Summary
공구 한정 담즙산 흡수 장애를 진단 및 생체 내 담즙산 수송을 측정한다. 살아있는 동물에서 혁신적인 접근 결합 양성자 (1H) - 플러스 불소 (F 19), 자기 공명 영상을 이용하는 것이 기재되어있다; 이 새로운 방법은 임상에서 담즙산 흡수 불량을 선별하는 병진 가능성이있다.
Abstract
지방 흡수를 촉진 세제 등의 전통적인 역할과 함께, 문학 신흥 것은 담즙산이 여러 장기에 영향을 미치는 강력한 신호 분자가 있음을 나타냅니다; 이들은 장 이동성 및 호르몬 생산을 조절하고, 혈관 톤, 포도당 대사, 지질 대사 및 에너지 사용량을 변경. 배설물 담즙산의 변화는 장내 마이크로 바이 옴을 변경하고 cholerrheic 설사와 대장 암을 포함한 대장 병리를 촉진 할 수있다. 배설물 담즙산 조성의 주요 규제는 소장 혀끝 나트륨에 의존하는 담즙 산 수송기 (ASBT)와 섬유 아세포 성장 인자 19 (FGF19)에 있습니다. ASBT의 감소 표현과 기능은 장내의 담즙산가 테이크 감소한다. 또한, 시험 관내 데이터는 일부 FDA 승인 약물 ASBT 기능을 억제하는 것이 좋습니다. 결핍 FGF19 자료는 간에서 담즙산의 합성을 증가시키고 ASBT을 압도 수준으로 장내에 놓습니다. 어느 ASBT 장애 또는 FGF19 결핍은 F 증가ECAL 담즙산과 만성 설사의 원인이 대장 종양을 촉진 할 수있다. 안타깝게도 도구 담즙산 흡수 장애와 생체 내 담즙산 수송에 대한 약물의 작용을 측정하는 것은 제한적이다. 담즙산의 복잡한 작업을 이해하기 위해 기술은 소화관 및 대사 조직에서의 담즙산의 동시 모니터링을 허용하는 것이 요구된다. 이 양자 (1 H) 및 불소 (F 19), 자기 공명 영상 (MRI)의 조합을 사용하여 살아있는 동물에서 담즙산 수송을 측정하는 혁신적인 방법을 생각할하라고했다. 불소 (F (19))에 대한 신규 한 트레이서 시험 관내 및 생체 내 모두에서 살아있는 동물 MRI 만들고 기반 시험 하였다. 이 방법의 장점은 임상 연구와 실천에 대한 조사 및 번역 가능성을 이온화에 노출의 부족을들 수있다.
Introduction
장내에서 지방 흡수를 촉진 세제 그들의 고전적인 역할과 함께, 담즙산은 장간 순환 1, 2와 관련된 것 외에도 여러 장기에 영향을 미치는 강력한 신호 분자로 등장했다. 자신의 대사를 조절하는 것 외에도, 담즙산 위장 생리학 (예, 장 이동성 및 인크 레틴 호르몬 생산 대장 생리학 암 감수성)의 여러 부분을 조절하고, 혈관 톤, 글루코스 및 지질 대사 및 에너지 활용에 전신 효과를 갖는다. 이들 효과의 일부는 장내 매개 동안 비만 환자 또는 위암 바이 패스 수술 후 바와 같이, 다른 전신 담즙산 식후 수준의 변화에 기인한다. 위장관 메타 다른 해부학 구획 담즙산 농도의 동시 모니터링을 허용하는 새로운 기술이 요구되는 담즙산의 복잡한 대사 활동을 해명쌍곡선 조직 (간, 췌장, 골격근 및 지방). 이러한 시간과 공간 정보를 얻기 혁신적인 기술을 필요 - 생체 내 이미징에 여기에 설명 된 이러한 새로운 접근 방식으로 새로운 담즙산 추적기를 사용.
해부학 구획에서 담즙산 조성과 분포는 자신의 간 합성 및식이 요법, 수술, 항생제 사용 및 장내 식물의 변화를 포함 회장 흡수를 조절 인자에 의해 조절된다. 그 장간 순환 3 (도 1)에 대한 창자 담즙산 흡수 키 레귤레이터는 회장 혀끝 나트륨 - 의존성 담즙산 수송기 (; SLC10A2 ASBT)이다. 수동 흡수 장내 걸쳐 발생하지만, ASBT가되도록 일반적으로 대변 담즙산 제한된 유출가 창자 담즙산의 95 % 흡수를 매개한다. Asbt 결핍 (SLC10A2 - / -) 쥐 배설물 담즙산과 감소 된 담즙 ACI를 증가D 풀 4.
그림 1 : 담즙 산의 장간 순환.
담낭에 저장된 담즙 나무로 배뇨 담즙 산은 간에서 합성되어있다 장간 순환의 그림, 식사와 함께 근위 소장에 출시, 적극적으로 원위부 회장에 ASBT를 통해 흡수. 담즙산 소량이 소화관 전체에 수동적으로 흡수되는 반면, 창자 담즙산의 약 95 %는 새로운 담즙산 합성 유사한 양에 의해 보상된다 대변 최소한 (약 5 %)의 손실을 초래 ASBT 의해 적극적으로 반송되고 간장하여 정상 상태 담즙산 풀을 유지. 우측의 화살표는 위산, 췌장 및 소장 점막 효소, 그리고 가장 importantl 포함한 천연 불소 표지 된 담즙산의 안정성에 영향을 미칠 수있는 요인을 파악원위부 소장과 대장에 정착 클로스 트리 디움 종 발표 한 Y, 가수 분해 효소. (허가 16 수정) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
담즙산 흡수 장애함으로써 간헐적 또는 만성 설사를 일으키는 분변 히드 담즙산 증가 각각의 세 가지 유형으로 분류 될 수있다. 총 회장 병리학 (예를 들면, 절제, 크론 병) 5 1 결과를 입력합니다. 담낭 절제술, vagotomy, 체강 질병, 세균 증식 및 췌장 부전에서 3 개의 결과를 입력합니다. 그들은 같은 선행 조건이 부족하고 회장에서 병리학의 증거가 없기 때문에 대조적으로, '주'(유형 2) 담즙산 흡수 장애를 가진 사람들은 강력한 진단 도전을 제기. 따라서, 차 담즙산 흡수 장애는 일반적으로 설사-P으로 오진된다redominant 과민성 대장 증후군 (IBS-D), 소화기 관련 외래 환자 방문을 아마도 가장 일반적인 이유. IBS-D 환자의 3 차 담즙산 흡수 장애를 가질 것으로 예상되었다; 미국에서,이 수백만 명 5를 나타낼 수있다. 최근 통찰력 차 BAM하지 감소 식 또는 ASBT의 함수에서, 장 섬유 아세포 성장 인자-19 (FGF19)에 의한 간 담즙산 합성의 장애 피드백 억제에서 파생 나타냅니다.
ASBT 포함 창자 담즙산의 생성 증가 포화 담즙산 수송을하고, 배설물에 담즙산 증강 유출 설사 6 발생 - 기본 담즙산 흡수 장애에서, FGF19 낮은 혈장 농도는 간 담즙산 합성을 차단하지 (그림 2). Fgf15 (쥐 FGF19) 결핍 마우스는이 담즙산 풀을 확장하고 대변 담즙산 (7) 증가했다.
그림 2 : 장내 담즙산 흡수 불량의 메커니즘.
패널 (A)에 도시 된 바와 같이, 일반적으로, 창자 담즙산의 약 95 %가 ASBT 통해 원위 회장에 능동 수송에 의해 흡수된다. ASBT 발현 또는 활성 (패널 B), 대장으로 담즙산의 유출에 장애가 창자 담즙산 흡수 결과 감소되는 경우. 장애인 FGF19 신호 (패널 C)으로, 콜론으로 담즙산의 유출과 ASBT 전송 용량을 압도 장내 담즙산의 농도 증가에 간 담즙산 합성 결과의 피드백 억제의 부족. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.
장기, 배설물 담즙 ACI 만성 상승DS는 대장 종양을 촉진 할 수있다. 결장 종양 유전자의 체세포 돌연변이 있지만 가속이 프로세스를 보강 할 수있다 분변 담즙산 증가 환경 요소와 연관된 프로그레시브 점막 이형성증에서 발생한다. 설치류에서 하나 외인성 관리 또는 Asbt 결핍의 결과로 대장 이형성증과 종양 형성 8-10을 촉진 대변 담즙산 증가했다.
특히 도발적인 결과는 식품 의약품 안전청 (FDA)의 승인을 일반적으로 사용되는 약물은 강력하게 체외 11 ASBT하여 담즙산 수송을 억제하는 것을 나타낸다. 이들 약물은 생체 내에서 작은 창자 담즙산 수송을 감소시키고 배설물 담즙산 농도를 증가하면 대장 병리에 미치는 잠재적 영향에 관한 것이다. 결장 병변 심지어 작은 증가는 중요한 건강 영향을 줄 수있는 이러한 약물의 사용에 기인. 체외 결과와 역학 산부인과에서 이들의 타당성을 평가할 수있는 툴킷servations는 시판 후 안전성 시험 등의 추가 연구를 박차를 가할 것입니다.
필요성에도 불구하고, 실제적인 분석은 담즙산 흡수 장애를 가진 사람들이 부족 식별합니다. 배설물 담즙산의 직접 측정은 복잡 비현실적, 5 신뢰할 수없는로 년 전에 거부되었습니다. 대안 적 방법은 방사성 셀레늄 표지 콜산 유도체 (75 SeHCAT) 및 7α 하이드 록시 -4- cholesten -3- 온 (C4) 또는 담즙산 결합제의 치료 시험의 혈장 수준의 유지를 측정하는 것을 포함한다. 75 SeHCAT 테스트를 갖는다 진단 테스트에서 또한 미국에서 사용하기에 제한적인 유럽의 가용성 및 FDA 승인되지 않았거나 사용할 수 있습니다, 심지어 겸손 방사선 노출 (0.26 mSv를 / 75 SeHCAT 시험) 문제를 제기하고, 세균 증식 및 고급 간 질환은 75 SeHCAT 결과를 혼동 할 수 있습니다. C4 테스트는 플라즈마가 요구되기 때문에 잠재적 매력적이지만 낮은 포지티브 예측 브로있다UE 및 테스트 널리 사용할 수 없습니다. FGF19의 혈중 농도를 측정하는 것은 유사한 제한 사항이 있습니다. 자주 임상 담즙산의 치료 시험에 의존하지만,이 방법은 담즙산 흡수 장애 (5)의 확실한 진단을 제공 할 수 없다.
이러한 이유로, 신규 MRI 방식 혁신적인 다중 불소화 담즙산 (MFBA-MRI)를 사용하여 생체 내 담즙산 수송 및 분포를 측정하도록 고안되었다. 불소 (19 F) 100 % 자연 존재비의 안정된 동위 원소의 세 개의 원자를 함유 MFBA는 네이티브 담즙산 (12)와 마찬가지로 반송되고, 양자 (1 H) 및 불소 (의 조합 담즙산 수송을 시각화하는데 사용될 수있다 19 F) MRI, 방사선 노출 (13, 14)를 이온화없이 민감한, 안전한 방법.
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Protocol
다음 프로토콜 (2015년 6월 18일 승인 IACUC 프로토콜 # 0415011) 의학 메릴랜드 학교의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 가이드 라인을 준수합니다.
19 F-레이블 담즙 산 1. Gavaging 마우스
- 150 ㎎ / ㎏ 체중 19 F 표지 담즙산과 위관 마우스. 19 F 표지 담즙산 원액 [콜산 트리 플루오로 아세틸 리신과 필요한 부피 1 mL를 주사기를 채우기 (CA-LYS-TFA, 1 : 1의 폴리에틸렌 글리콜 400 : 둘 베코 인산염 완충 식염수) 또는 cholylsarcosine- 트리 플루오로 -N- 메틸 아세트 아미드 (CA-SAR-TFMA]. 60 % 폴리에틸렌 글리콜 400, 40 % 둘 베코 인산염 완충 식염수] 및 20 게이지 1.5 인치 곡선 전구 스쳐 위 위관 니들을 부착 확인 위관 영양법 바늘을 만들기에 바늘의 허브까지 식도 내에 삽입 할 때 마우스의 연골 xyphoid의 수준에 도달 할 정도로 길다
- 단단히 g엄지와 검지 손가락 사이의 목 뒤쪽에 느슨한 피부로 동물을 초조하고, 허리와 꼬리에 피부를 파악하는 나머지 손가락을 사용합니다.
- 수직으로 마우스를 잡고 측면을 따라 위관 바늘과 식도로 위장으로 내려 입의 지붕을 전달합니다. 저항에 밀어하지 않습니다 - 저항 인두에 발생하면 동물이 그것을 '제비'까지, 바늘의 위치를 변경.
- 마취가 위관 영양을 위해 필요한 경우, 5 ml의 이소 플루 란과 가까운을 포함하는 벨 항아리에 마우스를 놓습니다. 마우스가 옆으로 떨어지면, 7 초를 기다려야 마우스를 제거하고 위관을 수행합니다. 마취 증기로부터 작업자를 보호하려면 한 흄 후드에서 벨 항아리를 사용합니다.
- 동물이 몇 분의 이소 플루 란을 복구 관찰한다.
이소 플루 란이 간에서 대사되기 때문에, 그대로 약물 또는 그 대사 산물로부터 나오는 불소 신호가 시스템에 담즙 분비 및 담낭 FLUO 혼란 수 참고에피네프린은 19 F 표지 담즙산 (15)로부터 신호를 보낸다. 대안은 케타민 플러스 자일 라진을 (용량 섹션 3.1 참조)를 사용하는 것입니다.
2. 수확 담낭, 액체 크로마토 그래피 / 질량 분석을 사용하여 담즙 산성 측정을위한 간 및 혈액
- 장기를 수확하기 전에 적어도 6 시간 동안 최대 담낭 작성, 빠른 쥐를 달성했다. 인산염 완충 식염수에 케타민과 자일 라진을 준비합니다 (100 ㎕를 케타민, 62.5 μL 자일 라진, 840 ㎕의 PBS).
- 1 ㎖의 멸균 주사기를 사용하여, 케타민 / 자일 라진 용액 (150 mg을 케타민 체중 kg 당 18 mg을 자일 라진) 15 μL / g 체중으로 종래 장기 수확 마우스의 피하에 1 시간 주입.
- 케타민 / 자일 라진을 투여 한 후 한 시간은 발가락 핀치에 의한 적절한 마취를 확인하고 마취 마우스 부정사를 놓습니다.
- xyphoid 및 Fi에 치골에서 중간 선 복부 피부 절개를 만들기 위해 5 또는 6 인치 가위를 사용하여북동 가위 (4 인치) 복막 안감을 잘라 복부 장기를 노출하기 - 다이아 프램을 관통하지 않습니다.
- 5 인치 클램프와 xyphoid 과정을 잡고 위쪽 복강을 노출하는 가슴을 가로 질러 다시 올립니다. 담낭 노출 해부 따로 간을 이동하는 집게와 둔기를 사용합니다.
참고 : 간을 가르기 또는 이전으로 담낭을 만지지 마십시오 심각한 출혈의 원인이되고 후자는 담낭의 수축과 비우는을 자극 할 수있다. - 담관 걸쳐 4 인치 클램프 배치 (도 3의 화살표 점선). 다이어프램에 담낭의 우수한 극을 부착 인대를 잘라 부드럽게 복부의 오른쪽으로 담낭 이동합니다.
그림 3 : 마우스 담낭의 해부 및 양성자 자기 공명 영상보기.
왼쪽 패널은 노출 MOUS를 보여줍니다복부 절개 후 정중선의 왼쪽에있는 전자 담낭. 클램프는 xyphoid 프로세스를 파악했다. 담즙 가득 공복 담낭은 점선 화살표로 큰 화살표와 고정 담관으로 표시됩니다. [인세 : 절제는 담관에 그대로 담낭은 고정. 눈금자는 밀리미터 (mm)로 표시됩니다.] 오른쪽 패널은 금식 쥐의 담낭 (화살표)의 고해상도 양성자 밀도 가중 MRI 이미지를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 담낭은 심장 천자, 수확 혈액을 수행하고 안락사를 확인하기 위해 동물에게서 피를 뽑다 절개하기 전에.
참고 : 심장 혈관 붕괴와 적절한 혈액 샘플을 얻기 위해 실패 (≥ 200 μl를) 원인 간을 가르기 수 있습니다 먼저 담낭을 수확. - 왼쪽 다이어프램의 아래쪽을 노출하고심장의 박동 표면을 식별합니다. 최대 심장 맥동의 시점에서 1 ml의 주사기에 부착 된 23 게이지 바늘을 격막과 심장 천공.
- 흡입하면서 천천히 주사기를 철회. 혈액이 주사기를 채우기 위해 시작되면 인출을 중지하고 0.2 수집 흡입을 유지 - 0.6 ml의 혈액을. 조심스럽게 바늘을 회전하거나 중단하는 경우 흐름을 다시 설정할 수 있습니다 약간 철수.
- 15 분 동안 2,000 XG에서 1.5 ml의 헤파린 튜브와 원심 분리기에 피를 전송합니다. 10 분 동안 12,000 × g으로 4 개의 파트 아세토 원심 분리로 혈장을 침전. 액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 (LC / MS / MS) 11-1312-1412-1412-1412-14하여 상층 액을 분석합니다. 필요한 경우, 분석하기 전에 C O를 -80에서 플라즈마를 저장합니다.
- 무딘 절개를 사용하여 간에서 담낭 무료. 클램프 아래 담관을 가로로 쪼개다 제거하고 담낭 무게, 및 1.5 ml의 microcen에 배치trifuge 튜브. 간을 수확.
- 약 100 간 mg의 크기-21 유리 조직 균질 얼음에 전체 담낭을 균질화. 10 분 동안 12,000 XG에 75 % 아세토 니트릴, 25 %의 물 (간 800 μL, 담낭 300 μL) 원심 분리기로 추출한다. 필요 추출물을 희석하고, LC / MS / MS를 사용하여 11-13 담즙산 함량을 정량.
3. 살아있는 애완 동물 양성자 (1 H)와 불소 (19 F) 자기 공명 영상
- 이미징 전에 적어도 6 시간 동안 최대 담낭 작성, 빠른 쥐를 달성했다. 자일 라진 및 케타민을 사용 MRI 스캐너의 움직임을 방지하기 위해 쥐를 마취. 인산염 완충 생리 식염수 (130 ㎕를 케타민, 42.5 μL의 자일 라진, 827 ㎕의 PBS)에 케타민 플러스 자일 라진의 재고 솔루션을 준비합니다. MRI 전에 하나의 시간이 용액 5 μL / g 체중 (65 mg을 케타민 및 4.25 mg을 xylaz로 마우스에 피하 주사하는 1 ㎖의 멸균 주사기를 사용체중 kg 당 오프라인). 마취하에 건조가 동물의 눈에 수의학 연고를 적용하지 않도록합니다.
- 상기와 케타민 / 자일 라진으로 유도 한 후, # 40 또는 미세한 전기 클리퍼 블레이드를 사용하여 복부 마우스의 왼쪽 아래쪽에 1.5 cm 2 영역을 클립. 모피 제거 후, 8 지역 수험 - 12 % 희석 요오드 수술 스크럽 솔루션을 70 % 알코올로 씻어 - 두 단계를 반복합니다. 복강에 0.75 인치 바늘 / 카테터 피하 터널로 24 게이지를 삽입합니다. 확인 카테터는 플런저를 다시 잡아 당겨 맹장 또는 다른 복부 장기가 아닌지 확인 - 카테터에는 혈액이나 대변 물질이 없어야합니다.
- 바늘을 제거하고 복강 카테터를 둡니다. 자기 공명 영상 스캐너 동물 실의 온도 제어 열 패드에 마우스를 놓습니다.
- 인산염 완충 식염수에 케타민과 자일 라진을 포함하는 1 ml의 멸균 주사기 (1,000 μL 케타민, 300 ㎕의 자일 라진 준비, 6,700 μL PBS)와 72 인치 멸균 튜브의 원하는 길이를 입력합니다. 프리 필드 멸균 튜브에 복강 카테터를 연결하고 멀리 MRI 스캐너에서 그것을 확장 할 수 있습니다. 마우스의 활력 징후가 안정된 경우 마취는이 솔루션의 모든 20 분 50 μl를 주입 유지합니다.
참고 : 이미징 전에 어떤 금속은 MRI 스캐너 근처에없는 특정합니다. - 1 시간 동안 300.283 MHz 및 19 F 핵위한 282.524 MHz의 무선 주파수 신호를 송신 및 수신하기 위해 19 F / 1 H 이중 선형 조정 볼륨 MRI 코일을 사용한다.
- 빠른 로우 앵글 촬영 순서 (FLASH)를 사용하여 세 개의 슬라이스 (축, 중간 시상 및 관상) 스카우트 이미지 시스템 교정 (11), (13)과 동물의 현지화를 수행합니다. 실험을 시작하려면, 소프트웨어 콘솔의 검색 컨트롤 창에서 '신호등'버튼을 클릭합니다.
- 휴식과 빠른 획득이 향상 사용하여 멀티 나선형 1 H MR 영상 획득샘플 또는 반복 횟수 2,200 밀리과 동물의 몸, 에코 시간 8.9 밀리의 십자가 관점에서, 표준 (RARE) 시퀀스, RARE 요소 8,보기 4 × 4cm 2의 필드, 두께 1.0 mm, 매트릭스 크기 266 슬라이스 X 266, 평면 해상도 150 × 150 μm의 2, 실험을 시작하려면 평균 6 수, 소프트웨어 콘솔의 검색 컨트롤 창에서 '신호등'버튼을 클릭합니다.
- 반복 시간 1 H MRI의 동일한 영역에 FLASH 시퀀스를 사용하여 19 F 이미지를 획득 (220) 단말기, 플립 각 = 30 °, 에코 시간 3.078 밀리 매트릭스 크기 32 X 32 면내 해상도 1.25 X 1.25 mm (2) 'GOP'소프트웨어 콘솔의 분광계 제어 도구 창에서 (G O-O N- P ipeline) 버튼을 클릭, 두께 4.0 mm 슬라이스, 평균 768의 수는 실험을 시작하려면.
- MRI 후, 복강 내 injecti와 마우스를 안락사/ g의 15 μL에 체중 케타민 / 방혈위한 심장 천자 하였다 자일 라진 용액 (체중 kg 당 150 mg을 케타민 / 자일 라진 18 밀리그램).
- 마취에서 마우스를 복구하려면 복강 카테터를 제거하지만 흉골 드러 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오.
- 전술 한 바와 같이 장기 수확 19 F 표지 담즙산 농도를 측정하기 위해 11-13, 케타민 플러스 자일 라진으로 마취를 유지한다.
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Representative Results
실시간으로 생체 내 MRI에 대한 MFBA의 사용은 '볼'수 담즙산 교통 연구와 임상 모두를위한 큰 잠재력을 가지고있다. 또한, 담낭 절제술 및 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석법을 이용하여 내용의 생화학 적 분석을 위해 여기에 기술 된 방법은 이미징 결과를 확인하는 수단을 제공한다. 그러나, 이러한 방법의 유효성은 정확한 투여, 분석의 타이밍, 및 이미징 또는 수술 적 제거를위한 담낭의 현지화가 필요합니다. 후자의 경우, 마우스의 복부의 장기를 최대한 적게 교란하는 것이 매우 중요하다; 담낭의도 부드러운 조작이 수축 비우는을 자극 할 수 있습니다. 따라서, 그 전체 내용을 포착하기 위해서는, 가능한 한 빨리 담관 걸쳐 클램프를 배치하는 것이 중요하다.
, 수술 방법은 여기에 제안 된 담낭을 사용하여쉽게 복부의 오른쪽 윗부분에 간 오른쪽 전엽 (그림 3) 뒤에 확인해야합니다. 담낭을 건드리지 않고, 따로 간을 이동하면 클램핑에 대한 담관을 제공합니다. 이 클램프 자리에되면, 그대로 담낭을 제거하는 프로토콜에 설명 된 다른 단계를 진행하기 어려움이 없어야합니다.
표 1의 데이터는 담낭 (13, 14)에 MFBA의 매우 선택적 농도를 알 수있다. MFBA의 기관 (간 및 담낭) 농도 1 ㎍ / ㎖ (13, 14)의 밀도를 가정하여 계산 하였다. 경구 투여 7 시간 내에서 담낭에 MFBA의 평균 축적은 간 또는 혈액 (13, 14) 중 하나에서 관찰 된 것보다 더 높은 크기 (1,000 배)의 여러 주문했다; 밀리몰 수준은 간과 혈액 (표 1의 마이크로 수준에 비해 담낭에서 관찰되었다 </ STRONG>). 혈액에서 1.4 μM, 14.5 - - 간에서 78.8 밀리미터, 18.4 - 담낭에서 27.0 mM의 평균 MFBA 농도는 0.4에서였다. 이러한 연구 결과는 MFBA과 일치 생리적 담즙산과 같은 처리되고있다; 경구 투여 후, MFBA 적극적으로 담낭에서 농도 담즙 트리에 그들이 나트륨 / 타우로 콜산 공동 수송 폴리 펩타이드 (NTCP)에 의해 간세포에 능동 수송을위한 간으로 운반되어, 이에 장간 순환에 ASBT에 의해 수송, 배설된다 (그림 1).
그림 4는 MFBA와 위관 후 담낭에있는 19 F 신호의 시간에 따른 축적을 보여줍니다. 분석 방법을 사용하는 상세한 타임 코스 (LC / MS / MS)은 MFBA 피크 담낭 농도의 경구 투여 (12), 생체 역학과 함께 발견 일관된 후 7 시간 4의 범위에서 관찰되었다 지적담즙산의 장간 순환. 그림 4의 왼쪽 패널은 MRI를 이미지는 두 개의 인수 MFBA와 구강 투여 후 네 시간에 절반은 담관 (점선 화살표)로부터 나오는 더 강력한 신호로 보이는에서 나오는 19 F 신호를 보여준다 담낭 (화살표) 7 8.5 시간으로 담관 신호가 더 이상 검출되지 담낭 19 F 신호는 인접 MFBA 팬텀 (도 4, 오른쪽 패널 화살표)로부터 나오는 것과 동일한 강도로 증가했다.
우리는 담즙산 감소 장내 흡수를 검출 MFBA-MRI의 능력을 시험하기 Asbt 결핍 식 생쥐를 사용했다. 도 5a, Asbt 결핍 생쥐 쓸개 MFBA의 농도의 약 22 배 감소에 도시 된 바와 같이, LC 측정 하였다 / MS (13, 14); 그것이 번째 예상 된 이러한 연구 결과를 기반으로이 동물의 MFBA 19 F MRI 신호에서 검출 한계 이하로 될 것입니다. 도 5b에 도시 된 바와 같이, 담낭에서 나오는 강력한 19 F 신호는 야생형 마우스에서 검출 된 반면, 실제로, 상기 Asbt 결핍 마우스 (13, 14)에 상응하는 19 F 신호는 없었다. 이러한 결과는 MFBA 생리 담즙산과 동일하게 처리되도록하고 MFBA-MRI가 담즙산의 장 흡수 장애를 검출하는데 사용될 수 있음을 확인한다.
그림 4 : 대표 MFBA-MRI 이미지.
살아있는 생쥐의 실험 결과는 19 F의 재건 오버레이 (19) F 신호가 쥐의 담낭 (큰 화살표)에서 발산 것을 입증 한 H 이미지를 보여줍니다. 19 F 표지 담즙산의 알려진 농도를 포함하는 참조 팬텀이었다마우스 (왼쪽 화살표) 나란히 MRI 스캐너에 배치. 왼쪽 패널에서 점선 화살표는 담관에서 냄새가 나는데 19 F 표지 담즙산 신호를 나타냅니다. MRI는 그 이미지 수집이 완료 된 시간 (1.5 시간)에 시작된 19 F 표지 담즙산과 위관 후 시간이 각 패널 위에 기록했다. 예상 된 바와 같이, 담낭 시간으로 19 F 표지 담즙산 증가로 작성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 감쇠 MFBA-MRI 신호 Asbt 결핍 쥐의 담낭에서.
(A) 막대 그래프 LC 측정 MFBA의 농도 / MS / MS 약 생쥐 비교 Asbt 결핍 낮은 22 배임을 나타낸다d를 마우스를 제어 할 수 있습니다. (B)는 Asbt 결핍 마우스의 담낭 결석 MFBA-MRI 신호. 화살촉 19 F 표지 담즙산 팬텀 (왼쪽 패널) 및 팬텀 19 F MRI 신호 (오른쪽 패널)를 나타냅니다. 오른쪽 패널에서 화살표는 담낭에서 나오는 19 F 표지 담즙산 신호를 나타내고, Asbt 결핍 마우스 (오른쪽 패널)에 해당하는 19 F 표지 담즙산 신호가 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 담낭 무게 (mg)을 | MFBA 농도 | |||
| 담낭 (MM) | 간 (μM) | 플라즈마 (μM) | ||
| CA-리스-TFA | 25.2 ± 3.2 | 27.0 ± 2.4 | 78.8 ± 35.1 | 0.4 ± 0.2 |
| CA-SAR-TFMA | 29.2 ± 2.4 | 18.4 ± 1.6 | 14.5 ± 0.6 | 1.4 ± 0.1 |
표 1 : 19 F 표지 담즙 산의 쓸개, 간 및 플라즈마 농도에 대한 대표 값입니다.
평균 ± 표준 오차 (SE) 값은 담낭 무게와 쓸개, 간, 플라즈마 12, 13에 표시된 MFBA의 농도에 대해 표시됩니다. 표시된 숫자가 표시된 MFBA 150 ㎎ / ㎏ 체중으로 마우스 gavaging 후 5 시간 내지 7을 측정 하였다. 간과 혈장 마이크로 몰 농도에 비해 담낭에 MFBA의 밀리몰 농도를합니다. N은 = 3 마일CA-리스-TFA와 CA-SAR-TFMA 가치 당 5 쥐의 가치에 따라 CE 마크.
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Discussion
CA-LYS-TFA 및 CA-SAR-TFMA 및 나트륨 / 타우로 콜산 공동 수송 폴리펩티드를 발현 ASBT 인간 배아 신장 세포를 발현하는 안정하게 형질 Madin-다비 개과의 신장 세포를 사용하여 수송 관내 분석의 합성 (NTCP) 다른 곳 (13, 14)에 자세히 설명되어 있습니다. 여기서 초점은 살아있는 동물 MRI에 의해 담낭에 MFBA 이미징, 특히, MFBA 내용의 분석을위한 쓸개, 간, 혈액 수확 한 다음 동물을 살고 위관에 의해 MFBA의 경구 투여에 있고. 중요한 단계는 19 F 신호 경쟁 만들 수 불소계 마취제 회피 담낭 수축 될 수 담관 클램핑 및 장기를 적출하기 전에 비워 전에 담낭 조작을 방지하고, MRI 스캐너 근처 금속의 배치를 회피 포함한다.
여기에 다른 곳에서 13,14 설명 된대로, MFBA-MRI는 큰 잠재력 t이O 성공적 정상 및 비정상 생리 학적 조건하에 생체 내에서 모두 담즙산 수송을 분석한다. MFBA-MRI의 주요 장점이 더 전리 방사선 MFBA 마우스와 달리 (정맥 천자없이 경구 투여 (비 방사성 플루오르 나 MRI 방사선 이온화 방사가 자연적으로 표지도 MFBA)를 포함 없다고되어 대부분 인간은 비경 구 투여를 필요로하지 마취제 나 진정제의)가 MRI 스캐너의 동 잡음을 방지합니다. 장내 미생물 (13, 14)에 의해 가수 분해 저항하는 합성 담즙산과 가수 분해 담즙산의 교체, 장내 MFBA의 생체 내 안정성에 관한 문제를 극복 할 수 있습니다. MFBA의 초기 프로토 타입 콜산 분자 당 세 개의 불소 원자를 첨가 관여 클로스 트리 디움으로 장내에서 가수 분해되어 자연적으로 인체 담즙산 13,14 가수 분해. 사르코에 기초한 신규 한 트리 플루오르 담즙산, CA-SAR-TFMA,박테리아 효소에 의해 가수 분해에 내성 백본 MFBA 13,14의 반감기를 연장이 한계를 회피.
마지막으로, 잠재적 경쟁 방법, N- 메틸 - [11 C] PET / CT 용 cholylsarcosine의 사용은 방사성 담즙산과 CT 및 준비 선박 및 방사성을 저장할 필요가 모두에서 방사선 노출에 의해 제한된다 담즙산 17.
이 신규 한 방법에 대한 변형 및 문제에 관해서는, 하나의 기인 19 F 표지 된 담즙산 또는 이의 생물학적, 화상 취득의 타이밍 또는 불충분 한 충전에 문제가있을 수 담낭에서 나오는 MRI 검사 신호를 검출하지 못하면 고려할 수 담낭의. 상술 한 바와 같이, 우리는 자신의 능력으로 이들 제제의 구조적 무결성을 테스트 적합한 담즙산 수송 체를 발현하는 세포주에 의해 시험관 내에서 반송한다. 우리는 적어도 1.5 시간을 허용이 기간 영상 획득을위한 그러나 어떤 경우에는 r은 확장이 필요할 수 있습니다. 우리는 금식 쥐 사전 MRI는 최대 담낭 충전이 중요하기 위해 것을 찾을 수 있습니다.
19 F-MRI 신호를 검출 한계는 90 동물 이미징 필요 - 적절한 신호 획득을위한 120 분; 이것은 실제 임상 시험을 위해 너무 긴 것 같다 - 환자가 그 기간 동안 MRI 스캐너에서 여전히 거짓말을해야합니다. 또한, 현재, 임상 MRI 양성자 (1H) - 촬상에 주로 의존한다; 불소의 응용 프로그램 (19 F) 이미징 하드웨어에 대한 투자 (19 F 코일) 및 소프트웨어, MRI 스캐너 당 적어도 $ 25 만 투자가 필요합니다. 다른 불소계 MRI 애플리케이션은 담즙산 흡수 장애를위한 환자를 평가 MFBA-MRI를 사용하여 개발 될 때까지 비용 효과적 일 것 같지 않다.
MFBA-MRI 75 SeHCAT 유지율을 측정하는 유망한 대안을 제공하며, 플라즈마 7α 하이드 록시 -4- -cholesten -3- 온 (C4), 및 플라즈마 FGF19 또는 담즙산 결합제를 사용하여 치료 시험을 수행하는 단계를 포함한다. 방사선 노출을 포함 미국, 75 SeHCAT 테스트에서, FDA는 승인되지 않습니다. C4 및 FGF19 시험은 낮은 포지티브 예측이 테스트는 전문 연구소를 통해 현재 사용할 수 있습니다. 또한, C4 및 FGF19 수준 모두 담즙산의 간 합성을 반영합니다. 따라서 MFBA-MRI 달리, 이러한 테스트는 변화된 발현 또는 회장 담즙산 수송 또는 증가 담즙산 합성 무관 담즙산 흡수 장애의 다른 메커니즘의 돌연변이를 검출 할 수 없다. 담즙산 결합제의 치료 시험은 유용하지만 불확실성 예측값을 가지며 담즙산 흡수 장애 (5)의 확실한 진단을 제공 할 수있다. 배설물 담즙산의 직접 측정이 겉으로는 합리적이지만 마지막이 너무 복잡 비현실적, 일상적인 임상 사용 5 신뢰할 수없는로 년 전에 거부되었습니다.
혁신적인 접근법 (만성 설사의 원인으로 담즙산 흡수 장애의 진단, 예)는 병원에서 생체 담즙산 수송 측정로 번역 될 수 있도록 ENT "> 추가의 도전을 극복해야한다. 주요 과제는 최대화하는 즉, 인해 추가 19 F 원자가 너무 부피가 담즙산 분자 중 하나에 의해 운반되지 천연 담즙산처럼 행동 MFBA의 능력을 방해하지 않고 담즙산 분자 당 19 F 원자의 수를 증가시킴으로써 신호 강도 간에서 ASBT 또는 담즙산 수송. 시험관 내에서 반송되는 신규 MFBA의 능력은 중요한 인간 담즙산 수송 체 (13, 14)를 발현하는 세포주에서 시험 될 수 있고, 생체 내에서 전송을 예측해야한다. 증가 된 감도 MFBA-MRI로 전체 담즙 나무 (예, 담관 및 분기)의 개선 된 이미징을위한 잠재력을 갖고 이와 관련하여, 능력 t오 이미지 일부 마우스에서 담관이 약속 나타납니다 (그림 4, 왼쪽 패널).MFBA-MRI에 의한 담즙산 검출 전류 제한을 향상시킬 수있는 기술의 민감성을 가정하면, 단지 담낭 자신의 시각화를 허용하지만 적절한함으로써 광범위한 공간을 제공 MFBA-MRI는 생체 내 담즙산 수송 및 분포를 측정하는데 사용될 수있다 예상 실시간으로 정보 해부학; 분자 이미징을 향상 것 인 수 있도록 기술. MFBA-MRI는 유전자 다형성 담즙산 수송 기능을 저해 약물의 효과를 평가하기위한 새로운 기술을 제공하는 것이다. MFBA-MRI는 임상 담즙산 흡수 불량을 선별하여 증가 배설물 담즙산 (예를 들면, 설사 모방 과민성 대장 증후군)로 인한 질병을 파악하고 관리하는 데 도움이 번역 가능성이있다. 마지막으로해야이 기술은 좋은 프로가 임상 적으로 사용할 수있게됩니다미장센 분변 담즙산의 변화에 의해 영향을받을 수 결장 종양 또는 다른 조건 인 장내에서 변경 담즙산 흡수를 식별 할 수있는 능력을 제공함으로써 정확한 의학 발전을 가속화한다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국립 연구소, 당뇨병과 소화기의 국립 연구소 및 신장 질환 (허가 번호 JP.R.에 R21 DK093406 및 T32 DK067872) 및 (JP.R.에 허가 번호 1BX002129)는 VA 훈장 수상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Duall size-21 all glass tissue grinder | Kimble Chase Life Science, Vineland, NJ | 885351-0022 | |
| Bruker BioSpec 70/30USR Avance III 7T horizontal bore MR Scanner | Bruker Biospin MRI GmbH, Germany | Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5) | |
| Bruker 40 mm 19F/1H dual-tuned linerar volume coil | Bruker Biospin MRI GmbH, Germany | Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5) | |
| Waters Acquity UPLC System with Quadrupole Detector | Waters Corporation, Milford, MA | ||
| Waters Acquity UPLC ethylene bridged hybrid C8 1.7 μm 2.1 x 50 mm column | Waters Corporation, Milford, MA | ||
| Gavage Needle | Braintree Scientific, INC. | N-010 | 20 G-1.5" curved 2.25 mm ball |
| 2 Stainless Steel Hemostats | VWR | 10755-018 | 4 and 5 inch, straight |
| Ketamine | MWI Veterinary Supply | 501090 | Ketamin zetamine 100 mg/ml |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 20 mg/ml | |
| Intraperitoneal Catheter | Abbott | AbbocathTM-T.I.V. G720-A01 4535-42 | 24-G x 0.75" |
References
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