Abstract
Groen fluorescerend eiwit (GFP) en de varianten worden veel gebruikt gereedschap voor het bestuderen van eiwit lokalisatie en dynamiek van evenementen zoals het cytoskelet remodeling en vesiculair transport in levende cellen. Kwantitatieve methoden gebruikt chimeer GFP-fusies zijn ontwikkeld voor vele toepassingen; echter GFP enigszins resistent tegen proteolyse, waardoor de fluorescentie blijft in het lysosoom / vacuole, die kwantificering van vracht handel kan belemmeren de endocytische route. Een alternatieve werkwijze voor het kwantificeren endocytose en post-endocytische handel gebeurtenissen maakt gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige variant van GFP dat wordt geblust in zure milieus. Chimère fusie van pHluorin aan de cytoplasmatische staart van transmembraan lading eiwitten leidt tot een demping van fluorescentie bij de oprichting van de lading in multivesiculaire lichamen (MVBs) en levering aan het lysosoom / vacuole lumen. Zo, het doven van vacuolaire fluorescentie vergemakkelijkt kwantificeringcatie van endocytose en het begin van de gebeurtenissen in de endocytische route. Dit artikel beschrijft methoden waarbij pHluorin gemerkte ladingen voor het kwantificeren van endocytose via fluorescentiemicroscopie en populatie gebaseerde assays met flowcytometrie.
Introduction
Vesiculair transport speelt een belangrijke rol bij het handhaven organel identiteit en functie in eukaryotische cellen, en is een belangrijk mechanisme voor het reguleren van eiwit en membraan samenstelling van individuele cellulaire compartimenten. Op het plasmamembraan, fusie van vesicles exocytose levert nieuwe eiwitten en membranen aan het oppervlak van de cel, terwijl vesicles gegenereerd door middel van endocytose membraan en eiwitten te verwijderen van het oppervlak voor daaropvolgende recycling of richten naar het lysosoom. Aldus endocytose is belangrijk voor nutriënten en reacties op de extracellulaire omgeving. Exocytose en endocytose zijn evenwicht te plasmamembraan oppervlakte te reguleren, en de omzet van de beschadigde eiwitten mogelijk te maken.
Studies in gist en zoogdiercellen zijn een groot aantal eiwitten die betrokken zijn endocytose, evenals meerdere endocytotische wegen die internalisatie specifieke ladingen bevorderen of die handeling vastgesteld in reactie op verschillende environmental omstandigheden. De best bestudeerde pathway is clathrine gemedieerde endocytose (CME), waarin clathrine en cytosolische additionele eiwitten assembleren tot een laag structuur de ontluikende endocytische vesicles stabiliseren. Experimenten in de gist Saccharomyces cerevisiae hebben belangrijke inzichten in de dynamiek en de volgorde van de werving voor vele endocytische eiwitten 1-3 opleverde. Met name wordt de CME machine sterk geconserveerd door evolutie zodanig dat de meeste CME-gerelateerde eiwitten in gist hebben humane orthologen; dus, gist is een belangrijk instrument voor het begrip van de mechanismen van endocytose die zijn geconserveerd in hogere eukaryoten geweest. Bijvoorbeeld, studies met behulp van gist vastgesteld dat de vorming en rijping van CME structuren (als corticale actine vlekken in gist genoemd) omvat de sequentiële rekrutering van veel eiwitten, te beginnen met clathrine en-cargo bindende adapter eiwitten, gevolgd door de aanwerving van extra endocytische accessoire eiwitten,activering van Arp2 / 3-gemedieerde actine polymerisatie, en werving van eiwitten die betrokken zijn bij blaasje splitsing 1,2. Aanwerving van CME machines eiwitten aan actine pleisters corticale is een sterk geordende en stereotiepe proces, en de precieze volgorde van de werving voor veel eiwitten is vastgesteld met betrekking tot andere onderdelen van de CME machines. Belangrijk is, hebben recente studies een vergelijkbare orde van werving voor CME eiwitten op-clathrine gecoate pits in zoogdiercellen 4 bevestigd.
Naast CME vele celtypen bezitten één of meer clathrine afhankelijke endocytose (CIE) pathways die afhankelijk zijn van alternatieve mechanismen vorming vesikel en internalisatie van het plasmamembraan 5-7 promoten. In gist, hebben we onlangs geïdentificeerd een CIE traject dat de kleine GTPase Rho1 en het activeren van guanine nucleotide exchange factor (GEF), ROM1 8,9 gebruikt. Rho1 activeert de formin Bni1 om actine polymerisatie 1 te bevorderen0,11, die nodig is voor deze vorm van clathrine afhankelijke endocytose in gist 12. Bovendien, de α-arrestine eiwitfamilie rekruteren ubiquitine ligase Rsp5 om lading ubiquitinatie en daaropvolgende internalisering bevorderen door CME 13-17, en ook bevorderen lading internalisatie via de CIE route, mogelijk door directe interactie met eiwitten die betrokken zijn CIE 18. Verschillende CIE trajecten bestaan ook in zoogdiercellen, waaronder clathrine-onafhankelijke en fagocytische paden die afhankelijk zijn van de Rho1 ortholoog, RhoA 9,19. De rol van RhoA in zoogdiercellen CIE is slecht begrepen; dus, kunnen studies in gist extra mechanistische inzichten die van toepassing zijn op zoogdieren CIE zijn te verstrekken.
Nauwkeurige kwantificering van endocytische gebeurtenissen kunnen belangrijke informatie over de rol van specifieke eiwitten bij het reguleren van endocytose te bieden, en kunnen de effecten van mutaties op de lading internalisatie of progressio onthullenn door de endocytische route. Hiertoe kan biochemische methoden worden toegepast om ligand opname controleren of snelheden van afbraak van eiwitten endocytische lading te meten. In levende cellen, fusie van groen fluorescerend eiwit (GFP) en de varianten om ladingen van belang maakt directe visualisatie van vrachtvervoer. Echter, GFP ladingen hebben een beperkt nut voor het kwantificeren van endocytose omdat GFP is resistent tegen afbraak in het lysosoom (of vacuole in gist). Bovendien GFP fluorescentie slechts gedeeltelijk gevoelig voor veranderingen in pH en nog waarneembaar in de vacuole lumen 20,21. Derhalve fluorescentie van het GFP-tag blijft in de vacuole lang nadat de rest van de lading is afgebroken en whole-cell kwantificering lading intensiteit onnauwkeurig zijn als gevolg van langdurige GFP fluorescentie in de vacuole.
Om de nadelen van vacuolaire GFP fluorescentie overwinnen we eerder gebruikt superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige variant van GFP die helder fluoresceert bij neutrale pH, maar verliest fluorescentie in zure omgevingen zoals het lumen van de vacuole / lysosoom 20,22,23. Het plaatsen van een pHluorin tag op de cytoplasmatische staart van endocytische ladingen maakt visualisatie van de ladingen op het plasmamembraan en op de vroege endosomen, waar de pHluorin tag blijft blootgesteld aan het cytoplasma (Figuur 1A). Al in endosomen rijpen, de endosomale sorteren complex die nodig is voor het vervoer (ESCRT) machines pakketten-oppervlak gelokaliseerde ladingen in blaasjes die knop in het lumen van de endosoom, het genereren van multivesiculaire lichamen (MVBs) 24. Voor ladingen die in de interne MVB blaasjes hebben opgenomen, de pHluorin tag kijkt in de richting van het blaasje lumen. Interne MVB blaasjes worden aangezuurd; dus pHluorin-gelabeld lading verliezen fluorescentie op de vroege endosomen als ze volwassen worden in MVBs 20. Daaropvolgende fusie van het MVB de vacuole levert de inhoud MVB luminalevoor de afbraak, blijven en pHluorin labels geblust in het zure milieu van de vacuole lumen.
Dit document bevat gedetailleerde beschrijvingen van de kwantitatieve endocytische assays met behulp van ladingen met cytoplasmatische pHluorin labels in gist. Stammen die pHluorin-tag ladingen kunnen worden gebruikt in kinetische en / of eindpunt assays, afhankelijk van de eigenschappen en handel gedrag van de specifieke lading. Bovendien hebben sommige pHluorin-tag ladingen zijn vatbaar voor high-throughput analysemethoden, waaronder flowcytometrie. Belangrijk is dat de pHluorin tag is een veelzijdig instrument voor het bestuderen van endocytische gebeurtenissen in levende cellen, waardoor kwantificering van endocytose en vergelijking van endocytotische functie in het wild-type en mutante stammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oplossingen en Media
- Bereid de volgende bestanden, media en platen:
- 10x YNB bereiden, los 67 g gist basis van stikstof ontbreekt aminozuren in 1 liter water. Steriliseer door filtratie door een 0,22 urn nitrocellulosefilter.
- Bereid YNB medium met behulp van 1x YNB (van 10x voorraad) met 2% dextrose (van een steriele 50% w / v voorraad) en 1x aminozuur / nutriënt mengsel (van 100x voorraad, zie stap 1.1.4). Voor plasmideselectie, weglaten afzonderlijke aminozuren of nutriënten nodig. Voor inductie van expressie Mup1 bovendien weglaten methionine uit het aminozuur / nutriëntmengsel.
- Bereid YNB-platen gebruikt 1x YNB (van 10x voorraad), 2% glucose (uit een steriele 50% w / v stock), 0,7 g / l aminozuur / voedingsmengsel (zie stap 1.1.5) en 2,5% agar. Bereid plaatmedium autoclaaf 25 g agar en 0,7 g aminozuur / voedingsmengsel per 860 ml water. Laat het mengsel afkoelen tot 55 ° C, voeg vervolgens 100 ml van 10 x YNB en 40 ml of 50% glucose. Gietplaten (ongeveer 30 ml medium per 10 cm schaal), zodat het medium gestold bij kamertemperatuur, en opslag platen bij 4 ° C.
- Bereid 100x aminozuur / voedingsoplossing voorraadoplossing (voor vloeibare medium) door oplossen van de volgende in 100 ml gedeïoniseerd water: 0,1 g L-methionine, 0,3 g elk van L-leucine en L-lysine en 0,2 g per L-histidine , L-tryptofaan, adenine en uracil (andere aminozuren en voedingsstoffen kunnen worden opgenomen als nodig is voor specifieke stammen). Gebruik zacht vuurtje als dat nodig is om op te lossen, en steriliseer door een 0,45 micrometer nitrocellulose filter. Bewaar bij kamertemperatuur met bescherming tegen licht. Voor plasmide selectie, voor te bereiden stock oplossingen ontbreekt specifieke onderdelen als dat nodig is.
- Bereid aminozuur / voedingsmengsel (voor platen) door het volgende te combineren: 0,5 g adenine, 4 g L-leucine en 2 g per stuk L-histidine, L-lysine, L-methionine, L-tryptofaan, L- tyrosine en uracil. Maal met een mortier en een stamper, en op te slaan met een probescherming tegen licht. Voor plasmide selectie, voor te bereiden mengsels ontbreekt specifieke onderdelen als nodig is, en het gebruik van 0,7 g aminozuur mengsel per liter van de plaat medium (zie stap 1.1.3).
- Bereid 8-well kamer objectglaasjes voor microscopie door het bekleden van het oppervlak van de dia met concanavaline A (ConA). Aan elk putje van de kamer schuif, voeg 25 ul van 2 mg / ml ConA opgelost in water. Met behulp van een pipet, spreid het ConA over het bodemoppervlak van de put, dan laat de schuif aan de lucht drogen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 4-8 uur. Gebruik bij voorkeur kamer dia's binnen 24 uur van ConA coating.
- Genereer giststammen met in-frame fusies van GFP of pHluorin deze endocytotische lading plaats via de polymerasekettingreactie (PCR) gebaseerde integratie werkwijze Longtine et al. en Goldstein en McCusker 25,26.
LET OP: Plasmiden die pHluorin tagging cassettes met resistentiegenen voor kanamycine (KANMX6) en nourseothricin (- Amplificeren GFP of pHluorin cassettes met selecteerbare markers met primers bevatten additionele sequenties specifiek voor de plaats van genomische integratie 20,25.
- Transformeer de resulterende PCR product in de gewenste giststam met de lithiumacetaat werkwijze 27.
- Selecteren voor integratie van de cassette door groeiende cellen op YPD platen die het geschikte geneesmiddel. Platen, autoclaaf 10 g gistextract, 20 g pepton, 0,1 g tryptofaan en 25 g agar in 960 ml water bereiden. Voor het storten platen, laat het mengsel afkoelen tot 55 ° C, voeg 40 ml 50% glucose en ofwel G418 tot een uiteindelijke concentratie van 200 ug / ml voor KANMX6 selectie of nourseothricin tot een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml voor NATMX4 selectie.
- Bevestigen integratie van het GFP of pHluorin tag in individuele kolonies door PCR en / of Western blotting met behulp van anti-GFP antilichamen,en door detectie van het gemerkte eiwit door fluorescentiemicroscopie 20.
OPMERKING: Specifieke giststammen en plasmiden die in deze studie zijn weergegeven in de tabellen 1 en 2, respectievelijk.
2. Endpoint Assay voor steady-state fluorescentie constitutief geïnternaliseerd Endocytische Cargo
- Inoculeren cellen (~ 3 kleine kolonies) in 5 ml YNB medium zonder aminozuren en voedingsstoffen zoals vereist voor plasmide onderhoud (indien van toepassing). Kweek cellen gedurende 16-24 uur in een orbitale schudden incubator bij 30 ° C met 250 rpm schudden. Alternatief strook een ~ 1-2 mm kolonie van cellen op een YNB-plaat die aminozuren en voedingsstoffen voor plasmideselectie en groeien de cellen overnacht bij 30 ° C.
- Meet de densiteit (OD 600) van elke overnacht kweek met een spectrofotometer. Bereid een 5 ml verdunning 0,35-0,4 OD 600 / ml in YNB medium zonder aminozuren en voedingsstoffen voor plaSmid onderhoud en groeien gedurende ongeveer 3 uur bij 30 ° C onder schudden. Bij gebruik van cellen uitgestreken op een plaat, deze stap overslaan en doorgaan met stap 2.4 (zie hieronder).
- Meet de densiteit (OD 600) cellen, die nu moet tussen 0,6-1,0 OD 600 / ml. Transfer 1,5 ml van cultuur aan een microfugebuis en pellet cellen bij 8000 rpm (6800 xg) gedurende 2 minuten. Verwijder 1475 pl supernatant.
- Breng cellen een fluorescentiemicroscoop. Vóór afbeelden elk monster, een dia door resuspenderen van de cellen in de resterende medium en zet 3 pl celsuspensie onder een dekglaasje. Als alternatief voor te bereiden 8-well kamer dia's zoals hieronder beschreven in protocol 3, met behulp van YNB medium als geschikt voor plasmide selectie. Idealiter afbeelding cellen met een 100X, 1.4 of hoger numerieke lensopening (NA) olie-immersie objectief, een 12- of 16-bits camera, en excitatie / emissie filters geoptimaliseerd voor GFP fluorescentie.
NB: Bij gebruik van cellen gekweekt door uitstrijken ona plaat, de voorbereiding van de glijbaan door het plaatsen van 3 ul van verse YNB medium op een cover slip. Met behulp van een pipet tip, laat een kleine kolonie van cellen van de plaat, verspreiden de cellen in de YNB medium, en zet de verkregen suspensie op een glasplaatje onmiddellijk voor beeldvorming. - Afbeelding 4-6 willekeurige velden van cellen voor elke conditie, met dezelfde opnameparameters (dwz filtersets en belichtingstijd) voor alle beelden binnen een experiment.
LET OP: Het verzamelen van het DIC een helderveld of voor elk veld kan nuttig zijn voor cellen, waar het pHluorin signaal wordt gedoofd in MVB en vacuolaire compartimenten. - Kwantificeren van fluorescentie-intensiteit van ten minste 30-50 cellen voor elke omstandigheid (zie protocol 5).
3. Kinetic Assay voor het kwantificeren van de Humor van Koopvaardij die Gereglementeerde Endocytosis ondergaan
- Enten 2-3 kolonies van gistcellen (ongeveer 2 mm diameter per kolonie) in 5 ml YNB medium zonder methionine en voegnele aminozuren en voedingsstoffen voor het onderhouden plasmideselectie. Groeien kweken gedurende 16-24 uur bij 30 ° C onder schudden.
OPMERKING: In dit artikel zal protocollen voor het bestuderen van gereguleerde endocytische lading eiwitten gebruik van de methionine permease, Mup1 maken. Andere ladingen die gereguleerde endocytose ondergaan zijn ook geschikt voor tagging met pHluorin (bijvoorbeeld de uracil permease Fur4, dat zich ophoopt in het plasmamembraan in afwezigheid van uracil en internaliseert in reactie op extern aangelegde uracil); Voor deze ladingen, moeten media voorwaarden worden aangepast aan de specifieke expressie, inductie en internalisatie voorwaarden voor die lading te geven. - Meet de densiteit (OD 600) van elke overnacht kweek ongeveer 3 uur voor beeldvorming. Bereid een verdunning 5 ml van 0,35-0,4 OD 600 / ml in YNB medium zonder methionine en additionele aminozuren of nutriënten voor plasmide onderhoud en groeien bij 30 ° C onder schudden.
- Pre-evenwicht van de microgaan de klimaatkamer of verwarmde stadium (indien beschikbaar) tot 30 ° C gedurende de 3 uur incubatie van stap 3.2.
- Breng 1 ml celkweek een microfugebuis en pellet cellen bij 8000 rpm (6800 x g) gedurende 2 min. Verwijder 975 pl supernatant.
- Bereid een ConA behandelde, 8-goed-glazen bodem kamer glijbaan voor imaging (protocol 1.2).
- Voeg 200 ul YNB medium zonder methionine en additionele aminozuren of nutriënten voor plasmideselectie aan elk putje. Resuspendeer de celpellet uit stap 3.4 in de resterende supernatant en neerzetten 2,5 pl celsuspensie in het midden van elk putje. Disperse cellen over het oppervlak van de put door en neer te pipetteren, en laat cellen bezinken gedurende 5-10 minuten.
- Plaats de kamer dia op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop geëquilibreerd tot 30 ° C (zie stap 3,3). Zoek een gebied van de cellen met behulp van helderveld verlichting.
- Voeg 50 pl YNB medium dat 100 ug / ml methionine(Voorverwarmd tot 30 ° C) aan de 200 ul medium in de put tot een uiteindelijke concentratie van methionine 20 ug / ml te verkrijgen. Te verstoren het medium in de put om te voorkomen dat de cellen drijven van de bodem.
- Laat de cellen equilibreren gedurende 2 minuten voor het begin van de beeldvorming. Onmiddellijk voorafgaand aan het vastleggen van het eerste beeld, pas de microscoop om de gewenste focal plane (meestal een equatoriale focal plane werkt het beste).
- Verwerven GFP en helderveld (of DIC) beelden op 5 min intervallen gedurende 45-60 min, waarbij dezelfde opnameparameters voor alle afbeeldingen in een tijdreeks (bijvoorbeeld 100 x 1,4 NA olie-immersie objectief en 500 msec acquisitietijd gebruiken GFP filter, 100 msec overname tijd met behulp van DIC filter).
OPMERKING: als stadium van de microscoop en imaging software niet automatisch kunnen corrigeren focal plane drift, kan het nodig zijn om de focus voor elke beeldvorming tijdstip handmatig bijstellen. Bovendien overname tijden zullenmicroscopen variëren als gevolg van verschillen in verlichting en filters, en optimale omstandigheden worden bepaald met de hand voor het begin van het experiment. Als een endocytische vracht dan Mup1 wordt gebruikt, kan het nodig zijn om de acquisitietijd en beeldvorming intervallen, alsmede de duur van het experiment te wijzigen, om de internalisatie kinetiek van deze vracht weerspiegelen. - Kwantificeren fluorescentie-intensiteit van afzonderlijke cellen op elk tijdstip (zie protocol 5) en een automatische waarden als percentage van de initiële intensiteit van het eerste beeld.
4. Endpoint Assay voor het kwantificeren van Endocytische Koopvaardij die Gereglementeerde Endocytosis ondergaan
- Bereid je cellen voor beeldvorming zoals beschreven in protocol 3 (stappen 3.1 tot 3.6).
- Afbeelding 4-5 willekeurige velden van cellen voor elke conditie onmiddellijk vóór het toevoegen methionine, gebruik helderveld en GFP filtersets.
- Voeg 50 pl YNB medium dat 100 ug / ml methionine (pre-warmed tot 30 ° C) aan de 200 ul medium in de put tot een uiteindelijke concentratie van methionine 20 ug / ml te verkrijgen. Te verstoren het medium in de put om te voorkomen dat de cellen drijven van de bodem.
- Afbeelding 4-5 willekeurige velden van cellen 30 minuten na toevoeging van methionine, met dezelfde verwervingsparameters als de 0 min tijdstip (stap 4,2).
- Kwantificeren fluorescentie-intensiteit van ten minste 30-50 cellen voor elk tijdspunt (zie protocol 5). Express waarden in procenten Mup1-pHluorin geïnternaliseerd na 30 min met de formule: [gemiddelde intensiteit bij 0 min - gemiddelde intensiteit 30 min] / [gemiddelde intensiteit bij 0 min] x 100%.
Opmerking. Het is mogelijk om gelijktijdig uitvoeren tot acht eindpunten assays door spreiding van de starttijd van elke test Tabel 3 een voorbeeldworkflow acht gelijktijdige testen.
5. Post-acquisitie Analyse
- beelden Export van acquisitie software als een 16-bit tag-bestandsformaat (.tif of .tiff formaat).
LET OP: Andere bestandsformaten kunnen ook geschikt zijn, en idealiter gebruiken lossless compressie algoritmen. 8-bits beelden zijn doorgaans niet geschikt voor kwantificatie doeleinden. - Open bestanden met behulp van ImageJ software (vrij beschikbaar naar keuze van 'Open' in het menu 'Bestand'. Met imago van de fluorescentie voor kwantificering en de helderveld beeld / DIC als een verwijzing naar de locatie te identificeren van de cellen en dode cellen uit te sluiten (indien aanwezig ), die donkerder dan levende cellen wanneer bekeken door DIC en worden autofluorescente wanneer bekeken met GFP excitatie / emissie filters verschijnen.
- Voer een achtergrond aftrekken imago van de fluorescentie op. Voor beelden met een oneffen achtergrond signaal, gebruik maken van de 'achtergrond aftrek' algoritme in het 'menu Proces'. Gebruik de standaardinstelling (rollende bal straal van 50 pixels), die in het algemeen voldoende voor kwantificering doeleinden.
LET OP: Een alternatief background aftrekken methode om beelden met egale achtergrond wordt beschreven in stap 5.3.1.-5.3.2; De bovenstaande methode werkt ook voor egale achtergrond.- Voor beelden met egale achtergrond (dwz achtergrondintensiteit bij benadering constant in alle randen en in het midden van het beeld), een handmatige achtergrond aftrek. Klik op de knop 'de vrije hand selecties' gevonden in de belangrijkste ImageJ venster, en selecteer 3-5 willekeurige regio's in het beeld dat geen cellen bevatten.
- Open de functie 'Set Metingen' in het menu 'Analyseren', selecteert u de 'Mean Gray Value' parameter, en het meten van de intensiteit waarden met behulp van de functie 'Measure' (ook te vinden in het menu 'Analyseren'). Bereken de gemiddelde waarde van de 3-5 gemeten regio's, en aftrekken van alle volgende metingen in dat beeld.
- Voor kwantificering van kinetische assays (protocol 3), het genereren van single, beeld gestapeld voor de time-serie. Open de fluorescentie beelden van elk tijdstip in chronologische volgorde, en het genereren van een stapel met behulp van de 'Images te stapelen' functie (in het menu 'Beeld', onder de Stacks submenu).
- Schetsen een cel met behulp van de vrije hand selectie-instrument, en zorg ervoor dat de gehele cel, maar zo weinig in de buurt is buiten de cel mogelijk te maken.
- Meet de volgende parameters: "Ruimte, Integrated Density 'en' Mean Gray Value '. Selecteer parameters met behulp van de 'Set Metingen' functie, gelegen in het 'Analyze' menu.
OPMERKING: Geïntegreerde dichtheid overeenstemt met de som van alle pixelintensiteiten binnen het geselecteerde gebied, en gemiddelde grijswaarde correspondeert met [Integrated Densiteit / Area], die intensiteitswaarden corrigeert celgrootte. - Open de 'ROI Manager' in het menu 'Analyseren', onder sub-menu 'Extra'. In het venster ROI Manager, klik op de knop 'Toevoegen' om de gemarkeerde regio in te voerenn als een nieuwe regio van belang (ROI).
- Herhaal stap 5,4 tot 5,6 voor de overige cellen in de afbeelding. Exclusief eventuele dode cellen zoals vastgesteld door helderveld / DIC en fluorescentie (dode cellen donkerder in DIC afbeeldingen en hebben autofluorescente cytoplasma signaal wanneer bekeken met GFP excitatie / emissie; zie figuur 2F) en alle cellen die de rand van het beeld aan te raken. Sla de geselecteerde ROI als een zip-bestand door te klikken op de knop 'Meer' in het venster 'ROI Manager', en exporteren alle metingen naar een spreadsheet of statistische analyse software.
- Voor kwantificering van kinetische assays (protocol 3), schetsen en het meten van een cel van het oorspronkelijke tijdstip zoals beschreven in stap 5.4 en 5.5. Gebruik dezelfde ROI voor het meten van alle volgende tijdstippen tijdens het experiment.
- Voor eindpunt assays (protocollen 2 en 4), meet minste 30-50 cellen per conditie. Voer kwantificering voor ten minste 2-3 afbeeldingen en omvatten alle cellen in elkafbeelding die voldoen aan de in stap 5.8 in de analyse criteria.
- Beoordelen van statistische significantie tussen de monsters met behulp van one-way ANOVA, gevolgd door meerdere vergelijkingstest Tukey voor post hoc analyse.
6. Bevolking Analyse van Mup1-pHluorin Endocytosis door flowcytometrie
- Enten 2-3 kolonies van gistcellen (ongeveer 2 mm diameter per kolonie) in 0,5 ml YNB medium zonder methionine en additionele aminozuren en voedingsstoffen voor het onderhouden plasmideselectie. Groeien cellen in 5 ml ronde bodem buizen gedurende 16-24 uur bij 30 ° C op een roller trommel.
- Voeg 1,5 ml YNB medium zonder methionine en additionele aminozuren of nutriënten voor plasmide onderhoud en groeien bij 30 ° C gedurende nog 3 uur op een roller trommel.
- Breng 1 ml cellen in elk van twee 5 ml rondbodem buizen. Voeg 0,25 ml YNB medium -Met de eerste buis (-Met toestand) en 0,25 ml YNB medium dat 100 ug/ Ml methionine aan de tweede buis tot een uiteindelijke concentratie van methionine 20 ug / ml (+ Met conditie) werd verkregen. Incubeer cellen bij 30 ° C gedurende 45 minuten op een roller trommel.
- Analyseer cellen door flowcytometrie, selecteren voorwaartse verstrooiing (FS) als maat voor celgrootte en Mup1-pHluorin fluorescentie-intensiteit van een fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) filter als een maat voor de lading internalisatie.
- Met de schuif toetsen om de spanning van de FS en FITC kanalen aan te passen om detectie te optimaliseren voor de orde van grootte en fluorescentie-intensiteit van de gistcellen worden gebruikt (deze experimenten gebruikte instellingen waren 50 V voor FS en 400 V FITC).
OPMERKING: Spanning voor beide kanalen hangt af van de flowcytometer gebruikt. Deze stap dient voor of tijdens de 45 minuten behandeling met methionine (stap 6,3). - Meet FS en fluorescentie-intensiteit voor 10.000 cellen van elke staat, met behulp van de hoge stroomsnelheid setting. Genereer een scatter plot van FS tegen fluocerend intensiteit: klik "add grafiek 'selecteert FITC (x-as) en FS (y-as), en de grafiek 1000 punten (de software waarden voor 1000 cellen, terwijl 10.000 cellen gemeten).
OPMERKING: Voor maximale consistentie, analyseren cellen 45-50 min na toevoeging van methionine; Voor experimenten waarbij grote aantallen monsters, wankelen toevoegen van methionine aan de tijd die flowcytometrieanalyse tegemoet. - -Met Omvatten en + Met voorwaarden voor wildtype (WT) cellen als controle. Met de poort functie toewijzen verticale poort met de WT + Met voorwaarde, zodat bij benadering 5% van de helderste cellen vallen rechts van de poort. Gebruik deze venstertijd voor alle andere voorwaarden aan het experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Steady-state lokalisatie en kwantificering van de constitutief geïnternaliseerde endocytische cargo eiwit Ste3
Aantonen dat pHluorin gemerkte ladingen kan worden gebruikt voor het kwantificeren van endocytose in levende cellen, lokalisatie van chimeer GFP en pHluorin fusies met het C-eindstandige cytoplasmatische staart van Ste3, het a-factor feromoon receptor in gist, werden vergeleken. Ste3 is een G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) die constitutief wordt getransporteerd naar het plasmamembraan, geïnternaliseerd en gericht op de vacuole voor afbraak 28. Zo bepaalt steady-state omstandigheden, de meeste Ste3 lokaliseert de vacuole lumen, zoals in wildtype (WT) cellen die Ste3-GFP (Figuur 2A). In tegenstelling tot cellen die de genen die coderen voor de vier-clathrine adapter bindende eiwitten Ent1, Ent2, Yap1801 en Yap1802 (ent1 Δent2 Δ yap1801 Δ yap1802 Δ, hierna te noemen 4Δ) niet aan clathrine stabiliseren op plaatsen van endocytose 29 en ernstig defect in CME 30. 4Δ cellen vereisen expressie van het epsin N-terminale homologie (ENTH) domein van een van beide Ent1 of Ent2 voor levensvatbaarheid 30,31. Het ENTH-domein is niet voldoende endocytose in 4Δ cellen, zoals aangetoond door het behoud van Ste3-GFP in de plasmamembraan in 4Δ + ENTH1 cellen die het ENTH-domein van Ent1 (figuur 2A) 8,30; Vertaald plasmamembraan retentie 4Δ + ENTH1 cellen is waargenomen voor andere endocytische ladingen, zoals STE2-GFP (de α-factor feromoon receptor) en Mup1-GFP of Mup1-pHluorin (a methionine permease) 8,18. Daarentegen expressie van volledige lengte Ent1 van een plasmide 4Δ cellen (4Δ + Ent1) herstelt endocytose en lokalisatie van GFP-Ste3 naar de vacuole. 4Δ + ENTH1 cellen werden recent gebruikte ina genetische screen een CIE pathway in gist die afhankelijk identificeren van de actine-modulerende Rho1 GTPase en GEF, ROM 1, en de formin Bni1 en leden van de α-arrestine familie van eiwitten die deze lading sortering 8,18. Consistent met een rol in de CIE, expressie van ROM 1 of α-arrestin LDB19 van high-kopie plasmiden in 4Δ + ENTH1 cellen verbeterd internalisering van Ste3-GFP (Figuur 2A).
Cellen die Ste3-GFP of andere GFP-tag endocytische ladingen hebben een lichte vacuoles te wijten aan accumulatie en proteolytische weerstand van het GFP-tag. Daarentegen cellen die Ste3-pHluorin zeer lage vacuolaire fluorescentie door uitdoving van de pHluorin tag in zure milieus 20. Zoals we eerder hebben gezien, WT en 4Δ + Ent1 cellen vertoonden weinig detecteerbaar Ste3-pHluorin met behulp van fluorescentie microscopie (Figuur 2B). In tegenstelling Ste3-pHluorinwas gemakkelijk detecteerbaar in het plasmamembraan van 4Δ ENTH1 + cellen, terwijl vacuolaire Ste3-pHluorin bleef nagenoeg niet detecteerbaar in alle gevallen. Hoge-kopie expressie van ROM 1 of LDB19 verminderde de hoeveelheid detecteerbare Ste3-pHluorin op het celoppervlak, Soortgelijke resultaten Ste3-GFP, hoewel vacuolaire Ste3-pHluorin bleef nagenoeg niet detecteerbaar in alle gevallen.
Om de effectiviteit van GFP wensen pHluorin gemerkt ladingen als middel voor het kwantificeren van veranderingen in de endocytische aantal cellen, whole-cell fluorescentie van GFP-Ste3 en Ste3-pHluorin werd gemeten in WT- en 4Δ cellen. Hoewel veranderingen in Ste3-GFP localisatie waren direct detecteerbaar microscopie (Figuur 2A), verschillen in de totale fluorescentie-intensiteit waren niet statistisch significant tussen WT, 4Δ + Ent1 en 4Δ + ENTH1 getransformeerd met lege vector (Figuur 2C) 20. Likewise, 4Δ + ENTH1 getransformeerd met vector, ROM1 en LDB19 had soortgelijke whole-cell fluorescentie-intensiteiten. Met name 4Δ + ENTH1 getransformeerd met ROM 1 of LDB19 waren beduidend zwakker dan WT-cellen (figuur 2C) 8,18; echter Ste3-GFP eiwitniveaus waren hetzelfde als bepaald door immunoblotting (Figuur 2E). Terwijl het verschil in intensiteit mede door veranderingen in vacuole grootte of morfologie of verschillen in retentie van het GFP-tag in de vacuole kan zijn, is kwantificatie van Ste3-GFP fluorescentie de wijzigingen in lokalisatie waargenomen met fluorescentiemicroscopie geven (Fig 2A). In contrast, kwantificering van Ste3-pHluorin intensiteit aangetoond dat 4Δ + ENTH1 getransformeerd met vector waren beduidend helderder dan WT of 4Δ + Ent1 cellen, en high-copy expressie van ROM 1 of LDB19 in 4Δ + ENTH1 cellen verminderd Ste3-pHluorin intensiteitniveaus die vergelijkbaar WT en 4Δ + Ent1 (figuur 2D) waren. Zo kwantificering van steady-state Ste3-pHluorin intensiteit weerspiegelt nauwkeurig de verschillen in lokalisatie geobserveerd met behulp van fluorescentie microscopie.
Kinetic internalisatie testen met behulp van de gereguleerde endocytische lading, Mup1
Kwantificering van fluorescentie-intensiteit voor constitutieve internalisering ladingen bij steady-state kan verschillen in endocytische aantal mutante cellen in vergelijking met WT cellen onthullen. Het is echter mogelijk dat sommige ladingen dezelfde steady-state verdeling en intensiteit in WT- en endocytotische mutante cellen kunnen bereiken, terwijl de mutante cellen vertraagd endocytose of langzamere kinetiek voor vracht internalisatie. In plaats daarvan hebben pHluorin-ladingen die gereguleerde endocytose ondergaan in antwoord op een specifieke stimulus of ligand kunnen worden gebruikt om de monitorkinetiek van endocytose. Daartoe internalisatie van de hoge-affiniteit methionine permease, Mup1, 32 werd gevolgd. In afwezigheid van extracellulair methionine wordt Mup1 opgereguleerd expressie en de permease wordt bewaard door het plasmamembraan; na toevoeging van methionine aan het medium, Mup1 onderhevig aan een snelle opname en richten naar de vacuole 13.
Om de kinetiek van Mup1 internalisatie controleren, werden WT stammen die Mup1-GFP of Mup1-pHluorin van de genomische locus gekweekt in afwezigheid van methionine om fluorescerende Mup1 ophopen aan de plasmamembraan (Figuur 3A, 0 min tijdstip). Time-lapse beeldvorming van cellen werd vervolgens uitgevoerd met intervallen van 5 min in afwezigheid of aanwezigheid van methionine lading internalisatie en veranderingen in fluorescentie monitoren. Zoals verwacht, GFP- en pHluorin gemerkte Mup1 afgebeeld in afwezigheid van methionine bleef op het plasmamembraan fof de volledige 45 minuten observatieperiode 20. Daarentegen cellen afgebeeld in de aanwezigheid van methionine vertoonde progressieve uitputting van het fluorescentiesignaal van het celoppervlak, internalisatie overeenstemming met lading. Met name Mup1-GFP fluorescentie opgebouwde interne structuren (dat wil zeggen endosomen en de vacuole), terwijl Mup1-pHluorin gelokaliseerde interne punctae die waarschijnlijk overeenkomen met vroege endosomen, maar werd niet gezien in de vacuole.
Bij fluorescentie werd gekwantificeerd op alle tijdstippen voor afzonderlijke cellen, Mup1-GFP en Mup1-pHluorin intensiteit toonde weinig verandering in de afwezigheid van extern aangelegde methionine in de loop van 45 min experiment, in overeenstemming met het eiwit blijft stabiel gelokaliseerd in het plasmamembraan (Figuur 3B). Daarentegen whole-cell-Mup1 pHluorin intensiteit snel af in aanwezigheid van methionine, zodat een vermindering van 50% in fluorescence intensiteit werd waargenomen na ongeveer 20-25 min, en een 80% reductie werd waargenomen na ongeveer 40 min 20. Mup1 GFP-cellen vertoonden een afname in fluorescentie-intensiteit na toevoeging van methionine; De kinetiek van fluorescentie verliezen werden vertraagd vergeleken met die van Mup1-pHluorin, zodanig dat een afname van 50% in intensiteit alleen werd waargenomen na 40 min. Zoals blijkt uit figuur 3A, Mup1-GFP was nauwelijks detecteerbaar in het plasmamembraan op dit moment geeft aan dat persistente vacuolaire GFP fluorescentie voorkomen kwantificatie van endocytotische gebeurtenissen op het celoppervlak.
Endpoint testen met behulp van de gereguleerde endocytische lading, Mup1
Naast kwantitatieve kinetische analyses volgens endocytose zoals hierboven beschreven, kan gereguleerd endocytische ladingen zoals Mup1 ook voor eindpunt testen Soortgelijke kwantificeringvan steady-state Ste3-pHluorin intensiteit. Daartoe de test voor het kwantificeren van Mup1-pHluorin internalisatie werd aangepast aan vergelijking van gemiddelde fluorescentie intensiteiten van celpopulaties afgebeeld onmiddellijk voor of 30 minuten na toevoeging van methionine 8,18 toe. Deze aanpak maakt het mogelijk een vergelijking van het percentage Mup1 geïnternaliseerd tussen WT en endocytische mutant cellen.
In overeenstemming met de resultaten van de kinetische assay (figuur 3), werd Mup1-pHluorin snel uitgeput van het plasmamembraan in WT-cellen (Figuur 4A), zodat bij benadering 60% van Mup1-pHluorin werd geïnternaliseerd 30 min na toevoeging van methionine ( figuur 4B). Zoals verwacht, Mup1-pHluorin internalisatie was ook efficiënt in 4 Ent1 + cellen, terwijl internalisatie aanzienlijk 4Δ ENTH1 + cellen, in overeenstemming met een ernstig defect in endocytose verlaagd. High-copy expressievan ROM1 of de α-arrestin LDB19, die speciaal voor Mup1 internalisatie vereist is zowel via CME en CIE pathways 13,18, een betere internalisering van Mup1-pHluorin, in overeenstemming met hun vermogen om endocytose in 4Δ + ENTH1 cellen 18 bevorderen. Met name, hoewel steady-state Ste3-pHluorin intensiteit in 4Δ + ENTH1 cellen die high-copy ROM 1 of LDB19 was niet te onderscheiden van WT of 4Δ + Ent1 cellen, internalisering van Mup1-pHluorin werd slechts gedeeltelijk verbeterd 4Δ + ENTH1 cellen die high-copy ROM1 of LDB19 (Figuur 4C). Aldus geven deze gegevens aan dat de kinetische en / of eindpunt assays verschillen endocytotische weer tussen WT en mutante stammen voor sommige ladingen kan onthullen, hoewel soortgelijke steady-state verdeling andere lading kan worden bereikt dezelfde stammen.
Bevolking op basis van analyse van Mup1-PHLuorin internalisatie met behulp van flowcytometrie
High-throughput analyse van grotere celpopulaties middels flowcytometrie kan een alternatief voor het uitvoeren van kinetische en eindpunt assays voor vracht internalisering door microscopie verschaffen. Daartoe fluorescentie-intensiteit van Mup1-pHluorin vergeleken bij WT cellen uit een kweek in afwezigheid van methionine (WT -Met, waarin "helder" moeten zijn) of bij aanwezigheid van methionine gedurende 45 minuten (WT + Met, die moet worden "dim" in vergelijking met onbehandelde cellen op basis van de 80% afname in fluorescentie-intensiteit te zien in figuur 3B). Na analyse door middel van flow cytometrie, werd een verticale poort toegevoerd aan de WT + Met aandoening, waarbij ~ 5% van de cellen die aan de rechterzijde van het hek, en kwam overeen met de helderste cellen in de populatie (Figuur 5A en 5B rood populatie). Wanneer dezelfde poort werd toegepastde WT -Met staat ongeveer 65% van de cellen vielen in de lichte categorie, waaruit blijkt dat flowcytometrie kan worden gebruikt gemakkelijk verschillen in Mup1-pHluorin fluorescentie-intensiteit tussen celpopulaties nemen vóór en na toevoeging van methionine. In tegenstelling, de verdeling van heldere versus dim cellen niet te onderscheiden in 4Δ + ENTH1 -Met en + Met omstandigheden met dezelfde poort toegevoerd aan de WT + Met populatie, in overeenstemming met defecte endocytose. Aldus kan flowcytometrie veranderingen in de endocytische capaciteit van cellen te detecteren, en maakt een snelle analyse van grote populaties van cellen. Belangrijker flowcytometrie kan ook worden gebruikt in genetische als instrument voor het sorteren en selecteren van mutante cellen met defecte endocytose (K. Wrasman en B. Wendland, manuscript in voorbereiding) 33.
Figuur 1:
Figuur 2:. Lokalisatie en kwantificering van Ste3-GFP en Ste3-pHluorin in wild-type en mutant endocytische cellen (A) WT, 4Δ + Ent1 en 4Δ + ENTH1 cellen die genomisch gecodeerd Ste3-GFP en getransformeerd met vector, high-copy ROM 1 of high-copy LDB19 zoals aangegeven werden gevisualiseerd met behulp van fluorescentie microscopie (bovenste rij) of DIC (onderste rij). Ste3 GFP-beelden werden aangepast om dezelfde maximale en minimale intensiteiten om directe vergelijking van Ste3 lokalisatie mogelijk te maken. (B) WT, 4Δ + Ent1 en 4Δ + ENTH1 cellen die het genoom gecodeerd Ste3-pHluorin werden getransformeerd en afgebeeld, zoals beschreven in paneel A. Schaal bar = 2 micrometer. (C, D) Kwantificering van fluorescentie-intensiteit Ste3-GFP (C) en Ste3-pHluorin (D) stammen gebruikt in panelen A en B. Voor elke conditie werd whole-cell fluorescentie gekwantificeerd minimaal 40 cellen. Waarden werden gecorrigeerd voor celgrootte en uitgedrukt in willekeurige eenheden (AU) als gemiddelde ± SEM (*** p <0,001 in vergelijking met WT; ††† p <0,001 vergeleken met 4Δ ENTH1 + + vector). (E) Relative expressie van Ste3-GFP beoordeeld in WT, 4Δ + Ent1 en 4Δ + ENTH1 getransformeerd met vector, high-copy ROM 1 of high-copy LDB19 zoals aangegeven. Celextracten werden bereid zoals eerder 20 beschreven en gelijke hoeveelheden van elk monster werden gescheiden door SDS-PAGE. Ste3-GFP-expressie werd bepaald door immunoblotting met anti-GFP antilichamen en eiwitbelading werd bepaald met behulp van anti-GAPDH. (F) Wild-type cellen die het genoom gecodeerd Ste3-GFP bekeken met behulp van fluorescentie microscopie (Ste3 GFP-paneel) en DIC optica, met een dode cel aangegeven met pijlen. Dode cellen blijken autofluorescente in het GFP-filter, en zijn donkerder wanneer bekeken door DIC. Schaal bar = 2 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Kinetische analyse van Mup1-GFP en Mup1-pHluorin internalisatie (A) Wild-type cellen die het genoom gecodeerd Mup1-GFP (bovenste twee panelen) of Mup1-pHluorin (onderste twee panelen) werden gekweekt tot midden-logaritmische fase in YNB medium zonder methionine Mup1 expressie en retentie induceren op het plasmamembraan. Cellen werden vervolgens afgebeeld door fluorescentiemicroscopie elke 5 min in afwezigheid (- Met) of aanwezigheid (+ Met) van 20 ug / ml methionine. Voor elk tijdspunt in een toestand, werden identieke maximale en minimale intensiteit waarden toegepast vergelijking van fluorescentie-intensiteit en lokalisatie mogelijk. 0, 5, 10, 20 en 40 min tijdstippen zijn opgenomen zoals aangegeven voor alle omstandigheden. Schaal bar = 2 micrometer. (B) Kwantificering van Mup1-GFP en Mup1-pHluorin internalisatie in wild-type cellen van panel A. Whole-cell fluorescentie-intensiteit van Mup1-GFP (- Met, paarse vierkanten, + Met, Blue Diamonds) of Mup1-pHluorin (- Met, groene driehoeken, + Met, rode cirkels) gemeten individuele cellen afgebeeld in 5 min intervallen, en uitgedrukt als een percentage van de initiële fluorescentie-intensiteit (gemiddelde ± SEM, n = 6 cellen per conditie). Overgenomen uit Prosser et al. (2010) 20 met toestemming van de uitgever. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Eindpunt test van Mup1-pHluorin internalisatie (A) WT, 4Δ + Ent1 en 4Δ + ENTH1 cellen die het genoom gecodeerd Mup1-pHluorin en getransformeerd met vector, high-copy ROM 1 of high-copy LDB19 zoals aangegeven werden gekweekt tot midden -logarithmic fase in YNB medium zonder methionine. Willekeurige velden cellen werd afgebeeld door fluorescenc e microscopie onmiddellijk voor (- Met) of 30 minuten na (+ Met) toevoeging van 20 ug / ml methionine. Alle foto's werden aangepast om dezelfde maximale en minimale intensiteit waarden. Schaal bar = 2 micrometer. (B) Kwantificering van Mup1-pHluorin internalisatie in cellen van panel A. Voor elke conditie werd whole-cell fluorescentie-intensiteit gemeten voor tenminste 40 cellen en gecorrigeerd voor celgrootte. Het percentage Mup1-pHluorin geïnternaliseerd werd berekend door gemiddelde intensiteit waarden voor en na 30 min behandeling met methionine. Waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 4; *** p <0,001 in vergelijking met WT; † p <0,05 vergeleken met 4Δ ENTH1 + + vector). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Prosser et al. (2015) 18 met toestemming van de uitgever. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Bevolking analyse van Mup1-pHuorin internalisatie door flowcytometrie (A) WT en 4Δ + ENTH1 cellen werden gekweekt tot midden-logaritmische fase in YNB medium zonder methionine. De cellen werden vervolgens geïncubeerd in de afwezigheid (- Met) of aanwezigheid (+ Met) van 20 ug / ml methionine gedurende 45 minuten vóór de analyse met flowcytometrie. Voor elke voorwaarde, voorwaartse verstrooiing (in willekeurige eenheden, au) werd uitgezet tegen de fluorescentie-intensiteit (au, met behulp van een FITC filter) voor 1000 cellen op een totaal van 10.000 cellen gemeten. Populaties werden verder geanalyseerd door een verticale poort (blauwe pijl) naar de WT + Met aandoening, waarbij ongeveer 5% van de helderste cellen (getoond in rood) viel op de rechterzijde van het hek. De gating gegenereerd voor de WT + Met conditie werd vervolgens toegepast op de overige voorwaarden aan vergelijking toelatenmonster distributies. (B) Samenvatting van het percentage dim cellen (zwarte punten, links van de poort) en heldere cellen (rode punten rechts van de poort) WT en 4Δ + ENTH1 ± Met proeven getoond in paneel A. Zoom klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| spanning | Genotype | Bron |
| SEY6210 een | MAT α his3-Δ200 TRP1-Δ901 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 SUC2-Δ9 | laboratorium plasmide |
| BWY2858 | STE3-GFP :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY2995 | STE3-pHluorin :: KANMX6 | PRosser et al. (2010) 16 |
| BWY3036 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3037 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3399 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3400 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3817 | MUP1-GFP :: KANMX6 | PrOsser et al. (2010) 16 |
| BWY3818 | MUP1-pHluorin :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY4153 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| BWY4154 | ent1Δ :: LEU2 ent2Δ :: HIS3 yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| a Alle stammen die bij deze studie zijn isogene om SEY6210 behalve bij de aangegeven loci. | ||
Tabel 1: Giststammen die in deze studie.
| plasmide | Beschrijving | Bron |
| pRS426 | 2μ URA3 | Sikorski en Hieter 1989 |
| pBW0768 | pRS414 :: ENT1 [CEN TRP1] | pEnt1, Laboratorium plasmide |
| pBW0778 | pRS414 :: ent1 (aa1-151) [CEN TRP1] | pENTH1, Laboratorium plasmide |
| pBW1571 | pFA6a-pHluorin-KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| pBW2053 | YEp24 :: ROM1 [2μ URA3] | pROM1 (Prosser et al., 2011) 7 |
| pRS426-Ldb19 | LDB19prom-LDB19 [2μ URA3] | Prosser et al. (2015) 15 |
| pFA6a-GFP (S65T) -kanMX6 | pFA6a-GFP-KANMX6, PCR-gebaseerde integratie plasmide voor GFP-tagging in gist | Longtineet al. (1998) 21 |
Tabel 2: De plasmiden gebruikt in deze studie.
| Tijd (min) | Actie (s) |
| -5 | Afbeelding monster 1 (-Met) |
| 0 | methionine Toevoegen aan proeven 1 |
| Afbeelding monster 2 (-Met) | |
| 5 | methionine Toevoegen aan 2 |
| Afbeelding monster 3 (-Met) | |
| 10 | methionine toevoegen om te proeven 3 |
| Afbeelding monster 4 (-Met) | |
| 15 | methionine toevoegen om te proeven 4 |
| Afbeelding monster 5 (-Met) | |
| 20 | Toevoegenmethionine te proeven 5 |
| Afbeelding monster 6 (-Met) | |
| 25 | methionine Toevoegen aan 6 |
| Afbeelding monster 7 (-Met) | |
| 30 | methionine Toevoegen aan 7 |
| Afbeelding monster 8 (-Met) | |
| Afbeelding monster 1 (+ Met) | |
| 35 | methionine Toevoegen aan 8 |
| Afbeelding monster 2 (+ Met) | |
| 40 | Afbeelding monster 3 (+ Met) |
| 45 | Afbeelding monster 4 (+ Met) |
| 50 | Afbeelding monster 5 (+ Met) |
| 55 | Afbeelding monster 6 (+ Met) |
| 60 | Afbeelding monster 7 (+ Met) |
| 65 | Afbeelding monster 8 (+ Met) |
tabel 3: Voorbeeld workflow voor maar liefst 8 Mup1-pHluorin eindpunt assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toepassingen van pHluorin voor het kwantificeren van endocytotische gebeurtenissen in gistcellen maakt gebruik van transmembraan ladingen waarin de fluorescente tag gefuseerd met de cytoplasmische staart van het eiwit (Figuur 1A). Voor de hier beschreven assays, ladingen zijn fel tl wanneer de pHluorin tag wordt blootgesteld aan neutrale omgevingen, maar worden gedoofd toen de pHluorin tag tegenkomt zure omstandigheden. Aldus wordt een pHluorin gemerkte endocytische lading gemakkelijk gedetecteerd bij het cytoplasmische oppervlak van het plasmamembraan en vroege endosomen, maar wordt "dim" indien zij in luminale MVB blaasjes of bij aflevering aan de vacuole lumen. In het algemeen nieuw gesynthetiseerde endocytische ladingen waarschijnlijk verlaten het endoplasmatisch reticulum (ER) en bereikt de plasmamembraan voor GFP en veel van zijn varianten volledig gerijpt; dus pHluorin-tag ladingen die nog niet het celoppervlak hebben bereikt wordt voorspeld niet op te sporen te blijven, tenzij het verlaten van de ER of Golgi is impaired.
Gebruik van pHluorin-tag endocytische ladingen zoals Ste3 en Mup1 heeft vergemakkelijkt karakterisering van een aantal eiwitten betrokken bij de gist CIE route (Figuur 1B) 8,18. Specifiek zijn de in dit document beschreven werkwijzen gebruikt om het verhoogde productie van tonen de actine-modulerende Rho1 GTPase en GEF ROM1 bevorderen endocytose in diverse gist mutanten met defecten in CME 8. Daarnaast werden pHluorin-tag ladingen recent gebruikte om kwantitatief aan te tonen dat α-arrestins, die gevestigde rollen in CME 13-15,34-36, spelen cargo-selectieve rollen in zowel CME en de CIE, en hebben mechanistisch verschillende functies in beide paden 18.
Voor de in deze paper protocollen, moet een aantal belangrijke factoren die worden overwogen om consistente, kwantitatieve resultaten te verkrijgen. Ten eerste, Mup1-GFP of Mup1-pHluorin expressie en FLUOREScentie afneemt naarmate gistcellen benaderen of voer de stationaire groeifase (ongepubliceerde resultaten); daarom moeten de cellen gegroeid uit een overnachtkweek worden verdund en opnieuw gekweekt gedurende nog 3 uur (zie stap 3,1-3,2 en 6,1-6,2). Bovendien, wanneer een spreiding meerdere experimentele omstandigheden of stammen in eindpunt assays of voor analyse met flowcytometrie, is het belangrijk om gegevens voor alle monsters na dezelfde duur van methionine behandeling verzamelen om vergelijkingen tussen individuele toelaat. Voor post-acquisitie analyse, moet de kwantificering worden uitgevoerd met behulp van 16-bits afbeeldingen, omdat conversie naar 8-bit formaat zorgt ervoor dat het verlies van gegevens die van invloed kunnen de fluorescentie-intensiteit waarden. Bovendien moet achtergrond aftrek worden uitgevoerd voorafgaand aan kwantificering (stap 5,3), aangezien het achtergrondsignaal significant verschil in intensiteit tussen de monsters kunnen afsluiten.
Overwegende pHluorin-tag Ste3 en Mup1 hebben bewezen vatbaar is voor kwantificering, nietalle ladingen zullen goed geschikt voor pHluorin tagging zijn. Zo probeert de α-factor receptor STE2 label hebben opgeleverd inconsistente kwantitatieve resultaten, mogelijk als gevolg van lagere fluorescentie intensiteit van STE2-pHluorin vergelijking met die van Ste3 of Mup1 (ongepubliceerde resultaten), hoewel het mogelijk dat tandem pHluorin labels kunnen verbeteren de signaalintensiteit. Daarnaast kunnen ladingen met zeer langzaam verloopt-ligand geïnduceerde endocytose niet vatbaar pHluorin labelen voor kwantificering, vooral als de halfwaardetijd van opname langer is dan de gist celcyclus (ongeveer 90 min). Voor dergelijke ladingen kan een afname in fluorescentie ontstaan door endocytose en / of verdeling van de lading tussen moeder en dochtercellen tijdens deling. Zo, het testen van individuele ladingen van belang is aan te bevelen om te bepalen of hun expressie en kinetiek zijn geschikt voor pHluorin-tagging en kwantificering.
Hoewel de recente studies met behulp van PHLuorin zijn vooral gericht op endocytische gebeurtenissen in het plasmamembraan, kan pHluorin-tag ladingen worden gebruikt om later mensenhandel gebeurtenissen in de endocytische route bestuderen. Zo heeft Mup1-pHluorin succes gebruikt in stroomcytometrie-gebaseerde testen van ESCRT gemedieerde lading sorteren in MVBs 37, aangezien de pHluorin tag wordt geblust na opname in MVB luminale blaasjes 20. Deze aanpak is vergelijkbaar met de recent beschreven luciferase reporter intraluminale depositie (LUCID) test, die gebruik maakt van ladingen met een cytoplasmatisch luciferase tag een bioluminescente signaal in de aanwezigheid van luciferine 38,39 genereren. Net als bij het doven van pHluorin fluorescentie bij de oprichting in MVB luminale blaasjes, is bioluminescentie in de LUCID assay verzwakt bij de oprichting van de luciferase-tag in MVB blaasjes. Terwijl pHluorin en LUCID assays zijn conceptueel vergelijkbaar, kan pHluorin-tag ladingen worden gebruikt om endocytose en MVB rijping te bestuderen in intacte cellen.
Alternatieve methoden bestaan voor het kwantificeren van endocytose, en waardevolle informatie over de tarieven van de lading internalisering in wild-type en endocytische mutant cellen hebben verstrekt. Voorbeelden omvatten bewaking opname van radioactief gemerkte liganden zoals α-factor (dat bindt aan de receptor feromoon STE2) en uracil (die wordt geïnternaliseerd door de permease Fur4) 40,41 of bewakings- de afbraaksnelheid van endocytotische ladingen zoals Ste3 zij worden geïnternaliseerd en naar de vacuole 42. Deze biochemische benaderingen vereisen cellysis, en dus niet geschikt voor directe kwantificatie van levende cellen. Alternatief fluorescent gelabelde α-factor, de vloeistoffase kleurstof Lucifer Yellow, of styrylkleurstof FM4-64 kan worden gebruikt om endocytose te visualiseren in levende cellen, maar geen directe controle van endogeen tot expressie lading eiwitten 40,43,44 niet toe. Voor deze benaderingen, persistentie van fluorescentie in de vacuole lumen kan kwantificering bemoeilijken, zoals gezien met GFP. Het is ook mogelijk om GFP-gelabeld lading voor kwantificering van endocytose gebruikt door meting whole-cell fluorescentie-intensiteit en het aftrekken van het signaal van cytoplasmatische en endosomale / vacuolaire compartimenten; echter, endosomen en vacuolen zijn vaak in de nabijheid van de plasmamembraan. Daarentegen worden pHluorin-tag endocytische ladingen geblust in MVB / vacuole compartimenten, die een duidelijk voordeel voor de kwantificering van mensenhandel gebeurtenissen in vergelijking met de grotere schaal gebruikt GFP-tag kan zijn. Onze toekomstige studies zal uitbreiden op de huidige kennis van de endocytische paden en vracht sortering in gist om extra factoren die bijdragen aan CME en CIE te identificeren en om de mechanismen die lading sorteren beslissingen regelen begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
- Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604 (2011).
- Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
- Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
- Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
- Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
- Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
- Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
- Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
- Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
- Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
- Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
- Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
- O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
- O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
- Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
- Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
- Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
- Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
- Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
- Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
- Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
- Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
- Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
- Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
- Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
- Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
- Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
- Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
- Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
- Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
- Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
- Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
- Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
- Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).
