Protocol
1. İşlenebilir PANI Sentezi
- 250 mL'lik yuvarlak dipli bir şişede kloroform, 60 ml tamamen (1 mi, 11 mmol) anilin içinde çözülür. 600, 5 dakika boyunca rpm'de ve buz ile 0-5 ° C'ye soğutun karıştırın. Bu, genellikle 15-20 dakika (Şekil 2A) alır.
- 600 rpm'de karıştırılırken, yuvarlak dipli bir reaksiyon kabına, anilin çözeltisine, sodyum dodesil benzen sülfonat (NaDBS) (7.44 gr, 21 mmol) ekleyin.
- 20 ml su içindeki amonyum persülfat (APS) (3.072 gr, 13.5 mmol) çözündürülür ve tüm damla damla 30 dakika boyunca reaksiyon aşırı ısınmasını önlemek için ekleyin.
- 24 saat süre ile 0-5 ° C'de reaksiyonun yürütülmesi ve başka bir 24 saat süre ile oda sıcaklığına ulaşmasına izin verir.
- Reaksiyon karışımı başlangıçta 15 dakika sonra süt beyazı edecek dikkat, 2 saat sonra, ve son olarak da 24 saat (Şekil 2B-F) sonra, koyu yeşil, sonra koyu kahverengi.
- Buchner hunisi ile PANI-NaDBS çözelti filtre. olarak 80 ml kloroform ve 120 ml su ile karıştırılırAyırma hunisi (Şekil 2G).
- Sulu süpernatan içinde reaksiyona girmemiş NaDBS ve APS bırakarak, oda sıcaklığında 24 saat boyunca çözelti inkübe ve ayırma hunisinden koyu yeşil Pani toplar.
2. PANI-prob Karıştırma ve UV Işınlama
- kloroform-su ile PANI çözeltisi 10x seyreltilir (1: 3 h / h) ile bir mikrofüj tüpü içinde, 15 dakika boyunca hafif sallanan probun DNA oligonükleotitleri 6.4 umol ile seyreltildi PANI 200 ul karıştırın.
- 2 dakika boyunca, bir çapraz bağlayıcı UV 1200 μJ / cm2 olan PANI-DNA eriyiği ışın tedavisi. UV maruziyeti belirtilen tutarla sınırlı olduğu önemlidir. UV uzun süre maruz Bayan ve DNA kovalent çapraz bağlanma nedeniyle olası Pani floresans değişikliği ödün.
- 6 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüj ile pelet kompleksleri ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkanır. Yine pelet ve PBS içinde yeniden askıya.
3. HPani-prob ybridization
- Pani-prob komplekslerinin 200 ul nükleik asitleri 100 uM tamamlayıcı DNA oligonükleotidleri 8 ul ekle hedefler.
- 40 ° C'de 15 dakika boyunca çözelti karışımı sallanmasıyla hibridizasyon gerçekleştirmek ° C.
- 6 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüj ile PANI kompleksleri Pelet. PBS ile yıkayın ve su yeniden askıya.
4. Emisyon Kararlı Hal Floresan Ölçüm
- 250 nm'de eksitasyon ile 96 oyuklu mikro-, farklı tedaviler Pani ekleyin ve 270-850 nm aralığında emisyon floresan ölçer. Pani bir emisyon tepe 500 nm civarında gözlenmelidir.
Melezleştirilmiş Dubleks 5. Floresan Mikroskopi Ölçümü
- 48 saat süre ile, 40 ° C'de bir borosilikat cam lamel üzerine kuru kaplama Pani bırakın.
- Kurutulmuş PANI film üzerine prob (100 uM 8 ul) ilave edin ve UV ışığı (1.200 μJ / cm2 ile ışın
- 48 saat süre ile, 40 ° C'de PANI-prob PBS ile film ve kuru yıkayın.
- Hedef nükleik asitleri ilave edilerek 15 dakika boyunca hibridizasyon gerçekleştirmek. Bu, bir biyolojik numune veya bir kontrol hedef oligonükleotit (100 uM 8 ul) olabilir. PBS yıkama izleyin.
- 500 nm uzun geçiş filtresi ile, 40X büyütmede floresan görüntüleri elde edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2A, APS ilave edilmeden önce polimerizasyon işlemi, örneğin, başlangıcında Reaksiyon setup yakalar. Misel oluşumu misel arayüzü süreç PANI sentezi meydana reaksiyonda ilk adımdır. Şekil 2B, 5 dakika sonra süt bir çözümü göstermektedir. APS Reaksiyon ilave edildikten sonra 30 dakika hafif kahverengi bir renge dönüşür. Şekil 2C oligomerler oluşumu ile bağlantılı bir renk değişikliği gösterir. Şekil 2B, uygun kısa zincirli PANI yüksek konsantrasyon gösteren, 4 saat sonra koyu kahverengi bir renk gösterir çok yavaş bir tepki. Son olarak kloroform-su (Şekil 2E) içinde dağılmış yüksek molekül ağırlıklı PANI koyu yeşil renkli bir çözelti elde edilebilir 48 saat sonra. Şekil 2F hiçbir faz ayrımı olmaksızın ayırma hunisinde iyi dağılmış, homojen PANI çözümü göstermektedir.
(Şekil 2) ya da açılan kaplanmış filmlerin yüzeyi üzerinde (Şekil 3). Pani filmlerin taban floresans (Şekil 3A) göreceli olarak düşüktür. Prob, DNA film üzerine ilave edildi ve oda sıcaklığında kurumaya bırakılmıştır. Beklenen DNA PANI kompleks oluşturan floresan yoğun bir artış (Şekil 3b) gözlenebilir zaman. negatif yüklü DNA Elektron tutucu floresans artışa neden olan, PANI moleküllerinin yüksek elektron yoğunluğuna yol açar. Prob hedef çiftli hibridizasyonu neden ayrıldıktan sonra, PANI flüoresans taban yoğunluğuna (Şekil 3C) geri döner. Ayrılma melezleme üzerine DNA omurgasının uzlaşmanın PANI-prob etkileşim değişiklikleri nedeniyle oluşur. Bu teknoloji ile Algılama nükleik asitler, emülsiyon (Şekil 3D) 'de, doğrudan gerçekleştirilebilir. emülsiyon kullanmanın bir yararı tabanlı sistem plaka okuyucu aletleri ile uyumluluk. Bu PANI floresan bir derece hassas ölçüm verir ve film kaplamada düzensizlikler nedeniyle zorluklar önler. emülsiyon biçiminde bir PANI tabanlı sensör son derece özeldir. Hedef oligo tek bir uyumsuzluğu (mm) giriş taban PANI floresan (Şekil 3D) geri başarısız olur.
UV ışınlarına maruz kalma aracılık prob Şekil 1. Ek PANI gelen dekolmanı hedef nükleik asitler sonuçlarının PANI floresan. Hibridizasyon artırır ve bazal floresan polimer geri dönmesinin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
iles / ftp_upload / 54590 / 54590fig2.jpg "/>
Işlenebilen PANI Şekil 2. sentezi (A). Polimerizasyon reaksiyonunun başlangıcı. APS yavaş yavaş ilave edilir, 5 dakika sonra, (B). (C) 30 dakika sonra APS ekleme. 1 saat sonra (D). 4 saat sonra (D). (F) reaksiyon 48 saat sonra Yeşil ürün. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
PANI Floresans Şekil 3. nükleik asit hibridizasyon tespit etmek için. 40 ° C'de 48 saat boyunca kurutma, ardından borosilikat camına açılır kaplama ile oluşturulan (A) PANI film. Sonda immobilizasyon sonrası (B) PANI floresan. (C)PANI immobilize problar ile, hedef DNA'nın hibridizasyonu takiben. Önce ve ya tamamlayıcı veya tek uyuşmazlığı (mm) hedef oligonükleotidler ile hibridizasyon sonrası PANI emülsiyon, 500 nm (D) Floresan. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nükleik asitlerin bir PANI tabanlı sensör DNA ve RNA ile etkileşime girmesi için, su içinde polimerin çözünür hale gerektirir. Su içinde PANI dispersiyon, daha önce rapor edildiği gibi 8 miseller oluşturan, yüzey aktif maddeler kullanılarak gerçekleştirilir. 4-sülfoftalik asit dodesil ester gibi diğer anyonik yüzey aktif maddeler Burada kullanılan NaDBS ek olarak, nonil fenol etoksilat veya setiltrimetil amonyum bromür katyonik yüzey iyonik olmayan yüzey aktif maddeler de işlenebilir PANI 9,10 sentezi için kullanılabilir. 1 mol oranında: Burada tarif edilen sentez, 2 monomer aniline ilave anyonik sürfaktan NaDBS sabit bir oran ile başlar. yüzey aktif madde NaDBS yüksek hidrofil-lipofil dengesi (HLB) misel polimerik yağ damlacıkları ve su arasında denge kurularak kloroform-su içinde emülsifiye edilmiş anilin monomerinin polimerizasyonu sağlayan yer alır. gr miseller oluşturmak için 1.5 mol oranı: oksidanın APS sonra 1 ilave ediliriç kısım, bir çekirdeklendirici madde olarak hareket eder Pani, sayesinde. Bu, çevredeki çözücü 11,12 ile dinamik bir denge içinde Pani tutarken, monomerlerin kuyruk eki baş yol açar. Yüksek molekül ağırlıklı polimerler kadar kontrollü bir şekilde reaksiyon, 13 oluşturulur. Bu protokol, 50 nm ila 1,500 nm 3 e kadar olan parçacıkları oluşturur. PANI henüz yavaş büyür çözünür kalır bir tepki kuran kritik oksidan APS, düşük sıcaklık ve güçlü protonik asitler yokluğunda yavaş bir ektir. reaktan ait bazı optimizasyonu, iyi dağılmış Pani oluşturmak için gerekli olabilir. Bu yöntemle sentezlenebilir PANI bir emülsiyon olarak bir yıldan fazla stabildir. dispersiyon HLB dengesi bozulur edilebilir aşırı seyreltme PANI çökelmeye neden kaçınılmalıdır. Yüksek hızlı karıştırma çözeltisi içinde Pani tutmaya yardımcı olabilir. o pelet formati engel gibi mükemmel çözünürlük, arzu değildirbir emülsiyon esaslı sensör melezleme prosedürleri için önemli bir kriterdir üzerinde.
Pani dağılmış oluşturduktan sonra, söz konusu DNA probu oligolar elektrostatik etkileşimi yoluyla polimer matrisine bağlanır. PANI imin grupları etkileşmesi DNA omurgası fosfatlar kendiliğinden meydana gelir. Non-spesifik PANI-nükleik asit etkileşimleri karmaşık biyolojik numunelerde 14 analit algılama zorlaştırıyor. Spontan etkileşimler ayırt edilebilir Bayan ve prob DNA arasındaki ilişki elde etmek için, kompleks bir UV ile ışınlandırılır. UV tetiklenen şarj lokalizasyonu ile oluşturulan polar kısımların oluşturulması polimer yüzeyinin 15 ıslatılabilirliğini arttırır. Optimum maruz yaklaşık 2 dakika, ve 500 nm'de PANI floresans yaklaşık 5X (Şekil 3) yüksek olup olmadığını teyit edilebilir. Aşırı maruz kalma UV kompleksin PANI ve DNA, elektrostatik etkileşimler aksine, doe arasında çapraz bağlanma yol açabilirPANI floresans yükselmesine neden değil.
sensörleri üreten süreci kolay ve hızlıdır. Polimerizasyon reaksiyonu, reaksiyona girmemiş oksitleyici ve NaDBS ayrı 24 saat, ardından 48 saat sonra tamamlanır. bir algılayıcı kullanılan miktardan çok büyük görece sentezi bu makalede protokolü tarafından üretilen hazır PANI miktar olarak seyrek gerçekleştirilir gerekir olan. Yüksek konsantrasyonlarda PANI emülsiyonu kararlı olduğu; Bununla birlikte, sonda takılması sırasında meydana gelen herhangi bir seyreltme sensör performansını tehlikeye, PANI çökelmesine neden olabilir. hedefleri tespit etmek PANI-prob komplekslerinin hemen kullanılması bu sorunu önlemek olacaktır. Birlikte, kompleksleri ve melezleşme yaratılması bir saatin altında yapılabilir. Pani-prob filmleri daha kararlı ve uzun süreli depolamadan sonra da kullanılabilir. Bu sensör teknolojisinin bir sınırlaması multiplexing'i için son derece müsait olmamasıdır. Her tespit olayı ayrı bir tüp içinde gerçekleştirilmelidir. filmler olabilirfarklı prob bir filmin farklı bölgelerinde lekeli olabilir olarak çoklama için daha iyi bir biçim sağlar. Bir numune Noktası dizi üzerinde uygulanabilir ve her bir noktada floresans farklı gen ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılır.
Burada tarif edilen algılama mekanizması, diğer sistemlere göre pek çok avantaj sağlar. Pani kapsayan bir ayrışma mekanizması yoluyla nükleik asitleri tespit Raporlar DNA oligos 5 prob bağlı fluorophores güveniyor. Diğer stratejiler hedef nükleik asitler 16-17 tek baz-çift farkı ayırt başarısız problar, kovalent bağlanmasını kullanır. etiketleme veya bu teknolojinin algılama diğer ikincil modları ihmal elektro-aktif PANI diğer özelliklerini kullanmak için fırsatlar yaratır. Sensör tepkisi dolayısıyla sensörün eki-sıyrılma dinamikleri tarafından değiştirilmiş elektrokimyasal özelliklerinin ölçümü için uzun olabilir. Bu tekniği benimseyen Labs s bulacaksınızEnsor sistem, hızlı ve kolay yanı sıra maliyet etkili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
- Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
- Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498 (2013).
- Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
- Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
- Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569 (2011).
- Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
- John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
- El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
- Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
- Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
- Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
- Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
- Kadashchuk, A., et al.
- Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
- Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).
