Abstract
Grönt fluorescerande protein (GFP) och dess varianter används allmänt verktyg för att studera protein lokalisering och dynamik händelser såsom cytoskelettala ombyggnad och vesikulär handel med levande celler. Kvantitativa metoder använder chimära GFP fusioner har utvecklats för många tillämpningar; dock GFP något resistenta mot proteolys, därmed dess fluorescens kvarstår i lysosomen / vakuolen, som kan hindra kvantifiering av last handel i den endocytiska vägen. En alternativ metod för att kvantifiera endocytos och post-endocytiska trafficking händelser utnyttjar superecliptic pHluorin, en pH-känslig variant av GFP som släckes i sura miljöer. Chimär fusion av pHluorin till den cytoplasmatiska svansen av translast proteiner resulterar i en dämpning av fluorescens vid inkorporering av lasten i multivesikulära kroppar (MVBs) och leverans till lysosom / vakuol lumen. Således, utsläckning av vakuolär fluorescens underlättar quantifiningen av endocytos och tidiga händelser i endocytiska vägen. Detta dokument beskriver förfaranden som använder pHluorin-märkta last för kvantifiering av endocytos via fluorescensmikroskopi, samt populationsbaserade analyser med hjälp av flödescytometri.
Introduction
Vesikulär trafficking spelar en viktig roll för att upprätthålla organell identitet och funktion i eukaryota celler, och är en viktig mekanism för att reglera protein och membran sammansättningen av enskilda cellulära avdelningar. Vid plasmamembranet, levererar fusion av exocytiska vesiklar nya proteiner och membran på ytan av cellen, medan vesiklar genererade genom endocytos avlägsna membran och proteiner från ytan för efterföljande återanvändning eller målinriktning till lysosomen. Således är viktigt för näringsupptag och för svar på den extracellulära omgivningen endocytos. Exocytos och endocytos balanseras för att reglera plasmamembran yta, och att tillåta omsättning av skadade proteiner.
Studier i jäst och däggdjursceller har identifierat ett stort antal proteiner som är involverade i endocytos, liksom flera endocytiska vägar som främjar internalisering av specifika last eller att agera som svar på en mängd olika svjömässiga förhållanden. Den bästa-studerade reaktionsvägen är clathrin-förmedlad endocytos (CME), i vilken clathrin och cytosoliska accessoriska proteiner montera in ett lager struktur för att stabilisera den begynnande endocytiska vesikeln. Experiment i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae har gett viktiga insikter i dynamiken och ordning rekrytering för många endocytiska proteiner 1-3. Noterbart är maskiner och CME starkt konserverad genom evolutionen, så att majoriteten av CME-relaterade proteiner i jäst har mänskliga ortologer; alltså, knoppande jäst har varit ett viktigt verktyg för att förstå mekanismerna för endocytos som är bevarade i högre eukaryoter. Till exempel, studier med användning av knoppande jäst bestämdes att bildning och mognad av CME strukturer (kallad kortikala aktin patchar i jäst) involverar den sekventiella rekrytering av många proteiner, som börjar med clathrin och lastbindande adaptorproteiner, följt av rekrytering av ytterligare endocytiska tillbehöret proteiner,aktivering av Arp2 / 3-medierad aktin polymerisation, och rekrytering av proteiner involverade i vesikler uppdelning 1,2. Rekrytering av CME maskiner proteiner för att kortikala aktin plåster är en mycket beställt och stereotypa process, och den exakta ordningen för rekrytering till många proteiner har fastställts med avseende på andra komponenter i maskiner och CME. Viktigt har nya studier bekräftade en liknande ordning rekrytering för CME proteiner vid clathrin-belagda gropar i däggdjursceller 4.
Förutom CME, många celltyper har en eller flera clathrin oberoende endocytiska (CIE) vägar som är beroende av alternativa mekanismer för att främja vesikelbildning och internalisering från plasmamembranet 5-7. I jäst, nyligen identifierade vi en CIE väg som utnyttjar små GTPas Rho1 och dess aktiverande guaninnukleotidutbytesfaktor (GEF), Rom1 8,9. Rho1 aktiverar formin Bni1 att främja aktin polymerisation 10,11, vilket krävs för denna form av clathrin oberoende endocytos i jäst 12. Dessutom α-arrestin familj av proteiner rekrytera ubiquitin ligas Rsp5 att främja last ubikvitinering och efterföljande interna genom CME 13-17, och även främja last interna via CIE vägen, eventuellt genom direkt interaktion med proteiner involverade i CIE 18. En mängd olika CIE vägar finns också i däggdjursceller, inklusive clathrin oberoende och fagocytiska vägar som är beroende av Rho1 ortolog, RhoA 9,19. Rollen av RhoA i däggdjur CIE är dåligt känd, således kan studier i knoppande jäst ytterligare mekanistiska insikter som är tillämpliga på däggdjurs CIE.
Exakt kvantifiering av endocytiska händelser kan ge viktig information om de roller specifika proteiner i regleringen endocytos, och kan avslöja effekterna av mutationer på lastinternalisering eller övergång frånn genom den endocytiska reaktionsvägen. För detta ändamål, kan biokemiska metoder användas för att övervaka ligand upptag eller för att mäta hastigheter av nedbrytning av endocytiska cargo-proteiner. I levande celler, fusion av grönt fluorescerande protein (GFP) och dess varianter till laster av intresse medger direkt visualisering av godstransport. Men GFP-märkta last är av begränsad användning för kvantifiering av endocytos eftersom GFP är resistent mot nedbrytning i lysosomen (eller vakuolen i jäst). Dessutom är GFP fluorescens endast delvis känsliga för förändringar i pH, och fortfarande går att urskilja i vakuolen lumen 20,21. Följaktligen fluorescens av GFP taggen kvar i vakuolen långt efter resten av lasten har försämrats, och hela cellbaserade kvantifiering av last intensitet kan vara felaktiga på grund av långsiktiga GFP fluorescens i vakuolen.
I syfte att övervinna nackdelarna med vakuolär GFP-fluorescens, vi tidigare använt sig av superecliptic pHluorin, en pH-känslig variant av GFP som fluorescerar starkt vid neutralt pH, men förlorar fluorescens i sura miljöer, såsom lumen i vakuolen / lysosomen 20,22,23. Placera en pHluorin tagg på den cytoplasmatiska svansen av endocytiska last medger visualisering av laster på plasmamembranet och på tidiga endosomer, där pHluorin taggen förblir exponerade till cytoplasman (Figur 1A). Så tidigt endosomer mogna, det endosomala sorterings komplexa krävs för transport (ESCRT) maskineripaket yt-lokaliserad last in i vesiklar som knoppas in i lumen av endosomen, generering multivesikulära kroppar (MVBs) 24. För last som har införlivats i den interna MVB vesikler, vetter mot pHluorin tag mot vesikler lumen. Interna MVB vesiklar surgörs; därmed pHluorin-märkta last förlorar fluorescens på tidiga endosomer som de mognar i MVBs 20. Efterföljande fusion av MVB med vakuolen levererar MVB luminala innehålletför nedbrytning förblir och pHluorin taggar släcktes i den sura miljön i vakuolen lumen.
Detta dokument innehåller detaljerade beskrivningar av kvantitativa endocytiska analyser med hjälp av laster med cytoplasmiska pHluorin taggar i jäst. Stammar som uttrycker pHluorin-märkta last kan användas i kinetiska och / eller endpoint analyser, beroende på egenskaper och handel beteende specifika last. Dessutom är vissa pHluorin-märkta last är mottagliga för hög genomströmning analysmetoder, inklusive flödescytometri. Viktigare är pHluorin taggen ett mångsidigt verktyg för att studera endocytiska händelser i levande celler, vilket möjliggör kvantifiering av endocytos och jämförelse av endocytiska funktion i vildtyps- och mutantstammar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lösningar och media
- Förbered följande bestånd, media och tallrikar:
- Att förbereda 10x YNB, upplösa 67 g jästkvävebas saknande aminosyrorna i 1 L vatten. Sterilisera genom filtrering genom ett 0,22 | im nitrocellulosafilter.
- Förbered YNB medium med användning av 1x YNB (från 10x stock) med 2% dextros (från en steril 50% vikt / volym lager) och 1x aminosyra / näringsblandning (från 100x lager, se steg 1.1.4). För plasmid val, utelämna individuella aminosyror eller näringsämnen som behövs. För induktion av Mup1 uttryck, dessutom utelämna metionin från aminosyran / näringsblandning.
- Förbereda YNB plattor med användning av 1x YNB (från 10x stock), 2% dextros (från en steril 50% vikt / volym stock), 0,7 g / L aminosyra / näringsblandning (se steg 1.1.5) och 2,5% agar. Förbereda plattmediet genom autoklavering 25 g agar och 0,7 g aminosyra / näringsblandning per 860 ml vatten. Låt blandningen svalna till 55 ° C, tillsätt sedan 100 ml av 10x YNB och 40 ml of 50% glukos. Häll ut på plattor (cirka 30 ml medium per 10 cm skål), låt substratet stelna vid rumstemperatur, och lagra plattorna vid 4 ° C.
- Förbereda 100x aminosyra / näringsstamlösning (för flytande medium) genom att lösa följande i 100 ml avjoniserat vatten: 0,1 g L-metionin, 0,3 g vardera av L-leucin och L-lysin, och var och en av L-histidin 0,2 g , L-tryptofan, adenin och uracil (andra aminosyror och näringsämnen kan inkluderas efter behov för specifika stammar). Använd svag värme om det behövs för att lösa upp, och sterilisera genom ett 0,45 um nitrocellulosafilter. Förvara vid rumstemperatur med skydd från ljus. För plasmid urval, förbereda stamlösningar som saknar specifika komponenter som behövs.
- Förbereda aminosyra / näringsblandning (för plattor) genom att kombinera följande: 0,5 g adenin, 4 g L-leucin, och 2 g vardera av L-histidin, L-lysin, L-metionin, L-tryptofan, L- tyrosin och uracil. Slipa med en mortel och mortelstöt, och lagra med proskydd från ljus. För plasmid urval, förbereda blandningar som saknar specifika komponenter som behövs, och använda 0,7 g aminosyrablandning per liter plattmedium (se steg 1.1.3).
- Förbered 8 brunnar kammare diabilder för mikroskopering genom att belägga ytan av objektglaset med konkanavalin A (ConA). Till varje brunn i kammarobjektglas, tillsätt 25 | il av 2 mg / ml ConA upplösta i vatten. Med hjälp av en pipettspets, sprida ConA över bottenytan i brunnen, låt bilden lufttorka vid rumstemperatur under åtminstone 4-8 timmar. Helst använder kammare diabilder inom 24 h av ConA beläggning.
- Generera jäststammar med in-frame fusioner av GFP eller pHluorin till den endocytiska last av intresse med användning av polymeraskedjereaktionen (PCR) -baserad metod integration beskrivs i Longtine et al. och Goldstein och McCusker 25,26.
OBS: Plasmider innehållande pHluorin märkning kassetter med resistensgener för kanamycin (KANMX6) och nourseothricin (- Amplifiera GFP eller pHluorin kassetter innehållande selekterbara markörer med primers innehållande ytterligare sekvenser som är specifika till stället för genomisk integration 20,25.
- Omvandla den resulterande PCR-produkten till den önskade jäststam med användning av litiumacetat-metoden 27.
- Välj för integrering av kassetten genom att odla celler på YPD-plattor innehållande det lämpliga läkemedlet. För att framställa plattor, autoklav 10 g jästextrakt, 20 g pepton, 0,1 g tryptofan och 25 g agar i 960 ml vatten. Innan hällplattor, låt blandningen svalna till 55 ° C, tillsätt sedan 40 ml 50% glukos och antingen G418 till en slutlig koncentration av 200 | ig / ml för KANMX6 markering eller nourseothricin till en slutlig koncentration av 100 | ig / ml för NATMX4 val.
- Bekräfta integration av GFP eller pHluorin tag i enskilda kolonier med PCR och / eller Western blotting med användning av anti-GFP-antikroppar,samt genom detektering av det märkta proteinet genom fluorescensmikroskopi 20.
OBS: Specifika jäststammar och plasmider som används i denna studie är listade i tabellerna 1 och 2, respektive.
2. Endpoint analys för Steady-state fluorescens konstitutivt internaliserad endocytiska Cargo
- Inokulera celler (~ 3 små kolonier) i 5 ml YNB-medium som saknar aminosyror eller näringsämnen som krävs för plasmid underhåll (i förekommande fall). Odla celler för 16-24 h i en orbital skakinkubator vid 30 ° C, med 250 rpm skakning. Alternativt strimma en ~ 1-2 mm koloni av celler på en YNB platta som saknar aminosyror eller näringsämnen för plasmid val, och odla celler över natten vid 30 ° C.
- Mät densiteten (OD 600) hos varje övernattskultur med användning av en spektrofotometer. Förbered en 5 ml utspädning vid 0,35-0,4 OD 600 / ml i YNB medium utan aminosyror eller näringsämnen för plaSmid underhåll, och växa under ca 3 h vid 30 ° C med skakning. Om du använder celler ströks ut på en platta, hoppa över detta steg och fortsätt med steg 2,4 (se nedan).
- Mät densiteten (OD 600) av celler, som nu bör vara mellan 0,6 till 1,0 OD 600 / ml. Överför 1,5 ml odlings till ett mikrofugrör, och pellets celler vid 8000 rpm (6800 x g) under 2 min. Avlägsna 1,475 pl av supernatanten.
- Föra celler till ett fluorescensmikroskop. Innan avbildning varje prov, förbereda ett objektglas genom återsuspendering av cellerna i den återstående mediet, och montera 3 | il av cellsuspension under ett täckglas. Alternativt, förbereder åtta brunnar kammare diabilder som beskrivs nedan i protokoll 3, med hjälp av YNB-medium som är lämpligt för plasmid val. Helst bildceller med 100X, 1,4 eller högre numerisk bländare (NA) oljeimmersionsobjektiv, en 12- eller 16-bitars kamera, och excitation / emissionsfilter optimerade för GFP fluorescens.
OBS: Om du använder celler odlas genom att stryka ona tallrik, förbereda bilden genom att placera 3 il färskt YNB medium på ett täckglas. Med användning av en pipettspets, samla in en liten koloni av celler från plattan, dispergera cellerna in i YNB-medium, och montera den resulterande suspensionen på en glasplatta omedelbart före avbildning. - Bild 4-6 slumpmässiga fält av celler för varje tillstånd, med samma förvärvsparametrar (dvs filteruppsättningar och exponeringstid) för alla bilder i ett experiment.
OBS: Samla en bright eller DIC bild för varje fält kan vara till hjälp för celler där pHluorin signalen kylda i MVB och vakuolära fack. - Kvantifiera fluorescensintensiteten hos åtminstone 30-50 celler för varje tillstånd (se protokoll 5).
3. kinetisk analys för kvantifiering av Endocytosis av Cargos som genomgår reglerad Endocytosis
- Ympa 2-3 kolonier av jästceller (ca 2 mm i diameter per koloni) i 5 ml YNB medium som saknade metionin och tillnella aminosyror eller näringsämnen för att upprätthålla plasmid val. Odla kulturer i 16-24 h vid 30 ° C med skakning.
OBS: I detta dokument kommer protokoll för att studera reglerade endocytiska last proteiner utnyttja metionin permeas, Mup1. Andra laster som genomgår reglerad endocytos är också lämpliga för att märka med pHluorin (till exempel den uracil permease Fur4, som ackumuleras vid plasmamembranet i frånvaro av uracil och internaliserar som svar på externt applicerade uracil); för dessa laster, bör media villkor ändras för att återspegla de specifika uttryck, induktion och interna villkoren för att lasten. - Mät densiteten (OD 600) hos varje övernattkultur approximativt 3 h före avbildning. Förbered en 5 ml utspädning vid 0,35-0,4 OD 600 / ml i YNB medium som saknade metionin och ytterligare aminosyror eller näringsämnen för plasmid underhåll och växa vid 30 ° C med skakning.
- Pre-jämvikt microsklara miljökammare eller uppvärmd skede (om sådan finns) till 30 ° C under 3 h inkubation av steg 3,2.
- Överföring 1 ml cellkultur till ett mikrofugrör, och pellets celler vid 8000 rpm (6800 x g) under 2 min. Ta bort 975 pl supernatant.
- Förbered en ConA-behandlad, 8 brunnar glas botten kammare glida för avbildning (protokoll 1,2).
- Tillsätt 200 pl av YNB-medium som saknar metionin och ytterligare aminosyror eller näringsämnen för plasmid urval till varje brunn. Resuspendera cellpelleten från steg 3,4 i den återstående supernatanten, och släppa 2,5 | il cellsuspension in i centrum av varje brunn. Dispergera celler inom hela ytan av brunnen genom att pipettera upp och ner, och tillåta cellerna att sedimentera under 5-10 min.
- Placera kammaren glider på ett inverterat fluorescensmikroskop jämvikt vid 30 ° C (se steg 3.3). Leta upp ett fält av celler genom att använda bright belysning.
- Tillsätt 50 pl av YNB-medium innehållande 100 | ig / ml metionin(Förvärmd till 30 ° C) till 200 | il medium i brunnen för att erhålla en slutlig metionin koncentration av 20 pg / ml. Undvika störningar mediet i brunnen för att förhindra cellerna från att flyta från botten.
- Tillåta cellerna att jämvikt under 2 minuter innan avbildning. Omedelbart innan du tar den första bilden, justera mikroskopet till önskad fokalplanet (typiskt, fungerar ett ekvatorial fokalplan bäst).
- Förvärva GFP och bright (eller DIC) bilder med 5 minuters intervall för 45-60 minuter, med hjälp av identiska förvärvsparametrar för alla bilder i en tidsserie (t.ex. 100X 1,4 NA oljeimmersionsobjektiv och 500 msek förvärv tid med GFP filter, 100 ms förvärv tid med DIC filter).
OBS: Om mikroskopets scenen och bildbehandlingsprogram inte tillåter automatisk korrigering av fokalplanet drift, kan det vara nödvändigt att manuellt justera fokus före varje avbildningstidpunkt. Dessutom förvärvstidervarierar mellan mikroskop på grund av skillnader i belysning och filter, och optimala villkor bör bestämmas manuellt innan du påbörjar experimentet. Om en endocytiska last annan än Mup1 används, kan det vara nödvändigt att ändra insamlingstiden och bildintervall, samt varaktigheten av försöket, för att återspegla interna kinetik att lasten. - Kvantifiera fluorescensintensiteten hos individuella celler vid varje tidpunkt (se protokoll 5) och express värden som procent av den initiala intensiteten hos den första bilden.
4. Endpoint analys för kvantifiering av endocytiska Cargos som genomgår reglerad Endocytosis
- Förbered celler för avbildning som beskrivs i protokoll 3 (steg 3,1 till 3,6).
- Bild 4-5 slumpmässiga fält av celler för varje tillstånd omedelbart före tillsats av metionin, med hjälp av ljusfält och GFP filteruppsättningar.
- Tillsätt 50 pl av YNB-medium innehållande 100 pg / ml metionin (före krigetMed till 30 ° C) till de 200 pl av mediet i brunnen för att erhålla en slutlig metionin koncentration av 20 pg / ml. Undvika störningar mediet i brunnen för att förhindra cellerna från att flyta från botten.
- Bild 4-5 slumpmässiga områden av celler 30 min efter tillsats av metionin, användning av samma insamlingsparametrar som för 0 min tidpunkten (steg 4,2).
- Kvantifiera fluorescensintensiteten hos åtminstone 30-50 celler för varje tidpunkt (se protokoll 5). Express värden som den procentuella andelen av Mup1-pHluorin internalis efter 30 min med användning av formeln: [Mean intensitet vid 0 min - medelintensitet på 30 min] / [Mean intensitet vid 0 min] x 100%.
OBS:. Det är möjligt att samtidigt utföra upp till åtta endpoints analyser genom svindlande starttiden för varje analys Tabell 3 ger ett exempel arbetsflöde för åtta samtidiga analyser.
5. Post-förvärvsanalys
- Exportera bilder från förvärv programvara som en6-bitars taggade bildfil format (.tif eller .tiff format).
OBS: Andra filformat kan också vara lämpliga, och bör helst använda förlustfri komprimeringsalgoritmer. 8-bitars bilder är i allmänhet inte lämpliga för kvantifiering ändamål. - Öppna filer med ImageJ programvara (fritt tillgänglig på "Open" i menyn "File". Använd fluorescens bild för kvantifiering och ljusfält / DIC bild som en referens för att identifiera platsen för celler och att utesluta döda celler (i förekommande fall ), som mörkare än levande celler när de ses av DIC och autofluorescerande när de betraktas med GFP excitation / emissionsfilter.
- Utföra en bakgrundssubtraktion på fluorescens bild. För bilder med en ojämn bakgrundssignal, använd "bakgrundssubtraktion algoritm finns i" Process-menyn. Använd standardinställningen (rullande boll radie på 50 pixlar), som är i allmänhet tillräckligt för kvantifiering ändamål.
ANMÄRKNING: En alternativ background subtraktion metod för bilder med enhetlig bakgrund beskrivs i steg 5.3.1.-5.3.2; emellertid ovanstående metod fungerar även för enhetlig bakgrund.- För bilder med enhetlig bakgrund (dvs ungefär konstant vid alla kanter och i mitten av bilden bakgrunden intensitet), utföra en manuell bakgrund subtraktion. Klicka på "frihand val" knappen finns i huvud ImageJ fönstret och välj 3-5 slumpmässiga områden i bilden som inte innehåller celler.
- Öppna "Ställ Mätningar" funktion som ligger i menyn "Analysera", välj "Mean Gray Value" parameter, och mäta intensitetsvärden med hjälp av "Measure" -funktion (som också finns i menyn "Analysera"). Beräkna medelvärdet från 3-5 uppmätta regionerna, och subtrahera från alla efterföljande mätningar i den bilden.
- För kvantifiering av kinetiska analyser (protokoll 3), genererar en enda, staplade bild för timE-serien. Öppna fluorescens bilder från varje tidpunkt i kronologisk ordning, och generera en stapel med hjälp av "Images att stapla" funktion (finns i menyn "Image", enligt Staplar undermeny).
- Disposition en cell med hjälp av frihand markeringsverktyget, och se till att inkludera hela cellen men så litet område utanför cellen som möjligt.
- Mäta följande parametrar: "Area, integrerad Density" och "Mean Gray Värde". Välj parametrar med hjälp av "Set mätningar" funktion, som ligger i menyn "Analysera".
OBS: Integrerad densitet motsvarar summan av alla intensiteter pixel inom det valda området, och Mean Gray Value motsvarar [Integrerat Densitet / Area], som korrigerar intensitetsvärden för cellstorleken. - Öppna "ROI manager" som ligger i menyn "Analysera" under "Verktyg" undermeny. I fönstret ROI, klicka på "Lägg till" knappen för att öppna den markerade region som en ny region av intresse (ROI).
- Upprepa steg 5,4 till 5,6 för de återstående cellerna i bilden. Uteslut alla döda celler som bedöms av ljusfält / DIC och fluorescens (döda celler mörkare i DIC bilder och har autofluorescent cytoplasma signal när de ses med GFP excitation / emission, se figur 2F), och alla celler som berör kanten av bilden. Spara valda ROI som en .zip-fil genom att klicka på "Mer" -knappen i "ROI Manager" fönstret, och exportera alla mätningar till ett kalkylblad eller statistisk programvara analys.
- För kvantifiering av kinetiska analyser (protokoll 3), beskriva och mäta en cell från den initiala tidpunkten som beskrivs i steg 5,4 och 5,5. Använd samma avkastning på investeringen för mätning av alla efterföljande tidpunkter i experimentet.
- För endpoint analyser (protokoll 2 och 4), vara minst 30-50 celler för varje tillstånd. Utföra kvantifiering under minst 2-3 bilder, och inkluderar alla celler i varjebild som uppfyller kriterierna i steg 5,8 i analysen.
- Bedöma statistisk signifikans mellan prov med användning av en envägs ANOVA, följt av Tukeys multipla jämförelsetest för post hoc-analys.
6. Population Analys av Mup1-pHluorin Endocytosis med flödescytometri
- Ympa 2-3 kolonier av jästceller (ca 2 mm i diameter per koloni) i 0,5 ml YNB medium som saknade metionin och ytterligare aminosyror eller näringsämnen för att upprätthålla plasmid val. Odla celler i 5 ml rundbottnade rör för 16-24 h vid 30 ° C på en valstrumma.
- Tillsätt 1,5 ml av YNB-medium som saknar metionin och ytterligare aminosyror eller näringsämnen för plasmid underhåll, och växa vid 30 ° C under ytterligare 3 h på en rulltrumma.
- Överföring 1 ml av celler i var och en av två 5 ml rundbottnade rör. Lägg 0,25 ml YNB Met medium till det första röret (Met tillstånd), och 0,25 ml YNB-medium innehållande 100 mikrogram/ Ml metionin till det andra röret för att ge en slutlig metionin koncentration av 20 | ig / ml (+ Met skick). Inkubera cellerna vid 30 ° C under 45 minuter på en rulltrumma.
- Analysera celler genom flödescytometri, välja ljusspridning framåt (FS) som ett mått på cellstorleken, och Mup1-pHluorin fluorescensintensiteten från en fluoresceinisotiocyanat (FITC) filter som ett mått på last intemalisering.
- Använd skjutknapparna för att justera spänningen hos FS och FITC kanaler för att optimera detektering för sin storlek och fluorescensintensiteten hos jästceller som används (för dessa experiment, inställningar som användes var 50 V för FS och 400 V för FITC).
OBS: Spänning för båda kanalerna kommer att variera beroende på flödescytometern som används. Detta steg bör göras före eller under 45 min behandling med metionin (steg 6,3). - Mät FS och fluorescensintensiteten för 10.000 celler från varje tillstånd, med hjälp av inställningen hög flödeshastighet. Skapa ett punktdiagram över FS mot fluorescence intensitet: klicka på "lägg till grafen", välj FITC (x-axeln) och FS (y-axel), och diagram 1000 poäng (programmet kommer att visa värden för 1000 celler, även om 10.000 celler mättes).
OBS: För maximal konsistens, analysera celler 45-50 minuter efter tillsats av metionin; för försök med ett stort antal prover, sprida tillsats av metionin för att rymma den tid som krävs för flödescytometrianalys. - Inkluderar -Met och + Met villkor för vildtyp (WT) celler som en kontroll. Med hjälp av grindfunktion, tilldela en vertikal grind med hjälp av WT + Met tillstånd, så att ca 5% av de ljusaste cellerna faller till höger om porten. Använd denna grind för alla andra villkor i experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Steady-state lokalisering och kvantifiering av konstitutivt interna endocytiska last protein STE3
För att demonstrera att pHluorin-etikette laster kan utnyttjas för kvantifiering av endocytos i levande celler, lokalisering av chimär GFP och pHluorin fusioner med den cytoplasmatiska C-terminala svansen av STE3, a-faktorferomonreceptor i jäst, jämfördes. STE3 är en G-proteinkopplade receptorer (GPCR) som konstitutivt transporteras till plasmamembranet, internaliseras, och riktade till vakuolen för nedbrytning 28. Således, under stationära förhållanden, de flesta STE3 lokaliserar till vakuolen lumen, vilket kan ses i vildtypen (WT) celler som uttrycker STE3-GFP (Figur 2A). Däremot celler som saknar de gener som kodar de fyra clathrin bindande adaptorproteiner Ent1, Ent2, Yap1801 och Yap1802 (ent1 Δent2 Δ yap1801 Δ yap1802 Δ, hädanefter kallad 4Δ) misslyckas med att stabilisera clathrin vid ställen för endocytos 29, och är allvarligt defekta i CME 30. 4A celler kräver uttryck av epsin N-terminal homologi (Enth) domänen av antingen Ent1 eller Ent2 för livskraft 30,31. Den enth domänen är inte tillräckligt för endocytos i 4A-celler, såsom visas med retention av STE3-GFP vid plasmamembranet i 4Δ + ENTH1 celler som uttrycker enth domänen av Ent1 (Figur 2A) 8,30; liknande plasmamembranet retention i 4Δ + ENTH1 celler har observerats för andra endocytiska last, inklusive STE2-GFP (den α-faktorferomonreceptor) och Mup1-GFP eller Mup1-pHluorin (en metionin permeas) 8,18. Däremot uttryck av fullängds Ent1 från en plasmid i 4A celler (4Δ + Ent1) åter endocytos och lokalisering av STE3-GFP till vakuolen. 4Δ + ENTH1 celler nyligen använde jagna genetisk skärmen för att identifiera en CIE väg i jäst som bygger på aktin modulerande GTPas Rho1 och GEF, Rom1, liksom formin Bni1 och medlemmar av α-arrestin familj av proteiner involverade i last sortering 8,18. Som överensstämmer med en roll i CIE, uttryck av ROM 1 eller α-arrestin LDB19 från high-copy-plasmider i 4Δ + ENTH1 celler förbättrade internalisering av STE3-GFP (Figur 2A).
Celler som uttrycker STE3-GFP eller andra GFP-märkta endocytiska last har ljusa vakuoler på grund av ansamling och proteolytisk motstånd av GFP taggen. I kontrast, celler som uttrycker STE3-pHluorin har mycket låga nivåer av vakuolär fluorescens på grund av släckning av pHluorin taggen i sura miljöer 20. Som tidigare, WT och 4Δ + Ent1 celler visade mycket liten påvisbar STE3-pHluorin genom fluorescensmikroskopi (Figur 2B). I kontrast, STE3-pHluorinvar lätt detekterbar vid plasmamembranet av 4Δ + ENTH1 celler medan vakuolära STE3-pHluorin förblev nästan odetekterbar i samtliga fall. High-copy expression av ROM 1 eller LDB19 minskat mängden detekterbar STE3-pHluorin vid cellytan, liknande resultat med STE3-GFP, fastän vakuolära STE3-pHluorin förblev nästan odetekterbar i samtliga fall.
Att jämföra effektiviteten av GFP- och pHluorin-märkta last som verktyg för att kvantifiera förändringar i endocytiska kapacitet celler, helcells-fluorescens av STE3-GFP och STE3-pHluorin mätt i WT och 4A celler. Även om förändringar i STE3-GFP lokalisering var lätt detekterbar genom mikroskopi (Figur 2A), skillnader i den totala fluorescensintensiteten inte var statistiskt signifikant mellan WT, 4Δ + Ent1 och 4Δ + ENTH1 celler transformerade med tom vektor (figur 2C) 20. Likewise, 4Δ + ENTH1 celler transformerade med vektorn, ROM 1 och LDB19 hade liknande helcells-fluorescensintensiteter. Noterbart är 4Δ + ENTH1 celler transformerade med ROM 1 eller LDB19 var betydligt svagare än WT-celler (Figur 2C) 8,18; dock STE3-GFP proteinnivåer var lika som fastställdes genom immunoblotting (figur 2E). Medan skillnaden i intensitet kan delvis bero på förändringar i vakuolen storlek eller morfologi, eller skillnader i retention av GFP taggen i vakuolen, gör kvantifiering av STE3-GFP fluorescens inte speglar förändringar i lokalisering observeras av fluorescensmikroskopi (Figur 2A). Däremot kvantifiering av STE3-pHluorin intensitet visade att 4Δ + ENTH1 celler transformerade med vektorn var betydligt ljusare än WT eller 4Δ + Ent1 celler och hög kopia uttryck för ROM 1 eller LDB19 i 4Δ + ENTH1 celler minskas STE3-pHluorin intensitetnivåer som liknade WT och 4Δ + Ent1 (figur 2D). Således, kvantifiering av steady-state STE3-pHluorin intensitet korrekt speglar skillnaderna i lokaliserings observeras genom fluorescensmikroskopi.
Kinetiska interna analyser med användning av den reglerade endocytiska last, Mup1
Kvantifiering av fluorescensintensitet för konstitutivt internaliserade laster vid steady state kan avslöja skillnader i den endocytiska kapacitet på mutanta celler jämfört med WT-celler. Det är dock möjligt att vissa laster kan nå samma steady-state distribution och intensitet i WT och endocytiska muterade celler, även om mutantcellerna har en fördröjning i endocytos eller långsammare kinetik för last internalisering. Istället pHluorin-etikette laster som undergår reglerad endocytos som svar på ett specifikt stimulus eller ligand kan användas för att övervakakinetiken för endocytos. För detta ändamål har internalisering av hög affinitet metionin permeas, Mup1, övervakas 32. I avsaknad av extracellulärt metionin är Mup1 uttryck uppregleras, och permeaset bibehålls vid plasmamembranet; vid tillsats av metionin till mediet, Mup1 genomgår snabb internalisering och målsökning till vakuolen 13.
För att övervaka kinetiken för Mup1 intemalisering, var WT stammar som uttrycker Mup1-GFP eller Mup1-pHluorin från det genomiska lokuset odlas i frånvaro av metionin för att ackumulera fluorescerande Mup1 vid plasmamembranet (figur 3A, 0 min tidpunkt). Tidsförlopp avbildning av celler utfördes därefter vid 5 min intervall i frånvaro eller närvaro av metionin för att övervaka lastinternalisering och förändringar i fluorescens. Som väntat, GFP- och pHluorin-märkt Mup1 avbildas i frånvaro av metionin förblev vid plasmamembranet feller hela 45 min observationsperioden 20. Däremot celler avbildas i närvaro av metionin visade progressiv utarmning av fluorescenssignalen från cellytan, i överensstämmelse med last intemalisering. Noterbart är Mup1-GFP fluorescens ackumulerats i interna strukturer (dvs endosomer och vakuolen), medan Mup1-pHluorin lokaliserade till intern punctae som sannolikt motsvarar tidiga endosomer, men sågs inte i vakuolen.
När fluorescens kvantifierades i alla tidpunkter för individuella celler, Mup1-GFP och Mup1-pHluorin intensitet uppvisade liten förändring i frånvaro av externt pålagda metionin under loppet av 45 min experimentet, i överensstämmelse med proteinet förblir stabilt lokaliserad till plasmamembranet (figur 3B). I kontrast, helcells-Mup1-pHluorin intensitet minskade snabbt i närvaro av metionin, så att en minskning av fluorescenc 50%e intensitet observerades efter cirka 20 till 25 minuter, och en sänkning med 80% observerades efter ca 40 min 20. Mup1-GFP-celler visade också en minskning i fluorescensintensitet efter tillsats av metionin; ades emellertid kinetiken för fluorescens förlust fördröjd jämfört med de för Mup1-pHluorin, så att en 50% -ig minskning i intensitet endast observerades efter 40 min. Som ses i figur 3A, Mup1-GFP var knappt detekterbar vid plasmamembranet vid denna tid, vilket tyder på att ihållande vakuolär GFP fluorescens förhindras exakt kvantifiering av endocytiska händelser på cellytan.
Slutpunktsanalyser med användning av den reglerade endocytiska last, Mup1
I tillägg till kvantitativa, kinetiska analyser av endocytos, såsom beskrivits ovan, kan reglerade endocytiska laster såsom Mup1 också användas för slutpunktsanalyser, liknande kvantifieringav steady-state STE3-pHluorin intensitet. För detta ändamål har analysen för kvantifiering av Mup1-pHluorin interna modifierats för att möjliggöra en jämförelse av genomsnittliga fluorescensintensiteter från populationer av celler avbildade omedelbart före eller 30 minuter efter tillsats av metionin 8,18. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att jämföra andelen Mup1 intern mellan WT och endocytiska muterade celler.
I överensstämmelse med resultatet av den kinetiska analysen (Figur 3), var Mup1-pHluorin snabbt utarmas från plasmamembranet i WT-celler (Figur 4A), så att ca 60% av Mup1-pHluorin var internaliserade 30 minuter efter tillsats av metionin ( Figur 4B). Som förväntat, Mup1-pHluorin interna var liknande effektiva i 4 + Ent1 celler, medan interna reducerades signifikant i 4Δ + ENTH1 celler, som är förenliga med en allvarlig brist i endocytos. Hög kopia uttryckav ROM 1 eller α-arrestin LDB19, som specifikt krävs för Mup1 interna via både CME och CIE vägar 13,18, förbättrad internalisering av Mup1-pHluorin, i enlighet med deras förmåga att främja endocytos i 4Δ + ENTH1 celler 18. Noterbart är även steady state STE3-pHluorin intensitet i 4Δ + ENTH1 celler som uttrycker hög kopia ROM1 eller LDB19 var omöjlig att skilja från WT eller 4Δ + Ent1 celler, internalisering av Mup1-pHluorin endast delvis förbättrats i 4Δ + ENTH1 celler som uttrycker hög kopia ROM 1 eller LDB19 (Figur 4C). Således indikerar dessa data att kinetiska och / eller slutpunkt analyser kan avslöja skillnader i endocytiska priser mellan WT och mutantstammar för vissa laster, även om liknande steady-state distribution av andra laster kan åstadkommas på samma stammar.
Populationsbaserad analys av Mup1-PHLuorin internalisering med hjälp av flödescytometri
Hög genomströmning analys av större populationer av celler med användning av flödescytometri kan ge ett alternativ till att utföra kinetiska och endpoint analyser för lastinterna av mikroskopi. För detta ändamål, var fluorescensintensiteten hos Mup1-pHluorin jämförs i WT-celler från en kultur som odlas i frånvaro av metionin (WT -Met, som bör vara "ljus") eller i närvaro av metionin under 45 minuter (WT + Met, vilka bör vara "dim" jämfört med obehandlade celler baserat på reduktion av 80% i fluorescensintensitet ses i figur 3B). Efter analys med flödescytometri, var en vertikal grind tillämpas på WT + Met tillstånd, där ~ 5% av cellerna som finns på den högra sidan av porten, och motsvarade den ljus celler i populationen (figur 5A och 5B , röd befolkning). När samma porten tillämpadestill WT -Met tillstånd, sjönk cirka 65% av cellerna in i det ljusa kategorin, vilket demonstrerar att flödescytometri kan användas för att lätt observera skillnader i Mup1-pHluorin fluorescensintensitet mellan populationer av celler före och efter tillsats av metionin. I kontrast, fördelningen av ljus kontra dim celler var omöjliga att särskilja i 4Δ + ENTH1 -Met och + Met betingelser med användning av samma grind som appliceras på WT + Met befolkning, som överensstämmer med defekt endocytos. Således flödescytometri kan detektera förändringar i den endocytiska kapaciteten hos celler, och medger en snabb analys av stora populationer av celler. Viktigt, flödescytometri kan också användas i genetiska skärmar som ett verktyg för sortering och urval av muterade celler med defekt endocytos (K. Wrasman och B. Wendland, manuskript under utarbetande) 33.
Figur 1:
Figur 2:. Lokalisering och kvantifiering av STE3-GFP och STE3-pHluorin i vildtyp och endocytiska mutanta celler (A) WT, 4Δ + Ent1 och 4Δ + ENTH1 celler som uttrycker genomiskt kodade STE3-GFP och transformerade med vektorn, hög kopia ROM 1 eller hög kopia LDB19 som anges visualiserades genom fluorescensmikroskopi (övre raden) eller DIC (nedersta raden). STE3-GFP bilder justerades till samma högsta och lägsta nivåer för att möjliggöra direkt jämförelse av STE3 lokalisering. (B) WT, 4Δ + Ent1 och 4Δ + ENTH1 celler som uttrycker genomiskt kodade STE3-pHluorin transformerades och avbildas som beskrivs i panel A. Skalstreck = 2 ^ m. (C, D) Kvantifiering av fluorescensintensiteten för STE3-GFP (C) och STE3-pHluorin (D) stammar som används i paneler A och B. För varje betingelse var helcells-fluorescens kvantifieras i minst 40 celler. Värden korrigerades för cellstorlek, och uttrycktes i godtyckliga enheter (AU) som medelvärde ± SEM (*** p <0,001 jämfört med WT; ††† p <0,001 jämfört med 4Δ + ENTH1 + vektor). (E) Relative uttryck av STE3-GFP bedömas i WT, 4Δ + Ent1 och 4Δ + ENTH1 celler transformerade med vektorn, hög kopia ROM1 eller hög kopia LDB19 som anges. Cellextrakt framställdes såsom beskrivits tidigare 20, och lika stora mängder av varje prov upplöstes genom SDS-PAGE. STE3-GFP uttryck bedömdes genom immunoblotting med anti-GFP antikroppar och proteinladdning bedömdes med användning av anti-GAPDH. (F) Vildtyp-celler som uttrycker genomiskt kodade STE3-GFP ses av fluorescensmikroskopi (STE3-GFP panel) och DIC optik, med en död cell som indikerats med pilar. Döda celler visas autofluorescerande i GFP filter, och är mörkare när de ses av DIC. Skalstreck = 2 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Kinetic analys av Mup1-GFP och Mup1-pHluorin interna (A) Vildtyp celler som uttrycker genomiskt kodade Mup1-GFP (övre två paneler) eller Mup1-pHluorin (lägre två panelerna) odlades till mitten av logaritmisk fas i YNB medium som saknade metionin att inducera Mup1 uttryck och bibehållande vid plasmamembranet. Cellerna överfördes därefter med bild genom fluorescensmikroskopi var 5 min i frånvaro (- Met) eller närvaro (+ Met) av 20 ^ g / ml metionin. För varje tidpunkt inom ett tillstånd, var identiska högsta och lägsta intensitetsvärden användas för att medge jämförelse av fluorescensintensitet och lokalisering. 0, 5, 10, 20 och 40 min tidpunkter visas såsom indikeras för alla förhållanden. Skalstreck = 2 ^ m. (B) Kvantifiering av Mup1-GFP och Mup1-pHluorin interna i celler av vild typ från panel A. Hela-cell fluorescens intensitet Mup1-GFP (- Met, lila rutor, + Met, blå diamanter) eller Mup1-pHluoRin (- Met, gröna trianglar, + Met, röda cirklar) mättes för enskilda celler avbildas på 5 minuters intervall, och uttryckt i procent av den ursprungliga fluorescensintensitet (medelvärde ± SEM, n = 6 celler per tillstånd). Omtryckt från Prosser et al. (2010) 20 med tillstånd från förlaget. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Endpoint analys av Mup1-pHluorin interna (A) WT, 4Δ + Ent1 och 4Δ + ENTH1 celler som uttrycker genomiskt kodade Mup1-pHluorin och transformerade med vektorn, hög kopia ROM 1 eller hög kopia LDB19 som anges odlades till mitten av -logarithmic fas i YNB medium som saknar metionin. Slumpmässiga fält av celler avbildades av fluorescenc e mikroskopi omedelbart före (- Met) eller 30 minuter efter (+ Met) tillsats av 20 mikrogram / ml metionin. Alla bilder justerades till samma högsta och lägsta intensitetsvärden. Skalstreck = 2 ^ m. (B) Kvantifiering av Mup1-pHluorin interna i celler från panel A. För varje tillstånd, var helcells-fluorescensintensitet mättes under ett minimum av 40-celler och korrigeras för cellstorleken. Den procentuella andelen av Mup1-pHluorin internalis beräknades genom jämförelse betyda intensitetsvärdena före och efter 30 min behandling med metionin. Värden visas som medelvärde ± SEM (n = 4; *** p <0,001 jämfört med WT; † p <0,05 jämfört med 4Δ + ENTH1 + vektor). Denna siffra har ändrats från Prosser et al. (2015) 18 med tillstånd från förlaget. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Populationsanalys av Mup1-pHuorin intemalisering genom flödescytometri (A) WT och 4Δ + ENTH1 celler odlades till mitten av logaritmisk fas i YNB medium som saknar metionin. Cellerna inkuberades sedan i frånvaro (- Met) eller närvaro (+ Met) av 20 ^ g / ml metionin under 45 minuter före analys med flödescytometri. För varje tillstånd, var ljusspridning framåt (i godtyckliga enheter, AU) avsatt mot fluorescensintensitet (au, med användning av ett FITC-filter) för 1000 celler av totalt 10.000 celler mättes. Populationer analyserades vidare genom att anbringa en vertikal grind (blå pil) till WT + Met tillstånd, där cirka 5% av de ljusaste cellerna (visas i rött) föll på den högra sidan av porten. Grind genereras för WT + Met villkor därefter appliceras på övriga villkor för att möjliggöra jämförelserprov distributioner. (B) Sammanfattning av procentandelen dunkla celler (svarta punkter, till vänster om porten) och ljusa celler (röda punkter, till höger om porten) för WT och 4Δ + ENTH1 ± Met prövningar som visas i panel A. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Anstränga | Genotyp | Källa |
| SEY6210 en | MAT α his3-Δ200 TRP1-Δ901 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 SUC2-Δ9 | laboratorie plasmid |
| BWY2858 | STE3-GFP :: KANMX6 | Prosser et (2010) 16 al. |
| BWY2995 | STE3-pHluorin :: KANMX6 | PRosser et (2010) 16 al. |
| BWY3036 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et (2010) 16 al. |
| BWY3037 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et (2010) 16 al. |
| BWY3399 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et (2010) 16 al. |
| BWY3400 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et (2010) 16 al. |
| BWY3817 | MUP1-GFP :: KANMX6 | prOsser et (2010) 16 al. |
| BWY3818 | MUP1-pHluorin :: KANMX6 | Prosser et (2010) 16 al. |
| BWY4153 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| BWY4154 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| a Alla stammar som används i denna studie är isogena till SEY6210 utom vid den angivna loci. | ||
Tabell 1: Jäststammar som användes i denna studie.
| plasmid | Beskrivning | Källa |
| pRS426 | 2μ URA3 | Sikorski och Hieter, 1989 |
| pBW0768 | pRS414 :: ENT1 [CEN TRP1] | pEnt1, Laboratory plasmid |
| pBW0778 | pRS414 :: ent1 (aa1-151) [CEN TRP1] | pENTH1, Laboratory plasmid |
| pBW1571 | pFA6a-pHluorin-KANMX6 | Prosser et (2010) 16 al. |
| pBW2053 | YEp24 :: ROM 1 [2μ URA3] | pROM1 (Prosser et al., 2011) 7 |
| pRS426-Ldb19 | LDB19prom-LDB19 [2μ URA3] | Prosser et al. (2015) 15 |
| pFA6a-GFP (S65T) -kanMX6 | pFA6a-GFP-KANMX6, PCR-baserad integrerande plasmid för GFP-märkning i jäst | Longtineet al. (1998) 21 |
Tabell 2: Plasmider som används i denna studie.
| Tid (min) | Handlingar) |
| -5 | Image sample 1 (Met) |
| 0 | Lägg metionin att prova en |
| Image sample 2 (Met) | |
| 5 | Lägg metionin att prova 2 |
| Image sample 3 (Met) | |
| 10 | Lägg metionin att prova 3 |
| Image sample 4 (Met) | |
| 15 | Lägg metionin att prova 4 |
| Image sample 5 (Met) | |
| 20 | Lägg tillmetionin till prov 5 |
| Image sample 6 (Met) | |
| 25 | Lägg metionin att prova 6 |
| Image sample 7 (Met) | |
| 30 | Lägg metionin att prova 7 |
| Image sample 8 (Met) | |
| Image sample 1 (+ Met) | |
| 35 | Lägg metionin att prova 8 |
| Image sample 2 (+ Met) | |
| 40 | Bild prov 3 (+ Met) |
| 45 | Image sample 4 (+ Met) |
| 50 | Image sample 5 (+ Met) |
| 55 | Image sample 6 (+ Met) |
| 60 | Image sample 7 (+ Met) |
| 65 | Image sample 8 (+ Met) |
tabell 3Exempel arbetsflöde för svindlande 8 Mup1-pHluorin endpoint analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillämpningar av pHluorin för kvantifiering av endocytiska händelser i jästceller använder sig av transmembranlaster i vilka den fluorescerande taggen är fuserade till den cytoplasmatiska svansen av proteinet (Figur 1A). För de analyser som beskrivs här, last är ljust fluorescerande när pHluorin tag utsätts för neutrala miljöer, men blir släcktes när pHluorin taggen möter sura betingelser. Således är en pHluorin-taggat endocytiska last lätt detekteras vid den cytoplasmiska ytan av plasmamembranet och på tidiga endosomer, men blir "dim" om det ingår i luminala MVB vesiklar eller vid leverans till vakuolen lumen. I allmänhet, nysyntetiserade endocytiska last sannolikt lämnar det endoplasmatiska retiklet (ER) och nå plasmamembranet innan GFP och många av dess varianter har fullt mognat; därmed pHluorin-märkta last som ännu inte har nått cellytan förutses förbli omätbara om utträde ur ER eller Golgi är impaired.
Användning av pHluorin-etikette endocytiska laster såsom STE3 och Mup1 har underlättat karaktärisering av ett antal proteiner som är inblandade i jäst CIE vägen (Figur 1B) 8,18. Specifikt har de metoder som beskrivs i detta dokument har använts för att visa att ökad produktion av aktin-modulerande GTPas Rho1 och dess GEF Rom1 främja endocytos i en mängd olika jästmutanter med defekter i CME 8. Dessutom har pHluorin-etikette last nyligen använts för att kvantitativt visa att a-arrestiner, vilka har väletablerade roller i CME 13-15,34-36, spela lastselektiva roller i både CME och CIE, och har mekanistiskt distinkta funktioner i de två banorna 18.
För de protokoll som beskrivs i detta dokument, bör flera viktiga faktorer i syfte att få konsekventa kvantitativa resultat. Först, Mup1-GFP eller Mup1-pHluorin uttryck och fluoresscens kan minska som jästceller närmar sig eller ange den stationära tillväxtfasen (opublicerade resultat); därför bör cellerna odlas från en övernattskultur spädas och åter odlas för ytterligare tre timmar (se steg 3,1-3,2 och 6.1-6.2). Dessutom, när vacklande flera experimentella betingelser eller stammar i endpoint analyser eller för analys med flödescytometri, är det viktigt att samla in uppgifter för alla prover efter samma längd metionin behandling för att möjliggöra jämförelser mellan individuella förutsättningar. För efter förvärvsanalysen, bör kvantifiering utföras med 16-bitarsbilder, eftersom omvandling till 8-bitars format orsakar förlust av data som kan påverka fluorescensintensitetsvärdena. Dessutom bör bakgrundssubtraktion utföras före kvantifiering (steg 5,3), eftersom bakgrundssignalen avsevärt kan ockludera skillnader i intensitet mellan proven.
Medan pHluorin-taggade STE3 och Mup1 har visat mottagliga för kvantifiering, intealla laster kommer att vara väl lämpad för pHluorin märkning. Till exempel har försök för att märka den α-faktorreceptorn STE2 har gett inkonsekventa kvantitativa resultat, möjligen beroende på lägre fluorescensintensitet av STE2-pHluorin jämfört med det för STE3 eller Mup1 (opublicerade resultat), även om det är möjligt att tandem pHluorin taggar skulle kunna förbättra signalintensiteten. Dessutom kan last med mycket långsamma hastigheter av ligand-inducerad endocytos inte vara mottagliga för pHluorin märkning för kvantifiering, särskilt om den halv-tiden för internalisering är längre än jästcellcykeln (ca 90 min). För sådana laster, skulle en minskning av fluorescens uppstå endocytos och / eller från uppdelning av lasten mellan mor och dotterceller under delning. Således, testa enskilda laster av intresse rekommenderas för att avgöra om deras uttryck och kinetik är lämpliga för pHluorin-märkning och kvantifiering.
Även om nya studier med användning av PHLuorin har fokuserat främst på endocytiska händelser på plasmamembranet, kan pHluorin-märkta last användas för att studera senare människohandel händelser i endocytiska vägen. Till exempel, har Mup1-pHluorin med framgång använts i flödescytometri-baserade analyser av ESCRT-medierad last sortering i MVBs 37, eftersom pHluorin taggen blir släcktes vid inkorporering i MVB luminala vesiklar 20. Detta tillvägagångssätt liknar det mer nyligen beskrivna luciferas reporter av intraluminal avsättning (LUCID) -analys, som använder sig av laster med en cytoplasmatisk luciferas tagg för att generera en självlysande signalen i närvaro av luciferin 38,39. I likhet med släckning av pHluorin fluorescens vid inkorporering i MVB luminala vesiklar, bioluminiscens i LUCID analysen dämpas vid införlivandet av luciferas tag i MVB blåsor. Medan pHluorin och Lucid analyser bygger på samma princip, kan pHluorin-märkta last användas för att studera endocytos och MVB mognad in intakta celler.
Alternativa metoder finns för kvantifiering av endocytos, och har gett värdefull information om priser av lastinterna i vild-typ och endocytiska muterade celler. Exempel innefattar övervakning upptag av radioaktivt märkta ligander, såsom α-faktor (vilken binder till feromonreceptorn STE2) och uracil (som internaliseras av permeaset Fur4) 40,41, eller övervakning nedbrytningshastigheten för endocytiska laster såsom STE3 som de internaliseras och transporteras till vakuolen 42. Dessa biokemiska metoder kräver cellys, och är därför inte lämpliga för direkt kvantifiering i levande celler. Alternativt fluorescent märkt α-faktor, den fluidfasen färgämne Lucifer Yellow, eller styryl färgämnet FM4-64 kan användas för att visualisera endocytos i levande celler, men tillåter inte direkt övervakning av endogent uttryckta cargo-proteiner 40,43,44. För dessa metoder, uthållighet av fluorescens i vacuole lumen kan komplicera kvantifiering, som ses med GFP. Det är även möjligt att använda GFP-märkta last för kvantifiering av endocytos genom mätning helcells-fluorescensintensitet och subtrahera signalen från cytoplasmiska och endosomala / vakuolära fack; dock endosomer och vakuoler är ofta i närheten av plasmamembranet. Däremot är pHluorin-märkta endocytiska last släcktes i MVB / vakuolen fack, som kan vara en klar fördel för kvantifiering av människohandel händelser jämfört med mer utbredd GFP taggen. Våra framtida studier kommer att expandera på aktuell kunskap om endocytiska vägar och last sortering i jäst för att identifiera ytterligare faktorer som bidrar till CME och CIE, samt att förstå de mekanismer som reglerar last sortering beslut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
- Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604 (2011).
- Hansen, C. G., Nichols, B. J.
- Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
- Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
- Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
- Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
- Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
- Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
- Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
- Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
- Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
- Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
- O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
- O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
- Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
- Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
- Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
- Bokman, S. H., Ward, W. W.
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
- Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
- Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
- Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
- Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
- Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
- Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
- Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
- Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
- Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
- Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
- Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
- Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
- Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H.
- Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
- Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
- Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).
