Abstract
proteína fluorescente verde (GFP) y sus variantes son ampliamente utilizados para el estudio de las herramientas de localización de la proteína y la dinámica de los acontecimientos tales como la remodelación del citoesqueleto y el tráfico vesicular en las células vivas. utilizando metodologías cuantitativas GFP fusiones quiméricas se han desarrollado para muchas aplicaciones; Sin embargo, la GFP es algo resistente a la proteolisis, por tanto, su fluorescencia persiste en el lisosoma / vacuola, lo cual puede dificultar la cuantificación del tráfico de carga en la vía endocítica. Un método alternativo para la cuantificación de los eventos de tráfico de endocitosis y post-endocítica hace uso de superecliptic pHluorin, una variante sensible al pH de GFP que se apaga en ambientes ácidos. fusión quimérica de pHluorin a la cola citoplasmática de carga transmembrana proteínas resulta en una amortiguación de la fluorescencia tras la incorporación de la carga en los cuerpos multivesiculares (MVBs) y la entrega a la luz del lisosoma / vacuola. Por lo tanto, extinción de la fluorescencia vacuolar facilita cuantificación de endocitosis y primeros eventos en la vía endocítica. Este documento describe los métodos que utilizan cargas de etiquetado pHluorin para la cuantificación de la endocitosis por medio de microscopía de fluorescencia, así como ensayos basados en la población usando citometría de flujo.
Introduction
el tráfico vesicular juega un papel importante en el mantenimiento de la identidad y la función orgánulo en células eucariotas, y es un mecanismo clave para la regulación de proteínas y de la membrana composición de compartimientos celulares individuales. En la membrana de plasma, fusión de vesículas exocytic ofrece nuevas proteínas y las membranas de la superficie de la célula, mientras que las vesículas generadas a través de endocitosis eliminar membrana y proteínas de la superficie para el reciclaje o la orientación al lisosoma posterior. Por lo tanto, la endocitosis es importante para la absorción de nutrientes y para respuestas al entorno extracelular. Exocitosis y endocitosis están equilibrados para regular el área de superficie de la membrana plasmática, y para permitir renovación de las proteínas dañadas.
Los estudios en levaduras y células de mamíferos han identificado un gran número de proteínas implicadas en la endocitosis, así como múltiples vías endocítica que promueven la internalización de cargas específicas o que actúan en respuesta a una variedad de encondiciones ambientales. La vía mejor estudiada es la endocitosis mediada por clatrina (CME), en la que las proteínas de clatrina y accesorias citosólicas se ensamblan en una estructura de capa para estabilizar la vesícula endocítica naciente. Los experimentos en los ciernes levadura Saccharomyces cerevisiae han arrojado información clave en la dinámica y la orden de contratación para muchas proteínas endocítica 1-3. En particular, la maquinaria CME está altamente conservada a través de la evolución de tal manera que la mayoría de las proteínas relacionadas con el CME en la levadura tiene ortólogos humanos; por lo tanto, la levadura en ciernes ha sido una herramienta importante para la comprensión de los mecanismos de endocitosis que están conservados en eucariotas superiores. Por ejemplo, los estudios que utilizan levadura en ciernes determinaron que la formación y la maduración de las estructuras de CME (denominado a los parches de actina como corticales en la levadura) implica el reclutamiento secuencial de muchas proteínas, a partir de clatrina y adaptador de proteínas de unión con la carga, seguido por reclutamiento de accesorio endocítica adicional proteínas,la activación de la polimerización de actina mediada por 3 Arp2 /, y el reclutamiento de las proteínas implicadas en 1,2 vesícula escisión. El reclutamiento de proteínas de maquinaria CME a cortical parches de actina es un proceso altamente ordenado y estereotipada, y el orden preciso de la contratación para muchas proteínas se ha establecido con respecto a otros componentes de la maquinaria de CME. Es importante destacar que estudios recientes han confirmado una orden similar de reclutamiento para las proteínas de CME en depresiones revestidas de clatrina en células de mamífero 4.
Además de CME, muchos tipos de células poseen una o más vías de clatrina independiente endocítica (CIE) que se basan en mecanismos alternativos para promover la formación de vesículas y la internalización de la membrana plasmática 5-7. En la levadura, recientemente hemos identificado una vía de CIE que utiliza la pequeña GTPasa Rho1 y su factor de activación de guanina intercambio de nucleótidos (GEF), Rom1 8,9. Rho1 activa el formin Bni1 para promover la polimerización de la actina 10,11, que se requiere para esta forma de endocitosis clathrin-independiente en la levadura 12. Por otra parte, la familia α-arrestina de proteínas reclutar la ubiquitina ligasa Rsp5 para promover la ubiquitinación de carga y la posterior interiorización a través de CME 13-17, y también promover la internalización de carga a través de la vía de CIE, posiblemente a través de la interacción directa con proteínas implicadas en la CIE 18. Una variedad de vías CIE también existen en células de mamífero, incluyendo las vías de clathrin independiente y fagocíticas que se basan en la ortholog Rho1, RhoA 9,19. El papel de RhoA en mamíferos CIE es poco conocida; por lo tanto, los estudios en levadura en ciernes pueden proporcionar conocimientos mecánicos adicionales que son aplicables a CIE mamíferos.
la cuantificación exacta de los acontecimientos de endocitosis puede proporcionar información importante acerca de las funciones de las proteínas específicas en la regulación de la endocitosis, y puede revelar los efectos de las mutaciones sobre la internalización de carga o progression a través de la vía endocítica. Para este propósito, los métodos bioquímicos se pueden utilizar para controlar la absorción de ligando o para medir las tasas de degradación de las proteínas de carga endocítica. En las células vivas, la fusión de proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes a cargas de interés permite la visualización directa de transporte de carga. Sin embargo, cargas GFP-etiquetados son de uso limitado para la cuantificación de la endocitosis porque GFP es resistente a la degradación en el lisosoma (o vacuola en levaduras). Por otra parte, la fluorescencia de GFP es sólo parcialmente sensible a los cambios en el pH, y permanece detectable dentro de la vacuola lumen 20,21. Por consiguiente, la fluorescencia de la etiqueta GFP persiste en la vacuola mucho después de que el resto de la carga se ha degradado, y toda la cuantificación basada en células de la intensidad de la carga puede ser inexacto debido a la fluorescencia de GFP a largo plazo en la vacuola.
Con el fin de superar los inconvenientes de la fluorescencia GFP vacuolar, que previamente hizo uso de pH supereclipticluorin, una variante sensible al pH de GFP que fluoresce brillantemente a pH neutro, pero pierde la fluorescencia en ambientes ácidos, tales como el lumen de la vacuola / lisosoma 20,22,23. La colocación de una etiqueta pHluorin en la cola citoplásmica de cargas endocítica permite la visualización de las cargas en la membrana plasmática y en los endosomas tempranos, donde la etiqueta pHluorin permanece expuesto al citoplasma (Figura 1A). A medida que maduran los endosomas tempranos, el complejo endosomal clasificación exigida en los paquetes de transporte (ESCRT) maquinaria cargas localizadas en la superficie en vesículas que brotan en el lumen del endosoma, la generación de cuerpos multivesiculares (MVBs) 24. Para las cargas que se han incorporado en vesículas internas MVB, la etiqueta pHluorin mira hacia el lumen de la vesícula. vesículas MVB internos se acidifican; por lo tanto, cargas marcadas con fluorescencia pHluorin pierden en los endosomas tempranos a medida que maduran en MVBs 20. fusión subsiguiente de la MVB con la vacuola entrega los contenidos luminales MVBpara la degradación, las etiquetas y pHluorin permanecen apagados en el ambiente ácido del lumen vacuola.
Este documento proporciona una descripción detallada de los ensayos cuantitativos endocítica utilizando cargas con etiquetas pHluorin citoplasmáticos en la levadura. Las cepas que expresan cargas de etiquetado pHluorin se pueden utilizar en ensayos cinéticos y / o de punto final, dependiendo de las propiedades y el tráfico de comportamiento de la carga específica. Además, algunos cargamentos de etiquetado pHluorin son susceptibles de métodos de análisis de alto rendimiento, incluyendo citometría de flujo. Es importante destacar que la etiqueta pHluorin es una herramienta versátil para el estudio de eventos endocítica en las células vivas, lo que permite la cuantificación de la endocitosis y la comparación de la función endocítica de tipo salvaje y cepas mutantes.
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Protocol
1. Soluciones y Medios de Comunicación
- Preparar los Stocks De acuerdo con los medios de comunicación, y las placas:
- Para preparar 10x YNB, se disuelven 67 g de base nitrogenada de levadura carece de los aminoácidos en 1 L de agua. Esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,22 micras de nitrocelulosa.
- Preparar medio YNB usando 1x YNB (de 10x) con 2% de dextrosa (de una estéril 50% w / v de valores) y la mezcla de 1x amino ácido / nutriente (de 100x de valores, véase la etapa 1.1.4). Para la selección de plásmido, omitir aminoácidos individuales o nutrientes según sea necesario. Para la inducción de la expresión Mup1, adicionalmente omitir metionina a partir de la mezcla de aminoácidos / nutriente.
- Preparar placas de YNB utilizando 1x YNB (de 10x), 2% de dextrosa (de una estéril 50% w / v de stock), 0,7 g / L de ácido amino mezcla / de nutrientes (véase la etapa 1.1.5) y 2,5% de agar. Preparar medio de placa por tratamiento en autoclave de 25 g de agar y 0.7 g de amino mezcla de ácido / nutriente por 860 ml de agua. Dejar que la mezcla se enfríe a 55 ° C, a continuación, añadir 100 ml de 10x YNB y 40 ml de of 50% de glucosa. Verter en las placas (aproximadamente 30 ml de medio por placa de 10 cm), dejar que el medio solidifique a temperatura ambiente, y las placas se almacenan a 4 ° C.
- Preparar la solución de amino ácido / nutriente Stock 100x (para medio líquido) por disolución de la siguiente en 100 ml de agua desionizada: 0,1 g L-metionina, 0,3 g cada uno de L-leucina y L-lisina, y 0,2 g de cada uno de L-histidina , L-triptófano, adenina y uracilo (otros aminoácidos y nutrientes pueden ser incluidos, según sea necesario para las cepas específicas). Use calor suave si es necesario para disolver y esterilizar a través de un filtro de 0,45 micras de nitrocelulosa. Almacenar a temperatura ambiente con protección de la luz. Para la selección del plásmido, preparar soluciones madre que carecen de componentes específicos, según sea necesario.
- Preparar ácido amino / mezcla de nutrientes (por placas) mediante la combinación de lo siguiente: 0,5 g de adenina, 4 g de L-leucina, y 2 g cada uno de L-histidina, L-lisina, L-metionina, L-triptófano, L- tirosina y uracilo. Triturar con un mortero y mano de mortero, y almacenar con Proprotección de la luz. Para la selección de plásmido, se preparan mezclas que carecen de componentes específicos, según sea necesario, y el uso de 0,7 g de mezcla de aminoácidos por litro de medio de placa (véase la etapa 1.1.3).
- Preparar portaobjetos de cámara de 8 pocillos para microscopía mediante el recubrimiento de la superficie de la corredera con concanavalina A (ConA). A cada pocillo de la diapositiva cámara, añadir 25 l de 2 mg / ml de ConA disueltos en agua. Utilizando una punta de pipeta, se extendió la cona través de la superficie inferior del pozo, y luego permitir que el portaobjetos se seque al aire a temperatura ambiente durante al menos 4-8 horas. Lo ideal es utilizar la cámara de diapositivas dentro de las 24 horas de recubrimiento ConA.
- Generar cepas de levadura con fusiones en marco de GFP o pHluorin a la carga endocítica de interés utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) método de integración basada describe en Longtine et al. y Goldstein y McCusker 25,26.
NOTA: Los plásmidos que contienen pHluorin etiquetado casetes con genes de resistencia para kanamicina (KANMX6) y (nourseothricin- Amplificar casetes GFP o pHluorin que contienen marcadores seleccionables con cebadores que contienen secuencias adicionales específicos para el sitio de integración genómica 20,25.
- Transformar el producto de PCR resultante en la cepa de levadura deseada usando el método de acetato de litio 27.
- Seleccionar para la integración de la casete por las células que crecen en placas de YPD que contienen el fármaco apropiado. Para preparar las placas, autoclave 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 0,1 g de triptófano y 25 g de agar en 960 ml de agua. Antes de verter las placas, dejar que la mezcla se enfríe a 55 ° C, a continuación, agregar 40 ml de 50% de glucosa y, o bien G418 a una concentración final de 200 mg / ml para la selección KANMX6, o nourseothricin a una concentración final de 100 mg / ml para NATMX4 selección.
- Confirmar la integración de la GFP o etiqueta pHluorin en colonias individuales por PCR y / o transferencia de Western usando anticuerpos anti-GFP,así como por la detección de la proteína marcada por microscopía de fluorescencia 20.
NOTA: cepas de levadura específicas y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en las Tablas 1 y 2, respectivamente.
2. El punto extremo Ensayo de fluorescencia en estado estacionario de manera constitutiva internalizada por carretera Endocítica
- Inocular células (~ 3 colonias pequeñas) en 5 ml de medio YNB que carecen de aminoácidos o nutrientes según se requiera para el mantenimiento del plásmido (si es aplicable). Se cultivan las células durante 16-24 horas en un incubador con agitación orbital a 30 ° C, con 250 rpm de agitación. Alternativamente, consecutivas a ~ 1-2 mm colonia de células en una placa de YNB carece de los aminoácidos o nutrientes para la selección de plásmido, y hacer crecer las células durante la noche a 30 ° C.
- Medir la densidad (OD 600) de cada cultivo de una noche usando un espectrofotómetro. Preparar una dilución 5 ml a 0.35-0.4 OD 600 / ml en medio YNB carece de los aminoácidos o nutrientes para las zonamantenimiento smid, y crecer durante aproximadamente 3 horas a 30 ° C con agitación. Si se utilizan células manchadas en un plato, omita este paso y continúe con el paso 2.4 (véase más adelante).
- Medir la densidad (OD 600) de las células, que ahora debe ser de entre 0,6 a 1,0 OD 600 / ml. Transferir 1,5 ml de cultivo a un tubo de microcentrífuga, y células de pellets a 8.000 rpm (6.800 xg) durante 2 min. Retire 1.475 l de sobrenadante.
- Llevar células a un microscopio de fluorescencia. Antes de la formación de imágenes de cada muestra, preparar una diapositiva resuspendiendo las células en el medio restante, y montar 3 l de suspensión de células bajo un cubreobjetos. Alternativamente, se preparan portaobjetos de cámara de 8 pocillos como se describe a continuación en el protocolo 3, utilizando medio YNB como apropiado para la selección del plásmido. Idealmente, las células de imagen con un 100X, 1,4 o mayor apertura numérica (NA) de inmersión en aceite de lente de objetivo, una cámara de 12 o de 16 bits, y los filtros de excitación / emisión optimizados para la fluorescencia de GFP.
NOTA: Si utiliza células cultivadas o rayandona placa, preparar la diapositiva mediante la colocación de 3 l de medio YNB fresco en una hoja de la cubierta. Utilizando una punta de pipeta, se recoge una pequeña colonia de células de la placa, dispersar las células en el medio YNB, y montar la suspensión resultante en un portaobjetos de vidrio inmediatamente antes de la imagen. - Image 4-6 campos aleatorios de células para cada condición, usando los mismos parámetros de adquisición (es decir, conjuntos de filtros y el tiempo de exposición) para todas las imágenes dentro de un experimento.
NOTA: La toma de una imagen DIC campo claro o para cada campo puede ser útil para las células en las que la señal pHluorin se apaga en MVB y compartimentos vacuolar. - Cuantificar la intensidad de fluorescencia de al menos 30-50 células para cada condición (véase el protocolo 5).
3. Ensayo cinético para la cuantificación de la endocitosis de Cargos que se someten a endocitosis Regulado
- Inocular 2-3 colonias de células de levadura (aproximadamente 2 mm de diámetro por colonia) en 5 ml de medio YNB que carece de metionina y añadiraminoácidos itional o nutrientes para el mantenimiento de la selección del plásmido. Crecer los cultivos durante 16-24 horas a 30 ° C con agitación.
NOTA: En este documento, los protocolos para el estudio de las proteínas de carga endocítica regulados harán uso de la permeasa de metionina, Mup1. Otras cargas que se someten a endocitosis regulada también son adecuados para el marcado con pHluorin (por ejemplo, el uracilo permeasa Fur4, que se acumula en la membrana plasmática en ausencia de uracilo, e internaliza en respuesta a la aplicada externamente uracilo); para estas cargas, las condiciones de los medios de comunicación deben ser modificados para reflejar las condiciones específicas de expresión, de inducción y de internalización para que dicha carga. - Se mide la densidad (OD 600) de cada cultivo de la noche aproximadamente 3 horas antes de exponer. Preparar una dilución 5 ml a 0.35-0.4 OD 600 / ml en medio YNB que carecen de ácidos metionina y aminoácidos adicional o nutrientes para el mantenimiento del plásmido, y crecer a 30 ° C con agitación.
- Pre-equilibrar los microsfrente de cámara ambiental o etapa climatizada (si está disponible) a 30 ° C durante la incubación de 3 h de paso 3.2.
- Transferir 1 ml de cultivo celular a un tubo de microcentrífuga, y células de pellets a 8000 rpm (6800 xg) durante 2 min. Eliminar 975 l de sobrenadante.
- Preparar un tratado con ConA, porta con cámara de 8 pocillos con fondo de vidrio para la imagen (protocolo 1.2).
- Añadir 200 l de medio YNB que carecen de ácidos metionina y aminoácidos adicional o nutrientes para la selección de plásmido a cada pocillo. Resuspender el sedimento celular de la etapa 3.4 en el sobrenadante restante, y soltar 2,5 l de suspensión celular en el centro de cada pocillo. Dispersar células en toda la superficie del pozo pipeteando arriba y abajo, y permiten que las células se asienten durante 5-10 minutos.
- Colocar el portaobjetos de cámara en un microscopio de fluorescencia invertida equilibrada a 30 ° C (véase el paso 3.3). Localizar un campo de las células utilizando iluminación de campo claro.
- Añadir 50 l de medio YNB que contienen 100 mg / ml de metionina(Pre-calentado a 30 ° C) a los 200 l de medio en el pocillo para obtener una concentración de metionina final de 20 mg / ml. No perturbar el medio en el pozo con el fin de evitar que las células de flotación de la parte inferior.
- Permitir que las células equilibrar durante 2 min antes de comenzar la formación de imágenes. Inmediatamente antes de la captura de la primera imagen, ajustar el microscopio al plano focal deseada (típicamente, un plano focal ecuatorial funciona mejor).
- Adquirir imágenes GFP y campo claro (o DIC) a intervalos de 5 min durante 45-60 min, utilizando los parámetros de adquisición idénticos para todas las imágenes dentro de una serie de tiempo (por ejemplo, 100X 1,4 NA objetivo de inmersión en aceite y 500 mseg el tiempo de adquisición usando el filtro de GFP, 100 tiempo de adquisición mseg usando el filtro de DIC).
NOTA: Si el escenario del microscopio y software de formación de imágenes no permiten para la corrección automática de la deriva de plano focal, puede ser necesario volver a ajustar manualmente el enfoque antes de cada punto de tiempo de formación de imágenes. Por otra parte, los tiempos de adquisiciónvarían entre microscopios debido a diferencias en la iluminación y filtros, y las condiciones óptimas deben ser determinados manualmente antes de comenzar el experimento. Si se utiliza una carga endocítica que no sea Mup1, puede ser necesario modificar los intervalos de tiempo de adquisición y formación de imágenes, así como la duración del experimento, para reflejar la cinética de internalización de esa carga. - Cuantificar la intensidad de fluorescencia de las células individuales en cada punto de tiempo (véase el protocolo 5), y expresar los valores como un porcentaje de la intensidad inicial de la primera imagen.
4. punto final del ensayo para la cuantificación de Endocítica Cargos que se someten a endocitosis Regulado
- Preparar las células para obtener imágenes como se describe en el protocolo 3 (pasos 3.1 a 3.6).
- Imagen 4-5 campos aleatorios de células para cada condición, inmediatamente antes de la adición de metionina, utilizando filtros de campo claro y GFP conjuntos.
- Añadir 50 l de medio YNB que contiene 100 mg / ml de metionina (antes de la guerramed a 30 ° C) a los 200 l de medio en el pozo para obtener una concentración de metionina final de 20 mg / ml. No perturbar el medio en el pozo con el fin de evitar que las células de flotación de la parte inferior.
- Image 4-5 campos aleatorios de células 30 min después de la adición de metionina, utilizando los mismos parámetros de adquisición como para el punto de tiempo 0 min (paso 4.2).
- Cuantificar la intensidad de fluorescencia de al menos 30-50 células para cada punto de tiempo (véase el protocolo 5). expresan valores como el porcentaje de Mup1-pHluorin internalizada después de 30 min mediante la fórmula: [intensidad media a 0 min - La media de la intensidad en 30 min] / [intensidad media a 0 min] x 100%.
NOTA:. Es posible realizar simultáneamente hasta ocho puntos finales ensayos escalonando la hora de inicio de cada ensayo de la Tabla 3 proporciona un flujo de trabajo de ejemplo para ocho ensayos simultáneos.
5. Análisis post-adquisición
- Exportación de imágenes de software de adquisición como un 16 bits formato de archivo de imagen etiquetada (.tif o .tiff).
NOTA: Otros formatos de archivos también pueden ser adecuados, e idealmente deben usar algoritmos de compresión sin pérdidas. imágenes de 8 bits en general no son adecuados para los propósitos de cuantificación. - Abrir archivos utilizando el software ImageJ (libremente disponible con la opción "Abrir" en el menú "Archivo". Utilice la imagen de fluorescencia para la cuantificación, y la imagen de campo claro / DIC como referencia para identificar la ubicación de las células y para excluir las células muertas (si está presente ), que aparecen más oscuras que las células vivas cuando se ve por la DIC y se autofluorescent cuando se ve con filtros GFP de excitación / emisión.
- Realizar una sustracción de fondo la imagen de fluorescencia sucesivamente. Para imágenes con una señal de fondo desigual, utilizar el algoritmo de "sustracción de fondo encontrado en el menú 'Proceso'. Utilice la configuración predeterminada (radio de rodadura de la bola de 50 píxeles), que es generalmente suficiente para los propósitos de cuantificación.
NOTA: Una alternativa background método de sustracción de imágenes con fondo uniforme se describe en el paso 5.3.1.-5.3.2; Sin embargo, el método anterior también funciona para el fondo uniforme.- Para imágenes con fondo uniforme (es decir, la intensidad de fondo es aproximadamente constante en todos los bordes y en el centro de la imagen), realizar una sustracción de fondo manual. Haga clic en el botón 'selecciones a mano alzada' que se encuentra en la ventana principal de ImageJ y seleccione 3-5 regiones aleatorias dentro de la imagen que no contienen células.
- Abrir la función de 'set' Las mediciones se encuentra en el menú "Analizar", seleccione el parámetro 'valor de gris promedio', y medir los valores de intensidad utilizando la función "Medir" (también se encuentra en el menú "Analizar"). Calcular el valor medio de las regiones 3-5 medidos, y resta de todas las mediciones posteriores en esa imagen.
- Para la cuantificación de ensayos cinéticos (protocolo 3), generar una sola imagen, apilados para el timserie e. Abra las imágenes de fluorescencia de cada punto de tiempo en orden cronológico, y generar una pila utilizando las Imágenes 'para el apilado "función (que se encuentra en el menú" Imagen ", bajo el submenú Pilas).
- Esquema de una célula usando la herramienta de selección a mano alzada, asegurándose de incluir toda la célula, sino como pequeña zona exterior de la célula como sea posible.
- Medir los siguientes parámetros: 'superficie, densidad integrado "y" valor de gris promedio'. Elija los parámetros usando la función 'set' Las mediciones, que se encuentra en el menú "Analizar".
NOTA: Integrado densidad corresponde a la suma de todas las intensidades de los píxeles dentro de la región seleccionada, y la media de valor de gris corresponde a [Integrated Densidad / Area], que corrige los valores de intensidad para el tamaño celular. - Abra el "Administrador de retorno de la inversión", ubicado en el menú "Analizar", bajo sub-menú 'Herramientas'. En la ventana Administrador de ROI, haga clic en el botón "Añadir" para entrar en el regio resaltadan como una nueva región de interés (ROI).
- Repetir los pasos 5.4 a través de 5.6 para las células restantes en la imagen. Excluir las células muertas según la evaluación de campo claro / DIC y fluorescencia (células muertas aparecen más oscuras en las imágenes DIC, y tienen señal citoplasmática autofluorescent cuando se ve con GFP excitación / emisión; véase la Figura 2F), y cualquier célula que tocan el borde de la imagen. Guardar las regiones de interés seleccionadas como un archivo .zip haciendo clic en el botón "Más" en la ventana "Administrador de retorno de la inversión", y exportar todas las mediciones a una hoja de cálculo o software de análisis estadístico.
- Para la cuantificación de ensayos cinéticos (protocolo 3), delinear y medir una célula desde el punto de tiempo inicial como se describe en los pasos 5.4 y 5.5. Utilice el mismo retorno de la inversión para la medición de todos los puntos de tiempo posteriores en el experimento.
- Para los ensayos de punto final (protocolos 2 y 4), medida de un mínimo de 30-50 células para cada condición. Realizar la cuantificación de al menos 2-3 imágenes, e incluyen todas las células en cadaimagen que cumplen con los criterios señalados en el paso 5.8 en el análisis.
- Evaluar la significación estadística entre las muestras usando ANOVA de una vía, seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey para el análisis post hoc.
6. Análisis de la Población Mup1-pHluorin endocitosis por Citometría de Flujo
- Inocular 2-3 colonias de células de levadura (aproximadamente 2 mm de diámetro por colonia) en 0,5 ml de medio YNB que carecen de aminoácidos adicionales o nutrientes para el mantenimiento de la selección del plásmido y metionina. Se cultivan las células en tubos de 5 ml de fondo redondo de 16 a 24 horas a 30 ° C en un tambor de rodillo.
- Añadir 1,5 ml de medio YNB que carecen de ácidos metionina y aminoácidos adicionales o nutrientes para el mantenimiento del plásmido, y crecer a 30 ° C durante 3 horas adicionales en un tambor de rodillos.
- Transferir 1 ml de células en cada uno de dos tubos de 5 ml de fondo redondo. Añadir 0,25 ml de medio YNB -Met al primer tubo (condición Met), y 0,25 ml de medio YNB que contiene 100 g/ Ml de metionina en el segundo tubo para dar una concentración de metionina final de 20 mg / ml (condición + Met). Se incuban las células a 30 ° C durante 45 min en un tambor de rodillo.
- Analizar las células por citometría de flujo, la selección de dispersión frontal (FS) como una medida del tamaño de la celda, y la intensidad de fluorescencia Mup1-pHluorin de un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) como una medida de la interiorización de carga.
- Utilice los botones deslizantes para ajustar la tensión de los FS y canales de FITC para optimizar la detección de la intensidad rango de tamaño y fluorescencia de las células de levadura que se utiliza (para estos experimentos, los ajustes utilizados fueron 50 V para FS y 400 V para FITC).
NOTA: Tensión para ambos canales variará dependiendo del citómetro de flujo que se utiliza. Este paso se debe hacer antes o durante el tratamiento de 45 min con metionina (paso 6.3). - Medir la intensidad de fluorescencia FS y por 10.000 células de cada condición, mediante el ajuste de alta velocidad de flujo. Generar un gráfico de dispersión de FS contra fluocencia intensidad: haga clic en "añadir gráfica ', seleccione FITC (eje x) y FS (eje y), y el gráfico 1.000 puntos (el software mostrará los valores de 1.000 células, a pesar de que se midieron 10.000 células).
NOTA: Para mantener la coherencia máxima, analizar las células de 45-50 minutos después de la adición de metionina; para los experimentos que involucran grandes cantidades de muestras, escalonar la adición de metionina para acomodar el tiempo requerido para la citometría de flujo análisis. - Incluir condiciones Met + y se reunió por células de tipo salvaje (WT) como control. Uso de la función de puerta, asignar una puerta vertical usando la condición WT + Met, tal que aproximadamente el 5% de las células más brillantes caer a la derecha de la puerta. Utilice esta gating para todas las otras condiciones en el experimento.
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Representative Results
La localización de estado estacionario y la cuantificación de la carga de proteínas endocítica constitutivamente internalizado Ste3
Para demostrar que cargamentos de etiquetado pHluorin pueden ser utilizados para la cuantificación de la endocitosis en las células vivas, la localización de GFP quimérico y fusiones pHluorin con la cola citoplásmica C-terminal de Ste3, el receptor de feromonas un factor en la levadura, se compararon. Ste3 es una proteína G-receptor acoplado (GPCR) que se constitutivamente transportada a la membrana plasmática, interioriza, y dirigida a la vacuola de la degradación 28. Así, bajo condiciones de estado estable, la mayoría de Ste3 se localiza en el lumen de vacuolas, como se ve en las células de tipo salvaje (WT) que expresan Ste3-GFP (Figura 2A). En contraste, las células que carecen de los genes que codifican las cuatro proteínas adaptadoras clathrin vinculante Ent1, Ent2, Yap1801 y Yap1802 (ent1 ΔEnt2 Δ Δ yap1801 yap1802 Δ, en lo sucesivo, 4Δ) no logran estabilizar clatrina en los sitios de endocitosis 29, y son graves carencias en CME 30. Células 4Δ requieren la expresión de la homología de N-terminal (de ENTH) dominio de cualquiera de Ent1 o Ent2 epsin para 30,31 viabilidad. El dominio de ENTH no es suficiente para la endocitosis en 4Δ células, como se muestra por la retención de Ste3-GFP en la membrana plasmática en las células 4Δ + ENTH1 que expresan el dominio de ENTH de Ent1 (Figura 2 A) 8,30; la retención de la membrana plasmática similar en células 4Δ + ENTH1 se ha observado para otros cargos endocítica, incluyendo Ste2-GFP (el receptor de feromonas α-factor de) y Mup1-GFP o Mup1-pHluorin (una permeasa de metionina) 8,18. Por el contrario, la expresión de larga duración Ent1 de un plásmido en las células 4Δ (4Δ + Ent1) restaura la endocitosis y la localización de Ste3-GFP a la vacuola. células 4Δ + i ENTH1 fueron utilizados recientementepantalla genética na para identificar una vía de CIE en la levadura que se basa en la modulación de la actina-GTPase Rho1 y su GEF, Rom1, así como la formin Bni1 y miembros de la familia α-arrestina de las proteínas implicadas en la carga de clasificación 8,18. Consistente con un papel en la CIE, la expresión de ROM1 o la LDB19 α-arrestina a partir de plásmidos de alta copia en células 4Δ + ENTH1 internalización de Ste3-GFP (Figura 2A) mejoradas.
Las células que expresan GFP-Ste3 u otras cargas endocítica GFP-etiquetados tienen vacuolas brillantes debido a la acumulación y la resistencia proteolítica de la etiqueta GFP. En contraste, las células que expresan Ste3-pHluorin tienen niveles muy bajos de fluorescencia vacuolar debido a la extinción de la etiqueta pHluorin en ambientes ácidos 20. Como se ha visto anteriormente, las células WT y 4Δ + Ent1 mostraron muy poco detectable Ste3-pHluorin por microscopía de fluorescencia (Figura 2B). Por el contrario, Ste3-pHluorinera fácilmente detectable en la membrana plasmática de las células 4Δ + ENTH1, mientras vacuolar Ste3-pHluorin permaneció casi indetectable en todos los casos. Una expresión de alto copia de ROM1 o LDB19 redujo la cantidad de detectable Ste3-pHluorin en la superficie celular, similar a los resultados con Ste3-GFP, aunque vacuolar Ste3-pHluorin permaneció casi indetectable en todos los casos.
Para comparar la eficacia de la GFP y cargas como herramientas pHluorin-etiquetado para cuantificar cambios en la capacidad endocítica de las células, se midió la fluorescencia de células enteras de Ste3-GFP y Ste3-pHluorin en WT y 4Δ células. Aunque los cambios en la localización Ste3-GFP eran fácilmente detectables por microscopía (Figura 2A), las diferencias en la intensidad de fluorescencia total no fueron estadísticamente significativas entre WT, 4Δ + Ent1 y células 4Δ + ENTH1 transformadas con el vector vacío (Figura 2 C) 20. Likewise, células 4Δ + ENTH1 transformadas con vector, ROM1 y LDB19 tenían intensidades de fluorescencia de células enteras similares. En particular, las células 4Δ + ENTH1 transformadas con memoria ROM 1 o LDB19 fueron significativamente más débiles que las células WT (Figura 2C) 8,18; sin embargo, los niveles de proteína Ste3-GFP fueron similares tal como se evaluó por inmunotransferencia (Figura 2E). Mientras que la diferencia en la intensidad puede ser debido en parte a cambios en el tamaño vacuola o morfología, o a las diferencias en la retención de la etiqueta GFP en la vacuola, la cuantificación de la fluorescencia Ste3-GFP no refleja los cambios en la localización observadas por microscopía de fluorescencia (figura 2A). Por el contrario, la cuantificación de la intensidad Ste3-pHluorin demostró que las células 4Δ + ENTH1 transformadas con vectores fueron significativamente más brillante que las células WT o 4Δ + Ent1, y la expresión de alto copia de memoria ROM 1 o LDB19 en las células 4Δ + ENTH1 reduce la intensidad Ste3-pHluorin deniveles que eran similares a WT y 4Δ + Ent1 (Figura 2D). Por lo tanto, la cuantificación de la intensidad de estado estacionario Ste3-pHluorin refleja con precisión las diferencias en la localización observada por microscopía de fluorescencia.
Los ensayos de internalización cinéticos utilizando la carga endocítica regulada, Mup1
La cuantificación de la intensidad de fluorescencia para las cargas constitutivamente internalizados en el estado estacionario puede revelar diferencias en la capacidad endocítica de las células mutantes en comparación con las células WT. Sin embargo, es posible que algunas cargas pueden alcanzar la misma distribución en estado estacionario y la intensidad en las células mutantes WT y endocítica, a pesar de que las células mutantes tienen un retraso en la endocitosis o más lenta la cinética para la internalización de carga. cargas lugar, Tagged-pHluorin que se someten a endocitosis regulada en respuesta a un estímulo o ligando específico se pueden utilizar para controlar lacinética de endocitosis. Para este propósito, la internalización de la permeasa de metionina de alta afinidad, Mup1, se controló 32. En ausencia de metionina extracelular, la expresión Mup1 está regulada positivamente, y la permeasa se retiene en la membrana plasmática; tras la adición de metionina al medio, Mup1 sufre internalización rápida y la orientación a la vacuola 13.
Para controlar la cinética de internalización Mup1, las cepas que expresan WT Mup1-GFP o Mup1-pHluorin desde el locus genómico se cultivaron en ausencia de metionina con el fin de acumular Mup1 fluorescente en la membrana plasmática (punto de tiempo de la Figura 3A, 0 min). a continuación, la imagen de lapso de tiempo de las células se realizó a intervalos de 5 minutos en ausencia o en presencia de metionina para monitorizar la internalización de carga y cambios en la fluorescencia. Como era de esperar, GFP y pHluorin-tagged Mup1 reflejado en ausencia de metionina se mantuvo en la membrana plasmática fo todo el período de observación de 45 min 20. En contraste, las células fotografiadas en presencia de metionina mostraron agotamiento progresivo de la señal de fluorescencia de la superficie celular, de acuerdo con la internalización de carga. En particular, la fluorescencia Mup1-GFP acumula en estructuras internas (es decir, endosomas y la vacuola), mientras que Mup1-pHluorin localiza en punctae interna que probablemente corresponden a los endosomas tempranos, pero no se observó en la vacuola.
Cuando la fluorescencia se cuantificó a través de todos los puntos de tiempo para las células individuales, la intensidad Mup1-GFP y Mup1-pHluorin mostró poco cambio en la ausencia de metionina aplicado externamente durante el curso del experimento 45 min, en consonancia con la proteína restante de forma estable localizado en la membrana plasmática (Figura 3B). Por el contrario, de células enteras intensidad Mup1-pHluorin disminuyó rápidamente en presencia de metionina, de manera que una reducción del 50% en fluorescencSe observó la intensidad de correo después de aproximadamente 20-25 minutos, y una reducción del 80% se observó después de aproximadamente 40 min 20. células Mup1-GFP también mostraron una disminución en la intensidad de fluorescencia después de la adición de metionina; sin embargo, la cinética de la pérdida de fluorescencia se retrasaron en comparación con los de Mup1-pHluorin, de manera que una disminución del 50% en la intensidad sólo se observó después de 40 min. Como se ve en la Figura 3A, Mup1-GFP fue apenas detectable en la membrana plasmática en este momento, lo que indica que la persistencia de la fluorescencia GFP vacuolar impedido la cuantificación exacta de los acontecimientos endocítica en la superficie celular.
Los ensayos de punto final utilizando la carga endocítica regulada, Mup1
Además de los ensayos cuantitativos, cinéticas de endocitosis como se describe anteriormente, cargas endocítica regulados, como Mup1 también se pueden utilizar para ensayos de punto final, similar a la cuantificaciónde estado estacionario intensidad Ste3-pHluorin. Para este propósito, el ensayo para la cuantificación de Mup1-pHluorin internalización se modificó para permitir la comparación de las intensidades de fluorescencia media de las poblaciones de células fotografiadas inmediatamente antes o 30 min después de la adición de metionina 8,18. Este enfoque permite la comparación del porcentaje de Mup1 internalizado entre células mutantes WT y endocítica.
De acuerdo con los resultados del ensayo de cinética (Figura 3), Mup1-pHluorin se agota rápidamente de la membrana plasmática en las células WT (Figura 4A), de tal manera que aproximadamente 60% de Mup1-pHluorin fue interiorizado 30 min después de la adición de metionina ( Figura 4B). Como era de esperar, Mup1-pHluorin internalización fue igualmente eficaz en 4 + Ent1 células, mientras que la internalización se redujo significativamente en células 4Δ + ENTH1, consistentes con un defecto grave en la endocitosis. Una expresión de alto copiade memoria ROM 1 o el LDB19 α-arrestina, que se requiere específicamente para la internalización Mup1 tanto a través de CME y CIE vías 13,18, mejor internalización de Mup1-pHluorin, en consonancia con su capacidad para promover la endocitosis en las células 4Δ + ENTH1 18. Cabe destacar que, si bien en estado estacionario intensidad Ste3-pHluorin en las células 4Δ + ENTH1 expresando copia de alta memoria ROM 1 o LDB19 era indistinguible de las células WT o 4Δ + Ent1, internalización de Mup1-pHluorin fue sólo mejoró parcialmente en las células 4Δ + ENTH1 expresar copia de alta memoria ROM 1 o LDB19 (Figura 4C). Por lo tanto, estos datos indican que los ensayos cinéticos y / o de punto final pueden revelar diferencias en las tasas endocítica entre WT y cepas mutantes para algunas cargas, a pesar de la distribución en estado estacionario similar de otras cargas puede conseguirse de las mismas cepas.
El análisis basado en la población de Mup1-PHLuorin internalización mediante citometría de flujo
El análisis de alto rendimiento de las poblaciones más grandes de células por medio de citometría de flujo puede proporcionar una alternativa a la realización de ensayos cinéticos y de punto final para la internalización de carga por microscopía. Para este fin, la intensidad de fluorescencia de Mup1-pHluorin se comparó en células WT de un cultivo crecido en ausencia de metionina (Met WT, que debe ser "brillante") o en presencia de metionina durante 45 min (WT + Met, que debe ser "dim" en comparación con las células no tratadas sobre la base de la reducción de 80% en la intensidad de fluorescencia se ve en la Figura 3B). Después del análisis por citometría de flujo, una puerta vertical, se aplicó a la condición WT + Met, donde ~ 5% de las células estaban contenidos en el lado derecho de la puerta, y correspondía a las células más brillantes dentro de la población (Figura 5A y 5B , la población de rojo). Cuando se aplicó la misma puertaa la condición WT Met, aproximadamente el 65% de las células cayó en la categoría brillante, lo que demuestra que la citometría de flujo puede ser utilizado para observar fácilmente las diferencias en la intensidad de fluorescencia Mup1-pHluorin entre poblaciones de células antes y después de la adición de metionina. Por el contrario, la distribución de brillante frente a las células oscuras era indistinguible de las condiciones 4Δ + ENTH1 -Met y + Met utilizando la misma puerta se aplica a la población WT + Met, consistente con la endocitosis defectuoso. Por lo tanto, la citometría de flujo puede detectar cambios en la capacidad endocítica de las células, y permite el análisis rápido de grandes poblaciones de células. Es importante destacar que la citometría de flujo también puede ser utilizado en las pantallas de genética como una herramienta para la clasificación y selección de las células mutantes con endocitosis defectuoso (K. Wrasman y B. Wendland, manuscrito en preparación) 33.
Figura 1:
Figura 2: Localización. Y cuantificación de Ste3-GFP y Ste3-pHluorin en de tipo salvaje y células mutantes endocítica células (A) WT, 4Δ + Ent1 y 4Δ + ENTH1 expresan genómicamente codificados Ste3-GFP y transformada con el vector, copia de alta memoria ROM 1 o copia de alta LDB19 como se ha indicado se visualizaron por microscopía de fluorescencia (fila superior) o DIC (fila inferior). imágenes Ste3-GFP se ajustaron a los mismos máximos y mínimos intensidades para permitir la comparación directa de Ste3 localización. (Células B) WT, 4Δ + Ent1 y 4Δ + ENTH1 que expresan genómicamente codificada Ste3-pHluorin se transformaron y la imagen como se describe en el panel A. Barra de escala = 2 micras. (C, D) La cuantificación de la intensidad de fluorescencia para Ste3-GFP (C) y Ste3-pHluorin (D) cepas utilizadas en los paneles A y B. Para cada condición, la fluorescencia de células enteras se cuantificó por un mínimo de 40 células. Los valores fueron corregidos para el tamaño celular, y se expresan en unidades arbitrarias (AU) como media ± SEM (*** p <0,001 en comparación con el WT; ††† p <0,001 en comparación con 4Δ + ENTH1 + vector). (E) Relative Ste3 expresión de GFP-evaluado en el documento WT, 4Δ + Ent1 y células 4Δ + ENTH1 transformada con el vector, memoria ROM 1 de alta copia o copia de alta LDB19 como se indica. Los extractos celulares se prepararon como se ha descrito previamente 20, y cantidades iguales de cada muestra se resolvieron mediante SDS-PAGE. expresión Ste3-GFP se evaluó por inmunotransferencia con anticuerpos anti-GFP, y la carga de proteínas se evaluó mediante anti-GAPDH. (F) las células de tipo salvaje que expresan genómicamente codificado Ste3-GFP visto por microscopía de fluorescencia (panel Ste3-GFP) y DIC óptica, con una célula muerta indicado por las flechas. Las células muertas aparecen autofluorescent en el filtro de GFP, y son más oscuras cuando se ve por la DIC. Barra de escala = 2 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Ensayo cinético de Mup1-GFP y Mup1-pHluorin internalización células de tipo salvaje (A) que expresa genómicamente codificados Mup1-GFP (dos paneles superiores) o Mup1-pHluorin (dos paneles inferiores) fueron cultivadas a mediados de la fase logarítmica de medio YNB que carece de metionina para inducir la expresión y la retención Mup1 en la membrana plasmática. Las células fueron entonces imágenes de microscopía de fluorescencia cada 5 min en ausencia (- Met) o presencia (+ Met) de 20 mg / ml de metionina. Para cada punto de tiempo dentro de una condición, se aplicaron los valores de intensidad máximo y mínimo idénticos para permitir la comparación de la intensidad de fluorescencia y localización. 0, 5, 10, 20 y 40 puntos de tiempo min se muestran como se indica para todas las condiciones. Barra de escala = 2 micras. (B) Cuantificación de Mup1-GFP y Mup1-pHluorin internalización en las células de tipo salvaje desde el panel A. la intensidad de fluorescencia de células enteras de Mup1-GFP (- Met, casillas de color púrpura; + Met, diamantes azules) o Mup1-pHluo(rin - Met, triángulos verdes; + Met, círculos rojos) se midió para las células individuales fotografiados en intervalos de 5 minutos, y se expresan como un porcentaje de la intensidad de fluorescencia inicial (media ± SEM, n = 6 células por condición). Reimpresión de Prosser et al. (2010) 20 con el permiso del editor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Ensayo de punto final de Mup1-pHluorin internalización (A) WT, 4Δ + Ent1 y 4Δ + ENTH1 células que expresan genómicamente codificados Mup1-pHluorin y transformadas con el vector, copia de alta memoria ROM 1 o copia de alta LDB19 como se indica fueron cultivadas a mediados fase -logarithmic en medio YNB metionina deficiente. campos aleatorios de células se obtuvieron imágenes por fluorescenc e inmediatamente antes de la microscopía (- Met) o 30 minutos después de la adición (+ Met) de 20 mg de metionina / ml. Todas las imágenes se ajustaron a los mismos valores máximos y mínimos de intensidad. Barra de escala = 2 micras. (B) Cuantificación de Mup1-pHluorin internalización en las células de panel A. Para cada condición, se midió la intensidad de fluorescencia de células enteras por un mínimo de 40 células y se corrige para el tamaño celular. El porcentaje de Mup1-pHluorin internalizado se calculó mediante la comparación de valores de intensidad media antes y después del tratamiento 30 min con metionina. Los valores se muestran como media ± SEM (n = 4; *** p <0,001 en comparación con WT; † p <0,05 en comparación con 4Δ + ENTH1 + vector). Esta cifra ha sido modificado a partir de Prosser et al. (2015) 18 con el permiso del editor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. Análisis de la población de Mup1-pHuorin internalización por citometría de flujo de células (A) WT y 4Δ + ENTH1 fueron cultivadas a mediados de la fase logarítmica en medio YNB que carece de metionina. Las células fueron incubadas en ausencia (- Met) o presencia (+ Met) de 20 g de metionina / ml durante 45 min antes del análisis por citometría de flujo. Para cada condición, dispersión hacia adelante (en unidades arbitrarias, au) se representó frente a la intensidad de fluorescencia (au, usando un filtro FITC) de 1.000 células de un total de 10.000 células medido. Las poblaciones fueron analizados mediante la aplicación de una puerta vertical (flecha azul) a la condición WT + Met, donde aproximadamente el 5% de las células más brillantes (en rojo) cayó en el lado derecho de la puerta. El gating generado para la condición WT + Met continuación, se aplicó a las condiciones restantes para permitir la comparaciónde la distribución de la muestra. (B) Resumen del porcentaje de células DIM (puntos negros, a la izquierda de la puerta) y las células brillantes (puntos rojos, a la derecha de la puerta) para WT y 4Δ + ENTH1 ± ensayos cumplieron mostrados en el panel A. Por favor, clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tensión | Genotipo | Fuente |
| SEY6210 una | MAT α-HIS3 Δ200 trp1-Δ901 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 SUC2-Δ9 | plásmido de laboratorio |
| BWY2858 | STE3-GFP :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY2995 | STE3-pHluorin :: KANMX6 | PAGRosser et al. (2010) 16 |
| BWY3036 | ent1Δ :: LEU2 :: HIS3 ent2Δ yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3037 | ent1Δ :: LEU2 :: HIS3 ent2Δ yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3399 | ent1Δ :: LEU2 :: HIS3 ent2Δ yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3400 | ent1Δ :: LEU2 :: HIS3 ent2Δ yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 STE3-GFP :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY3817 | MUP1-GFP :: KANMX6 | PrOsser et al. (2010) 16 |
| BWY3818 | MUP1-pHluorin :: KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| BWY4153 | ent1Δ :: LEU2 :: HIS3 ent2Δ yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pEnt1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| BWY4154 | ent1Δ :: LEU2 :: HIS3 ent2Δ yap1801Δ :: HIS3 yap1802Δ :: LEU2 MUP1-pHluorin :: KANMX6 + pENTH1 [CEN TRP1] | Prosser et al. (2011) 7 |
| un Todas las cepas utilizadas en este estudio son isogénicas a SEY6210 excepto en los loci indicada. | ||
Tabla 1: Las cepas de levadura utilizadas en este estudio.
| plásmido | Descripción | Fuente |
| pRS426 | 2μ URA3 | Sikorski y Hieter, 1989 |
| pBW0768 | pRS414 :: ENT1 [CEN TRP1] | pEnt1, el plásmido Laboratory |
| pBW0778 | pRS414 :: ent1 (aa1-151) [CEN TRP1] | pENTH1, el plásmido Laboratory |
| pBW1571 | pFA6a-pHluorin-KANMX6 | Prosser et al. (2010) 16 |
| pBW2053 | YEp24 :: memoria ROM 1 [2μ URA3] | PROM1 (Prosser et al., 2011) 7 |
| pRS426-Ldb19 | LDB19prom-LDB19 [2μ URA3] | Prosser et al. (2015) 15 |
| pFA6a-GFP (S65T) -kanMX6 | la integración de plásmido basado en PCR pFA6a-GFP-KANMX6, para GFP-etiquetado en la levadura | Longtineet al. (1998) 21 |
Tabla 2: Los plásmidos utilizados en este estudio.
| Tiempo (min) | Comportamiento) |
| -5 | Imagen de muestra 1 (Met) |
| 0 | Añadir metionina a la muestra 1 |
| Imagen de muestra 2 (Met) | |
| 5 | Añadir metionina a la muestra 2 |
| Imagen de muestra 3 (Met) | |
| 10 | Añadir metionina a la muestra 3 |
| Imagen de muestra 4 (Met) | |
| 15 | Añadir a la muestra 4 metionina |
| Imagen de muestra 5 (Met) | |
| 20 | Añadirmetionina a la muestra 5 |
| Imagen de muestra 6 (Met) | |
| 25 | Añadir metionina a la muestra 6 |
| Imagen de muestra 7 (Met) | |
| 30 | Añadir a la muestra 7 metionina |
| Imagen de muestra 8 (Met) | |
| Imagen de muestra 1 (+ Met) | |
| 35 | Añadir a la muestra metionina 8 |
| Imagen de muestra 2 (+ Met) | |
| 40 | Imagen de muestra 3 (+ Met) |
| 45 | Imagen de muestra 4 (+ Met) |
| 50 | Imagen de muestra 5 (+ Met) |
| 55 | Imagen de muestra 6 (+ Met) |
| 60 | Imagen de muestra 7 (+ Met) |
| sesenta y cinco | Imagen de muestra 8 (+ Met) |
Tabla 3: Ejemplo de flujo de trabajo para la asombrosa cifra de 8 ensayos de punto final Mup1-pHluorin.
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Discussion
Aplicaciones de la pHluorin para la cuantificación de eventos endocítica en células de levadura hace uso de cargas transmembrana en el que la etiqueta fluorescente está fusionada a la cola citoplasmática de la proteína (Figura 1A). Para los ensayos descritos aquí, son cargas con fluorescencia brillante cuando la etiqueta pHluorin se expone a ambientes neutros, pero se convierten en extinguió cuando la etiqueta se encuentra con pHluorin condiciones ácidas. Por lo tanto, un cargamento endocítica-etiquetados pHluorin se detecta fácilmente en la cara citoplasmática de la membrana plasmática y en los endosomas tempranos, pero se convierte en "dim" cuando se incorpora en vesículas MVB luminales o después de la entrega al lumen vacuola. En general, los cargos endocítica recién sintetizadas probable salen del retículo endoplásmico (ER) y alcanzan la membrana de plasma antes de GFP y muchos de sus variantes han madurado completamente; por lo tanto, los cargamentos que aún no han alcanzado la superficie de la célula se predice pHluorin-etiquetado para permanecer indetectable a menos que la salida de la sala de emergencias o de Golgi es impaired.
El uso de cargas endocítica de etiquetado pHluorin como Ste3 y Mup1 ha facilitado la caracterización de un número de proteínas implicadas en la ruta de levadura CIE (Figura 1B) 8,18. Específicamente, los métodos descritos en este documento se han utilizado para demostrar que el aumento de producción de la actina de modulación de GTPasa Rho1 y su promover la endocitosis GEF Rom1 en una variedad de mutantes de levadura con defectos en CME 8. Además, los cargamentos de etiquetado pHluorin fueron utilizados recientemente para demostrar cuantitativamente que las alfa-arrestinas, que han funciones bien establecidas en CME 13-15,34-36, desempeñar papeles de carga selectiva tanto en CME y CIE, y tienen funciones distintas mecánicamente en las dos vías 18.
Para los protocolos descritos en el presente documento, varios factores importantes que deben ser considerados con el fin de obtener resultados consistentes y cuantitativos. En primer lugar, Mup1-GFP o Mup1-pHluorin expresión y FLUORESCENTEcencia puede disminuir a medida que las células de levadura se acercan o entran en la fase de crecimiento estacionario (resultados no publicados); por lo tanto, las células cultivadas a partir de un cultivo de una noche se deben diluir y volver a crecer durante 3 h adicionales (consulte los pasos 3.1-3.2 y 6.1-6.2). Además, cuando escalonamiento múltiples condiciones experimentales o cepas en ensayos de punto final o para el análisis por citometría de flujo, es importante para recopilar datos para todas las muestras después de la misma duración del tratamiento metionina con el fin de permitir las comparaciones entre las condiciones individuales. Para el análisis posterior a la adquisición, la cuantificación se efectuará utilizando las imágenes de 16 bits, ya que la conversión a formato de 8 bits provoca la pérdida de datos que puede afectar a los valores de intensidad de fluorescencia. Por otra parte, la sustracción del fondo se debe realizar antes de la cuantificación (etapa 5.3), ya que la señal de fondo se puede ocluir de manera significativa diferencias de intensidad entre las muestras.
Considerando-etiquetados pHluorin Ste3 y Mup1 han demostrado susceptibles de cuantificación, notodos los cargamentos serán bien adaptado a pHluorin etiquetado. Por ejemplo, los intentos para etiquetar el receptor α-factor de Ste2 han dado resultados cuantitativos inconsistentes, posiblemente debido a la intensidad de fluorescencia inferior de Ste2-pHluorin comparación con la de Ste3 o Mup1 (resultados no publicados), aunque es posible que las etiquetas tándem pHluorin podrían mejorar la intensidad de la señal. Además, cargas con tasas muy lentas de la endocitosis inducida por el ligando no puede ser susceptible a pHluorin etiquetado para la cuantificación, especialmente si el tiempo medio de la internalización es más largo que el ciclo celular de la levadura (aproximadamente 90 min). Para tales cargas, una disminución de la fluorescencia podría surgir de la endocitosis y / o de reparto de la carga entre las células madre y la hija durante la división. Por lo tanto, las pruebas de cargas individuales de interés se recomienda con el fin de determinar si su expresión y cinética son adecuados para pHluorin-etiquetado y la cuantificación.
Aunque los estudios recientes que utilizan PHLuorin han centrado principalmente en eventos endocítica en la membrana plasmática, cargas de etiquetado pHluorin se pueden utilizar para estudiar eventos de tráfico posteriores en la vía endocítica. Por ejemplo, Mup1-pHluorin ha sido utilizado con éxito en el flujo de los ensayos basados en citometría de carga-ESCRT mediada clasificación en MVBs 37, ya que la etiqueta se convierte en pHluorin inactivó tras la incorporación en MVB vesículas luminales 20. Este enfoque es similar al indicador de luciferasa más recientemente descrita de deposición intraluminal de ensayo (LUCID), que hace uso de cargas con una etiqueta de luciferasa citoplásmica para generar una señal bioluminiscente en presencia de luciferina 38,39. Al igual que en la extinción de pHluorin fluorescencia tras la incorporación en MVB vesículas luminales, la bioluminiscencia en el ensayo lúcido es atenuada con la incorporación de la etiqueta de la luciferasa en vesículas MVB. Mientras pHluorin y ensayos LÚCIDOS son conceptualmente similares, cargas de etiquetado pHluorin se pueden utilizar para estudiar endocitosis y MVB maduración icélulas n intacto.
Existen métodos alternativos para la cuantificación de la endocitosis, y han proporcionado una valiosa información sobre las tasas de internalización de carga de tipo salvaje y las células mutantes endocítica. Los ejemplos incluyen la captación de seguimiento de ligandos radiomarcados tales como α-factor de (que se une al receptor de feromonas Ste2) y uracilo (que está internalizado por la permeasa Fur4) 40,41, o el control de la velocidad de degradación para las cargas endocítica como Ste3 como se internalizan y se transporta a la vacuola 42. Estos enfoques bioquímicos requieren la lisis celular, y por lo tanto no son adecuados para la cuantificación directa en las células vivas. Alternativamente, la etiqueta fluorescente α-factor de, el colorante-fase fluida Lucifer Yellow, o el colorante estiril FM4-64 se puede utilizar para visualizar la endocitosis en las células vivas, pero no permiten la monitorización directa de las proteínas de carga expresadas endógenamente 40,43,44. Para estos enfoques, la persistencia de la fluorescencia en el VAlumen cuole pueden complicar la cuantificación, como se ve con GFP. También es posible utilizar cargas GFP-etiquetados para la cuantificación de la endocitosis mediante la medición de la intensidad de fluorescencia de células enteras y restando la señal de los compartimentos citoplasmáticos y endosomal / vacuolar; sin embargo, los endosomas y vacuolas son a menudo muy cerca de la membrana plasmática. Por el contrario, cargas endocítica de etiquetado pHluorin se templan con MVB compartimentos / vacuola, que pueden ser una clara ventaja para la cuantificación de los eventos de tráfico en comparación con la etiqueta GFP más ampliamente utilizado. Nuestros estudios futuros se ampliarán en el conocimiento actual de las vías endocítica y clasificación de carga en la levadura para identificar factores adicionales que contribuyen a la CME y CIE, y para entender los mecanismos que regulan las decisiones de carga de clasificación.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
- Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604 (2011).
- Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
- Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
- Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
- Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
- Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
- Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
- Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
- Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
- Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
- Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
- Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
- O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
- O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
- Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
- Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
- Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
- Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
- Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
- Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
- Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
- Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
- Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
- Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
- Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
- Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
- Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
- Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
- Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
- Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
- Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
- Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
- Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
- Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).
