Abstract
绿色荧光蛋白（GFP）及其变种被广泛使用的工具用于研究蛋白质的定位和事件，如细胞骨架重构和活细胞囊泡运输的动态。使用嵌合的GFP融合物的定量方法已经被开发用于许多应用;然而，绿色荧光蛋白是蛋白水解有所抗性，因而其荧光在溶酶体/液泡，从而可以在吞途径妨碍货物贩卖定量存在。用于定量的内吞作用和胞吞后贩卖事件的另一种方法是利用superecliptic pHluorin，GFP的pH敏感的变体是在酸性环境中骤冷的。 pHluorin的嵌合融合的跨膜蛋白的货物导致的荧光在货物进入多泡体（MVBs）和交付溶酶体/液泡流明掺入一个阻尼胞质尾。因此，液泡的荧光的猝灭便于quantifi内吞作用和在吞途径的早期事件的阳离子。本文介绍如何使用pHluorin标签的货物通过荧光显微镜内吞作用的量化使用流式细胞仪基于人群的检测方法，以及。
Introduction
囊泡运输在维持在真核细胞的细胞器的身份和功能中起重要作用，并且是用于调节个体细胞区室的蛋白质和膜组合物的关键机制。在质膜，胞吐泡融合提供了新的蛋白质和膜的细胞的表面上，而通过内吞作用产生小泡从表面用于随后的回收或靶向溶酶体除去膜和蛋白质。因此，内吞作用是养分吸收和用于向细胞外环境的反应很重要。胞吐作用和胞吞作用被平衡以调节质膜表面积，并允许受损的蛋白质的周转。
已在酵母和哺乳动物细胞的研究确定了响应大量涉及内吞作用的蛋白，以及促进特定货物的内在多个内吞途径或该行为的各种连接的vironmental条件。该研究得最好的途径是网格蛋白介导的内吞作用（CME），其中网格蛋白和胞质辅助蛋白组装成一个涂层结构以稳定新生吞囊泡。在芽殖酵母实验已经取得了关键洞察动态和招聘的顺序许多内吞蛋白1-3。值得注意的是，在CME机械高度通过进化保守，使得大多数酵母CME相关蛋白具有人直系同源物;因而，芽殖酵母已经了解了在高等真核生物保守的细胞内吞作用的机制的一个重要工具。例如，使用出芽酵母研究确定CME结构即形成和成熟（在酵母中称为皮质肌动蛋白斑块）涉及许多蛋白质的顺序招募，与网格蛋白和货物结合衔接蛋白开始，接着附加内吞附件招募蛋白质，的Arp2 / 3介导的肌动蛋白聚合的活性，以及参与囊泡断裂1,2-蛋白的募集。 CME机械蛋白质招募到皮层肌动蛋白补丁程序是一个高度有序的和一成不变的过程中，和招聘的许多蛋白质的确切订单已经建立了关于CME机械等组成。重要的是，最近的研究已经证实招募在网格蛋白小窝的CME蛋白在哺乳动物细胞中4类似的顺序。
除了CME，许多细胞类型具有依赖于替代机制，以促进从质膜5-7囊泡形成和内化的一个或多个网格蛋白独立内吞（CIE）的途径。在酵母中，我们最近发现，利用小GTP酶RHO1其激活鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），ROM1 8,9一CIE途径。 RHO1激活formin Bni1促进肌动蛋白聚合10,11，这是需要在酵母12这种形式的网格蛋白独立的内吞作用的。此外，蛋白质的α休止家族招募泛素连接酶Rsp5通过CME 13-17促进货物泛素化和随后的内化，并且还通过在CIE途径促进货物内化，可能通过直接相互作用与参与CIE 18的蛋白质。各种CIE途径也存在于哺乳动物细胞，包括依赖于RHO1直向同源物，RhoA蛋白9,19网格蛋白独立和吞噬途径。 RhoA蛋白在哺乳动物CIE的作用是知之甚少;因此，在芽殖酵母的研究可能提供额外的机械见解，适用于哺乳动物CIE。
内吞事件的精确量化可以提供关于特定蛋白在调节细胞内吞作用的重要信息，并且可以揭示突变对货物内化或progressio的影响通过内吞途径ñ。为了这个目的，生物化学方法可用于监测配位体的吸收或以测量内吞货物蛋白质的降解的速率。在活细胞中，绿色荧光蛋白（GFP）及其与感兴趣货物变体的融合允许货物运输的直接可视化。但是，GFP标记的货物是用于内吞作用的量化用途有限，因为GFP是耐（在酵母或液泡）在溶酶体降解。此外，GFP荧光只有在pH值的变化部分敏感，并保持液泡腔20,21内检测到。因此，绿色荧光蛋白标记的荧光在液泡持续长后的货物的剩余部分已经退化，以及货物的强度的全细胞为基础的定量可能是不准确的，由于在液泡长期GFP荧光。
为了克服液泡GFP荧光的缺点，我们先前提出的使用superecliptic pH值luorin，GFP的pH敏感的变体，在中性pH明亮荧光，但失去了在酸性环境中的荧光，如液泡/溶酶体20,22,23的内腔中。上内吞货物的胞质尾区放置为pHluorin标签允许在质膜和早期内涵体，其中，pHluorin标签保持暴露到细胞质（ 图1A）的货物的可视化。由于早期内涵体成熟，胞内排序复杂所需的运输（ESCRT）机械封装表面本地化货物成芽进入核内体腔内囊泡，产生多泡体（MVBs）24。对于已纳入内部MVB泡货物时，pHluorin标记朝向囊泡流明。内部MVB囊泡酸化;因此，pHluorin标签的货物失去早期内涵体荧光，因为它们成熟为MVBs 20。与液泡的MVB的后续融合提供了MVB肠腔内容物用于降解和pHluorin标签保持在液泡腔的酸性环境骤冷。
本文提供了使用与酵母细胞质pHluorin标签货物的定量测定内吞的详细说明。表达pHluorin标签的货物的菌株可以在动力学和/或终点测定法中使用，这取决于具体的货物的性质和贩卖行为。此外，一些pHluorin标签的货物是适合于高通量的分析方法，包括流式细胞仪。重要的是，pHluorin标签是研究在活细胞内吞的事件，从而使内吞作用和在野生型和突变株的内吞作用的比较的量化的多功能工具。
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Protocol
1.解决方案和媒体
- 准备以下股票，媒体和板：
- 制备10倍的YNB，溶解67克酵母氮碱在1升水中缺乏氨基酸。通过0.22μm硝酸纤维素过滤器进行过滤灭菌。
- 用2％葡萄糖（从无菌50％w / v的股票）和1x氨基酸/养分混合物制备使用1倍的YNB（从10倍股票）的YNB培养基（从100倍的库存，见步骤1.1.4）。质粒的选择，可以根据需要省略单个氨基酸或营养物。为Mup1表达的诱导，另外从氨基酸/营养混合物省略蛋氨酸。
- 准备使用1X YNB（从10倍股票）2％葡萄糖的YNB平板，（从一个无菌的50％w / v的股票），0.7克/升氨基酸/营养混合物（见步骤1.1.5）和2.5％琼脂。通过高压灭菌25克琼脂和0.7g每860毫升水氨基酸/养分混合物的制备平板培养基。使混合物冷却到55℃，然后加入100 ml 10X鼎贞和40毫升邻°F±50％的葡萄糖。倾注平板（约30毫升，每10cm皿介质的），允许该介质在室温下固化，并存储板在4℃。
- 通过溶解在100毫升的去离子水中的下列制备（用于液体介质）100×氨基酸/营养原液：0.1克L-蛋氨酸，0.3 G各自L-亮氨酸和L-赖氨酸，和0.2g各L组氨酸的，（根据需要为特定的菌株可以包括其他氨基酸和营养物）L-色氨酸，腺嘌呤和尿嘧啶。如果需要的话，以溶解用文火，并通过0.45μm的硝酸纤维素滤膜除菌。在室温下储存避光。对于质粒的选择，准备根据需要缺乏具体的元器件库存解决方案。
- 通过组合制备氨基酸/营养混合物（对于板）以下为0.5g腺嘌呤，4-克L-亮氨酸，和2克每L-组氨酸，L-赖氨酸，L-蛋氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和尿嘧啶。用研钵和研杵研磨，并与亲存储tection避光。质粒的选择，制备缺乏特定组件根据需要的混合物，并且使用0.7克每升平板培养基（见步骤1.1.3）的氨基酸的混合物。
- 通过用刀豆蛋白A（ConA）的滑动的表面涂覆制备用于显微镜8孔腔室载玻片。到室幻灯片的各孔中，添加25μl的2mg / ml的刀豆溶解在水中。用移液管尖端，传播刀豆横跨孔的底部表面，然后允许在室温下将载玻片风干至少4-8小时。理想情况下，用刀豆涂层的24小时之内玻片。
- 生成与在帧使用聚合酶链式反应（PCR）在Longtine 等人描述的基于积分法GFP或pHluorin的融合到感兴趣的内吞货物酵母菌株。和Goldstein和国琛25,26。
注：含pHluorin标记与抗性基因的卡那霉素（KANMX6）和诺尔丝菌素磁带质粒（- 扩增含有与含有特定的基因组整合20,25的部位附加序列的引物的选择标记GFP或pHluorin盒。
- 变换所得到的PCR产物进用锂醋酸盐法27所需的酵母菌株。
- 通过在含有适当的药物的YPD平板上生长的细胞中选择的盒的整合。为了制备板，高压釜10g酵母提取物，20g蛋白胨，0.1g的色氨酸和960毫升水中25克琼脂。浇注板之前，允许该混合物冷却到55℃，再加入毫升40 50％葡萄糖，要么G418至200微克/毫升为KANMX6选择的最终浓度，或诺尔丝菌素至100微克/毫升的最终浓度NATMX4选择。
- 通过PCR确认在单个菌落的GFP或pHluorin标签的集成和/或使用抗GFP抗体Western印迹，以及通过检测标记蛋白的荧光显微镜20。
注意：特定酵母菌株，并在此研究中使用的质粒在表1和2分别列出。
2.端点检测方法的组成性内在化吞货的稳态荧光
- 接种细胞（〜3小菌落）在5毫升的YNB培养基中缺乏所需质粒维护（如果适用的话）氨基酸或营养物。生长细胞为16-24小时在轨道摇动培养箱中于30℃，用250rpm振荡。可替代地，细胞的条纹一〜1-2毫米菌落到缺乏氨基酸或质粒选择的营养物质，一个YNB板，并在30℃下生长的细胞过夜。
- 测量使用分光光度计各过夜培养物的密度（OD 600）。准备在YNB中0.35-0.4 OD 600 /毫升5毫升稀释缺乏解放军氨基酸或营养SMID维护和生长约3小时，在30℃振荡。如果使用电池放在盘子里挑染，跳过此步骤，步骤2.4（见下文）进行。
- 测量细胞密度（OD 600），它们现在应该0.6-1.0的OD 600 /毫升之间。转移1.5毫升培养到微量离心管中，并沉淀细胞以8,000rpm（6800 xg离心）2分钟。除去1475微升上清液。
- 带来的细胞的荧光显微镜。每个样品前成像，在剩余的培养基重悬细胞准备的幻灯片，并安装在盖玻片3微升细胞悬液。可替代地，如在协议3如下所述，使用的YNB培养基以适合质粒的选择制备8-孔腔式载玻片。理想的情况下，用100X，1.4或更高数值孔径（NA）油浸物镜透镜，12或16位的摄像头，以及激发/发射过滤器图像的细胞的GFP荧光优化。
注意：如果使用细胞裸奔Ø增长呐板，通过将3微升新鲜YNB培养基上盖玻片准备的幻灯片。用移液管尖端，收集细胞的一个小的菌落从平板，分散细胞进入的YNB培养基中，紧接在成像之前安装在载玻片上所得的悬浮液中。 - 图像单元为每个条件的4-6无规领域，使用相同的采集参数（ 即 ，过滤器组和曝光时间）为一个实验中的所有图片。
注：收集明或DIC图像的每个字段可以为那里的pHluorin信号在MVB和空泡车厢淬火细胞有帮助的。 - 量化至少30-50细胞每个条件的荧光强度（见协议5）。
3.动力学检定为货物的内吞作用的定量离岗管制吞
- 在5毫升的YNB培养基中接种酵母细胞（约2毫米每菌落直径）为2-3菌落缺乏甲硫氨酸和添加itional氨基酸或营养物用于维持质粒的选择。成长培养16-24小时，在30℃振荡。
注：本文为研究内吞调节蛋白质的货物将协议利用蛋氨酸通透，Mup1的。该经过调节的内吞作用的其他货物也适合用pHluorin标记（例如，尿嘧啶通透Fur4，其积聚在在不存在尿嘧啶的质膜，并且响应内化于外部施加的尿嘧啶）;对于这些货物，媒体条件应进行修改，以反映该货物的具体表达，诱导和内在条件。 - 成像前约3小时测量每个过夜培养的密度（OD 600）。在YNB培养基0.35-0.4 OD 600 / ml的缺乏甲硫氨酸和另外的氨基酸或营养素质粒保持准备5毫升稀释，并在30℃振荡生长。
- 预平衡的万分之一步3.2的3小时孵化过程中应付的环境室或加热阶段（如果可用）至30℃。
- 传送1 ml的细胞培养至微量离心管中，并以8,000rpm（6800 xg离心）2分钟沉淀细胞。取出975微升上清液。
- 准备成像（协议1.2）一个刀豆处理，8孔玻璃底室幻灯片。
- 添加YNB培养基的200微升缺乏甲硫氨酸和另外的氨基酸或营养物进行质粒选择到每个孔中。悬浮来自步骤3.4中剩余的上清液中的细胞沉淀，并下降2.5微升细胞悬浮液到每个的中心孔。分散在整个井的表面细胞吹打上下，并允许细胞沉降5-10分钟。
- 放在平衡至30°C（见步骤3.3），倒置荧光显微镜室幻灯片。找到使用明照明细胞领域。
- 添加YNB培养基50微升含有100微克/毫升的甲硫氨酸（预热至30℃）至200微升培养基中的井，以获得20微克/ ml的终蛋氨酸浓度。避免破坏在井中介质以防止细胞从底部浮动。
- 允许开始成像之前将细胞平衡2分钟。立即捕捉第一图像之前，调整显微镜到所需焦平面（通常，赤道焦平面效果最好）。
- 获得在5分钟的间隔GFP和明（或DIC）图像45-60分钟，使用相同的采集参数为一个时间序列中的所有图像（例如，100X 1.4 NA油浸物镜和500毫秒采集时间使用GFP的滤波器，100使用DIC过滤毫秒采集时间）。
注：如果在显微镜的阶段和成像软件不允许焦平面漂移的自动修正，它可能需要手动重新调整前各摄像时刻的焦点。此外，收购时间将显微镜之间有所不同，因为在照明和过滤器的差异，和最佳条件应该确定之前手动开始实验。如果使用比Mup1其他的内吞货物，可能有必要修改的采集时间和成像时间间隔，以及在实验的持续时间，以反映该货物的内化动力学。 - 量化在每个时间点的单个细胞的荧光强度（见协议5），并表达值作为第一图像的初始强度的百分比。
4.端点检测方法的吞货物的定量的离岗管制吞
- 在协议3所述准备成像细胞（步骤3.1到3.6）。
- 图片立即添加蛋氨酸，使用明和GFP过滤器集之前细胞每个条件的4-5个随机领域。
- 添加YNB培养基50微升含有100微克/毫升甲硫氨酸（战前MED至30℃）至200微升培养基中的井，以获得20微克/ ml的终蛋氨酸浓度。避免破坏在井中介质以防止细胞从底部浮动。
- 加入甲硫氨酸后图像4-5细胞的随机字段30分钟，用相同的采集参数为0分钟的时间点（步骤4.2）。
- 量化至少30-50细胞对每个时间点的荧光强度（见协议5）。快递值Mup1-pHluorin后，用公式30分钟内在的百分比：[0分钟时平均强度 - 在30分钟平均强度] / [平均强度为0分]×100％。
注意：可以将通过错开每个测定的开始时间同时执行多达八个端点测定表3提供了八个同时测定的一例的工作流程。
5.收购后分析
- 从采集软件导出图像为16位的标记图像文件格式（.TIF或.TIFF格式）。
注：其他的文件格式也可以是合适的，并且最好应该使用无损压缩算法。 8位图像一般不适合用于定量目的。 - 使用ImageJ软件（免费提供的“打开”选项，在“文件”菜单中打开文件。使用荧光图像进行定量和明/ DIC图像作为参考，以确定细胞的位置，以排除死细胞（如果存在的话），这似乎比当由DIC查看和用GFP激发/发射滤光片观察时都自身荧光活细胞暗。
- 执行荧光图像上的背景减除。对于具有不均匀的背景信号图像，请使用“Process菜单”中的“背景减法”的算法。使用默认设置（轧制的50像素球半径），这通常是足够的用于定量目的。
注：另一种backgro与统一的背景图像UND减法步骤5.3.1.-5.3.2描述;然而，上述方法也适用于统一的背景。- 为具有均匀的背景图像（ 即 ，背景强度是在所有的边缘，并在图像的中心大致恒定），执行手动背景扣除。点击在主ImageJ的窗口中找到的“徒手选择”按钮，并且不包含细胞的图像内选择3-5随机区域。
- 打开位于“分析”菜单中的“设置测量”功能，选择“平均灰度值'参数，并测量使用”测量“功能（在”分析“菜单中找到）的强度值。计算从3-5测量区的平均值，并从该图像中的所有后续测量中减去。
- 对于动力学测定法量化（协议3），生成用于添一个单一的，堆叠的图像E系列。从时间顺序每个时间点打开荧光图像，并生成使用“图像叠”功能栈（在“图像”菜单中的栈子菜单下）。
- 外形采用徒手选择工具电池，确保包括细胞尽可能之外的整个单元格，但尽可能少的区域。
- 测量以下参数：'区，集成密度“和”平均灰度值“。使用“设置测量”功能，位于“分析”菜单中选择参数。
注：集成密度对应于所有的像素强度的总和所选择的区域内，和平均灰度值对应于[集成密度/区]，它校正强度值为细胞大小。 - 打开“工具”子菜单下的“投资回报率经理”位于“分析”菜单。在投资回报率管理器窗口中，单击“添加”按钮，进入高亮显示的区域选择性n作为感兴趣区域（ROI）的新区域。
- 重复步骤5.4至5.6为图像中的剩余的细胞。排除所评定明/ DIC和荧光（死细胞出现在DIC的图像更暗，并具有用GFP激发/发射观看时自身荧光细胞质信号;参见图2F）的任何死细胞，并且触摸所述图像的边缘的任何细胞。通过点击“投资回报率管理”窗口中的“更多”按钮保存所选的ROI为.zip文件，所有的测量导出到电子表格或统计分析软件。
- 对于动力学测定法量化（协议3），轮廓和如在步骤5.4和5.5中所述测量从初始时间点的细胞。使用相同的投资回报率在实验中所有后续时间点的测量。
- 端点测定（协议2和4），测量的最小30-50细胞为每个条件的。为至少2-3个图像执行量化，并且包括在每所有的细胞图像符合在步骤5.8在分析中列出的标准。
- 评估使用单向ANOVA，接着Tukey多重比较检验事后分析样品之间的统计显着性。
通过流式细胞仪Mup1-pHluorin内吞6.人口分析
- 在0.5ml缺乏甲硫氨酸和另外的氨基酸或营养物用于维持质粒选择的YNB培养基中接种酵母细胞（约2毫米每菌落直径）2-3菌落。生长细胞在5ml圆底试管16-24小时，在30℃的辊筒。
- 添加1.5毫升YNB培养基缺乏甲硫氨酸和另外的氨基酸或营养质粒保养，并在30℃下生长在辊筒额外的3小时。
- 传送1萃取池的每一个由两个5毫升的圆底管中。添加0.25毫升的YNB -Met介质与所述第一管（-Met条件），和0.25的YNB培养基中含有100μg/ ml的甲硫氨酸至第二管，得到的20微克/毫升（+蛋氨酸条件）的终蛋氨酸浓度。孵育细胞在30℃下在转鼓45分钟。
- 分析由流动池术，选择前向散射（FS），为细胞大小的量度，并从异硫氰酸荧光素（FITC）滤波器作为货物内化的量度Mup1-pHluorin荧光强度。
- 使用滑块按钮调整FS和FITC通道的电压，以优化检测酵母细胞的尺寸范围和荧光强度使用（对于这些实验中，使用的设置是为FS的50伏和400 V代表FITC）。
注：电压为两个通道将根据流式细胞仪中使用的流变化。此步骤应之前或甲硫氨酸（步骤6.3）的45分钟处理期间进行。 - 测量FS和荧光强度为从每个条件10,000个细胞，使用高流量设定。产生FS对萤光灯的散点图rescence强度：点击“添加图形”，选择FITC（X轴）和FS（Y轴）和图1000点（该软件将1000单元格显示值，即使测定10,000个细胞）。
注：对于最大的一致性，分析细胞加入甲硫氨酸后45-50分钟;涉及大量样品的实验中，错开加入甲硫氨酸以适应流式细胞分析所需的时间。 - 包括野生型（WT）细胞作为对照-Met和+蛋氨酸的条件。使用栅函数，分配使用WT +蛋氨酸条件，使得最亮的细胞的约5％下降到门的右侧的垂直栅极。使用此门在实验中所有其他条件。
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Representative Results
稳态定位，定量的内在组成货物内吞蛋白质STE3的
为了演示在活细胞中，嵌合GFP和pHluorin融合与STE3，在酵母α-因子信息素受体的胞质C-末端尾部的本地化该pHluorin标签的货物可用于细胞内吞作用的定量，进行了比较。 STE3是一个G蛋白偶联受体（GPCR），其组成型转运到质膜，内化，并靶向液泡降解28。因此，稳态条件下，大多数STE3的定位于液泡腔，如在表达STE3-GFP（ 图2A）的野生型（WT）细胞可见。相反，缺乏编码四个网格蛋白结合接头蛋白ENT1，ENT2，Yap1801和Yap1802（该基因的细胞ENT1ΔENT2Δyap1801Δyap1802Δ，以下简称为4Δ）失败在胞吞作用29的部位，以稳定网格蛋白，并且是在CME 30严重故障。 4Δ细胞所需要的底物蛋白或ENT1或ENT2的N-末端的同源性（ENTH）域生存能力30,31的表达。的ENTH结构域是不足以在4Δ细胞内吞作用，如通过在表达ENT1（ 图2A）8,30的ENTH结构域4Δ+ ENTH1细胞质膜STE3-GFP的保留;在4Δ+ ENTH1细胞相似质膜保留已经观察到对于其他的内吞货物，包括STE2-GFP（α-因子信息素受体）和Mup1-GFP或Mup1-pHluorin（甲硫氨酸通透）8,18。与此相反，从在4Δ细胞的质粒（4Δ+ ENT1）全长ENT1的表达恢复内吞作用和STE3-GFP的定位于液泡。 4Δ+ ENTH1细胞最近使用过的我呐遗传筛选，以确定在酵母中一个CIE途径依赖于肌动蛋白的调节性GTP酶RHO1及其GEF，ROM1，以及formin Bni1和涉及货物分拣8,18蛋白的α休止家族的成员。在CIE在改善STE3-GFP（ 图2A）的内部4Δ+ ENTH1细胞的作用，表达ROM1的或α-休止LDB19从高拷贝质粒相一致。
表达STE3-GFP或其他GFP标记的内吞货物细胞有因积累和绿色荧光蛋白标记的蛋白酶抗性明亮空泡。与此相反，表达STE3-pHluorin细胞具有由于pHluorin标签的淬火在酸性环境中20液泡荧光的非常低的水平。如先前看到的，WT和4Δ+ ENT1细胞通过荧光显微镜（ 图2B）显示出非常小的可检测的STE3-pHluorin。与此相反，STE3-pHluorin是在4Δ+ ENTH1细胞的质膜容易检测，而液泡STE3-pHluorin仍然在所有情况下几乎检测不到。 ROM1或LDB19的高拷贝表达减少可检测STE3-pHluorin的量在细胞表面，类似于用STE3-GFP的结果，尽管液泡STE3-pHluorin仍然在所有情况下几乎检测不到。
比较GFP-和的有效性pHluorin标签的货物的工具用于定量细胞中的内吞能力的变化，STE3-GFP和STE3-pHluorin的全细胞荧光在WT和4Δ细胞中测量。虽然在STE3-GFP 定位的变化是由镜（ 图2A）容易检测到，在整体的荧光强度差异不WT，4Δ+ ENT1并用空载体（ 图2C）20变换4Δ+ ENTH1细胞间有统计学显著。 LikewisE，矢量，ROM1和LDB19转化4Δ+ ENTH1细胞也有类似的全细胞荧光强度。值得注意的是，与ROM1或LDB19转化4Δ+ ENTH1细胞比野生型细胞（ 图2C）8,18显著调光器;但是，通过免疫印迹（ 图2E）所评估STE3-GFP蛋白水平相似。而在强度差可能是部分由于在液泡的大小或形态的变化，或者在液泡中的GFP标记的保留的差异，STE3-GFP荧光的定量不反映荧光显微镜观察在本地化的改变（ 图2A）。相比之下，STE3-pHluorin强度的量化证明与载体转化4Δ+ ENTH1细胞比WT或4Δ+ ENT1细胞显著亮，ROM1或4Δ+ ENTH1细胞LDB19高拷贝表达减少STE3-pHluorin强度即类似于WT和4Δ+ ENT1（ 图2D）的水平。因此，稳态STE3-pHluorin强度的定量准确地反映在荧光显微镜下观察差异化定位。
通过调节内吞货，Mup1动力学内化分析
荧光强度的定量组成内在货物在稳态可以揭示相比野生型细胞突变的细胞的内吞能力的差异。然而，可能的是一些货物可能达到在WT和内吞突变的细胞相同的稳态分布和强度，即使突变细胞具有对货物内化于细胞内吞作用或慢动力学延迟。响应于特定的刺激物或配体进行调节的内吞作用相反，pHluorin标签的货物，可以用于监视内吞作用的动力学。为了这个目的，高亲和力甲硫氨酸通透，Mup1，内化监测32。在不存在细胞外甲硫氨酸，Mup1表达被上调，并且所述通透被保留在质膜;在加入甲硫氨酸至培养基中，Mup1经历快速内化和靶向液泡13。
并监控Mup1内化的动力学，从基因组基因座表达Mup1-GFP或Mup1-pHluorin WT菌株在缺乏甲硫氨酸以积累荧光Mup1在质膜（ 图3A，0分钟时间点）中生长。细胞的时间推移成像，然后在5分钟的间隔在不存在或甲硫氨酸的存在下进行并监控货物内化和在荧光变化。正如预期的那样，在没有甲硫氨酸的成像GFP-和pHluorin标签的Mup1保持在质膜˚F或整个45分钟的观察期20。与此相反，在甲硫氨酸的存在下成像的细胞显示从细胞表面的荧光信号的逐行枯竭，与货物的内化是一致的。值得注意的是，Mup1-GFP荧光在内部结构（ 即 ，核内体和液泡）积累，而Mup1-pHluorin定位于内部punctae那可能对应于早期内涵体，但在液泡未见。
当荧光物在所有的时间点为单个细胞进行定量，Mup1-GFP和Mup1-pHluorin强度呈现45分钟的实验过程中在没有外部施加的蛋氨酸变化不大，与蛋白质相一致剩余稳定地定位于质膜（ 图3B）。与此相反，全细胞Mup1-pHluorin强度迅速在甲硫氨酸的存在下降低，使得在fluorescenc减少50％后大约20-25分钟观察到ë强度，并观察到后约40分钟; 20减少80％。 Mup1-GFP细胞也表现出在加入甲硫氨酸的荧光强度降低;然而，荧光损失的动力学相比，那些Mup1-pHluorin的，使得在强度降低50％40分钟后只观察到被延迟。 如图3A中看到的，Mup1-GFP是在此时质膜几乎检测不到，表示持续液泡GFP荧光在细胞表面防止内吞事件的精确定量。
通过调节内吞货，Mup1端点检测
除了内吞作用的定量，动力学测定法，如上所述，调节的内吞货物如Mup1也可以用于端点测定，类似于量化稳态STE3-pHluorin力度。为了这个目的，对于Mup1-pHluorin内化的定量测定被修改，以允许从立即加入甲硫氨酸8,18的后或30分钟前成像的细胞群的平均荧光强度的比较。这种方法允许Mup1的WT和内吞突变的细胞之间的内在的比例比较。
与动力学测定的结果一致（ 图3），Mup1-pHluorin迅速从野生型细胞（ 图4A），以使得Mup1-pHluorin的约60％被加入甲硫氨酸后内化30分钟质膜（贫图4B）。正如所料，Mup1-pHluorin内化是在4 + ENT1细胞同样有效，而内化于4Δ+ ENTH1细胞，用在细胞内吞一个严重缺陷一致显著降低。高拷贝表达ROM1或α-休止LDB19，其经由两个CME特别需要Mup1内化和CIE的通路13,18，改进Mup1-pHluorin的内化，用它们促进内吞在4Δ+ ENTH1细胞18的能力相一致。值得注意的是，虽然在4Δ+ ENTH1细胞稳态STE3-pHluorin强度表达高拷贝ROM1或LDB19来自WT或4Δ+ ENT1细胞无法区分，Mup1-pHluorin的内只有部分在4Δ+ ENTH1细胞表达的高拷贝改进ROM1或LDB19（ 图4C）。因此，这些数据表明，动能和/或端点测定可以揭示一些货物在WT和突变体菌株之间的内吞率的差异，即使其他货物的类似稳态分布可以在相同的菌株来实现。
Mup1-PHL的人口为基础的分析uorin化流式细胞仪
较大的使用流式细胞仪可以提供对通过显微镜执行用于货物内化动力学和端点检测的替代细胞群的高通量分析。为了这个目的，Mup1-pHluorin的荧光强度在从在无甲硫氨酸的生长的培养物（WT -Met，这应该是“亮”），或在甲硫氨酸的存在下进行45分钟（WT + Met的野生型细胞比较，这应该是“模糊”相比，基于荧光强度的减少80％， 如图3B所示）未经处理的细胞。通过流式细胞术，一个垂直栅施加到WT +蛋氨酸状态，其中细胞的〜5％载在栅的右手侧，而人口（ 图5A和5B中对应于最亮的细胞分析后红色的人口）。当施加相同的栅极向WT -Met条件，将细胞的约65％下降到明亮的类别，这表明流式细胞仪可用于前和加入甲硫氨酸后容易地观察细胞群之间Mup1-pHluorin荧光强度的差异。与此相反，亮与暗的细胞的分布利用施加到WT +蛋氨酸人口相同的栅极，与有缺陷的细胞内吞作用一致是4Δ+ ENTH1 -Met和+ Met的条件没有区别。由此，流式细胞仪可检测的细胞内吞能力的变化，并允许大量人口的细胞的快速分析。重要的是，流式细胞仪，也可以在遗传筛选用作工具进行排序和突变的细胞与有缺陷的细胞内吞作用的选择（K. Wrasman和B德兰德，手稿中制备）33。
图1：
图 2： 在野生型和内吞突变的细胞定位，定量STE3-GFP和STE3-pHluorin的 （A）WT，4Δ+ ENT1和4Δ+ ENTH1细胞表达的基因组编码，STE3-GFP和载体，高拷贝ROM1或高拷贝LDB19转化指示用荧光显微镜（上排）或DIC（下排）的可视化。 STE3-GFP图像进行了调整，以相同的最大和最小强度，以允许STE3本地化的直接比较。表达基因组编码，STE3-pHluorin（B）WT，4Δ+ ENT1和4Δ+ ENTH1细胞转化和在面板中的描述成像。比例尺= 2微米。 （C，D），用于STE3-GFP（C）和STE3-pHluorin（D）的荧光强度的定量菌株在图A和B.对于每个条件使用时，全细胞荧光最少40个细胞的定量。值进行校正的单元尺寸，并以任意单位（AU）以平均值±SEM表示（*** P <0.001与WT相比;†††P <0.001相比4Δ+ ENTH1 +载体）。 （E）Relativ在WT，4Δ+ ENT1和4Δ+ ENTH1细胞评估STE3-GFP电子表达载体，高拷贝ROM1或高拷贝LDB19转化所示。如先前20所述制备细胞提取物，和每个样品的等量通过SDS-PAGE分离。 STE3-GFP表达通过用抗GFP抗体免疫印迹评估，蛋白质加载用抗GAPDH评估。 （F）的表达的基因组编码的STE3-GFP通过荧光显微镜（STE3-GFP面板）和DIC光学观察，以由箭头所示的死细胞的野生型细胞。死细胞出现自身荧光在GFP过滤器，并且当由DIC观察更暗。比例尺= 2微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：Mup1-GFP和Mup1-pHluorin内化的动力学测定 （A）中的野生型细胞中表达的基因组编码的Mup1-GFP（上部两个面板）或Mup1-pHluorin（低级两个面板）中生长至中期对数生长期中YNB培养基缺乏甲硫氨酸诱导Mup1表达并保留在质膜。然后将细胞用荧光显微镜拍摄在不存在每5分钟（ - 蛋氨酸）或存在（+蛋氨酸）20微克/毫升的蛋氨酸。一个条件中的每个时间点，相同的最大和最小强度值被应用，以允许荧光强度和本地化的比较。 0，5，10，20和40分钟的时间点被示出为在所有条件下指示。比例尺= 2微米。在野生型细胞（B）Mup1-GFP和Mup1-pHluorin定量化从A组。或Mup1-pHluo; - （+ MET，蓝色钻石相遇，紫色的正方形）Mup1-GFP的全细胞荧光强度RIN（ - 蛋氨酸，绿色三角形+蛋氨酸，红色圆圈）溶液在5分钟间隔拍摄个体细胞中测量，并表示为初始荧光强度的百分比（平均值±SEM，每组n =条件6个细胞）。从普罗瑟等转载。 （2010年）20与出版商的许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：Mup1-pHluorin内化的端点测定 （A）WT，，4Δ+ ENT1和4Δ+ ENTH1细胞中表达基因组编码，Mup1-pHluorin与向量，高拷贝ROM1或高拷贝LDB19转化所指示中生长到中在YNB中缺乏蛋氨酸-logarithmic阶段。细胞随机领域被fluorescenc成像 （ - 蛋氨酸）在紧接显微术或之后（+ MET）加入20微克/毫升蛋氨酸30分钟。所有图像进行了调整，以相同的最大和最小强度值。比例尺= 2微米。从A组细胞Mup1-pHluorin内化（B）量化。对于各条件，全细胞测定荧光强度为至少40个细胞的和为细胞大小校正。 Mup1-pHluorin的内化的百分比是通过比较之前和之后用蛋氨酸30分钟处理的意思的强度值计算出来的。值显示为平均值±SEM（n = 4时; *** P <0.001与WT相比;†P <0.05相比4Δ+ ENTH1 +载体）。这个数字已经从普罗瑟等进行修改。 （2015年）18与出版商的许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5： 通过流式细胞术Mup1-pHuorin内化的人口分析 （A）的WT和4Δ+ ENTH1细胞生长至中期对数生长期中的YNB培养基缺乏蛋氨酸。 （ - 蛋氨酸）20微克/毫升甲硫氨酸或存在（+蛋氨酸）分析之前由流动45分钟术细胞然后在不存在下温育。对于各条件，前向散射（任意单位，AU）作图针对荧光强度（AU，使用FITC标记过滤器）为1,000个细胞进行测定的总10,000个细胞的。群通过施加一个垂直栅（蓝色箭头）的WT +蛋氨酸条件，其中，最亮的细胞（红色示出）的大约5％的在栅的右侧下降进一步分析。然后用于WT +蛋氨酸条件所产生的选通被施加到其余的条件，使比较样本分布。 （B）昏暗的细胞（黑点，门的左边）和明亮的细胞WT和4Δ+ ENTH1百分比（红点，到门的右侧）摘要±面板A中遇见试验。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 应变 | 基因型 | 资源 |
| SEY6210 一个 | MATαHIS3-Δ200TRP1-Δ901leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 SUC2-Δ9 | 实验室质粒 |
| BWY2858 | STE3-GFP :: KANMX6 | 普罗瑟等人 （2010）16 |
| BWY2995 | STE3-pHluorin :: KANMX6 | P罗瑟等人 （2010）16 |
| BWY3036 | ent1Δ:: LEU2ent2Δ:: HIS3yap1801Δ:: HIS3yap1802Δ:: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | 普罗瑟等人 （2010）16 |
| BWY3037 | ent1Δ:: LEU2ent2Δ:: HIS3yap1801Δ:: HIS3yap1802Δ:: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | 普罗瑟等人 （2010）16 |
| BWY3399 | ent1Δ:: LEU2ent2Δ:: HIS3yap1801Δ:: HIS3yap1802Δ:: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | 普罗瑟等人 （2010）16 |
| BWY3400 | ent1Δ:: LEU2ent2Δ:: HIS3yap1801Δ:: HIS3yap1802Δ:: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | 普罗瑟等人 （2010）16 |
| BWY3817 | MUP1-GFP :: KANMX6 | 镨osser 等人 （2010）16 |
| BWY3818 | MUP1-pHluorin :: KANMX6 | 普罗瑟等人 （2010）16 |
| BWY4153 | ent1Δ:: LEU2ent2Δ:: HIS3yap1801Δ:: HIS3yap1802Δ:: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | 普罗瑟等人 （2011）7 |
| BWY4154 | ent1Δ:: LEU2ent2Δ:: HIS3yap1801Δ:: HIS3yap1802Δ:: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | 普罗瑟等人 （2011）7 |
| 一个在这项研究中使用的所有菌株是等基因来SEY6210除了在所指示的位点。 | ||
表1：本研究中使用的酵母菌株。
| 质粒 | 描述 | 资源 |
| pRS426 | 2μURA3 | 西科尔斯基和Hieter，1989年 |
| pBW0768 | pRS414 :: ENT1 [CEN TRP1] | pEnt1，实验室质粒 |
| pBW0778 | pRS414 :: ENT1（aa1-151）CEN TRP1] | pENTH1，实验室质粒 |
| pBW1571 | pFA6a-pHluorin-KANMX6 | 普罗瑟等人 （2010）16 |
| pBW2053 | YEp24 :: ROM1 [2μURA3] | PROM1（普罗瑟等 ，2011）7 |
| pRS426-Ldb19 | LDB19prom-LDB19 [2μURA3] | 普罗瑟等人 （2015）15 |
| pFA6a-GFP（S65T）-kanMX6 | 用于在酵母中的GFP标记基于PCR的pFA6a-GFP-KANMX6，整合质粒 | Longtine等人（1998年）21 |
表2：本研究中使用的质粒。
| 时间（min） | 行动（S） |
| -5 | 图片样品1（-Met） |
| 0 | 添加甲硫氨酸样品1 |
| 图片样品2（-Met） | |
| 五 | 添加蛋氨酸样品2 |
| 图像样本3（-Met） | |
| 10 | 添加蛋氨酸样品3 |
| 图像样本4（-Met） | |
| 15 | 添加蛋氨酸样品4 |
| 图片样品5（-Met） | |
| 20 | 加蛋氨酸样品5 |
| 图片样品6（-Met） | |
| 25 | 添加蛋氨酸样品6 |
| 图像样本7（-Met） | |
| 三十 | 添加蛋氨酸样品7 |
| 图像样本8（-Met） | |
| 图片样品1（+ MET） | |
| 35 | 添加蛋氨酸样品8 |
| 图片样品2（+ MET） | |
| 40 | 图像样本3（+ MET） |
| 45 | 图像样本4（+ MET） |
| 50 | 图片样品5（+ MET） |
| 55 | 图片样品6（+ MET） |
| 60 | 图像样本7（+ MET） |
| 65 | 图像样本8（+ MET） |
表3：示例工作流程惊人的8 Mup1-pHluorin端点检测。
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Discussion
pHluorin的用于在酵母细胞内吞事件量化应用利用，其中所述荧光标签融合到蛋白质（ 图1A）的胞质尾跨膜货物的。对于此处所描述的测定法中，当pHluorin标签暴露于中性的环境中，但是成为当pHluorin标签遇到酸性条件猝灭货物是明亮的荧光。因此，为pHluorin标签的内吞货物容易在质膜的胞质面和早期内涵体检测，但是当掺入管腔MVB囊泡或在递送到液泡腔变成“暗”。在一般情况下，新合成的内吞货物可能离开内质网（ER）和GFP和它的许多变体已经完全成熟之前到达质膜;由此，pHluorin标签的尚未达到在细胞表面被预测货物保持检测不到的，除非从ER或高尔基体出口为impaired。
pHluorin标记的内吞货物如STE3和Mup1使用提供了便利一些参与酵母CIE途径（ 图1B）8,18蛋白质的表征。具体地，在本文所描述的方法已被用于证明产量增加的肌动蛋白-调节GTP酶RHO1及其GEF ROM1促进内吞作用在各种酵母突变体在CME 8缺陷。此外，pHluorin标签的货物被最近使用定量证明α-抑制蛋白，在CME 13-15,34-36已成熟的角色，在这两个CME和CIE打货选择性作用，机制上有不同的功能在两种途径18。
对于本文所述的协议，几个重要的因素应以获得一致的，定量的结果加以考虑。首先，Mup1-GFP或Mup1-pHluorin表达和fluores萤光可能会降低酵母细胞接近或进入静止生长期（未发表的结果）;由此，从过夜培养物中生长的细胞应稀释和再生长额外3小时（参见步骤3.1-3.2和6.1-6.2）。另外，错开在端点测定或用于通过流式细胞分析多种实验条件或菌株时，它收集甲硫氨酸治疗的相同的持续时间之后的所有样本的数据，以允许各个条件之间的比较是重要的。对采集后分析，量化应使用16位的图像来执行，因为转换为8位格式导致数据丢失，可以影响荧光强度的值。此外，背景减除应之前量化（步骤5.3）中进行，由于背景信号可以显著闭塞样品之间的强度差异。
而pHluorin标记STE3和Mup1已被证明适合于定量，不所有货物将是非常适合pHluorin标记。例如，曾试图以标记的α因子受体STE2已产生不一致的定量结果，可能是由于相比于STE3或Mup1（未发表的结果）的STE2-pHluorin的低荧光强度，虽然它可能是串联pHluorin标签可以改善的信号强度。此外，配体诱导的内吞作用非常缓慢速率货物可能并不适合于pHluorin标记为量化，特别是如果内化的半时间比酵母细胞周期（大约90分钟）更长。对于这样的货物，在荧光的减少可能出现从内吞作用和/或从分裂期间的母亲和女儿的细胞之间的货物的划分。从而，测试的个人感兴趣货物，以便建议以确定它们的表达和动力学是否适合pHluorin标记和定量。
虽然使用PHL最近的研究uorin主要集中于在质膜内吞的事件，pHluorin标签的货物，可以用于研究内吞途径购买贩卖事件。例如，Mup1-pHluorin已成功在流动中使用ESCRT介导的货物分类到MVBs 37的流式细胞仪为基础的测定，由于pHluorin标签变得在掺入淬入MVB管腔囊泡20。此方法类似于腔内沉积（LUCID）测定的更最近描述的萤光素酶报道，这使得利用货物的具有细胞质荧光素酶标记，以产生在萤光素38,39的存在的生物发光信号。类似pHluorin荧光在纳入MVB管腔囊泡淬火，生物发光的LUCID分析是建立在荧光素标记的掺入减毒到MVB囊泡。而pHluorin和清晰测定是概念上相似，pHluorin标签的货物，可以用于研究细胞内吞作用和MVB成熟我ñ完整细胞。
替代方法为内吞作用的量化的存在，并提供了对野生型和内吞突变的细胞的货物内化的速率的有价值的信息。实例包括放射性标记的配体如α因子（其结合到信息素受体STE2）和尿嘧啶40,41，或监测内吞货物降解速率（这是由透Fur4内在）如STE3作为监控摄取它们被内化并输送到液泡42。这些生化方法需要细胞裂解，并因此不适合用于在活细胞中直接量化。备选地，荧光标记的α因子，流体相的染料荧光黄，或苯乙烯基染料FM4-64可用于在活细胞中的可视化的内吞作用，但不允许内源性表达的货物蛋白40,43,44的直接监控。对于这些方法，持久性的荧光在弗吉尼亚州与GFP看到，cuole内腔可量化复杂。另外，也可以通过测量全细胞的荧光强度和从细胞质和内体/液泡区室中减去信号要用于内吞作用的定量GFP标记货物;然而，内涵体和液泡靠近质膜往往。与此相反，pHluorin标签的内吞货物在MVB /液泡区室，这可以是用于相比于更广泛的应用的GFP标记贩卖事件量化明显的优势骤冷。我们未来的研究将进一步扩展，在酵母内吞途径和货物分拣的现有知识来识别，有助于CME和CIE其他因素，并了解规范货物分拣决策的机制。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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