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Biology

मात्रात्मक, काइनेटिक और उच्च throughput नवोदित खमीर में endocytosis के विश्लेषण के लिए pHluorin के आवेदन

Published: October 23, 2016 doi: 10.3791/54587
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biology, The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

Abstract

हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और इसके वेरिएंट को व्यापक रूप से प्रोटीन स्थानीयकरण और इस तरह cytoskeletal remodeling और जीवित कोशिकाओं में vesicular तस्करी के रूप में की घटनाओं की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उपकरणों का इस्तेमाल कर रहे हैं। कैमेरिक GFP fusions का उपयोग कर मात्रात्मक तरीके में कई अनुप्रयोगों के लिए विकसित किया गया है; हालांकि, कुछ हद तक GFP प्रोटियोलिसिस के लिए प्रतिरोधी है, इस प्रकार अपने प्रतिदीप्ति lysosome / रिक्तिका, जो endocytic मार्ग में माल की तस्करी की मात्रा का ठहराव बाधित कर सकते हैं में बनी रहती है। endocytosis और बाद endocytic की तस्करी की घटनाओं बढ़ाता के लिए एक वैकल्पिक तरीका superecliptic pHluorin, GFP की एक पीएच के प्रति संवेदनशील संस्करण है कि अम्लीय वातावरण में बुझती है का उपयोग करता है। Multivesicular निकायों (MVBs) और lysosome / रिक्तिका लुमेन के लिए वितरण में माल के समावेश पर प्रतिदीप्ति की एक dampening में transmembrane कार्गो प्रोटीन परिणामों के cytoplasmic पूंछ को pHluorin की chimeric संलयन। इस प्रकार, vacuolar प्रतिदीप्ति का शमन quantifi की सुविधाendocytosis और endocytic मार्ग में प्रारंभिक घटनाओं के केशन। इस पत्र के माध्यम से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी endocytosis की मात्रा का ठहराव के लिए pHluorin टैग cargos का उपयोग तरीकों, साथ ही जनसंख्या के आधार पर assays के प्रवाह cytometry का उपयोग का वर्णन करता है।

Introduction

Vesicular की तस्करी organelle पहचान और कोशिकाओं में समारोह को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और व्यक्तिगत सेलुलर डिब्बों में से प्रोटीन और झिल्ली रचना को विनियमित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र है। प्लाज्मा झिल्ली में, exocytic पुटिकाओं के विलय, कोशिका की सतह पर नए प्रोटीन और झिल्ली बचाता है जबकि endocytosis के माध्यम से उत्पन्न पुटिकाओं बाद रीसाइक्लिंग या lysosome को लक्षित करने के लिए सतह से झिल्ली और प्रोटीन को हटा दें। इस प्रकार, endocytosis पोषक तत्व तेज करने के लिए और बाह्य वातावरण के लिए प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है। Exocytosis और endocytosis प्लाज्मा झिल्ली सतह क्षेत्र को विनियमित करने के लिए, और क्षतिग्रस्त प्रोटीन के कारोबार की अनुमति देने के लिए संतुलित कर रहे हैं।

खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में अध्ययन एन की एक किस्म के जवाब में endocytosis में शामिल प्रोटीन की एक बड़ी संख्या है, साथ ही कई endocytic मार्ग है कि विशिष्ट cargos के internalization को बढ़ावा देने या कि अधिनियम की पहचान की हैvironmental की स्थिति। सबसे अध्ययन मार्ग क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis (सीएमई), जिसमें क्लैथ्रिन और साइटोसोलिक गौण प्रोटीन एक कोट संरचना में इकट्ठा नवजात endocytic पुटिका को स्थिर करने के लिए है। नवोदित खमीर में प्रयोगों की गतिशीलता और कई endocytic प्रोटीन 1-3 के लिए भर्ती के आदेश में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि मिले हैं। विशेष रूप से, सीएमई मशीनरी अत्यधिक विकास के माध्यम से संरक्षित है कि इस तरह के खमीर में सीएमई से संबंधित प्रोटीन का बहुमत मानव orthologs है; इस प्रकार, नवोदित खमीर endocytosis के तंत्र है कि उच्च eukaryotes में संरक्षित कर रहे हैं समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण किया गया है। उदाहरण के लिए, नवोदित खमीर का उपयोग अध्ययन है कि गठन और सीएमई संरचनाओं की परिपक्वता (खमीर के रूप में cortical actin पैच करने के लिए कहा गया है) कई प्रोटीन के अनुक्रमिक भर्ती शामिल है, क्लैथ्रिन और कार्गो बाध्यकारी एडाप्टर प्रोटीन के साथ शुरुआत, अतिरिक्त endocytic सहायक की भर्ती के द्वारा पीछा चुना गया प्रोटीन,Arp2 / 3 की मध्यस्थता actin polymerization की सक्रियता, और पुटिका तराश 1,2 में शामिल प्रोटीन की भर्ती। सीएमई मशीनरी प्रोटीन की भर्ती actin पैच cortical करने के लिए एक उच्च आदेश दिया और टकसाली प्रक्रिया है, और कई प्रोटीन के लिए भर्ती की सटीक आदेश सीएमई मशीनरी के अन्य घटकों के लिए सम्मान के साथ स्थापित किया गया है। महत्वपूर्ण बात है, हाल के अध्ययनों स्तनधारी कोशिकाओं 4 में क्लैथ्रिन लेपित गड्ढ़े में सीएमई प्रोटीन के लिए भर्ती की एक ऐसी ही आदेश की पुष्टि की है।

सीएमई के अलावा, कई प्रकार की कोशिकाओं में एक या अधिक क्लैथ्रिन स्वतंत्र endocytic (सीआईई) रास्ते कि वैकल्पिक तंत्र पर भरोसा प्लाज्मा झिल्ली 5-7 से पुटिका गठन और internalization बढ़ावा देने के लिए मेरे पास है। खमीर में, हम हाल ही में एक सीआईई मार्ग है कि छोटे GTPase Rho1 और उसके सक्रिय गुआनिन न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारक (जीईएफ), Rom1 8,9 इस्तेमाल की पहचान की। Rho1 actin polymerization 1 बढ़ावा देने के लिए formin Bni1 को सक्रिय करता है0,11, जो खमीर 12 में क्लैथ्रिन स्वतंत्र endocytosis के इस फार्म के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, प्रोटीन की α-arrestin परिवार यूबीक्यूटिन ligase Rsp5 सीएमई 13-17 के माध्यम से माल ubiquitination और बाद में internalization बढ़ावा देने के लिए, और भी सीआईई 18 में शामिल प्रोटीन के साथ सीआईई मार्ग के माध्यम से माल internalization को बढ़ावा देने, संभवतः प्रत्यक्ष बातचीत के माध्यम से भर्ती। सीआईई रास्ते की एक किस्म भी क्लैथ्रिन स्वतंत्र और phagocytic मार्ग है कि Rho1 ortholog, RhoA 9,19 पर भरोसा सहित स्तनधारी कोशिकाओं में मौजूद हैं। स्तनधारी सीआईई में RhoA की भूमिका खराब समझा जाता है; इस प्रकार, नवोदित खमीर में अध्ययन के अतिरिक्त यंत्रवत अंतर्दृष्टि है कि स्तनधारी सीआईई करने के लिए लागू कर रहे हैं प्रदान कर सकता है।

endocytic घटनाओं की सटीक मात्रा का ठहराव endocytosis को विनियमित करने में विशिष्ट प्रोटीन की भूमिकाओं के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं, और कार्गो internalization या प्रोग्राम पर परिवर्तन के प्रभाव प्रकट कर सकते हैंendocytic मार्ग के माध्यम से एन। इस प्रयोजन के लिए, जैव रासायनिक तरीकों ligand तेज नजर रखने के लिए या endocytic कार्गो प्रोटीन की गिरावट की दर को मापने के लिए उपयोग किया जा सकता है। जीवित कोशिकाओं में, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और ब्याज की cargos के लिए उसके संस्करण के विलय माल परिवहन के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है। हालांकि, GFP टैग cargos endocytosis की मात्रा का ठहराव के लिए सीमित उपयोग के हैं क्योंकि GFP (खमीर में या रिक्तिका) लाइसोसोम में गिरावट के लिए प्रतिरोधी है। इसके अलावा, GFP प्रतिदीप्ति केवल आंशिक रूप से पीएच में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है, और 20,21 लुमेन रिक्तिका भीतर detectable बनी हुई है। नतीजतन, GFP टैग की प्रतिदीप्ति रिक्तिका में बनी रहती है लंबे समय के बाद माल के शेष अपमानित किया गया है, और माल तीव्रता के पूरे सेल आधारित मात्रा का ठहराव रिक्तिका में लंबी अवधि GFP प्रतिदीप्ति के कारण गलत हो सकता है।

आदेश vacuolar GFP प्रतिदीप्ति की खामियों को दूर करने के लिए हम पहले से superecliptic पीएच का इस्तेमाल कियाluorin, GFP की एक पीएच के प्रति संवेदनशील संस्करण है कि तटस्थ पीएच पर चमकते fluoresces, लेकिन इस तरह के कोटर / 20,22,23 lysosome के लुमेन के रूप में अम्लीय वातावरण में प्रतिदीप्ति खो देता है। Endocytic cargos के cytoplasmic पूंछ पर एक pHluorin टैग लगाना प्लाज्मा झिल्ली में है और जल्दी endosomes, जहां pHluorin टैग कोशिका द्रव्य (चित्रा 1 ए) के संपर्क में रहता है पर cargos के दृश्य परमिट। जल्दी endosomes परिपक्व, endosomal छँटाई जटिल पुटिकाओं कि इंडो सोम की लुमेन में कली में परिवहन (ESCRT) मशीनरी संकुल सतह स्थानीय cargos के लिए आवश्यक है, पैदा Multivesicular निकायों (MVBs) के रूप में 24। cargos कि आंतरिक MVB पुटिकाओं में शामिल किया गया है, pHluorin टैग पुटिका लुमेन की ओर चेहरे। आंतरिक MVB पुटिकाओं अम्लीय कर रहे हैं; इस प्रकार, pHluorin टैग cargos जल्दी endosomes पर प्रतिदीप्ति खो के रूप में वे MVBs 20 में परिपक्व। रिक्तिका साथ MVB के बाद संलयन MVB ल्यूमिनल सामग्री बचाता हैगिरावट के लिए, और pHluorin टैग रिक्तिका लुमेन के अम्लीय वातावरण में बुझती रहते हैं।

इस पत्र में खमीर cytoplasmic pHluorin टैग के साथ cargos का उपयोग कर मात्रात्मक endocytic assays के विस्तृत विवरण प्रदान करता है। pHluorin टैग cargos व्यक्त तनाव, काइनेटिक और / या समापन बिंदु assays में इस्तेमाल किया जा सकता गुण और तस्करी विशिष्ट माल के व्यवहार पर निर्भर करता है। इसके अलावा, कुछ pHluorin टैग cargos से फ्लो सहित उच्च throughput विश्लेषण के तरीकों, के लिए उत्तरदायी हैं। महत्वपूर्ण बात है, pHluorin टैग, जीवित कोशिकाओं में endocytic घटनाओं का अध्ययन endocytosis और जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों में endocytic समारोह की तुलना की मात्रा का ठहराव की अनुमति के लिए एक बहुमुखी उपकरण है।

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Protocol

1. समाधान और मीडिया

  1. स्टॉक के बाद, मीडिया और प्लेटें तैयार:
    1. 10x YNB तैयार करते हैं, पानी का 1 एल में अमीनो एसिड की कमी खमीर नाइट्रोजन बेस के 67 ग्राम भंग। एक 0.22 माइक्रोन nitrocellulose फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा जीवाणुरहित।
    2. 2% डेक्सट्रोज (एक बाँझ 50% w / वी स्टॉक से) और 1x अमीनो एसिड / पोषक तत्व मिश्रण के साथ (10x स्टॉक से) 1x YNB का उपयोग कर YNB मध्यम तैयार (100x स्टॉक से, कदम 1.1.4 देखें)। प्लाज्मिड चयन के लिए, अलग-अलग अमीनो एसिड या पोषक तत्वों के रूप में जरूरत न आना। Mup1 अभिव्यक्ति की प्रेरण के लिए, इसके अतिरिक्त अमीनो एसिड / पोषक तत्व मिश्रण से methionine न आना।
    3. (एक बाँझ 50% w / वी स्टॉक से) (10x स्टॉक से) 1x YNB का उपयोग कर YNB प्लेटें, 2% डेक्सट्रोज तैयार करें, 0.7 ग्राम / एल अमीनो एसिड / पोषक तत्व मिश्रण (कदम 1.1.5 देखें) और 2.5% अगर। अगर की 25 ग्राम और पानी की 860 मिलीलीटर प्रति अमीनो एसिड / पोषक तत्व मिश्रण के 0.7 ग्राम autoclaving द्वारा प्लेट के माध्यम से तैयार। मिश्रण 55 डिग्री सेल्सियस को शांत करने के लिए, तो जोड़ 40 100 10x YNB मिलीलीटर और अनुमति दें मिलीलीटर ओएफ 50% ग्लूकोज। , प्लेट (प्रति 10 सेमी पकवान माध्यम के लगभग 30 मिलीलीटर) डालो मध्यम कमरे के तापमान पर जमना करने की अनुमति, और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान प्लेटें।
    4. विआयनीकृत पानी की 100 मिलीलीटर में निम्नलिखित भंग द्वारा (तरल माध्यम के लिए) 100x अमीनो एसिड / पोषक तत्व शेयर समाधान तैयार: 0.1 जी एल methionine, 0.3 ग्राम एल leucine और एल लाइसिन, और 0.2 ग्राम एल हिस्टिडीन में से प्रत्येक के प्रत्येक , एल tryptophan, एडेनाइन और uracil (अन्य अमीनो एसिड और पोषक तत्वों के रूप में विशिष्ट उपभेदों के लिए आवश्यक शामिल किया जा सकता है)। कोमल गर्मी का प्रयोग करें अगर भंग करने की जरूरत है, और एक 0.45 माइक्रोन nitrocellulose फिल्टर के माध्यम से बाँझ। प्रकाश से सुरक्षा के साथ कमरे के तापमान पर स्टोर। प्लाज्मिड चयन के लिए जरूरत के रूप में विशिष्ट घटकों की कमी स्टॉक समाधान तैयार करते हैं।
    5. संयोजन से अमीनो एसिड / पोषक तत्व मिश्रण (प्लेटों के लिए) तैयार निम्नलिखित हैं: adenine की 0.5 ग्राम, एल leucine की 4 जी और 2 जी एल हिस्टिडीन, एल Lysine, एल methionine, एल tryptophan के प्रत्येक, एल tyrosine और uracil। एक मोर्टार और मूसल के साथ मिलाकर पीस लें, और समर्थक के साथ स्टोरप्रकाश से tection। प्लाज्मिड चयन के लिए, जरूरत के रूप में विशिष्ट घटकों की कमी के मिश्रण तैयार है, और प्रति प्लेट मध्यम (कदम 1.1.3 देखें) की लीटर एमिनो एसिड के मिश्रण के 0.7 ग्राम का उपयोग करें।
  2. कोटिंग concanavalin एक (conA) के साथ स्लाइड की सतह से माइक्रोस्कोपी के लिए 8 अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड तैयार करें। चैम्बर स्लाइड के प्रत्येक अच्छी तरह से, पानी में भंग 2 मिलीग्राम / एमएल conA के 25 μl जोड़ें। एक विंदुक टिप का उपयोग करना, अच्छी तरह से नीचे सतह भर conA फैला है, तो कम से कम 4-8 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर शुष्क हवा के लिए स्लाइड अनुमति देते हैं। आदर्श रूप में, conA कोटिंग के 24 घंटा के भीतर कक्ष स्लाइड का उपयोग करें।
  3. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित एकीकरण विधि Longtine एट अल में वर्णित का उपयोग ब्याज की endocytic माल को GFP या pHluorin के फ्रेम में fusions के साथ खमीर उपभेदों उत्पन्न करता है। और गोल्डस्टीन और McCusker 25,26।
    नोट: pHluorin केनामाइसिन के लिए प्रतिरोध जीन (KANMX6) और nourseothricin साथ कैसेट टैगिंग युक्त plasmids ( 20 में वर्णित किया गया।
    1. बढ़ाना जीनोमिक एकीकरण 20,25 की साइट के लिए विशिष्ट अतिरिक्त दृश्यों से युक्त प्राइमरों के साथ चयन मार्कर युक्त GFP या pHluorin कैसेट।
    2. लिथियम एसीटेट विधि का उपयोग कर वांछित 27 खमीर तनाव में जिसके परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पाद रूपांतरण।
    3. उचित दवा युक्त YPD प्लेटों पर कोशिकाओं बढ़ रही द्वारा कैसेट के एकीकरण के लिए चयन करें। प्लेटें, आटोक्लेव 10 ग्राम खमीर निकालने, 20 ग्राम peptone, 0.1 ग्राम नियासिन और 960 मिलीलीटर पानी में 25 ग्राम अगर तैयार करने के लिए। प्लेटों डालने का कार्य करने से पहले, मिश्रण 55 डिग्री सेल्सियस को शांत करने के लिए है, तो या तो ग्लूकोज और KANMX6 चयन के लिए 200 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए G418, या के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए nourseothricin 40 मिलीलीटर 50% की जोड़ने की अनुमति NATMX4 चयन।
    4. पीसीआर द्वारा GFP या अलग-अलग कॉलोनियों में pHluorin टैग के एकीकरण की पुष्टि करें और / या पश्चिमी सोख्ता विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग,साथ ही साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 20 द्वारा टैग प्रोटीन का पता लगाने के द्वारा।
      नोट: विशिष्ट खमीर तनाव और इस अध्ययन में इस्तेमाल plasmids क्रमश: टेबल्स 1 और 2 में सूचीबद्ध हैं।

2. अनिवार्यता से भली भाँति endocytic कार्गो स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति के लिए समापन बिंदु परख

  1. अमीनो एसिड या पोषक तत्वों के रूप में (यदि लागू हो) प्लाज्मिड रखरखाव के लिए आवश्यक कमी YNB माध्यम के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं (~ 3 छोटी कालोनियों) टीका लगाना। कोशिकाओं 250 rpm झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय मिलाते इनक्यूबेटर में 16-24 घंटे के लिए आगे बढ़ें। वैकल्पिक रूप से, लकीर एक ~ 1-2 मिमी एक YNB प्लेट अमीनो एसिड या प्लाज्मिड चयन के लिए पोषक तत्वों की कमी पर कोशिकाओं की कॉलोनी और कोशिकाओं को रातोंरात 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है।
  2. प्रत्येक रात संस्कृति एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करने का घनत्व (600 आयुध डिपो) को मापने। अमीनो एसिड या पीएलए के लिए पोषक तत्वों की कमी YNB माध्यम में 0.35-0.4 आयुध डिपो 600 / मिलीलीटर में एक 5 मिलीलीटर कमजोर पड़ने को तैयारस्मिड रखरखाव, और झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 3 घंटे के लिए बढ़ता है। यदि कोशिकाओं का उपयोग कर एक प्लेट पर रेखादार, इस कदम को छोड़ और कदम 2.4 (देखें नीचे) के साथ आगे बढ़ें।
  3. कोशिकाओं के घनत्व (600 आयुध डिपो), जो अब 0.6-1.0 आयुध डिपो 600 / एमएल के बीच होना चाहिए उपाय। 2 मिनट के लिए 8,000 आरपीएम (6800 XG) पर गोली कोशिकाओं को एक microfuge ट्यूब संस्कृति के 1.5 मिलीलीटर, और हस्तांतरण। सतह पर तैरनेवाला के 1,475 μl निकालें।
  4. एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के लिए कोशिकाओं लाओ। प्रत्येक नमूना इमेजिंग से पहले, शेष माध्यम से कोशिकाओं resuspending द्वारा एक स्लाइड तैयार है, और एक कवर पर्ची के तहत सेल निलंबन के 3 μl माउंट। वैकल्पिक रूप से, 8 अच्छी तरह से चैम्बर स्लाइड के रूप में प्रोटोकॉल 3 में नीचे वर्णित है, प्लाज्मिड चयन के लिए उचित रूप YNB माध्यम का उपयोग कर तैयार करते हैं। आदर्श रूप में, एक 100X, 1.4 या उच्चतर संख्यात्मक एपर्चर (एनए) तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस, एक 12 या 16-बिट कैमरा, और / उत्तेजना उत्सर्जन फिल्टर के साथ छवि कोशिकाओं GFP प्रतिदीप्ति के लिए अनुकूलित।
    नोट: कोशिकाओं का उपयोग ओ streaking से बड़े हो गए हैंna थाली, एक कवर पर्ची पर ताजा YNB माध्यम के 3 μl रखकर स्लाइड तैयार करते हैं। एक विंदुक टिप का उपयोग करना, थाली से कोशिकाओं के एक छोटे कॉलोनी इकट्ठा YNB माध्यम में कोशिकाओं को फैलाने, और इमेजिंग से ठीक पहले एक गिलास स्लाइड पर जिसके परिणामस्वरूप निलंबन माउंट।
  5. छवि हर हालत के लिए कोशिकाओं के 4-6 यादृच्छिक क्षेत्रों, एक प्रयोग के भीतर सभी छवियों के लिए एक ही अधिग्रहण के मानकों (यानी, फिल्टर सेट और जोखिम समय) का उपयोग।
    नोट: प्रत्येक क्षेत्र के लिए एक brightfield या डीआईसी छवि एकत्रित कोशिकाओं जहां pHluorin संकेत MVB और vacuolar डिब्बों में बुझती है के लिए उपयोगी हो सकता है।
  6. हर हालत के लिए कम से कम 30-50 कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता यों (5 प्रोटोकॉल देखें)।

3. cargos के endocytosis की मात्रा का ठहराव के लिए काइनेटिक परख है कि नियमित endocytosis गुजरना

  1. YNB माध्यम के 5 मिलीलीटर में खमीर कोशिकाओं (कॉलोनी प्रति व्यास में लगभग 2 मिमी) के 2-3 कालोनियों टीका लगाना methionine कमी और जोड़नेitional अमीनो एसिड या प्लाज्मिड चयन को बनाए रखने के लिए पोषक तत्वों। झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 16-24 घंटे के लिए संस्कृतियों के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: इस पत्र में, विनियमित endocytic कार्गो प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल methionine permease, Mup1 का प्रयोग करना होगा। (उदाहरण के लिए, Fur4 permease uracil, जो uracil के अभाव में प्लाज्मा झिल्ली में जम जाता है, और जवाब में internalizes बाहर से लागू करने के लिए uracil) अन्य cargos कि विनियमित endocytosis गुजरना भी pHluorin साथ टैगिंग के लिए उपयुक्त हैं; इन cargos के लिए, मीडिया की स्थिति है कि माल के लिए विशिष्ट अभिव्यक्ति, प्रेरण और internalization की स्थिति को प्रतिबिंबित करने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए।
  2. प्रत्येक रातोंरात संस्कृति का घनत्व (600 आयुध डिपो) उपाय इमेजिंग से पहले लगभग 3 घंटा। प्लाज्मिड रखरखाव के लिए methionine और अतिरिक्त अमीनो एसिड या पोषक तत्वों की कमी YNB माध्यम में 0.35-0.4 आयुध डिपो 600 / मिलीलीटर में एक 5 मिलीलीटर कमजोर पड़ने को तैयार है, और झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है।
  3. पूर्व संतुलित माइक्रो3.2 कदम के 3 घंटा ऊष्मायन के दौरान 30 डिग्री सेल्सियस के पर्यावरण कक्ष या गर्म मंच (यदि उपलब्ध हो) सामना।
  4. स्थानांतरण 2 मिनट के लिए 8,000 आरपीएम (6800 XG) पर एक microfuge ट्यूब सेल संस्कृति के 1 मिलीलीटर, और गोली कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला के 975 μl निकालें।
  5. इमेजिंग (प्रोटोकॉल 1.2) के लिए एक conA इलाज, 8 अच्छी तरह से गिलास तली चैम्बर स्लाइड तैयार करें।
  6. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए प्लाज्मिड चयन के लिए methionine और अतिरिक्त अमीनो एसिड या पोषक तत्वों की कमी YNB माध्यम के 200 μl जोड़ें। शेष सतह पर तैरनेवाला में 3.4 कदम से सेल गोली Resuspend, और अच्छी तरह से प्रत्येक के केंद्र में सेल निलंबन के 2.5 μl ड्रॉप। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से की सतह भर में कोशिकाओं को फैलाने, और कोशिकाओं 5-10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  7. एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी 30 डिग्री सेल्सियस (3.3 कदम देखें) equilibrated पर चैम्बर स्लाइड रखें। brightfield रोशनी का उपयोग कोशिकाओं के एक क्षेत्र का पता लगा।
  8. 100 माइक्रोग्राम / एमएल methionine युक्त YNB माध्यम के 50 μl जोड़ेकुएं में मध्यम के 200 μl (30 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म) 20 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम methionine एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। आदेश में नीचे से चल से कोशिकाओं को रोकने में अच्छी तरह से मध्यम में खलल न डालें से बचें।
  9. कोशिकाओं इमेजिंग की शुरुआत से पहले 2 मिनट के लिए संतुलित करने की अनुमति दें। इसके तत्काल बाद पहली छवि पर कब्जा करने से पहले, वांछित फोकल हवाई जहाज़ के लिए माइक्रोस्कोप समायोजित (आमतौर पर, एक भूमध्यरेखीय फोकल हवाई जहाज़ के लिए सबसे अच्छा काम करता है)।
  10. 45-60 मिनट के लिए 5 मिनट के अंतराल पर GFP और brightfield (या डीआईसी) छवियों का मोल, एक समय श्रृंखला के भीतर सभी छवियों के लिए, 100X 1.4 एनए तेल विसर्जन उद्देश्य और 500 मिसे अधिग्रहण के समय के समान अधिग्रहण मापदंडों का उपयोग (उदाहरण के लिए GFP फिल्टर का उपयोग कर, 100 मिसे अधिग्रहण समय डीआईसी फिल्टर का उपयोग)।
    नोट: माइक्रोस्कोप के मंच और इमेजिंग सॉफ्टवेयर फोकल हवाई जहाज़ बहाव का स्वत: सुधार के लिए अनुमति नहीं देते हैं, तो इसे मैन्युअल फोकस प्रत्येक इमेजिंग समय बिंदु से पहले बदल डालना करने के लिए आवश्यक हो सकता है। इसके अलावा, अधिग्रहण बार होगारोशनी और फिल्टर में मतभेद के कारण माइक्रोस्कोप के बीच भिन्नता है, और इष्टतम स्थितियों मैन्युअल प्रयोग शुरू करने से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए। एक endocytic Mup1 के अलावा अन्य माल प्रयोग किया जाता है, तो यह है कि माल के internalization कैनेटीक्स प्रतिबिंबित करने के लिए, अधिग्रहण के समय और इमेजिंग अंतराल, साथ ही प्रयोग की अवधि को संशोधित करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  11. हर समय बिंदु पर व्यक्ति की कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता यों (5 प्रोटोकॉल देखें), और पहली छवि की प्रारंभिक तीव्रता का एक प्रतिशत के रूप में मान व्यक्त करते हैं।

4. endocytic Cargos की मात्रा का ठहराव के लिए समापन बिंदु परख है कि नियमित endocytosis गुजरना

  1. प्रोटोकॉल 3 में वर्णित के रूप में इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को तैयार (3.6 के माध्यम से 3.1 कदम)।
  2. छवि तुरंत methionine जोड़ने, brightfield और GFP फिल्टर सेट उपयोग करने से पहले हर हालत के लिए कोशिकाओं के 4-5 यादृच्छिक खेतों।
  3. 100 माइक्रोग्राम / एमएल methionine युक्त YNB माध्यम के 50 μl जोड़ें (युद्ध पूर्व20 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम methionine एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के लिए मेड) में अच्छी तरह से मध्यम के 200 μl करने के लिए। आदेश में नीचे से चल से कोशिकाओं को रोकने में अच्छी तरह से मध्यम में खलल न डालें से बचें।
  4. छवि 4-5 कोशिकाओं के यादृच्छिक क्षेत्रों methionine के अलावा के बाद 30 मिनट, 0 मिनट समय बिंदु (4.2 कदम) के लिए के रूप में ही अधिग्रहण के मापदंडों का उपयोग।
  5. हर समय बिंदु के लिए कम से कम 30-50 कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता यों (5 प्रोटोकॉल देखें)। Mup1-pHluorin का प्रतिशत 30 मिनट के सूत्र का उपयोग करने के बाद भाँति के रूप में एक्सप्रेस मान: [0 मिनट पर तीव्रता मीन - 30 मिनट पर मतलब तीव्रता] x 100% [0 मिनट पर मतलब तीव्रता] /।
    नोट:। इसके साथ ही प्रत्येक परख की शुरुआत के समय चौंका देने वाला द्वारा आठ समापन assays करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए संभव है 3 टेबल आठ एक साथ assays के लिए एक उदाहरण कार्यप्रवाह प्रदान करता है।

5. अधिग्रहण के बाद विश्लेषण

  1. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से निर्यात छवियों के रूप में एक 16-सा टैग की छवि फ़ाइल स्वरूप (.tif या झगड़ा प्रारूप)।
    नोट: अन्य फ़ाइल स्वरूपों भी उपयुक्त हो सकता है, और आदर्श दोषरहित संपीड़न एल्गोरिदम का उपयोग करना चाहिए। 8-बिट छवियों आम तौर पर मात्रा का ठहराव प्रयोजनों के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
  2. 'फ़ाइल' मेनू में ImageJ सॉफ्टवेयर ( 'ओपन' विकल्प पर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध का उपयोग कर खुला फ़ाइलें। यदि वर्तमान मात्रा का ठहराव के लिए प्रतिदीप्ति छवि का उपयोग करें, और brightfield / एक संदर्भ के रूप में डीआईसी छवि कोशिकाओं के स्थान की पहचान करने और मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए ( ) है, जो जब डीआईसी द्वारा देखी और जब GFP / उत्तेजना उत्सर्जन फिल्टर के साथ देखी autofluorescent कर रहे हैं जीवित कोशिकाओं से अधिक गहरा दिखाई देते हैं।
  3. प्रतिदीप्ति छवि पर एक पृष्ठभूमि घटाव प्रदर्शन करना। एक असमान पृष्ठभूमि संकेत के साथ छवियों के लिए, 'पृष्ठभूमि घटाव' एल्गोरिथ्म 'प्रक्रिया मेनू' में पाया का उपयोग करें। डिफ़ॉल्ट सेटिंग (रोलिंग 50 पिक्सल की गेंद त्रिज्या) है, जो आम तौर पर मात्रा का ठहराव प्रयोजनों के लिए पर्याप्त है का प्रयोग करें।
    नोट: एक वैकल्पिक backgroवर्दी पृष्ठभूमि के साथ छवियों के लिए und घटाव विधि कदम 5.3.1.-5.3.2 में वर्णित है; हालांकि, उपरोक्त विधि भी वर्दी पृष्ठभूमि के लिए काम करता है।
    1. वर्दी पृष्ठभूमि के साथ छवियों के लिए (यानी, पृष्ठभूमि तीव्रता सभी किनारों पर और छवि के केंद्र में लगभग स्थिर है), एक मैनुअल पृष्ठभूमि घटाव प्रदर्शन करते हैं। 'मुक्तहस्त चयन' बटन मुख्य ImageJ खिड़की में पाया पर क्लिक करें, और छवि है कि कोशिकाओं को शामिल नहीं है के भीतर 3-5 यादृच्छिक क्षेत्रों का चयन करें।
    2. 'विश्लेषण' मेनू में स्थित 'माप सेट' समारोह खोलें, 'मतलब ग्रे मूल्य' पैरामीटर का चयन करें, और 'उपाय' समारोह (भी 'विश्लेषण' मेनू में पाया जाता है) का उपयोग करते हुए तीव्रता मूल्यों को मापने। 3-5 मापा क्षेत्रों से औसत मूल्य की गणना करें, और उस छवि में बाद के सभी माप से घटाना।
  4. गतिज assays की मात्रा का ठहराव के लिए (प्रोटोकॉल 3), टिम के लिए एक एकल, खड़ी छवि उत्पन्नई श्रृंखला। कालानुक्रमिक क्रम में हर समय बिंदु से प्रतिदीप्ति छवियों को खोलें, और एक ढेर 'छवियाँ ढेर करने के लिए' का उपयोग समारोह ( 'छवि' मेनू में पाया गया है, ढेर उप मेनू के तहत) उत्पन्न करते हैं।
  5. एक सेल मुक्तहस्त चयन उपकरण का उपयोग रेखांकित, संभव के रूप में सेल के बाहर पूरे सेल लेकिन के रूप में छोटे क्षेत्र में शामिल करने के लिए सुनिश्चित कर रही है।
  6. उपाय निम्नलिखित मानकों: 'क्षेत्र, एकीकृत घनत्व' और 'मतलब ग्रे मूल्य'। मापदंडों का चयन करें 'माप सेट' समारोह 'का विश्लेषण करें' मेनू में स्थित इस्तेमाल करते हैं।
    नोट: एकीकृत घनत्व चयनित क्षेत्र के भीतर सभी पिक्सेल तीव्रता का योग से मेल खाती है, और मतलब ग्रे मूल्य के लिए [एकीकृत घनत्व / क्षेत्र], जो सेल आकार के लिए तीव्रता मूल्यों को सही मेल खाती है।
  7. 'उपकरण' उप मेनू के तहत 'रॉय प्रबंधक' 'का विश्लेषण करें' मेनू में स्थित, खोलें। रॉय प्रबंधक विंडो में, पर प्रकाश डाला Regio में प्रवेश के लिए 'जोड़ें' बटन क्लिक करेंn ब्याज (आरओआई) के एक नए क्षेत्र के रूप में।
  8. दोहराएँ छवि में शेष कोशिकाओं के लिए 5.6 के माध्यम से 5.4 कदम। , और किसी भी कोशिकाओं है कि छवि के किनारे स्पर्श, रूप brightfield / डीआईसी और प्रतिदीप्ति (चित्रा 2 एफ को देखने मृत कोशिकाओं डीआईसी छवियों में गहरे रंग दिखाई देते हैं, और autofluorescent cytoplasmic संकेत जब GFP / उत्तेजना उत्सर्जन के साथ देखा है) द्वारा मूल्यांकन किसी भी मृत कोशिकाओं को बाहर। 'रॉय प्रबंधक' विंडो में 'अधिक' बटन पर क्लिक करके एक ज़िप फ़ाइल के रूप में चयनित ROIs सहेजें, और एक स्प्रेडशीट या सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर करने के लिए सभी मापन निर्यात।
  9. गतिज assays की मात्रा का ठहराव (प्रोटोकॉल 3) के लिए, रूपरेखा और कदम 5.4 और 5.5 में वर्णित के रूप में प्रारंभिक समय बिंदु से एक सेल को मापने। प्रयोग में बाद के सभी समय अंक की माप के लिए एक ही रॉय का प्रयोग करें।
  10. समापन बिंदु assays (प्रोटोकॉल 2 और 4) के लिए, हर हालत के लिए 30-50 कोशिकाओं की एक न्यूनतम उपाय। कम से कम 2-3 छवियों के लिए मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करना, और प्रत्येक में सभी कक्षों में शामिलछवि है कि मानदंड विश्लेषण में 5.8 कदम में उल्लिखित मिलते हैं।
  11. एक तरह से एनोवा, पोस्ट अस्थायी विश्लेषण के लिए Tukey एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद का उपयोग कर नमूने के बीच सांख्यिकीय महत्व का आकलन करें।

से फ्लो द्वारा Mup1-pHluorin endocytosis के 6. जनसंख्या विश्लेषण

  1. YNB मध्यम methionine और अतिरिक्त अमीनो एसिड या प्लाज्मिड चयन बनाए रखने के लिए पोषक तत्वों की कमी के 0.5 मिलीलीटर में खमीर कोशिकाओं (कॉलोनी प्रति व्यास में लगभग 2 मिमी) के 2-3 कालोनियों टीका लगाना। कोशिकाओं को एक रोलर ड्रम पर 30 डिग्री सेल्सियस पर 16-24 घंटे के लिए 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब में आगे बढ़ें।
  2. प्लाज्मिड रखरखाव के लिए methionine और अतिरिक्त अमीनो एसिड या पोषक तत्वों की कमी YNB माध्यम की 1.5 मिलीलीटर जोड़ें, और एक रोलर ड्रम पर एक अतिरिक्त 3 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है।
  3. स्थानांतरण दो 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों के प्रत्येक में कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर। पहली ट्यूब (-Met हालत) को YNB -Met माध्यम के 0.25 मिलीलीटर जोड़ें, और YNB माध्यम की 0.25 एमएल 100 माइक्रोग्राम से युक्त/ एमएल दूसरी ट्यूब के लिए methionine 20 माइक्रोग्राम / एमएल (+ मेट हालत) के अंतिम methionine एकाग्रता देने के लिए। एक रोलर ड्रम पर 45 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. प्रवाह cytometry द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण, सेल आकार का एक उपाय है, और माल internalization का एक उपाय के रूप में एक fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) फिल्टर से Mup1-pHluorin प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में आगे तितर बितर (एफएस) का चयन।
  5. स्लाइडर बटन का प्रयोग करें एफएस और FITC चैनलों की वोल्टेज को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा खमीर कोशिकाओं के आकार रेंज और प्रतिदीप्ति तीव्रता का पता लगाने के लिए अनुकूलन करने के लिए (इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया सेटिंग्स एफएस के लिए 50 वी और FITC के लिए 400 वी थे)।
    नोट: दोनों चैनलों के लिए इस्तेमाल किया जा रहा वोल्टेज प्रवाह के आधार पर अलग अलग होंगे। इस कदम से पहले या methionine (कदम 6.3) के साथ 45 मिनट के उपचार के दौरान किया जाना चाहिए।
  6. उपाय एफएस और प्रतिदीप्ति तीव्रता हर हालत से 10,000 कोशिकाओं के लिए, उच्च प्रवाह दर सेटिंग का उपयोग। Fluo के खिलाफ एफएस की एक तितर बितर साजिश उत्पन्नrescence तीव्रता: 'ग्राफ जोड़ने' पर क्लिक करें, FITC (एक्स अक्ष) और एफएस (शाफ़्ट) का चयन करें, और ग्राफ 1,000 अंक (सॉफ्टवेयर, 1000 कोशिकाओं के लिए मूल्यों को प्रदर्शित करेगा, भले ही 10,000 कोशिकाओं मापा गया)।
    ध्यान दें: अधिक से अधिक स्थिरता के लिए, कोशिकाओं methionine के अलावा के बाद 45-50 मिनट का विश्लेषण; नमूनों की बड़ी संख्या शामिल प्रयोगों के लिए, methionine के अलावा डगमगाते समय प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए आवश्यक समायोजित करने के लिए।
  7. एक नियंत्रण के रूप में जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) कोशिकाओं के लिए -Met और + मौसम की स्थिति को शामिल करें। गेट समारोह का उपयोग करना, एक खड़ी गेट गुम्मट + मौसम शर्त का उपयोग, ऐसा है कि प्रतिभाशाली कोशिकाओं के लगभग 5% गेट के अधिकार के लिए गिर आवंटित। प्रयोग में अन्य सभी स्थितियों के लिए इस gating का प्रयोग करें।

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Representative Results

स्थिर राज्य स्थानीयकरण और अनिवार्यता से भली भाँति endocytic माल प्रोटीन की मात्रा का ठहराव Ste3

प्रदर्शित करने के लिए जीवित कोशिकाओं, chimeric GFP और Ste3, खमीर में एक कारक फेरोमोन रिसेप्टर के cytoplasmic सी टर्मिनल पूंछ के साथ pHluorin fusions के स्थानीयकरण में है कि pHluorin टैग cargos endocytosis की मात्रा का ठहराव के लिए उपयोग किया जा सकता है, की तुलना में थे। Ste3 एक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) कि अनिवार्यता से गिरावट 28 के लिए, प्लाज्मा झिल्ली के लिए ले जाया जाता है भाँति, और रिक्तिका करने का लक्ष्य रखा है। इस प्रकार, स्थिर राज्य शर्तों के तहत, Ste3 के बहुमत रिक्तिका लुमेन के लिए, के रूप में जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) कोशिकाओं Ste3-GFP (2A चित्रा) को व्यक्त करने में देखा localizes। इसके विपरीत, जीन चार क्लैथ्रिन बाध्यकारी एडाप्टर प्रोटीन Ent1, Ent2, Yap1801 और Yap1802 (एन्कोडिंग कमी कोशिकाओं ent1 Δent2 Δ yap1801 Δ yap1802 Δ, इसके बाद 4Δ के रूप में) endocytosis 29 की साइटों पर क्लैथ्रिन को स्थिर करने में विफल रहते हैं, और सीएमई 30 में गंभीर रूप से खराब कर रहे हैं। 4Δ कोशिकाओं epsin एन टर्मिनल अनुरूपता (एन वां) या तो Ent1 या Ent2 के डोमेन व्यवहार्यता 30,31 के लिए अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। Enth डोमेन के रूप में 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं Ent1 (2A चित्रा) 8,30 के enth डोमेन को व्यक्त करने में प्लाज्मा झिल्ली में Ste3-GFP की अवधारण से दिखाया गया है, 4Δ कोशिकाओं में endocytosis के लिए पर्याप्त नहीं है; 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं में इसी प्रकार के प्लाज्मा झिल्ली प्रतिधारण Ste2-GFP (α-कारक फेरोमोन रिसेप्टर) और Mup1-GFP या Mup1-pHluorin (एक methionine permease) 8,18 सहित अन्य endocytic cargos, के लिए रखा गया है। इसके विपरीत, 4Δ कोशिकाओं में एक प्लाज्मिड (4Δ + Ent1) से पूर्ण लंबाई Ent1 की अभिव्यक्ति endocytosis और Ste3-GFP के स्थानीयकरण रिक्तिका को पुनर्स्थापित करता है। 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं हाल ही में मैं इस्तेमाल किया गयाna आनुवंशिक स्क्रीन खमीर में एक सीआईई मार्ग पर निर्भर करता है कि पहचान करने के लिए actin का नियमन GTPase Rho1 और उसके जीईएफ, Rom1, साथ ही formin Bni1 और कार्गो छँटाई 8,18 में शामिल प्रोटीन की α-arrestin परिवार के सदस्य हैं। एक बेहतर Ste3-GFP (2A चित्रा) के internalization 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं में उच्च प्रतिलिपि plasmids से ROM1 की सीआईई में भूमिका, अभिव्यक्ति या α-arrestin LDB19 के अनुरूप।

Ste3-GFP या अन्य GFP टैग endocytic cargos व्यक्त कोशिकाओं संचय और GFP टैग की प्रोटिओलिटिक प्रतिरोध के कारण उज्ज्वल रिक्तिकाएं है। इसके विपरीत, Ste3-pHluorin व्यक्त कोशिकाओं अम्लीय वातावरण में 20 pHluorin टैग के शमन के कारण vacuolar प्रतिदीप्ति का स्तर बहुत कम है। जैसा कि पहले देखा, गुम्मट और 4Δ + Ent1 कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 बी) के द्वारा बहुत कम पहचाने जाने Ste3-pHluorin दिखाया। इसके विपरीत, Ste3-pHluorin, 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर आसानी से पहचाने जा रहा था, जबकि vacuolar Ste3-pHluorin सभी मामलों में लगभग undetectable बने रहे। ROM1 या LDB19 की उच्च प्रतिलिपि अभिव्यक्ति, कोशिका की सतह, Ste3-GFP के साथ परिणामों के समान पर पहचाने जाने Ste3-pHluorin की मात्रा कम है, हालांकि vacuolar Ste3-pHluorin सभी मामलों में लगभग undetectable बने रहे।

टैग pHluorin GFP- और के प्रभाव की तुलना करने के लिए कोशिकाओं की endocytic क्षमता में परिवर्तन बढ़ाता के लिए उपकरण के रूप में cargos, Ste3-GFP और Ste3-pHluorin के पूरे सेल प्रतिदीप्ति WT और 4Δ कोशिकाओं में मापा गया था। हालांकि Ste3-GFP स्थानीयकरण में परिवर्तन आसानी से माइक्रोस्कोपी (2A चित्रा) द्वारा detectable थे, समग्र प्रतिदीप्ति तीव्रता में मतभेद गुम्मट, 4Δ + Ent1 और 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं के साथ खाली वेक्टर (चित्रा 2 सी) 20 तब्दील बीच सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं थे। Likewisई, 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं वेक्टर, ROM1 और LDB19 के साथ बदल समान पूरे सेल प्रतिदीप्ति तीव्रता था। विशेष रूप से, 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं ROM1 या LDB19 के साथ बदल गुम्मट कोशिकाओं (चित्रा -2) 8,18 की तुलना में काफी मद्धम थे; हालांकि, Ste3-GFP प्रोटीन का स्तर समान थे के रूप में immunoblotting (चित्रा 2 ई) द्वारा मूल्यांकन। तीव्रता में अंतर की वजह से रिक्तिका आकार या आकृति विज्ञान में परिवर्तन करने के लिए भाग में, या रिक्तिका में GFP टैग की अवधारण में मतभेद के लिए किया जा सकता है, Ste3-GFP प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव (चित्रा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया स्थानीयकरण में परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं करता 2A)। इसके विपरीत, Ste3-pHluorin तीव्रता की मात्रा का ठहराव दिखा दिया है कि 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं वेक्टर के साथ बदल गुम्मट या 4Δ + Ent1 कोशिकाओं की तुलना में काफी उज्जवल थे, और ROM1 या 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं में LDB19 के उच्च प्रतिलिपि अभिव्यक्ति को कम करने के लिए Ste3-pHluorin तीव्रतास्तर है कि WT और 4Δ + Ent1 (चित्रा 2 डी) के समान थे। इस प्रकार, स्थिर राज्य Ste3-pHluorin तीव्रता की मात्रा का ठहराव सही प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया स्थानीयकरण में अंतर को दर्शाता है।

काइनेटिक internalization विनियमित endocytic कार्गो, Mup1 का उपयोग कर assays

स्थिर राज्य में अनिवार्यता से भली भाँति cargos के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता की मात्रा गुम्मट कोशिकाओं की तुलना में उत्परिवर्ती कोशिकाओं के endocytic क्षमता में मतभेद प्रकट कर सकते हैं। हालांकि, यह है कि कुछ cargos WT और endocytic उत्परिवर्ती कोशिकाओं में एक ही स्थिर राज्य वितरण और तीव्रता तक पहुंच सकता है, भले ही उत्परिवर्ती कोशिकाओं माल internalization के लिए endocytosis या धीमी कैनेटीक्स में देरी संभव है। इसके बजाय, pHluorin टैग cargos कि एक विशिष्ट उत्तेजना या ligand के जवाब में विनियमित endocytosis गुजरना नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताendocytosis के कैनेटीक्स। इस प्रयोजन के लिए, उच्च आत्मीयता methionine permease, Mup1, के internalization 32 नजर रखी थी। बाह्य methionine के अभाव में, Mup1 अभिव्यक्ति upregulated है, और permease प्लाज्मा झिल्ली पर बनाए रखा है; मध्यम करने के लिए methionine के अलावा पर, Mup1 तेजी internalization और रिक्तिका 13 करने का लक्ष्य आए।

Mup1 internalization के कैनेटीक्स पर नजर रखने के लिए, गुम्मट उपभेदों जीनोमिक ठिकाना से Mup1-GFP या Mup1-pHluorin व्यक्त आदेश प्लाज्मा झिल्ली पर फ्लोरोसेंट Mup1 जमा करने के लिए (चित्रा 3 ए, 0 मिनट समय बिंदु) में methionine के अभाव में बड़े हो रहे थे। कोशिकाओं के समय चूक इमेजिंग तो अभाव या methionine की उपस्थिति में 5 मिनट के अंतराल पर प्रदर्शन किया गया था माल internalization और प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए। जैसी कि उम्मीद थी, GFP- और pHluorin टैग Mup1 methionine के अभाव में imaged प्लाज्मा झिल्ली च पर बने रहेया पूरे 45 मिनट के अवलोकन की अवधि 20। इसके विपरीत, methionine की उपस्थिति में imaged कोशिकाओं कोशिका की सतह से प्रतिदीप्ति संकेत के प्रगतिशील कमी, माल internalization के साथ संगत कर दिखाया। विशेष रूप से, Mup1-GFP प्रतिदीप्ति आंतरिक संरचना (यानी, endosomes और कोटर) में जमा है, जबकि Mup1-pHluorin आंतरिक punctae की संभावना है कि जल्दी endosomes के अनुरूप करने के लिए स्थानीय, लेकिन रिक्तिका में नहीं देखा गया था।

प्रतिदीप्ति व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए हर समय अंक के पार मात्रा निर्धारित किया गया था, Mup1-GFP और Mup1-pHluorin तीव्रता 45 मिनट के प्रयोग के दौरान बाहर से लागू methionine के अभाव में थोड़ा परिवर्तन, प्रोटीन के साथ संगत कर दिखाया स्थिरतापूर्वक प्लाज्मा झिल्ली के लिए स्थानीय शेष (चित्रा 3 बी)। इसके विपरीत, पूरे सेल Mup1-pHluorin तीव्रता तेजी से methionine की उपस्थिति में कमी आई है, ऐसा है कि fluorescenc में 50% की कमीई तीव्रता लगभग 20-25 मिनट के बाद मनाया गया था, और एक 80% की कमी मनाया गया के बाद लगभग 40 मिनट 20। Mup1-GFP कोशिकाओं को भी methionine के अलावा पर प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी देखी गई; हालांकि, प्रतिदीप्ति नुकसान के कैनेटीक्स Mup1-pHluorin के उन लोगों के, कि इस तरह की तीव्रता में 50% की कमी केवल 40 मिनट के बाद मनाया गया था की तुलना में देरी हुई। जैसा कि चित्र 3 ए में देखा, Mup1-GFP इस समय प्लाज्मा झिल्ली में मुश्किल से detectable था, यह दर्शाता है कि लगातार vacuolar GFP प्रतिदीप्ति कोशिका की सतह पर endocytic घटनाओं की सटीक मात्रा का ठहराव रोका।

समापन बिंदु विनियमित endocytic कार्गो, Mup1 का उपयोग कर assays

जैसा कि ऊपर वर्णित endocytosis की मात्रात्मक, गतिज assays के अलावा, इस तरह के Mup1 के रूप में विनियमित endocytic cargos भी समापन बिंदु assays, मात्रा का ठहराव के लिए इसी तरह के लिए इस्तेमाल किया जा सकताके स्थिर राज्य Ste3-pHluorin तीव्रता। इस प्रयोजन के लिए, Mup1-pHluorin internalization की मात्रा का ठहराव के लिए परख methionine 8,18 के अलावा के बाद या 30 मिनट पहले तुरंत imaged कोशिकाओं की आबादी से मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना अनुमति देने के लिए संशोधित किया गया था। यह दृष्टिकोण Mup1 का प्रतिशत WT और endocytic उत्परिवर्ती कोशिकाओं के बीच भाँति की तुलना की अनुमति देता है।

काइनेटिक परख के परिणामों के साथ समझौते (चित्रा 3) में, Mup1-pHluorin तेजी से गुम्मट कोशिकाओं (चित्रा 4 ए), ऐसा है कि Mup1-pHluorin का लगभग 60% methionine के अलावा के बाद 30 मिनट के भाँति था में प्लाज्मा झिल्ली (से समाप्त हो गया था चित्रा 4 बी)। जैसी कि उम्मीद थी, Mup1-pHluorin internalization, 4 + Ent1 कोशिकाओं में इसी प्रकार कुशल था, जबकि internalization काफी 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं, endocytosis में एक गंभीर दोष के अनुरूप कम हो गया था। उच्च प्रतिलिपि अभिव्यक्तिROM1 या α-arrestin LDB19 है, जो विशेष रूप से दोनों सीएमई के माध्यम से Mup1 internalization के लिए आवश्यक है और सीआईई के रास्ते 13,18, Mup1-pHluorin के सुधार internalization, उनके 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं 18 में endocytosis बढ़ावा देने की क्षमता के साथ संगत। विशेष रूप से, हालांकि स्थिर राज्य 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं में Ste3-pHluorin तीव्रता उच्च प्रतिलिपि ROM1 व्यक्त या LDB19 गुम्मट या 4Δ + Ent1 कोशिकाओं से पृथक किया गया था, Mup1-pHluorin के internalization केवल आंशिक रूप से 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं में उच्च प्रतिलिपि व्यक्त सुधार किया गया था ROM1 या LDB19 (चित्रा 4C)। इस प्रकार, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि गतिज और / या समापन बिंदु assays कुछ cargos के लिए WT और उत्परिवर्ती उपभेदों के बीच endocytic दरों में मतभेद प्रकट कर सकते हैं, भले ही अन्य cargos के समान स्थिर राज्य वितरण ही उपभेदों में प्राप्त किया जा सकता है।

Mup1-पीएचएल की जनसंख्या के आधार पर विश्लेषणinternalization uorin से फ्लो का उपयोग कर

से फ्लो का उपयोग कर माइक्रोस्कोपी द्वारा माल internalization के लिए गतिज और समापन बिंदु assays के प्रदर्शन के लिए एक विकल्प प्रदान कर सकते हैं कोशिकाओं की बड़ी आबादी के उच्च throughput विश्लेषण। इस प्रयोजन के लिए, Mup1-pHluorin के प्रतिदीप्ति तीव्रता एक संस्कृति methionine के अभाव में उगाया (डब्ल्यूटी -Met है, जो "तेज" होना चाहिए) से या 45 मिनट के लिए methionine की उपस्थिति (डब्ल्यूटी + मुलाकात में WT कोशिकाओं की तुलना में किया गया था, जो जाना चाहिए "मंद" चित्रा 3 बी में देखा प्रतिदीप्ति तीव्रता में 80% की कमी) पर आधारित अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में। से फ्लो, एक खड़ी गेट गुम्मट + मौसम की स्थिति, जहां कोशिकाओं की ~ 5% फाटक के दाएँ हाथ की ओर पर निहित थे, और जनसंख्या (चित्रा 5 ए और 5 ब भीतर प्रतिभाशाली कोशिकाओं के लिए corresponded के लिए लागू किया गया था द्वारा विश्लेषण के बाद लाल आबादी)। जब एक ही गेट लागू किया गया थागुम्मट -Met हालत के लिए, कोशिकाओं का लगभग 65% उज्ज्वल श्रेणी में गिर गई, प्रदर्शन है कि आसानी से फ्लो से पहले और methionine के अलावा के बाद कोशिकाओं की आबादी के बीच Mup1-pHluorin प्रतिदीप्ति तीव्रता में मतभेद का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके विपरीत, मंद कोशिकाओं बनाम उज्ज्वल का वितरण एक ही गेट गुम्मट + मौसम की आबादी के लिए आवेदन किया है, दोषपूर्ण endocytosis के साथ संगत का उपयोग कर 4Δ + ENTH1 -Met और + मौसम की स्थिति में पृथक किया गया था। इस प्रकार, प्रवाह cytometry कोशिकाओं के endocytic क्षमता में परिवर्तन का पता लगाने कर सकते हैं, और कोशिकाओं की बड़ी आबादी के तेजी से विश्लेषण परमिट। महत्वपूर्ण बात है, फ्लो का भी आनुवंशिक स्क्रीन में एक उपकरण के रूप छंटाई और दोषपूर्ण endocytosis के साथ उत्परिवर्ती कक्षों के चयन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (लालकृष्ण Wrasman और बी Wendland, तैयारी में पांडुलिपि) 33।

आकृति 1
आकृति 1: (ए) एक pHluorin (पीएचएल) की chimeric संलयन प्लाज्मा झिल्ली पर कार्गो के detectable प्रतिदीप्ति (हरा) में endocytic कार्गो प्रोटीन परिणामों के cytoplasmic पूंछ पर टैग (प्रधानमंत्री )। endocytosis के बाद, कार्गो प्रोटीन जल्दी इंडो सोम (इंडो), जहां pHluorin टैग कोशिका द्रव्य से अवगत कराया रहता है, और इस प्रकार फ्लोरोसेंट है के लिए दिया जाता है। बाद में, ESCRT मशीनरी Multivesicular निकायों (MVB) की ल्यूमिनल vesicles में माल छँटाई और समावेश को बढ़ावा देता है। MVBs तो रिक्तिका के साथ फ्यूज गिरावट के लिए प्रोटीन और झिल्ली घटकों देने के लिए। MVBs में शामिल करने पर, pHluorin टैग (ग्रे) अम्लीकरण के कारण बुझती हो जाता है। (बी) pHluorin टैग cargos के उपयोग की खोज और एक क्लैथ्रिन स्वतंत्र endocytic (सीआईई) खमीर में मार्ग में शामिल प्रोटीन के लक्षण वर्णन में मदद की है। दोषपूर्ण क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytos के साथ कोशिकाओं मेंहै, GTPase Rho1 के उच्च प्रतिलिपि अभिव्यक्ति, साथ ही साथ अपनी सक्रिय जीईएफ Rom1, सीआईई 8 के माध्यम से माल internalization बढ़ावा देने के। इसके अलावा, हालांकि प्रोटीन की α-arrestin परिवार (α-एआरआर) माल ubiquitination और सीएमई 13-17 के माध्यम से internalization को बढ़ावा देने में भूमिका के नाम से जाना जाता है, सीआईई में α-arrestins के लिए हाल ही में भूमिकाओं सीआईई के बजाय प्रोटीन के साथ बातचीत करने के लिए कारण की पहचान की गई, संभावना यूबीक्यूटिन की भर्ती के माध्यम से ligases 18। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। प्रकार के जंगली और endocytic उत्परिवर्ती कोशिकाओं में स्थानीयकरण और Ste3-GFP और Ste3-pHluorin की मात्रा का ठहराव (ए) गुम्मट, 4Δ + Ent1 और 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं genomically इनकोडिंग व्यक्त Ste3-जीएफपी और संकेत के रूप में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (शीर्ष पंक्ति) या डीआईसी (नीचे पंक्ति) द्वारा कल्पना थे वेक्टर, उच्च प्रतिलिपि ROM1 या उच्च प्रतिलिपि LDB19 के साथ बदल दिया। Ste3-GFP छवियों को एक ही अधिकतम और न्यूनतम तीव्रता को समायोजित किया गया Ste3 स्थानीयकरण के प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति है। (बी) के गुम्मट, 4Δ + Ent1 और 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं genomically इनकोडिंग Ste3-pHluorin व्यक्त बदल दिया है और पैनल में वर्णित के रूप में imaged थे। स्केल बार = 2 माइक्रोन। (सी, डी) Ste3-GFP (सी) और Ste3-pHluorin (डी) के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता की मात्रा पैनलों ए और बी हर हालत के लिए में इस्तेमाल में तनाव, पूरे सेल प्रतिदीप्ति 40 कोशिकाओं की एक न्यूनतम के लिए मात्रा निर्धारित किया गया था। मान सेल आकार के लिए सही थे, और ± SEM के मतलब के रूप में मनमाना इकाइयों (एयू) में व्यक्त (*** पी <0.001 गुम्मट की तुलना में, ††† पी <0.001 4Δ + ENTH1 + वेक्टर की तुलना में)। (ई) relativके रूप में संकेत Ste3-GFP के ई अभिव्यक्ति गुम्मट, 4Δ + Ent1 और 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं में मूल्यांकन वेक्टर, उच्च प्रतिलिपि ROM1 या उच्च प्रतिलिपि LDB19 के साथ बदल दिया। सेल के अर्क के रूप में पहले 20 में वर्णित तैयार किए गए थे, और प्रत्येक नमूने की बराबर मात्रा में एसडीएस पृष्ठ से सुलझाया गया। Ste3-GFP अभिव्यक्ति विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ immunoblotting द्वारा मूल्यांकन किया गया था, और प्रोटीन लोड हो रहा है विरोधी GAPDH का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। (एफ) जंगली प्रकार की कोशिकाओं genomically इनकोडिंग Ste3-GFP एक मृत सेल तीर द्वारा संकेत के साथ, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (Ste3-GFP पैनल) और डीआईसी प्रकाशिकी द्वारा देखी व्यक्त। मृत कोशिकाओं GFP फिल्टर में autofluorescent दिखाई देते हैं, और गहरा जब डीआईसी द्वारा देखा जाता है। स्केल बार = 2 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Mup1-GFP और Mup1-pHluorin internalization की काइनेटिक परख (ए) जंगली प्रकार की कोशिकाओं genomically Mup1-GFP (ऊपरी दो पैनलों) या Mup1-pHluorin (कम दो पैनलों) इनकोडिंग को व्यक्त करने में मध्य लघुगणक चरण के लिए बड़े हो रहे थे YNB मध्यम methionine कमी प्लाज्मा झिल्ली में Mup1 अभिव्यक्ति और प्रतिधारण प्रेरित करने के लिए। कोशिकाओं तो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged थे अभाव में हर 5 मिनट (- मिले) या उपस्थिति (+ मेट) 20 माइक्रोग्राम / एमएल methionine की। एक शर्त के भीतर प्रत्येक समय बिंदु के लिए, समान अधिकतम और न्यूनतम तीव्रता मूल्यों प्रतिदीप्ति तीव्रता और स्थानीयकरण की तुलना करने के लिए लागू किया गया। के रूप में सभी स्थितियों के लिए संकेत दिया 0, 5, 10, 20 और 40 मिनट का समय अंक दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 2 माइक्रोन। पैनल से जंगली प्रकार की कोशिकाओं में internalization Mup1-pHluorin Mup1-GFP के (बी) और मात्रा। या Mup1-pHluo; - (+ मेट, नीले हीरे मेट, बैंगनी वर्गों) Mup1-GFP के पूरे सेल प्रतिदीप्ति तीव्रतारिन (- मिले, हरे त्रिकोण + मेट, लाल हलकों) अलग-अलग 5 मिनट के अंतराल पर imaged कोशिकाओं के लिए मापा गया था, और प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त (मतलब ± SEM, एन = हालत प्रति 6 कोशिकाओं)। Prosser एट अल से पुनर्प्रकाशित। (2010) 20 प्रकाशक से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। Mup1-pHluorin internalization का समापन बिंदु परख (ए) के गुम्मट, 4Δ + Ent1 और 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं genomically Mup1-pHluorin इनकोडिंग और संकेत के रूप में मध्य लिए बड़े हो रहे थे वेक्टर, उच्च प्रतिलिपि ROM1 या उच्च प्रतिलिपि LDB19 के साथ बदल व्यक्त YNB मध्यम कमी methionine में -logarithmic चरण। कोशिकाओं के यादृच्छिक क्षेत्रों fluorescenc द्वारा imaged थे (- मिले) ठीक पहले ई माइक्रोस्कोपी या बाद (+ मेट) 20 माइक्रोग्राम / एमएल methionine के अलावा 30 मिनट। सभी छवियों को एक ही अधिकतम और न्यूनतम तीव्रता मूल्यों को समायोजित किया गया। स्केल बार = 2 माइक्रोन। (बी) के पैनल से कोशिकाओं में Mup1-pHluorin internalization की मात्रा। हर हालत के लिए, पूरे सेल प्रतिदीप्ति तीव्रता 40 कोशिकाओं की एक न्यूनतम के लिए मापा जाता है और कोशिका के आकार के लिए ठीक किया गया था। Mup1-pHluorin का प्रतिशत भाँति से पहले और methionine के साथ 30 मिनट के उपचार के बाद तीव्रता मूल्यों मतलब की तुलना द्वारा गणना की गई। मान ± SEM के मतलब के रूप में दिखाया जाता है (एन = 4; *** पी <0.001 गुम्मट की तुलना में; † पी <0.05 4Δ + ENTH1 + वेक्टर की तुलना में)। यह आंकड़ा Prosser एट अल से संशोधित किया गया है। (2015) 18 प्रकाशक से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ontent "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 5
चित्रा 5:। प्रवाह cytometry द्वारा Mup1-pHuorin internalization की जनसंख्या विश्लेषण (ए) के गुम्मट और 4Δ + ENTH1 कोशिकाओं methionine कमी YNB माध्यम में मध्य लघुगणक चरण के लिए बड़े हो रहे थे। (- मिले) 20 माइक्रोग्राम / एमएल methionine की उपस्थिति या (+ मेट) 45 मिनट के लिए विश्लेषण करने से पहले प्रवाह cytometry कोशिकाओं तो अनुपस्थिति में incubated रहे थे। हर हालत के लिए, आगे तितर बितर (मनमाना इकाइयों, Au में) प्रतिदीप्ति तीव्रता के खिलाफ साजिश रची गई थी (एयू, एक FITC फिल्टर का उपयोग) 10,000 कोशिकाओं की कुल मापा जाता से बाहर 1,000 कोशिकाओं के लिए। आबादी आगे गुम्मट + मौसम की स्थिति, जहां प्रतिभाशाली कोशिकाओं (लाल रंग में दिखाया गया है) के लगभग 5% फाटक के दाएँ हाथ की ओर पर गिर करने के लिए एक ऊर्ध्वाधर गेट (नीले तीर) को लागू करने से विश्लेषण किया गया। गुम्मट + मौसम हालत के लिए उत्पन्न gating तो शेष की स्थिति के लिए लागू किया गया था तुलना अनुमति देने के लिएनमूना वितरण की। (बी) के गुम्मट और 4Δ + ENTH1 के लिए मंद कोशिकाओं (काला अंक, गेट के बाईं ओर) और उज्ज्वल कोशिकाओं का प्रतिशत (लाल अंक, फाटक के सही करने के लिए) का सारांश पैनल में दिखाया गया मेट परीक्षणों ±। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तनाव जीनोटाइप स्रोत
SEY6210 एक मेट α HIS3-Δ200 trp1-Δ901 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 suc2-Δ9 प्रयोगशाला प्लाज्मिड
BWY2858 STE3-GFP :: KANMX6 Prosser एट अल। (2010) 16
BWY2995 STE3-pHluorin :: KANMX6 पीRosser एट अल। (2010) 16
BWY3036 ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] Prosser एट अल। (2010) 16
BWY3037 ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] Prosser एट अल। (2010) 16
BWY3399 ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] Prosser एट अल। (2010) 16
BWY3400 ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] Prosser एट अल। (2010) 16
BWY3817 MUP1-GFP :: KANMX6 पीआरOsser एट अल। (2010) 16
BWY3818 MUP1-pHluorin :: KANMX6 Prosser एट अल। (2010) 16
BWY4153 ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] Prosser एट अल। (2011) 7
BWY4154 ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] Prosser एट अल। (2011) 7
एक इस अध्ययन में इस्तेमाल सभी उपभेदों संकेत लोकी पर छोड़कर SEY6210 को isogenic हैं।

तालिका 1: खमीर इस अध्ययन में इस्तेमाल उपभेदों।

प्लाज्मिड विवरण स्रोत
pRS426 2μ URA3 सिकोर्स्की और Hieter, 1989
pBW0768 pRS414 :: ENT1 [CEN TRP1] pEnt1, प्रयोगशाला प्लाज्मिड
pBW0778 pRS414 :: ent1 (aa1-151) [CEN TRP1] pENTH1, प्रयोगशाला प्लाज्मिड
pBW1571 pFA6a-pHluorin-KANMX6 Prosser एट अल। (2010) 16
pBW2053 YEp24 :: ROM1 [2μ URA3] pROM1 (Prosser एट अल।, 2011) 7
pRS426-Ldb19 LDB19prom-LDB19 [2μ URA3] Prosser एट अल। (2015) 15
pFA6a-GFP (S65T) -kanMX6 खमीर में GFP-टैगिंग के लिए pFA6a-GFP-KANMX6, पीसीआर आधारित एकीकृत करने प्लाज्मिड Longtineएट अल। (1998) 21

तालिका 2: इस अध्ययन में इस्तेमाल प्लास्मिड।

समय (मिनट) कार्रवाई (s)
-5 छवि नमूना 1 (-Met)
0 methionine नमूने के लिए 1 जोड़ें
छवि नमूना 2 (-Met)
5 methionine नमूने के लिए 2 जोड़े
छवि नमूना 3 (-Met)
10 methionine नमूना 3 में जोड़े
छवि नमूना 4 (-Met)
15 methionine नमूना 4 में जोड़े
छवि नमूना 5 (-Met)
20 जोड़नानमूने के लिए 5 methionine
छवि नमूना 6 (-Met)
25 methionine नमूने के लिए 6 जोड़े
छवि नमूना 7 (-Met)
30 methionine नमूने के लिए 7 जोड़े
छवि नमूना 8 (-Met)
छवि नमूना 1 (+ मेट)
35 methionine नमूने के लिए 8 जोड़े
छवि नमूना 2 (+ मेट)
40 छवि नमूना 3 (+ मेट)
45 छवि नमूना 4 (+ मेट)
50 छवि नमूना 5 (+ मेट)
55 छवि नमूना 6 (+ मेट)
60 छवि नमूना 7 (+ मेट)
65 छवि नमूना 8 (+ मेट)

टेबल तीन: चौंका देने वाला 8 Mup1-pHluorin समापन बिंदु assays के लिए उदाहरण कार्यप्रवाह।

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Discussion

खमीर कोशिकाओं में endocytic घटनाओं की मात्रा का ठहराव के लिए pHluorin के आवेदन transmembrane cargos जिसमें फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन (चित्रा 1 ए) के cytoplasmic पूंछ से जुड़े हुए है का उपयोग करता है। यहाँ वर्णित assays के लिए, cargos जब pHluorin टैग तटस्थ वातावरण के संपर्क में है, लेकिन जब बुझती pHluorin टैग अम्लीय परिस्थितियों का सामना करना पड़ता बनने चमकीले फ्लोरोसेंट हैं। इस प्रकार, एक pHluorin टैग endocytic माल आसानी से प्लाज्मा झिल्ली के cytoplasmic चेहरे पर और जल्दी endosomes पर पता चला है, लेकिन हो जाता है "मंद" जब ल्यूमिनल MVB vesicles में या रिक्तिका लुमेन के लिए वितरण पर शामिल किया। सामान्य तौर पर, नए संश्लेषित endocytic cargos संभावना जालिका (ईआर) छोड़ दो और GFP और इसके वेरिएंट के कई पूरी तरह से परिपक्व है इससे पहले कि प्लाज्मा झिल्ली तक पहुँचने; इस प्रकार, pHluorin टैग cargos कि अभी तक कोशिका की सतह पर नहीं पहुंचे हैं भविष्यवाणी कर रहे हैं undetectable रहने के लिए जब तक कि ईआर या Golgi से बाहर निकलने रहा हैmpaired।

ऐसे Ste3 और Mup1 रूप pHluorin टैग endocytic cargos के उपयोग खमीर सीआईई मार्ग (चित्रा 1 बी) 8,18 में शामिल प्रोटीन के एक नंबर के लक्षण वर्णन में मदद की है। विशेष रूप से, तरीकों इस पत्र में वर्णित है कि उत्पादन में वृद्धि प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है actin का नियमन सीएमई 8 में दोष के साथ खमीर म्यूटेंट की एक किस्म में GTPase Rho1 और उसके जीईएफ Rom1 endocytosis बढ़ावा देने के। इसके अलावा, pHluorin टैग cargos हाल ही में मात्रात्मक, दिखाना है कि α-arrestins, जो सीएमई 13-15,34-36 में अच्छी तरह स्थापित है भूमिकाओं दोनों सीएमई और सीआईई में माल-चयनात्मक भूमिका निभाते इस्तेमाल किया गया, और mechanistically अलग कार्य किया है दो रास्ते 18 में।

प्रोटोकॉल इस पत्र में उल्लिखित के लिए, कई महत्वपूर्ण कारकों आदेश संगत, मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, Mup1-GFP या Mup1-pHluorin अभिव्यक्ति और fluorescence खमीर कोशिकाओं दृष्टिकोण या स्थिर विकास के चरण (अप्रकाशित परिणाम) प्रवेश के रूप में कम हो सकती है; इस प्रकार, एक रात संस्कृति से विकसित कोशिकाओं पतला होना चाहिए और (कदम 3.1-3.2 और 6.1-6.2 देखें) एक अतिरिक्त 3 घंटे के लिए फिर से वृद्धि हुई है। इसके अलावा, जब समापन बिंदु assays में या प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए कई प्रयोगात्मक शर्तों या उपभेदों चौंका देने वाला है, यह महत्वपूर्ण आदेश में अलग-अलग स्थितियों के बीच तुलना की अनुमति देने के लिए methionine उपचार की इसी अवधि के बाद सभी नमूनों के लिए डेटा इकट्ठा करने के लिए है। अधिग्रहण के बाद विश्लेषण के लिए, मात्रा का ठहराव के बाद से 8 बिट प्रारूप करने के लिए रूपांतरण डेटा हानि कि प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों को प्रभावित कर सकते हैं का कारण बनता है, 16-बिट छवियों का उपयोग किया जाना चाहिए। इसके अलावा, पृष्ठभूमि घटाव, मात्रा का ठहराव (कदम 5.3) से पहले किया जाना चाहिए क्योंकि पृष्ठभूमि संकेत काफी नमूनों के बीच तीव्रता में मतभेद रोक देना कर सकते हैं।

जबकि pHluorin टैग Ste3 और Mup1 मात्रा का ठहराव के लिए उत्तरदायी सिद्ध कर दिया है, नहींसभी cargos pHluorin टैगिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल होगा। उदाहरण के लिए, α-कारक रिसेप्टर Ste2 टैग करने के लिए प्रयास करता है संभवतः Ste3 या Mup1 (अप्रकाशित परिणाम) की तुलना में Ste2-pHluorin के निचले प्रतिदीप्ति तीव्रता के कारण असंगत मात्रात्मक परिणाम सामने आए हैं, हालांकि यह संभव है कि मिलकर pHluorin टैग में सुधार सकता है संकेत तीव्रता। इसके अलावा, ligand प्रेरित endocytosis के बहुत धीमी दर के साथ cargos pHluorin मात्रा का ठहराव के लिए टैगिंग के लिए उत्तरदायी नहीं हो सकता है, खासकर अगर internalization के आधे समय खमीर सेल चक्र (लगभग 90 मिनट) से अधिक है। ऐसे cargos के लिए, प्रतिदीप्ति में कमी पैदा हो सकता है endocytosis से और / या विभाजन के दौरान मां और बेटी की कोशिकाओं के बीच माल के विभाजन से। इस प्रकार, ब्याज की अलग-अलग cargos के परीक्षण के क्रम में की सिफारिश की है निर्धारित करने के लिए कि क्या उनकी अभिव्यक्ति और कैनेटीक्स pHluorin-टैगिंग और मात्रा का ठहराव के लिए उपयुक्त हैं।

पीएचएल का उपयोग करते हुए हाल ही के अध्ययन यद्यपिuorin प्लाज्मा झिल्ली में endocytic घटनाओं पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित किया है, pHluorin टैग cargos endocytic मार्ग में बाद में की तस्करी की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, Mup1-pHluorin सफलतापूर्वक प्रवाह में ESCRT की मध्यस्थता माल MVBs 37 में छँटाई के cytometry आधारित assays, इस्तेमाल किया गया है के बाद से pHluorin टैग MVB ल्यूमिनल पुटिकाओं 20 में शामिल करने पर बुझती हो जाता है। यह दृष्टिकोण intraluminal बयान (स्पष्ट अर्थ) परख की और अधिक हाल ही में वर्णित luciferase संवाददाता, जो luciferin 38,39 की उपस्थिति में एक bioluminescent संकेत उत्पन्न करने के लिए एक cytoplasmic luciferase टैग के साथ cargos का उपयोग करता है के समान है। MVB ल्यूमिनल पुटिकाओं में शामिल करने पर pHluorin प्रतिदीप्ति के शमन के लिए इसी प्रकार, चमकदार परख में bioluminescence MVB vesicles में luciferase टैग के समावेश पर तनु है। pHluorin और चमकदार assays अवधारणात्मक रूप से समान हैं, pHluorin टैग cargos endocytosis और MVB परिपक्वता अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मैंn बरकरार कोशिकाओं।

वैकल्पिक तरीकों endocytosis की मात्रा का ठहराव के लिए मौजूद हैं, और जंगली प्रकार और endocytic उत्परिवर्ती कोशिकाओं में माल internalization की दर पर बहुमूल्य जानकारी प्रदान की है। उदाहरण ऐसे α-कारक और uracil ऐसे Ste3 के रूप में के रूप में 40,41, या endocytic cargos के लिए गिरावट की दर की निगरानी (जो permease Fur4 से भली भाँति है) (जो फेरोमोन रिसेप्टर Ste2 को बांधता है) के रूप में radiolabeled ligands के तेज निगरानी शामिल हैं वे भाँति और रिक्तिका 42 के लिए ले जाया जाता है। ये जैव रासायनिक दृष्टिकोण सेल की आवश्यकता होती है, और इस तरह जीवित कोशिकाओं में प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव के लिए उपयुक्त नहीं हैं। वैकल्पिक रूप से, fluorescently लेबल α-कारक, द्रव चरण डाई लूसिफ़ेर पीला, या styryl डाई FM4-64 जीवित कोशिकाओं में endocytosis कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन endogenously व्यक्त कार्गो प्रोटीन 40,43,44 की प्रत्यक्ष निगरानी की अनुमति नहीं है। इन तरीकों, VA प्रतिदीप्ति की दृढ़ता के लिएcuole लुमेन, मात्रा का ठहराव के रूप में मुश्किल हो सकती है GFP के साथ देखा। यह भी पूरे सेल प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने और cytoplasmic और endosomal / vacuolar डिब्बों से संकेत घटा कर endocytosis की मात्रा का ठहराव के लिए GFP टैग cargos उपयोग करना संभव है; हालांकि, endosomes और रिक्तिकाएं प्लाज्मा झिल्ली के करीब निकटता में अक्सर होते हैं। इसके विपरीत, pHluorin टैग endocytic cargos MVB / रिक्तिका डिब्बों, जो की तस्करी की घटनाओं और अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल GFP टैग की तुलना की मात्रा का ठहराव के लिए एक विशिष्ट लाभ हो सकता है में बुझ गए। हमारे भविष्य के अध्ययनों में खमीर endocytic रास्ते और माल छँटाई की वर्तमान ज्ञान पर विस्तार होगा अतिरिक्त कारक है कि सीएमई और सीआईई के लिए योगदान की पहचान है, और तंत्र है कि विनियमित माल-छँटाई फैसलों को समझते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine Sigma A8626-25G Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Bacto-agar Fisher BP1423-2 Use for preparation of plate media
BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) BD 291920 Use for preparation of liquid and plate media
Concanavalin A Sigma C5275-5MG Use for coating of chamber slides
Dextrose Fisher BP350-1 Use for preparation of liquid and plate media
L-Histidine Fisher BP382-100 Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Leucine Acros 125121000 Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Lysine Fisher BP386-100 Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Methionine Fisher BP388-100 Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tryptophan Fisher BP395-100 Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tyrosine Acros 140641000 Use for preparation of amino acid mixture
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) Thermo Scientific 155411 Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization
Uracil Sigma U0750-100G Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Axiovert 200 inverted microscope Carl Zeiss Custom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens Carl Zeiss Objective should be 100X, 1.4NA or higher
Sensicam Cooke Corporation Camera should have 12-bit or higher dynamic range
X-Cite 120PC Q Illumination Source Excelitas Technologies
Slidebook 5 software Intelligent Imaging Innovations
ImageJ software National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij/

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References

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  4. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604 (2011).
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आण्विक जीवविज्ञान अंक 116 endocytosis कार्गो छंटाई मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी प्रवाह cytometry लाइव सेल इमेजिंग lysosome कोटर इंडो सोम Multivesicular शरीर
मात्रात्मक, काइनेटिक और उच्च throughput नवोदित खमीर में endocytosis के विश्लेषण के लिए pHluorin के आवेदन
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Prosser, D. C., Wrasman, K.,… More

Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O’Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (116), e54587, doi:10.3791/54587 (2016).

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