Abstract
Grøn fluorescerende protein (GFP) og dens varianter er meget udbredt værktøj til at studere protein lokalisering og dynamik begivenheder såsom cytoskeletal remodellering og vesikulær handel med levende celler. Kvantitative metoder der anvender kimære GFP-fusioner er blevet udviklet til mange anvendelser; dog GFP er noget resistente over for proteolyse, således sin fluorescens fortsætter i lysosomet / vacuolen, som kan hæmme kvantificering af fragt handel i endocytiske proces. En alternativ fremgangsmåde til kvantificering endocytose og post-endocytiske trafficking begivenheder gør brug af superecliptic pHluorin, en pH-følsom variant af GFP, der er standset i sure miljøer. Kimære fusion af pHluorin til cytoplasmatiske hale af transmembrane fragt proteiner resulterer i en afdæmpning af fluorescens ved inkorporering af lasten i multivesikulære organer (MVBs) og levering til lysosomer / vacuole lumen. Således quenching af vakuolær fluorescens letter kvantifikation af endocytose og tidlige begivenheder i endocytiske proces. Dette papir beskriver fremgangsmåder, der anvender pHluorin-mærkede ladninger til kvantificering af endocytose via fluorescensmikroskopi samt populationsbaserede assays under anvendelse af flowcytometri.
Introduction
Vesikulær handel spiller en vigtig rolle i at opretholde organel identitet og funktion i eukaryote celler, og er en vigtig mekanisme til at regulere protein og membran sammensætning af individuelle cellulære rum. Ved plasmamembranen, fusion af exocytiske vesikler leverer nye proteiner og membraner til overfladen af cellen, mens vesikler genereres via endocytose fjerne membran og proteiner fra overfladen til efterfølgende genbrug eller målretning til lysosomet. Således endocytose er vigtig for optagelse af næringsstoffer og for svar på det ekstracellulære miljø. Exocytose og endocytose er afbalanceret til at regulere plasmamembranen areal, og at tillade omsætning af beskadigede proteiner.
Studier i gær og mammale celler har identificeret et stort antal proteiner involveret i endocytose, samt flere endocytiske veje, der fremmer internalisering af specifikke ladninger, eller at reagere på en række enmæssige forhold. Den bedst undersøgte pathway er clathrin endocytose (CME), hvori clathrin og cytosoliske accessoriske proteiner samles til en frakke struktur til at stabilisere den spirende endocytiske vesikel. Forsøg i den spirende gær Saccharomyces cerevisiae har givet vigtige indsigter i dynamik og rækkefølge af rekruttering til mange endocytiske proteiner 1-3. Især er CME maskiner højt konserveret gennem evolutionen, således at størstedelen af CME-relaterede proteiner i gær har humane ortologer; således, knopskydende gær har været et vigtigt redskab til at forstå mekanismerne i endocytose, som er konserverede i højere eukaryoter. For eksempel, undersøgelser under anvendelse af knopskydende gær fastslået, at dannelse og modning af CME strukturer (benævnt kortikale actin patches i gær) involverer den sekventielle rekruttering af mange proteiner, der begynder med clathrin og fragt-bindende adapter proteiner, efterfulgt af ansættelse af yderligere endocytiske tilbehør proteiner,aktivering af ARP2 / 3-medieret actinpolymerisation, og rekruttering af proteiner involveret i vesikel opdeling 1,2. Rekruttering af CME maskiner proteiner til cortical actin patches er en meget ordnet og stereotype proces, og den præcise rækkefølge af rekruttering til mange proteiner er blevet etableret med hensyn til andre dele af CME maskiner. Vigtigere, de seneste undersøgelser har bekræftet en lignende rækkefølge af rekruttering til CME proteiner på clathrin-belagte gruber i pattedyrceller 4.
Foruden CME, mange celletyper have et eller flere clathrin-uafhængig endocytiske (CIE) baner der er afhængige af alternative mekanismer til fremme vesikeldannelse og internalisering fra plasmamembranen 5-7. I gær vi for nylig identificeret en CIE sti, der udnytter den lille GTPase Rho1 og dets aktivering guanin nukleotid udveksling faktor (GEF), ROM1 8,9. Rho1 aktiverer formin Bni1 at fremme actinpolymerisation 10,11, hvilket er påkrævet for denne form for clathrin-uafhængig endocytose i gær 12. Desuden α-arrestin-familien af proteiner rekruttere ubiquitin ligase Rsp5 at fremme fragt ubiquitinering og efterfølgende internalisering gennem CME 13-17, og også fremme fragt internalisering via CIE-vejen, eventuelt gennem direkte interaktion med proteiner involveret i CIE 18. En række af CIE pathways også eksistere i mammale celler, herunder clathrin-uafhængig og fagocytiske veje, der er afhængige af Rho1 ortholog, RhoA 9,19. Rolle RhoA i pattedyr CIE er dårligt forstået; dermed kan studier i spirende gær give yderligere mekanistiske indsigt, der gælder for pattedyr CIE.
Nøjagtig kvantificering af endocytiske begivenheder kan give vigtige oplysninger om roller specifikke proteiner i reguleringen endocytose, og kan afsløre effekten af mutationer på fragt internalisering eller Progression gennem endocytiske proces. Til dette formål kan biokemiske metoder anvendes til at overvåge ligand optagelse eller at måle nedbrydningshastigheder af endocytiske lastproteiner. I levende celler, fusion af grønt fluorescerende protein (GFP) og dens varianter til laster af interesse giver mulighed for direkte visualisering af godstransport. Imidlertid GFP-mærkede ladninger er af begrænset anvendelse til kvantificering af endocytose fordi GFP er resistente over for nedbrydning i lysosomer (eller vacuolen i gær). Endvidere GFP-fluorescens er kun delvis følsom over for ændringer i pH, og fortsat kan spores inden vacuolen lumen 20,21. Følgelig fluorescens af GFP tag fortsætter i vacuolen længe efter resten af lasten er nedbrudt, og helcelle-baseret kvantificering af lasten intensitet kan være upræcis pga langvarig GFP-fluorescens i vacuolen.
For at overvinde ulemperne ved vakuolær GFP-fluorescens, vi tidligere gjort brug af superecliptic pHluorin, en pH-følsom variant af GFP, der fluorescerer lyst ved neutral pH, men mister fluorescens i sure miljøer såsom hulrummet i vacuolen / lysosomet 20,22,23. Placering af et pHluorin tag på den cytoplasmatiske hale af endocytiske laster tillader visualisering af laster på plasmamembranen og på tidlige endosomer, hvor pHluorin tag forbliver eksponeret for cytoplasmaet (figur 1A). Som tidlige endosomer modne, den endosomale sortering komplekse kræves for transport (ESCRT) maskiner pakker overfladeaktive lokaliserede ladninger i vesikler, der opløbet ind i lumen af endosomet, genererer multivesikulære organer (MVBs) 24. For ladninger, der er blevet indarbejdet i de interne MVB vesikler, den pHluorin tag vender mod vesikel lumen. Interne MVB vesikler syrnet; således, pHluorin-mærkede last mister fluorescens på tidlige endosomer som de modnes til MVBs 20. Efterfølgende fusion af MVB med vacuolen leverer MVB luminale indholdfor nedbrydning, forbliver og pHluorin tags standset i det sure miljø i vacuolen lumen.
Dette papir giver detaljerede beskrivelser af kvantitative endocytiske assays ved anvendelse af ladninger med cytoplasmatiske pHluorin tags i gær. Stammer, der udtrykker pHluorin-mærkede ladninger kan anvendes i kinetiske og / eller endpoint assays, afhængigt af egenskaberne og ulovlig adfærd den transporterede last. Desuden er nogle pHluorin-mærkede laster kan underkastes high-throughput analysemetoder, herunder flowcytometri. Vigtigere er det, pHluorin tag er et alsidigt værktøj til at studere endocytiske begivenheder i levende celler, tillader kvantificering af endocytose og sammenligning af endocytiske funktion i vildtype- og mutantstammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Løsninger og Medier
- Forbered følgende bestande, Medier og Plader:
- Til fremstilling 10x YNB, opløses 67 g gærnitrogenbase mangler aminosyrerne i 1 I vand. Der steriliseres ved filtrering gennem et 0,22 um nitrocellulosefilter.
- Forbered YNB medium ved hjælp 1x YNB (fra 10x lager) med 2% dextrose (fra en steril 50% w / v lager), og blandingen 1x aminosyre / næringsstof (fra 100x lager, se trin 1.1.4). For plasmid udvælgelse, udelade individuelle aminosyrer eller næringsstoffer efter behov. Til induktion af Mup1 ekspression, derudover udelade methionin fra blandingen aminosyren / næringsstof.
- Forbered YNB plader under anvendelse 1x YNB (fra 10x stock), 2% dextrose (fra en steril 50% vægt / volumen lager), 0,7 g / l aminosyre-blanding syre / næringsstof (se trin 1.1.5) og 2,5% agar. Forbered plade medium ved autoklavering 25 g agar og 0,7 g amino- blanding syre / næringsstof pr 860 ml vand. Lad blandingen afkøle til 55 ° C, hvorefter der tilsættes 100 ml 10x YNB og 40 ml of 50% glucose. Hæld plader (ca. 30 ml medium pr 10 cm skål), tillade mediet at størkne ved stuetemperatur, og gemme plader ved 4 ° C.
- Forbered 100x aminosyre / næringsstof-stamopløsning (for flydende medium) ved at opløse følgende i 100 ml deioniseret vand: 0,1 g L-methionin, 0,3 g hver af L-leucin og L-lysin og 0,2 g hver af L-histidin , L-tryptophan, adenin og uracil (andre aminosyrer og næringsstoffer kan inkluderes efter behov for specifikke stammer). Brug blid varme, hvis nødvendigt for at opløse, og der steriliseres gennem et 0,45 um nitrocellulosefilter. Opbevar ved stuetemperatur med beskyttelse mod lys. For plasmid udvælgelse, forberede stamopløsninger mangler specifikke komponenter efter behov.
- Forbered aminosyre / blandingen næringsstof (for plader) ved at kombinere følgende: 0,5 g adenin, 4 g L-leucin, og 2 g hver af L-histidin, L-lysin, L-methionin, L-tryptophan, L- tyrosin og uracil. Grind med en morter og støder, og opbevar med probeskyttelse mod lys. For plasmid udvælgelse, forberede blandinger mangler specifikke komponenter efter behov, og bruge 0,7 g aminosyreblanding pr liter plade medium (se trin 1.1.3).
- Forbered 8-brønds kammerobjektglas til mikroskopi ved at overtrække overfladen af objektglasset med concanavalin A (ConA). Til hver brønd af kammeret slide, tilsættes 25 pi 2 mg / ml ConA opløst i vand. Ved hjælp af en pipettespids, sprede ConA over bunden overfladen af brønden, og derefter køles objektglasset lufttørre ved stuetemperatur i mindst 4-8 timer. Ideelt set bruge kammer dias inden 24 timer af ConA belægning.
- Generere gærstammer med i-ramme-fusioner af GFP eller pHluorin til endocytiske last af interesse under anvendelse af polymerasekædereaktion (PCR) -baseret integration metoden beskrevet i Longtine et al. og Goldstein og McCusker 25,26.
BEMÆRK: Plasmider indeholdende pHluorin tagging kassetter med resistensgener for kanamycin (KANMX6) og nourseothricin (- Amplificere GFP eller pHluorin kassetter indeholdende selekterbare markører med primere indeholdende yderligere sekvenser specifikke til stedet for genomisk integration 20,25.
- Omdan det resulterende PCR produktet til den ønskede gærstamme under anvendelse af lithiumacetatfremgangsmåden 27.
- Vælg til integration af kassetten ved at dyrke celler på YPD-plader indeholdende det passende stof. Til fremstilling plader, autoklaven 10 g gærekstrakt, 20 g pepton, 0,1 g tryptophan og 25 g agar i 960 ml vand. Før hælde plader, lad blandingen afkøle til 55 ° C, tilsæt derefter 40 ml 50% glucose og enten G418 til en slutkoncentration på 200 ug / ml for KANMX6 udvælgelse, eller nourseothricin til en slutkoncentration på 100 ug / ml for NATMX4 valg.
- Bekræft integration af GFP eller pHluorin tag i individuelle kolonier ved PCR og / eller Western blotting under anvendelse af anti-GFP-antistoffer,samt ved påvisning af det mærkede protein ved fluorescensmikroskopi 20.
BEMÆRK: Specifikke gærstammer og plasmider anvendt i denne undersøgelse, er anført i tabel 1 og 2, henholdsvis.
2. Endpoint Assay for Steady-state Fluorescens af konstitutivt internaliseret Endocytic Cargo
- Pode celler (~ 3 små kolonier) i 5 ml YNB medium uden aminosyrer eller næringsstoffer som kræves til plasmidopretholdelse (hvis relevant). Grow celler i 16-24 timer i en orbital rysteinkubator ved 30 ° C, med 250 rpm rystning. Alternativt streak en ~ 1-2 mm koloni af celler på en YNB plade mangler aminosyrer eller næringsstoffer for plasmid udvælgelse, og vokse celler natten over ved 30 ° C.
- Mål densitet (OD 600) af hver overnatskultur under anvendelse af et spektrofotometer. Forbered en 5 ml fortynding på 0,35-0,4 OD 600 / ml i YNB medium uden aminosyrer eller næringsstoffer for plaSmid vedligeholdelse, og vokse i ca. 3 timer ved 30 ° C under omrystning. Hvis du bruger celler stribede på en plade, skal du springe dette trin over og fortsætte med trin 2.4 (se nedenfor).
- Mål densitet (OD600) af celler, som nu skal være mellem 0,6-1,0 OD600 / ml. Overfør 1,5 ml kultur til en mikrocentrifugerør og pellet celler ved 8.000 rpm (6800 xg) i 2 min. Fjern 1.475 pi supernatant.
- Bring celler til et fluorescensmikroskop. Før billeddannelse hver prøve, udarbejde et objektglas ved resuspendering af cellerne i de resterende medium, og montere 3 pi cellesuspension under et dækglas. Alternativt forberede 8-brønds kammerobjektglas som beskrevet nedenfor i protokol 3 under anvendelse YNB-medium som passende til plasmidselektion. Ideelt, billed celler med et 100X, 1.4 eller højere numerisk apertur (NA) immersionsolie objektiv, en 12- eller 16-bit-kamera, og excitation / emission filtre optimeret til GFP-fluorescens.
BEMÆRK: Hvis du bruger celler vokset med striber ona plade, forberede dias ved at placere 3 pi frisk YNB medium på en dækglas. Ved hjælp af en pipettespids, indsamle en lille koloni af celler fra pladen, dispergere cellerne i YNB-medium, og montere den resulterende suspension på et objektglas umiddelbart før billeddannelse. - Billede 4-6 tilfældige områder af celler for hver tilstand, ved hjælp af de samme erhvervelse parametre (dvs. filtersæt og eksponering tid) for alle billeder i et eksperiment.
BEMÆRK: Indsamling et lysfelt eller DIC billede for hvert felt kan være nyttigt for celler, hvor pHluorin signalet standset i MVB og vakuolære rum. - Kvantificer fluorescensintensitet på mindst 30-50 celler for hver betingelse (se protokol 5).
3. Kinetic Assay for Kvantificering af Endocytose af Cargos der undergår Reguleret Endocytose
- Pode 2-3 kolonier af gærceller (ca. 2 mm i diameter pr koloni) i 5 ml YNB-medium uden methionin og tilsættionelle aminosyrer eller næringsstoffer til at opretholde plasmid valg. Grow kulturer i 16-24 timer ved 30 ° C under omrystning.
BEMÆRK: I dette papir vil protokoller for at studere regulerede endocytiske lastproteiner gøre brug af methionin permease, Mup1. Andre laster, som undergår reguleret endocytose er også egnede til mærkning med pHluorin (f.eks uracil permease Fur4, som akkumulerer på plasmamembranen i fravær af uracil, og internaliserer som reaktion på eksternt anvendt uracil); for disse laster bør medieforhold ændres for at afspejle de specifikke udtryk, induktion og internalisering betingelser for, at lasten. - Mål densitet (OD 600) af hver overnatskultur ca. 3 timer før billeddannelse. Der fremstilles en 5 ml fortynding på 0,35-0,4 OD600 / ml i YNB-medium uden methionin og yderligere aminosyrer eller næringsstoffer for plasmidopretholdelse, og vokse ved 30 ° C under omrystning.
- Pre-ligevægt de mikroerklare miljømæssige kammer eller opvarmet fase (hvis tilgængelig) til 30 ° C under 3 hr inkubation af trin 3.2.
- Overfør 1 ml cellekultur til et mikrocentrifugerør og pellet cellerne ved 8000 rpm (6800 xg) i 2 min. Fjern 975 pi supernatant.
- Forbered en ConA-behandlet, 8-godt glas-bund kammer slide for imaging (protokol 1.2).
- Tilsæt 200 pi YNB-medium uden methionin og yderligere aminosyrer eller næringsstoffer for plasmid markering til hver brønd. Resuspender cellepelleten fra trin 3.4 i den resterende supernatant, og slip 2,5 pi cellesuspension ind i midten af hver brønd. Disperse celler i hele overfladen af brønden ved at pipettere op og ned, og tillade cellerne at sætte sig i 5-10 min.
- Placer kammeret slide på en inverteret fluorescensmikroskop ækvilibreret til 30 ° C (se trin 3.3). Lokalisere et felt af celler under anvendelse lysfelt belysning.
- Der tilsættes 50 pi YNB-medium indeholdende 100 ug / ml methionin(Forvarmet til 30 ° C) til 200 pi medium i brønden for at opnå en endelig methionin koncentration på 20 ug / ml. Undgå forstyrrelser af mediet i brønden for at forhindre cellerne i at flyde fra bunden.
- Lade cellerne ækvilibrere i 2 min før påbegyndelse billeddannelse. Umiddelbart før opfange det første billede, juster mikroskopet til den ønskede brændplanet (typisk, virker en ækvatorial fokalplan bedst).
- Erhverve GFP og lysfelt (eller DIC) billeder med 5 minutters intervaller i 45-60 minutter, under anvendelse af identiske erhvervelse parametre for alle billeder i en tidsserie (f.eks 100X 1.4 NA oliebestandighedsobjektets og 500 msek erhvervelse tid ved hjælp GFP filter, 100 ms erhvervelse tid ved hjælp af DIC filter).
BEMÆRK: Hvis mikroskopets etape og billedbehandlingssoftware ikke tillader automatisk korrektion af fokusplan afdrift, kan det være nødvendigt manuelt at justere fokus forud for hver billeddannelse tidspunkt. Desuden vil indfangningstidervarierer mellem mikroskoper grund af forskelle i belysning og filtre, og optimale betingelser bør bestemmes manuelt forud for begyndelsen af eksperimentet. Hvis der anvendes en endocytisk fragt bortset Mup1, kan det være nødvendigt at modificere erhvervelse tid og billedbehandling intervaller, såvel som varigheden af eksperimentet, at afspejle internalisering kinetik at fragten. - Kvantificer fluorescensintensitet af individuelle celler ved hvert tidspunkt (se protokol 5) og hurtig værdier som en procentdel af den oprindelige intensitet af det første billede.
4. Endpoint Assay for Kvantificering af Endocytic Cargos der gennemgår Reguleret Endocytose
- Forbered cellerne til billeddannelse som beskrevet i protokol 3 (trin 3.1 gennem 3.6).
- Billede 4-5 tilfældige områder af celler for hver betingelse umiddelbart før tilsætning methionin, ved hjælp af lysfelt og GFP filtersæt.
- Der tilsættes 50 pi YNB-medium indeholdende 100 ug / ml methionin (førkrigsMed til 30 ° C) til 200 pi medium i brønden for at opnå en endelig methionin koncentration på 20 ug / ml. Undgå forstyrrelser af mediet i brønden for at forhindre cellerne i at flyde fra bunden.
- Billeddata 4-5 tilfældige områder af celler 30 minutter efter tilsætning af methionin, anvendelse af de samme erhvervelse parametre som for 0 min tidspunkt (trin 4.2).
- Kvantificer fluorescensintensitet på mindst 30-50 celler for hvert tidspunkt (se protokol 5). Express værdier som procentdelen af Mup1-pHluorin internaliseres efter 30 minutter ved anvendelse af formlen: [Mean intensitet ved 0 min - Mean intensitet ved 30 min] / [Mean intensitet ved 0 min] x 100%.
BEMÆRK:. Det er muligt at samtidigt udføre op til otte endpoints analyser ved at forskyde starttidspunktet for hvert assay Tabel 3 giver et eksempel workflow for otte samtidige analyser.
5. Post-erhvervelse Analysis
- Eksport billeder fra erhvervelse software som en6-bit mærkede billedfil format (.tif eller .tiff-format).
BEMÆRK: Andre filformater kan også være egnede, og bør ideelt bruge tabsfri komprimering algoritmer. 8-bit billeder er generelt ikke egnet til kvantificering formål. - Åbne filer ved hjælp ImageJ software (frit tilgængelig på 'Åbn' i menuen 'Filer'. Brug fluorescens billede til kvantificering og brightfield / DIC billede som en henvisning til identificere placeringen af cellerne og at udelukke døde celler (hvis ), som synes mørkere end levende celler, når set af DIC og autofluorescerende når de ses med GFP excitation / emission filtre.
- Udfør en baggrund subtraktion på fluorescensbillede. For billeder med en ujævn baggrund signal, bruge 'Baggrund Subtraktion "algoritme findes i» Process menuen'. Brug standardindstillingen (rullende kugle radius på 50 pixels), hvilket er normalt tilstrækkeligt til kvantificering formål.
BEMÆRK: En alternativ background subtraktion metode til billeder med ensartet baggrund er beskrevet i trin 5.3.1.-5.3.2; men den ovennævnte fremgangsmåde fungerer også for ensartet baggrund.- For billeder med ensartet baggrund (dvs. baggrund intensitet er omtrent konstant ved alle kanter og i midten af billedet), udføres en manuel baggrund subtraktion. Klik på knappen 'frihånd valg' findes i det primære ImageJ vinduet, og vælg 3-5 tilfældige områder i billedet, der ikke indeholder celler.
- Åbn "Set Målinger 'funktion placeret i' Analyser 'menuen, vælge' Mean Gray Value 'parameter, og måle intensitet værdier ved hjælp af" Mål "funktion (også fundet i" Analyser "menuen). Beregn den gennemsnitlige værdi af de 3-5 målte områder, og trække fra alle efterfølgende målinger i dette billede.
- For kvantificering af kinetiske analyser (protokol 3), generere en enkelt, stablet billede til time-serien. Åbn fluorescens billederne fra hvert tidspunkt i kronologisk rækkefølge, og generere en stak ved hjælp af 'billeder til Stack' funktion (findes i menuen 'Billede', under undermenuen Stakke).
- Skitsere en celle ved hjælp af frihånd markeringsværktøjet, og sørg for at inkludere hele cellen, men som lille område uden for cellen som muligt.
- Mål følgende parametre: "Area, Integreret Density" og "Mean Gray Value '. Vælg parametre ved hjælp af "Set Målinger 'funktion, som ligger i" Analyser "menuen.
BEMÆRK: Integreret Density svarer til summen af alle pixel intensiteter inden for den valgte region, og Mean Gray værdi svarer til [Integreret Density / Area], som korrigerer værdier intensitet for celle størrelse. - Åbn "ROI Manager" placeret i menuen 'Analyser', under 'Funktioner' undermenu. I vinduet ROI manager, skal du klikke på knappen 'Tilføj' for at indtaste det fremhævede region som en ny region af interesse (ROI).
- Gentag trin 5.4 gennem 5.6 for de resterende celler i billedet. Udeluk eventuelle døde celler som vurderet af lysfelt / DIC og fluorescens (døde celler vises mørkere i DIC-billeder, og har autofluorescerende cytoplasmatisk signal, når den ses med GFP excitation / emission, se figur 2F), og eventuelle celler, der rører ved kanten af billedet. Gem de valgte ROI'er som en .zip-fil ved at klikke på knappen 'More' i 'ROI Manager "vinduet, og eksportere alle målinger til et regneark eller statistisk analyse software.
- Til kvantificering af kinetiske assays (protokol 3), skitsere og måle en celle fra det oprindelige tidspunkt som beskrevet i trin 5.4 og 5.5. Brug samme ROI til måling af alle efterfølgende tidspunkter i forsøget.
- For endpoint assays (protokol 2 og 4), måle mindst 30-50 celler for hver betingelse. Udfør kvantificering i mindst 2-3 billeder, og omfatter alle celler i hverbillede, der opfylder kriterierne i trin 5.8 i analysen.
- Vurdere statistisk signifikans mellem prøver ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey multiple sammenligning test for post-hoc analyse.
6. Population Analyse af Mup1-pHluorin Endocytose ved flowcytometri
- Pode 2-3 kolonier af gærceller (ca. 2 mm i diameter pr koloni) i 0,5 ml YNB-medium uden methionin og yderligere aminosyrer eller næringsstoffer til opretholdelse plasmid markering. Grow celler i 5 ml rundbundet rør i 16-24 timer ved 30 ° C på en valse tromle.
- Tilsættes 1,5 ml YNB-medium uden methionin og yderligere aminosyrer eller næringsstoffer for plasmidopretholdelse, og vokse ved 30 ° C i yderligere 3 timer på en rulle tromle.
- Overføres 1 ml celler i hver af to 5 ml rundbundet rør. Tilsættes 0,25 ml YNB -Met medium til det første rør (-Met tilstand), og 0,25 ml YNB-medium indeholdende 100 ug/ Ml methionin til det andet rør for at give en endelig methionin koncentration på 20 ug / ml (+ Met condition). Cellerne inkuberes ved 30 ° C i 45 minutter på en rulle tromle.
- Analyser celler ved flowcytometri, vælge forward scatter (FS) som et mål for cellestørrelse, og Mup1-pHluorin fluorescensintensitet fra en fluoresceinisothiocyanat (FITC) filter som et mål for fragt internalisering.
- Brug knapperne skyderen for at justere spændingen af FS og FITC-kanaler for at optimere påvisning for størrelsen rækkevidde og fluorescens intensiteten af gærceller, der anvendes (for disse eksperimenter, indstillinger, der anvendes var 50 V for FS og 400 V for FITC).
BEMÆRK: Spænding for begge kanaler vil variere afhængigt af flowcytometeret bruges. Dette trin bør ske før eller under 45 min behandling med methionin (trin 6.3). - Mål FS og fluorescensintensiteten for 10.000 celler fra hver betingelse, ved hjælp rate indstillingen højt flow. Generer et scatter plot af FS mod fluorescence intensitet: Klik på 'tilføj graf' skal du vælge FITC (x-aksen) og FS (y-aksen), og graf 1.000 point (softwaren vil vise værdier for 1.000 celler, selvom 10.000 celler blev målt).
BEMÆRK: For maksimal konsistens, analysere celler 45-50 minutter efter tilsætning af methionin; for forsøg med et stort antal prøver, forskyde tilsætning af methionin til at rumme den nødvendige tid til flowcytometrianalyse. - Indbefatter -Met og + Met betingelser for vildtype (WT) celler som en kontrol. Brug af porten funktion, tildele en lodret gate hjælp af WT + Met betingelse, således at ca. 5% af de lyseste celler falde til højre for indgangen. Brug denne gating for alle andre forhold i forsøget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Steady-state lokalisering og kvantificering af konstitutivt internaliseret endocytiske last protein Ste3
For at demonstrere at pHluorin-mærkede ladninger kan anvendes til kvantificering af endocytose i levende celler, lokalisering af kimært GFP og pHluorin fusioner med det cytoplasmiske C-terminale hale af Ste3, a-faktor pheromon receptoren i gær, blev sammenlignet. Ste3 er en G-protein-koblede receptorer (GPCR), som konstitutivt transporteres til plasmamembranen, internaliseres, og målrettet mod vacuolen for nedbrydningen 28. Således under steady-state betingelser, de fleste af Ste3 lokaliseres til vacuolen lumen, som det ses i vildtype (WT) -celler der udtrykker Ste3-GFP (figur 2A). I modsætning hertil celler, der mangler generne kodende for de fire clathrin-bindende adapter proteiner ent1, Ent2, Yap1801 og Yap1802 (ent1 Δent2 Δ yap1801 Δ yap1802 Δ, i det følgende benævnt 4Δ) undlader at stabilisere clathrin på steder af endocytose 29, og er alvorligt defekte i CME 30. 4Δ celler kræver udtryk for epsin N-terminal homologi (enth) domæne af enten ent1 eller Ent2 for levedygtighed 30,31. Den enth domæne er ikke tilstrækkelig til endocytose i 4Δ celler, som vist ved tilbageholdelse af Ste3-GFP på plasmamembranen i 4Δ + ENTH1 celler, der udtrykker enth domæne af ent1 (figur 2A) 8,30; Der er observeret lignende retention plasmamembranen i 4Δ + ENTH1 celler til andre endocytiske ladninger, herunder Ste2-GFP (den α-faktor pheromon receptor) og Mup1-GFP eller Mup1-pHluorin (a methionin permease) 8,18. I modsætning hertil ekspression af fuldlængde ent1 fra et plasmid i 4Δ celler (4Δ + ent1) genopretter endocytose og lokalisering af Ste3-GFP til vacuolen. 4Δ + ENTH1 celler blev for nylig brugt ina genetisk screen til at identificere et CIE vej hos gær, der er afhængig af actin-modulerende GTPase Rho1 og dens GEF, ROM1, samt formin Bni1 og medlemmer af α-arrestin familie af proteiner involveret i fragt sortering 8,18. I overensstemmelse med en rolle i CIE, udtryk for rom1 eller α-arrestin LDB19 fra high-kopi plasmider i 4Δ + ENTH1 celler forbedret internalisering af Ste3-GFP (figur 2A).
Celler, der udtrykker Ste3-GFP eller andre GFP-mærkede endocytiske last har lyse vakuoler grund af ophobning og proteolytisk modstand af GFP tag. I modsætning hertil celler, der udtrykker Ste3-pHluorin har meget lave niveauer af vakuolær fluorescens som følge af quenching af den pHluorin tag i sure miljøer 20. Som tidligere set viste WT og 4Δ + ent1 celler meget lidt detekterbart Ste3-pHluorin ved fluorescensmikroskopi (Figur 2B). I modsætning hertil Ste3-pHluorinvar let påviselig ved plasmamembranen af 4Δ + ENTH1 celler, mens vacuolær Ste3-pHluorin forblev næsten ikke målbart i alle tilfælde. High-copy ekspression af ROM1 eller LDB19 reducerede mængden af påviseligt Ste3-pHluorin på celleoverfladen i lighed med resultater med Ste3-GFP, selv vacuolær Ste3-pHluorin forblev næsten upåviselig i alle tilfælde.
At sammenligne effektiviteten af GFP- og pHluorin-mærkede ladninger som redskaber til at kvantificere ændringer i endocytiske kapacitet af celler, blev helcelle fluorescensen af Ste3-GFP og Ste3-pHluorin målt i WT og 4Δ celler. Selvom ændringerne i Ste3-GFP lokalisering var let påvises ved mikroskopi (figur 2A), forskelle i den samlede fluorescensintensitet var ikke statistisk signifikant mellem WT, 4Δ + ent1 og 4Δ + ENTH1 celler transformeret med tom vektor (Figur 2C) 20. Likewise, 4Δ + ENTH1 celler transformeret med vektor, rom1 og LDB19 havde lignende hel-celle fluorescensintensiteter. Især 4Δ + ENTH1 celler transformeret med rom1 eller LDB19 var betydeligt svagere end WT celler (Figur 2C) 8,18; dog Ste3-GFP proteinniveauer var ens som vurderet ved immunoblotting (figur 2E). Mens forskellen i intensitet kan være delvist skyldes ændringer i vacuolen størrelse eller morfologi, eller forskelle i retention af GFP tag i vacuolen, går kvantificering af Ste3-GFP-fluorescens ikke afspejle ændringerne i lokalisering observeret ved fluorescensmikroskopi (Figur 2A). I modsætning hertil kvantificering af Ste3-pHluorin intensitet viste, at 4Δ + ENTH1 celler transformeret med vektor var signifikant lysere end WT eller 4Δ + ent1 celler, og high-kopi udtryk for rom1 eller LDB19 i 4Δ + ENTH1 celler reduceret Ste3-pHluorin intensitet tilniveauer, der var magen til WT og 4Δ + ent1 (figur 2D). Således kvantificering af steady state Ste3-pHluorin intensitet afspejler præcist forskellene i lokaliseringen observeret ved fluorescens mikroskopi.
Kinetiske internalisering assays under anvendelse af reguleret endocytiske fragt, Mup1
Kvantificering af fluorescensintensitet for konstitutivt internaliserede ladninger ved steady-state kan afsløre forskelle i endocytiske kapacitet mutantceller sammenlignet med WT-celler. Det er dog muligt, at nogle laster kan nå samme steady-state fordeling og intensitet i WT og endocytiske mutantceller, selv om de mutante celler har en forsinkelse i endocytose eller langsommere kinetik for fragt internalisering. I stedet pHluorin-mærkede ladninger, som undergår reguleret endocytose som reaktion på en specifik stimulus eller ligand kan anvendes til at overvågekinetik endocytose. Til dette formål blev internalisering af høj affinitet methionin permease, Mup1, overvåget 32. I fravær af ekstracellulært methionin, er Mup1 ekspression opreguleres, og permeasen opbevares på plasmamembranen; ved tilsætning af methionin til mediet, Mup1 undergår hurtig internalisering og målretning til vacuolen 13.
At overvåge kinetikken for Mup1 internalisering blev WT stammer, der udtrykker Mup1-GFP eller Mup1-pHluorin fra det genomiske locus dyrket i fravær af methionin for at akkumulere fluorescerende Mup1 på plasmamembranen (fig 3A, 0 min tidspunkt). Time-lapse billeddannelse af celler blev derefter udført med 5 minutters intervaller i fravær eller nærvær af methionin til at overvåge fragt internalisering og ændringer i fluorescens. Som forventet, GFP- og pHluorin-mærket Mup1 afbildet i fravær af methionin forblev på plasmamembranen feller hele 45 min observationsperioden 20. I modsætning hertil celler afbildes i nærvær af methionin viste progressiv udtynding af fluorescenssignalet fra celleoverfladen, konsistent med last internalisering. Især Mup1-GFP-fluorescens akkumuleret i interne strukturer (dvs. endosomer og vakuolen), hvorimod Mup1-pHluorin lokaliseret til intern punctae der sandsynligvis svarer til tidlige endosomer, men blev ikke set i vacuolen.
Når fluorescens blev kvantificeret på tværs af alle tidspunkter for individuelle celler, viste Mup1-GFP og Mup1-pHluorin intensitet lille ændring i fravær af eksternt påførte methionin i løbet af 45 min eksperiment, i overensstemmelse med proteinet forbliver stabilt lokaliseret til plasmamembranen (figur 3B). I modsætning hertil helcelle Mup1-pHluorin intensitet hurtigt faldt i nærvær af methionin, således at en reduktion i fluorescenc 50%e intensitet blev observeret efter ca. 20-25 min, og en nedsættelse på 80% blev observeret efter ca. 40 min 20. Mup1-GFP-celler viste også et fald i fluorescensintensitet efter tilsætning af methionin; imidlertid blev kinetikken for fluorescens tab forsinket sammenlignet med dem for Mup1-pHluorin, således at en 50% nedgang i intensitet kun blev observeret efter 40 min. Som det ses i figur 3A, Mup1-GFP var næppe detekterbar ved plasmamembranen på dette tidspunkt, hvilket indikerer, at vedvarende vakuolær GFP-fluorescens forhindret nøjagtig kvantificering af endocytiske begivenheder på celleoverfladen.
Endpoint assays under anvendelse af reguleret endocytiske fragt, Mup1
Foruden kvantitative, kinetiske assays af endocytose som beskrevet ovenfor, kan regulerede endocytiske laster såsom Mup1 også anvendes til endpoint assays, svarende til kvantificeringaf steady state Ste3-pHluorin intensitet. Til dette formål blev analysen til kvantificering af Mup1-pHluorin internalisering modificeret til at kunne sammenligne gennemsnitlige fluorescensintensiteter fra populationer af celler afbildet umiddelbart før eller 30 min efter tilsætning af methionin 8,18. Denne fremgangsmåde giver mulighed sammenligning af andelen af Mup1 internaliseret mellem WT og endocytiske mutant celler.
I overensstemmelse med resultaterne af den kinetiske analyse (figur 3), blev Mup1-pHluorin hurtigt udtømt fra plasmamembranen i WT-celler (figur 4A), således at ca. 60% af Mup1-pHluorin blev internaliseret 30 min efter tilsætning af methionin ( Figur 4B). Som forventet, Mup1-pHluorin internalisering var ligeledes effektiv i 4 + ent1 celler, mens internalisering blev signifikant reduceret i 4Δ + ENTH1 celler, i overensstemmelse med en alvorlig defekt i endocytose. High-kopi udtrykaf rom1 eller α-arrestin LDB19, der specielt kræves for Mup1 internalisering via både CME og CIE veje 13,18, forbedret internalisering af Mup1-pHluorin, i overensstemmelse med deres evne til at fremme endocytose i 4Δ + ENTH1 celler 18. Især selvom steady state Ste3-pHluorin intensitet i 4Δ + ENTH1 celler, der udtrykker høj kopi rom1 eller LDB19 var til at skelne fra WT eller 4Δ + ent1 celler, internalisering af Mup1-pHluorin blev kun delvist forbedret i 4Δ + ENTH1 celler, der udtrykker høj kopi rOM1 eller LDB19 (figur 4C). Således indikerer disse data, at kinetiske og / eller endpoint assays kan afsløre forskelle i endocytiske satserne mellem WT og mutantstammer for nogle laster, selv om lignende steady-state distribution af andre laster kan opnås på de samme stammer.
Befolkning-baseret analyse af Mup1-PHLuorin internalisering hjælp flowcytometri
High-throughput analyse af større populationer af celler ved hjælp af flowcytometri kan give et alternativ til at udføre kinetiske og slutpunkt analyser for fragt internalisering ved mikroskopi. Til dette formål blev fluorescens intensiteten af Mup1-pHluorin sammenlignet i WT celler fra en kultur dyrket i fravær af methionin (WT Met, som bør være "lyse") eller i nærværelse af methionin i 45 min (WT + Met, som bør være "dim" sammenlignet med ubehandlede celler baseret på 80% reduktion i fluorescensintensitet ses i figur 3B). Efter analyse ved flowcytometri blev en vertikal port påføres WT + Met tilstand, hvor ~ 5% af cellerne var indeholdt i højre side af porten, og svarede til de lyseste celler i populationen (figur 5A og 5B , red befolkning). Når den samme gate blev påførttil WT -Met tilstand, ca. 65% af cellerne faldt i den lyse kategori, hvilket viser, at flowcytometri kan bruges til let at observere forskelle i Mup1-pHluorin fluorescensintensitet mellem populationer af celler før og efter tilsætning af methionin. I modsætning hertil fordelingen af lyse versus dim celler kunne ikke skelnes i 4Δ + ENTH1 -Met og + Met betingelser under anvendelse af samme gate påføres WT + Met population, i overensstemmelse med defekt endocytose. Således flowcytometri kan konstatere ændringer i endocytiske kapacitet af celler, og tillader hurtig analyse af store populationer af celler. Vigtigere, flowcytometri kan også bruges i genetiske skærme som et redskab til sortering og udvælgelse af mutant celler med defekte endocytose (K. Wrasman og B. Wendland, manuskript under udarbejdelse) 33.
Figur 1:
Figur 2:. Lokalisering og kvantificering af Ste3-GFP og Ste3-pHluorin i vildtype og endocytiske mutant celler (A) WT, 4Δ + ent1 og 4Δ + ENTH1 celler, der udtrykker genomisk kodet Ste3-GFP og transformeret med vektor, høj-kopi ROM1 eller høj-kopi LDB19 som indikeret blev visualiseret ved fluorescensmikroskopi (øverste række) eller DIC (nederste række). Ste3-GFP billeder blev justeret til de samme maksimale og minimale intensiteter for at muliggøre direkte sammenligning af Ste3 lokalisering. (B) WT, 4Δ + ent1 og 4Δ + ENTH1 celler, der udtrykker genomisk kodet Ste3-pHluorin blev transformeret og filmede som beskrevet i panel A. Scale bar = 2 um. (C, D) Kvantificering af fluorescensintensiteten for Ste3-GFP (C) og Ste3-pHluorin (D) stammer anvendt i panel A og B. For hver betingelse blev helcelle fluorescens kvantificeret i mindst 40 celler. Værdier blev korrigeret for cellestørrelse, og udtrykt i arbitrære enheder (AU) som middelværdi ± SEM (*** p <0,001 sammenlignet med WT; ††† p <0,001 sammenlignet med 4Δ + ENTH1 + vektor). (E) Relative udtryk for Ste3-GFP vurderet i WT, 4Δ + ent1 og 4Δ + ENTH1 celler transformeret med vektor, høj kopi rom1 eller høj-kopi LDB19 som angivet. Celleekstrakter blev fremstillet som tidligere 20 beskrevet, og lige mængder af hver prøve blev opløst ved SDS-PAGE. Ste3-GFP-ekspression blev vurderet ved immunoblotting med anti-GFP-antistoffer, og protein loading blev vurderet ved anvendelse af anti-GAPDH. (F) vildtypeceller udtrykker genomisk kodet Ste3-GFP ses af fluorescensmikroskopi (Ste3-GFP panel) og DIC optik, med et dødt celle angivet med pile. Døde celler vises autofluorescerende i GFP-filter, og er mørkere, når de ses ved DIC. Scale bar = 2 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Kinetic assay af Mup1-GFP og Mup1-pHluorin internalisering (A) Wild-type celler, der udtrykker genomisk kodet Mup1-GFP (to øverste paneler) eller Mup1-pHluorin (nederste to paneler) blev dyrket til midt-logaritmisk fase i YNB-medium uden methionin for at inducere Mup1 ekspression og fastholdelse på plasmamembranen. Celler blev derefter afbildes ved fluorescensmikroskopi hver 5 min i fravær (- Met) eller nærvær (+ Met) på 20 pg / ml methionin. For hvert tidspunkt i en tilstand, var identiske maksimum og minimum intensitetsværdier anvendt til sammenligning af fluorescensintensiteten og lokalisering. 0, 5, 10, 20 og 40 min tidspunkter er vist som angivet for alle forhold. Scale bar = 2 um. (B) Kvantificering af Mup1-GFP og Mup1-pHluorin internalisering i vildtypeceller fra panel A. Whole-celle fluorescens intensiteten af Mup1-GFP (- Met, lilla firkanter, + Met, blå diamanter) eller Mup1-pHluoRin (- Met, grønne trekanter; + Met, røde cirkler) blev målt for enkelte celler afbildet med 5 min intervaller, og udtrykt som en procentdel af den oprindelige fluorescensintensitet (gennemsnit ± SEM, n = 6 celler pr betingelse). Genoptrykt fra Prosser et al. (2010) 20 med tilladelse fra udgiveren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Endpoint assay af Mup1-pHluorin internalisering (A) WT, 4Δ + ent1 og 4Δ + ENTH1 celler, der udtrykker genomisk kodet Mup1-pHluorin og transformeret med vektor, høj kopi rom1 eller høj-kopi LDB19 som indikeret blev dyrket til midt -logarithmic fase i YNB-medium uden methionin. Tilfældige områder af celler blev afbildet ved fluorescenc e mikroskopi umiddelbart før (- Met) eller 30 minutter efter (+ Met) tilsætning af 20 ug / ml methionin. Alle billeder blev justeret til de samme maksimale og minimale værdier intensitet. Scale bar = 2 um. (B) Kvantificering af Mup1-pHluorin internalisering i celler fra panel A. For hver betingelse blev helcelle fluorescensintensiteten målt for mindst 40 celler og korrigeret for cellestørrelse. Procentdelen af Mup1-pHluorin internaliseres blev beregnet ved at sammenligne middelværdier intensitet før og efter 30 minutters behandling med methionin. Værdier er vist som gennemsnit ± SEM (n = 4; *** p <0,001 sammenlignet med WT; † p <0,05 sammenlignet med 4Δ + ENTH1 + vektor). Dette tal er blevet ændret fra Prosser et al. (2015) 18 med tilladelse fra udgiveren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Population analyse af Mup1-pHuorin internalisering ved flowcytometri (A) WT og 4Δ + ENTH1 Cellerne blev dyrket til midt-logaritmisk fase i YNB-medium uden methionin. Celler blev derefter inkuberet i fravær (- Met) eller nærvær (+ Met) på 20 pg / ml methionin i 45 minutter før analyse ved flowcytometri. For hver betingelse blev forward scatter (i arbitrære enheder, AU) afbildet mod fluorescensintensitet (au, ved anvendelse af et FITC-filter) til 1000 celler ud af i alt 10.000 celler målt. Populationer blev yderligere analyseret ved at påføre en vertikal port (blå pil) til WT + Met tilstand, hvor ca. 5% af de lyseste celler (vist med rødt) faldt på højre side af porten. Gatingen genereret for WT + Met betingelse blev derefter påført på de øvrige betingelser for at tillade sammenligningaf prøven distributioner. (B) Sammenfatning af procentdelen af dim celler (sorte punkter, til venstre for porten) og lyse celler (røde punkter, til højre for indgangen) for WT og 4Δ + ENTH1 ± Met forsøg vist i panel A. Zoom klik her for at se en større version af dette tal.
| Strain | Genotype | Kilde |
| SEY6210 en | MAT α HIS3-Δ200 trp1-Δ901 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 SUC2-Δ9 | Laboratorium plasmid |
| BWY2858 | STE3-GFP :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY2995 | STE3-pHluorin :: KANMX6 | PRosser et al. (2010) 16 |
| BWY3036 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3037 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3399 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3400 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3817 | MUP1-GFP :: KANMX6 | prOsser et al. (2010) 16 |
| BWY3818 | MUP1-pHluorin :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY4153 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| BWY4154 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| a Alle stammer anvendt i denne undersøgelse, er isogene til SEY6210 undtagen ved den angivne loci. | ||
Tabel 1: Gærstammer anvendt i denne undersøgelse.
| Plasmid | Beskrivelse | Kilde |
| pRS426 | 2μ URA3 | Sikorski og Hieter, 1989 |
| pBW0768 | pRS414 :: ent1 [CEN TRP1] | pEnt1, Laboratory plasmid |
| pBW0778 | pRS414 :: ent1 (aa1-151) [CEN TRP1] | pENTH1, Laboratory plasmid |
| pBW1571 | pFA6a-pHluorin-KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| pBW2053 | YEp24 :: rom1 [2μ URA3] | pROM1 (Prosser et al., 2011) 7 |
| pRS426-Ldb19 | LDB19prom-LDB19 [2μ URA3] | Prosser et al. (2015) 15 |
| pFA6a-GFP (S65T) -kanMX6 | pFA6a-GFP-KANMX6, PCR-baseret integrere plasmid for GFP-tagging i gær | Longtineet al. (1998) 21 |
Tabel 2: Plasmider anvendt i denne undersøgelse.
| Tid (min) | Handling (er) |
| -5 | Billede prøve 1 (Met) |
| 0 | Tilføj methionin til prøve 1 |
| Billede prøve 2 (Met) | |
| 5 | Tilføj methionin til prøve 2 |
| Billede prøve 3 (Met) | |
| 10 | Tilføj methionin til prøve 3 |
| Billede prøve 4 (Met) | |
| 15 | Tilføj methionin til prøve 4 |
| Billede prøve 5 (Met) | |
| 20 | Tilføjemethionin til prøve 5 |
| Billede prøve 6 (Met) | |
| 25 | Tilføj methionin til prøve 6 |
| Billede prøve 7 (Met) | |
| 30 | Tilføj methionin til prøve 7 |
| Billede prøve 8 (Met) | |
| Billede prøve 1 (+ Met) | |
| 35 | Tilføj methionin til prøve 8 |
| Billede prøve 2 (+ Met) | |
| 40 | Billede prøve 3 (+ Met) |
| 45 | Billede prøve 4 (+ Met) |
| 50 | Billede prøve 5 (+ Met) |
| 55 | Billede prøve 6 (+ Met) |
| 60 | Billede prøve 7 (+ Met) |
| 65 | Billede prøve 8 (+ Met) |
tabel 3: Eksempel arbejdsgang for svimlende 8 Mup1-pHluorin endpoint analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelser af pHluorin til kvantificering af endocytiske begivenheder i gærceller gør brug af transmembrane laster, hvor det fluorescerende mærke er fusioneret til den cytoplasmiske hale af proteinet (figur 1A). For analyserne beskrevet her, laster er lyst fluorescerende når pHluorin tag udsættes for neutrale miljøer, men bliver standset, når pHluorin tag støder sure betingelser. Således er en pHluorin-mærket endocytisk last let påvises ved cytoplasmatiske side af plasmamembranen og på tidlige endosomer, men bliver "dim" når de indgår i luminale MVB blærer eller ved levering til vacuolen lumen. Generelt nysyntetiserede endocytiske laster sandsynligvis forlade det endoplasmatiske reticulum (ER) og når plasmamembranen før GFP og mange af dens varianter har fuldt modnet; således, pHluorin-mærkede ladninger, der endnu ikke har nået celleoverfladen forventes at forblive målbart medmindre exit fra ER eller Golgi er impaired.
Anvendelse af pHluorin-mærkede endocytiske ladninger såsom Ste3 og Mup1 har lettet karakterisering af en række proteiner involveret i gær CIE-vejen (figur 1B) 8,18. Specifikt har de i dette dokument metoder blevet anvendt til at påvise, at øget produktion af actin-modulerende GTPase Rho1 og dens GEF ROM1 fremme endocytose i en række forskellige gærmutanter med defekter i CME 8. Desuden blev pHluorin-mærkede laster nylig anvendes til kvantitativ påvise, at a-arrestiner, som har veletablerede roller i CME 13-15,34-36, spille last-selektive roller i både CME og CIE, og har mekanistisk distinkte funktioner i de to veje 18.
For de protokoller, der er skitseret i dette dokument, bør flere vigtige faktorer overvejes for at opnå ensartede, kvantitative resultater. Først Mup1-GFP eller Mup1-pHluorin udtryk og Lysstofrørblomsterstand kan falde som gærceller eller metoden indtaste den stationære vækstfase (upublicerede resultater); derfor bør celler dyrket fra en overnatning kultur fortyndes og re-dyrket i yderligere 3 timer (se trin 3,1-3,2 og 6.1-6.2). Hertil kommer, når vaklende flere eksperimentelle betingelser eller stammer i endpoint assays eller til analyse ved flowcytometri, er det vigtigt at indsamle data for alle prøver efter samme varighed methionin behandling for at tillade sammenligninger mellem individuelle forhold. For post-erhvervelse analyse bør kvantificering udføres ved hjælp af 16-bit-billeder, da konvertering til 8-bit format medfører tab af data, der kan påvirke fluorescensintensiteten værdier. Desuden bør baggrund subtraktion udføres før kvantificering (trin 5.3), idet baggrundssignalet betydeligt kan okkludere forskelle i intensitet mellem prøver.
Betragtninger pHluorin-mærket Ste3 og Mup1 har vist sig modtagelig for kvantificering, ikkealle laster vil være velegnet til pHluorin tagging. For eksempel forsøger at tagge α-factor receptor Ste2 har givet inkonsistente kvantitative resultater, muligvis på grund af lavere fluorescensintensitet af Ste2-pHluorin sammenlignet med den for Ste3 eller Mup1 (ikke offentliggjorte resultater), selv om det er muligt, at tandem pHluorin tags kunne forbedre signalintensiteten. Desuden kan ladninger med meget langsomt af ligand-induceret endocytose ikke kunne underkastes pHluorin tagging for kvantificering, især hvis den halve tid af internalisering er længere end gærcelle-cyklus (ca. 90 min). For sådanne ladninger kan et fald i fluorescens skyldes endocytose og / eller fra opdeling af gods mellem mor og datter celler under deling. Således teste enkelte laster af interesse anbefales for at afgøre, om deres udtryk og kinetik er velegnede til pHluorin-tagging og kvantificering.
Selv om de seneste undersøgelser under anvendelse Phluorin har fokuseret primært på endocytiske begivenheder på plasmamembranen, kan pHluorin-mærkede ladninger bruges til at studere senere trafficking begivenheder i endocytiske proces. For eksempel har Mup1-pHluorin succes blevet anvendt i flowcytometri-baserede assays af ESCRT-medieret fragt sortering i MVBs 37, eftersom pHluorin tag bliver standset ved inkorporering i MVB luminale vesikler 20. Denne fremgangsmåde svarer til den mere nyligt beskrevne luciferase reporter af intraluminal udfældning (LUCID) assay, hvilket gør brug af laster med et cytoplasmatisk luciferase tag at generere et bioluminescerende signal i nærværelse af luciferin 38,39. Svarende til quenching af pHluorin fluorescens ved inkorporering i MVB luminale vesikler, er bioluminescens i LUCID assay svækket ved inkorporering af luciferase tag i MVB vesikler. Mens pHluorin og LUCID analyser er begrebsmæssigt ligner, kan pHluorin-mærkede ladninger bruges til at studere endocytose og MVB modning in intakte celler.
Der findes alternative metoder til kvantificering af endocytose, og har givet værdifulde oplysninger om satserne for fragt internalisering i vildtype og endocytiske mutant celler. Eksempler indbefatter overvågning optagelse af radioaktivt mærkede ligander, såsom α-faktor (som binder til feromon receptoren Ste2) og uracil (som er internaliseret af permeasen Fur4) 40,41, eller overvågning nedbrydningshastigheden for endocytiske laster såsom Ste3 som de internaliseres og transporteres til vacuolen 42. Disse biokemiske fremgangsmåder kræver cellelyse, og er således ikke egnet til direkte kvantificering i levende celler. Alternativt fluorescensmærket α-faktor, fluid fase farvestof Lucifer Yellow, eller styrylfarvestof FM4-64 kan anvendes til at visualisere endocytose i levende celler, men tillader ikke direkte overvågning af endogent udtrykte lastproteiner 40,43,44. For disse fremgangsmåder, persistens af fluorescens i vacuole lumen kan komplicere kvantificering, som set med GFP. Det er også muligt at anvende GFP-mærkede ladninger til kvantificering af endocytose ved måling helcelle-fluorescensintensitet og subtrahere signalet fra cytoplasmatiske og endosomale / vakuolære rum; dog endosomer og vakuoler er ofte i tæt nærhed til plasmamembranen. I modsætning hertil er pHluorin-mærkede endocytiske laster bratkølet i MVB / vacuole rum, som kan være en klar fordel for kvantificering af menneskehandel I forhold til den mere udbredte GFP tag. Vores fremtidige studier vil udvide aktuelle viden om endocytiske veje og fragt sortering i gær at identificere yderligere faktorer, der bidrager til CME og CIE, og for at forstå de mekanismer, der regulerer cargo-sortering beslutninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
- Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604 (2011).
- Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
- Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
- Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
- Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
- Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
- Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
- Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
- Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
- Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
- Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
- Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
- O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
- O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
- Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
- Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
- Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
- Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
- Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
- Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
- Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
- Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
- Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
- Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
- Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
- Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
- Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
- Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
- Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
- Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
- Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
- Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
- Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
- Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).
