten Zellen.
Alternative Methoden existieren für die Quantifizierung der Endozytose, und haben in Wildtyp und endocytic mutierten Zellen wertvolle Informationen über die Preise der Ladung Internalisierung zur Verfügung gestellt. Beispiele umfassen die Überwachung Aufnahme von radiomarkiertem Liganden, wie α-Faktor (das dem Pheromon - Rezeptor bindet Ste2) und Uracil 40,41 oder Überwachung der Geschwindigkeit des Abbaus für endozytische cargos wie STE3 (die durch die Permease Fur4 internalisiert wird) , wie sie internalisiert und 42 zur Vakuole transportiert. Diese biochemischen Ansätze erfordern Zelllyse, und sind daher nicht geeignet für die direkte Quantifizierung in lebenden Zellen. Alternativ fluoreszenz α-Faktor markiert, um das Fluid-Phase Farbstoff Lucifer Yellow, oder die Styrylfarbstoffs FM4-64 verwendet werden können Endozytose in lebenden Zellen sichtbar zu machen, aber nicht zulassen , eine direkte Überwachung von endogen exprimierten Proteine Fracht 40,43,44. Für diese Ansätze, Persistenz der Fluoreszenz im vacuole Lumen kann Quantifizierung erschweren, wie mit GFP gesehen. Es ist auch möglich GFP-markiertes cargos zur Quantifizierung von Endozytose zu verwenden, indem Ganzzellfluoreszenzintensität zu messen und das Signal von cytoplasmatischen und endosomalen / vakuolären Kompartimente Subtrahieren; jedoch Endosomen und Vakuolen sind oft in unmittelbarer Nähe der Plasmamembran. Im Gegensatz dazu sind pHluorin-tagged endocytic Frachten in MVB / Vakuole Fächer abgeschreckt, die einen deutlichen Vorteil für die Quantifizierung des Handels Ereignisse im Vergleich zu den mehr verbreiteten GFP-Tag sein kann. Unsere zukünftigen Studien wird nach heutigem Kenntnisstand von endocytic Wege und Frachtsortierung in Hefe erweitern zusätzliche Faktoren zu identifizieren, die CME und CIE beitragen, und die Mechanismen zu verstehen, die Fracht-Sortier Entscheidungen regeln.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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