Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bruke Multi-fluorerte gallesyrer og Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/54597
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 2,6
1Department of Surgery, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 3Department of Radiology, University of Maryland School of Medicine, 4Food and Drug Administration, 5Department of Pharmaceutical Sciences, University of Maryland School of Pharmacy, 6VA Maryland Health Care System

Summary

Verktøy for å diagnostisere gallesyre malabsorpsjon og måle gallesyre transport in vivo er begrenset. En innovativ tilnærming i levende dyr er beskrevet som bruker kombinerte proton (1 H) pluss fluor (19 F) magnetic resonance imaging; denne romanen metodikken har translasjonsforskning potensial til å screene for gallesyre malabsorpsjon i klinisk praksis.

Abstract

Sammen med sin tradisjonelle rolle som vaskemidler som fremmer fettopptaket, nye litteraturen indikerer at gallesyrer er potente signalmolekyler som påvirker flere organer; de modulerer tarmmotilitet og hormonproduksjon, og endre vaskulær tone, glukose metabolisme, lipidmetabolismen, og energiutnyttelse. Endringer i fekal gallesyrer kan endre gut mikrobiomer og fremme tykktarms patologi inkludert cholerrheic diaré og tykktarmskreft. Nøkkel regulatorer av fekal gallesyresammensetning er tynntarm Apical Sodium avhengig gallesyre Transporter (ASBT) og fibroblast vekstfaktor-19 (FGF19). Redusert ekspresjon og funksjon av ASBT senker intestinale gallesyre-opp-ta. Videre in vitro data tyder på at noen FDA-godkjente legemidler hemmer ASBT funksjon. Mangel FGF19 utgivelsen øker levergallesyresyntese og slipper inn i tarmen til nivåer som overskygger ASBT. Enten ASBT dysfunksjon eller FGF19 mangel øker fecal gallesyrer og kan gi kronisk diaré og fremme kolon neoplasi. Dessverre, verktøy for å måle gallesyre malabsorpsjon og handlingene til narkotika på gallesyre transport in vivo er begrenset. For å forstå de komplekse virkninger av gallesyrer, er teknikker kreves at tillate samtidig overvåkning av gallesyrer i tarmen og metabolske vev. Dette førte oss til å unnfange en innovativ metode for å måle gallesyretransport i levende dyr ved hjelp av en kombinasjon av proton (1 H) og fluor (19 F) magnetic resonance imaging (MRI). Nye tracere for fluor- (19F) -baserte levende dyr MRI ble opprettet og testet, både in vitro og in vivo. Sterke av denne fremgangsmåten omfatter den manglende eksponering for ioniserende stråling og translasjonelle potensial for klinisk forskning og praksis.

Introduction

Sammen med sin klassiske rolle som vaskemidler som letter fettopptaket fra tarmen, har gallesyrer dukket opp som potente signalmolekyler som påvirker flere organer i tillegg til de som er forbundet med deres enterohepatisk sirkulasjon 1,2. I tillegg til å kontrollere sin egen metabolisme, gallesyrer modulere flere aspekter av mage-fysiologi (f.eks tarmmotilitet og inkretinhormon produksjon, tykktarm fysiologi, og kreft mottakelighet) og har systemiske effekter på vaskulær tone, glukose og lipid metabolisme, og energiutnyttelse. Mens noen av disse effektene formidles i tarmen, andre er på grunn av postprandial endringer i systemiske gallesyrenivå, som nevnt i overvektige pasienter eller etter gastric bypass operasjon. For å belyse de komplekse metabolske virkninger av gallesyrer ny teknologi er nødvendig, som tillater samtidig overvåking av gallesyrenivåer i forskjellige anatomiske avdelinger, i mage-tarmkanalen og metastoffskifte vev (lever, bukspyttkjertel, skjelettmuskulaturen og adipose). Innhenting slik tidsmessig og romlig informasjon krever innovative teknologien - in vivo avbildning ved hjelp nye gallesyre sporstoffer som er beskrevet her er en ny tilnærming.

Gallesyre sammensetning og fordeling i anatomiske avdelinger er regulert av faktorer som modulerer deres leversyntese og ileal opptak, inkludert kosthold, kirurgi, bruk av antibiotika og endringer i tarmfloraen. En viktig regulator av intestinal gallesyreopptak for deres enterohepatisk sirkulasjon 3 (figur 1) er den ileal Apical Sodium avhengig gallesyre Transporter (ASBT, SLC10A2). Selv om passiv absorpsjon skjer gjennom tarmen, medierer ASBT opptak av 95% av intestinale gallesyrer slik at normalt er det begrenset utslipp av gallesyrer i avføringen. Asbt-mangel (Slc10a2 - / -) mus har økt fecal galle syrer og en redusert galle ACId basseng 4.

Figur 1
Figur 1: enterohepatisk sirkulasjon av gallesyrer.
Illustrasjon av enterohepatisk sirkulasjon der gallesyrer syntetiseres i leveren, utskilles i Galle forfedre lagret i galleblæren, utgitt i den proksimale tynntarmen med måltider, og aktivt tatt opp via ASBT i Distal ileum. Mens små mengder av gallesyrer er absorbert passivt gjennom tarmen, er omtrent 95% av intestinale gallesyrer transporteres aktivt ved ASBT som resulterer i minimal (ca. 5%) tap i avføring som kompenseres ved en tilsvarende mengde ny gallesyresyntese i leveren, for derved å opprettholde en stabil tilstand gallesyrebasseng. Pilene på høyre identifisere faktorer som kan påvirke innfødte og fluor-merket gallesyre stabilitet, herunder magesyre, bukspyttkjertelen og tarmslimhinne enzymer, og, mest importantly, hydrolytic enzymer utgitt av clostridietypene at kolonisere distal tynntarm og tykktarm. (Modifisert med tillatelse 16) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Gallesyre malabsorpsjon kan kategoriseres i tre typer, som hver øker fecal dihydroksy gallesyrer, for derved å forårsake intermitterende eller kronisk diaré. Type 1 resultater fra brutto ileal patologi (f.eks, reseksjon, Crohns sykdom) 5. Skriv 3 resultater fra kolecystektomi, vagotomy, cøliaki, bakteriell overvekst, og bukspyttkjertelen insuffisiens. I motsetning til personer med "primær" (Type 2) gallesyre malabsorpsjon utgjør en formidabel diagnostisk utfordring fordi de mangler slike forutgående forhold og ikke har bevis for patologi i ileum. Derfor er hovedgallesyre malabsorpsjon ofte feildiagnostisert som diaré-predominant irritabel tarm syndrom (IBS-D), kanskje den vanligste årsaken til gastroenterologi relaterte polikliniske besøk. Det har blitt anslått at en tredjedel av pasienter med IBS-D har hovedgallesyre malabsorpsjon; i USA, kan dette representere flere millioner personer 5. Nyere innsikt viser at primær BAM stammer fra svekket tilbakemeldinger hemming av hepatisk gallesyresyntese ved tarm fibroblast vekstfaktor-19 (FGF19), ikke av redusert uttrykk eller funksjon ASBT.

I primærgallesyre malabsorpsjon, lave plasmanivået av FGF19 ikke klarer å stenge av levergallesyresyntese - den resulterende økningen i tarmgallesyrer syrer gallesyre transportører, inkludert ASBT, og utvidet søl av gallesyrer i avføringen forårsaker diaré 6 (Figur 2). Mus mangelfull i Fgf15 (murine FGF19) har en utvidet gallesyre basseng og økt fecal gallesyrer 7.


Figur 2: Mekanismer av Intestinal gallesyre malabsorpsjon.
Normalt, som vist i panel A, er omtrent 95% av intestinale gallesyrer absorbert av aktiv transport i den distale ileum via ASBT. Når ASBT ekspresjon eller aktivitet svekkes (panel B), svekkede intestinale gallesyre-opptak resulterer i utslipp av gallesyrer i kolon. Med nedsatt FGF19 signale (panel C), mangel på tilbakemeldinger hemming av hepatisk gallesyresyntese resulterer i økte konsentrasjoner av tarmgallesyrer som overskygger ASBT transportkapasitet søl av gallesyrer i tykktarmen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Langsiktig, kronisk heving i fecal galle ACIds kan fremme kolon neoplasi. Colon neoplasi oppstår fra progressiv slimhinneforandringer forbundet med somatiske genmutasjoner, men miljømessige faktorer som øker fecal gallesyrer kan akselerere og forsterke denne prosessen. I gnagere, økte fekale gallesyrer, enten som en konsekvens av eksogen administrering eller Asbt mangel fremme tykktarm dysplasi og tumordannelse 8-10.

Spesielt provoserende funn tyder på at de mest brukte legemidler godkjent av Food and Drug Administration (FDA) potent hemmer gallesyretransport av ASBT in vitro 11. Hvis disse legemidlene reduserer tynntarmgallesyre transport in vivo og øke fekal gallesyrenivå, vil den potensielle effekten på tykktarmen patologi være om. Selv en liten økning i tykktarmen patologi skyldes bruk av et slikt medikament kan ha et stort helse innvirkning. En verktøykasse som kan vurdere troverdigheten i disse in vitro funn og epidemiologiske observations ville anspore ytterligere forskning, blant annet etter markedsføring sikkerhetsstudier.

Til tross for behovet, til praktiske analyser identifisere personer med gallesyre malabsorpsjon mangler. Direkte måling av fekal gallesyrer ble avvist år siden som tungvint, upraktisk, og upålitelig 5. Alternative fremgangsmåter omfatter måling av retensjon av et radioaktivt selen-merket cholsyre-derivat (75 SeHCAT) og plasmanivåene av 7α-hydroksy-4-kolesten-3-on (C4), eller et terapeutisk utprøving av gallesyrebindemiddel. 75 SeHCAT testing har begrenset tilgjengelighet i Europa og er ikke FDA-godkjent eller tilgjengelig for bruk i USA Dessuten, selv beskjeden stråling (0,26 mSv / 75 SeHCAT test) fra diagnostiske tester gir grunn til bekymring, og bakteriell overvekst og avansert leversykdom kan forvirre 75 SeHCAT resultater. C4-testing er potensielt attraktiv ettersom bare plasma er nødvendig, men det har lav positiv-prediktiv value og testing er ikke allment tilgjengelig. Måling serumnivåer av FGF19 har lignende begrensninger. Vanlige klinikere ty til en terapeutisk utprøving av gallesyrekompleksdannere, men denne tilnærmingen kan ikke gi en definitiv diagnose av gallesyre malabsorpsjon 5.

Av disse grunner ble en ny tilnærming MRI unnfanget for å måle gallesyre transport og fordeling in vivo ved hjelp av nyskapende multi-fluorerte gallesyrer (MFBA-MRI). MFBA som inneholder tre atomer av fluor (19 F), en stabil isotop av 100% naturlig forekomst, blir transportert på samme måte som naturlige gallesyrer 12, og kan brukes til å visualisere gallesyretransport med en kombinasjon av proton (1 H) og fluor ( 19 F) MR, en følsom, sikker metode uten ioniserende stråling 13,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende protokoll følger retningslinjer godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Maryland School of Medicine (IACUC protokollen # 0415011, godkjent 18 juni 2015).

1. Gavaging mus med 19 F-Merket Bile Acids

  1. Gavage mus med 150 mg / kg kroppsvekt 19 F-merkede gallesyrer. Fyll en 1 ml sprøyte til det nødvendige volum med 19F-merket gallesyrestamløsning [cholsyre-trifluor-acetyl-lysin (CA-Lys-TFA; i 1: 1 polyetylenglykol 400: Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning) eller cholylsarcosine- trifluoro-N-metyl-acetamid (CA-sar-TFMA, i 60% polyetylenglykol 400 og 40% Dulbeccos fosfatbufret saltvann] og legge ved en 20-gauge 1,5-tommers buet pære-tipped gastrisk sonde nål Kontroller at sonde nål. er lang nok til å nå det nivået av musens xyphoid brusk når den settes inn i spiserøret opp til navet av nålen
  2. fast graspe dyret ved den løse huden på baksiden av halsen mellom tommelen og pekefingeren og bruke de resterende fingre for å gripe huden på den nedre del av ryggen og hale.
  3. Hold mus oppreist og passere gavage nålen langs sidene og taket av munnen i spiserøret og ned i magesekken. Hvis det oppstår motstand ved svelget, flytte nålen til dyr "sluker" det - ikke presse mot motstand.
  4. Dersom anestesi er nødvendig for sonde, plasserer du muse i en glassklokke som inneholder 5 ml isofluran og nær. Når musen faller på sin side, vent 7 sek, fjerne musen og utføre tvangsforing. For å beskytte personell fra anestesi damper, bruk bell jar bare i en avtrekkshette.
  5. Observere dyret gjenopprette fra isofluran i et par min.
    MERK: Siden isofluran metaboliseres i leveren, et fluor signal som kommer fra intakte legemiddel eller dets metabolitter utskilles i galle systemet og galleblæren kan forvirre fluoRine signaler fra 19 F-merket gallesyrer 15. Et alternativ er å bruke ketamin pluss xylazin (se avsnitt 3.1 for doser).

2. Høsting galleblæren, leveren og blod for gallesyre målinger ved hjelp av væskekromatografi / massespektrometri

  1. For å oppnå maksimal galleblæren fylling, rask mus i minst seks timer før høsting av organer. Forbered ketamin og xylazin i fosfat-bufret saltløsning (100 ul ketamin, 62,5 ul xylazin, 840 pl PBS).
  2. Ved hjelp av en 1-ml steril sprøyte, injiserer en mus subkutant 1 time før organ avling med 15 pl / g kroppsvekt av ketamin / xylazin oppløsning (150 mg ketamin og xylazin 18 mg per kg kroppsvekt).
  3. En time etter administrering av ketamin / xylazin bekrefte tilstrekkelig anestesi ved tå klype og plasser bedøvet mus liggende.
  4. Bruk 5 eller 6 tommers saks for å lage en midtlinjen abdominal hud snitt fra pubis til xyphoid og fine saks (4 tommer) til å kutte peritoneal fôr og utsette abdominal organer - ikke å pierce membranen.
  5. Ta tak i xyphoid prosessen med en 5 tommers klemme og løft tilbake over brystet for å avsløre den øvre bukhulen. Bruk pinsett og en stump gjenstand for å dissekere og bevege leveren til side, utsette galleblæren.
    MERK: Ikke rift i leveren eller berøre galleblæren som tidligere vil føre til alvorlige blødninger og sistnevnte kan stimulere galleblæren sammentrekning og tømming.
  6. Plasser en 4-tommers klemme over felles gallegang (figur 3, stiplede piler). Kutte ligament feste den overlegne pol av galleblæren til membranen og forsiktig flytte galleblæren til høyre side av abdomen.

Figur 3
Figur 3: Anatomiske og Proton MR Utsikt over Mouse galleblæren.
Det venstre panelet viser den eksponerte mouse galleblæren til venstre for midtlinjen etter abdominal innsnitt. Klemmen griper xyphoid prosessen. Gallefylte faste galleblæren er angitt med den store pilen og fastklemt felles gallegang ved de stiplede piler. [Innfelt: skåret intakt galleblæren med felles gallegang festet. Herskeren er merket i millimeter (mm).] Høyre panel viser en høy oppløsning proton tetthet vektede MR bilde av den faste murine galleblæren (pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Før excising galleblæren utføre hjerte punktering, høste blod, og exsanguinate dyret å verifisere aktiv dødshjelp.
    MERK: Høsting galleblæren første kan rift i leveren forårsaket kardiovaskulær kollaps og unnlatelse av å oppnå en tilstrekkelig blodprøven (≥ 200 mL).
  2. Expose undersiden av venstre membran ogidentifisere den vibrerende overflaten av hjertet. Ved punktet for maksimal hjertepulse punktere membranen og hjerte med en 23-gauge nål festet til en 1 ml sprøyte.
    1. Sakte trekke sprøyten mens aspirere. Når blodet begynner å fylle sprøyten, stoppe uttak og opprettholde suge å samle 0,2 til 0,6 ml blod. Forsiktig rotere nålen eller trekke det litt kan re-etablere flyt hvis det opphører.
    2. Overføre blodet til en 1,5 ml heparinisert rør og sentrifuger ved 2000 xg i 15 min. Utfelling av plasma med fire deler acetonitril og sentrifuger ved 12 000 xg i 10 min. Analyser supernatanten ved væskekromatografi / massespektroskopi (LC / MS / MS) 11-1312-1412-1412-1412-14. Om nødvendig, lagre plasma ved -80 o C før analyse.
  3. Ved hjelp av stump disseksjon, frigjøre galleblæren fra leveren. Transekt felles gallegang under klemmen, fjerne og veie galleblæren, og legg den i en 1,5 ml microcentrifuge tube. Høste leveren.
  4. Homogen omtrent 100 mg av leveren og galleblæren hele på is i et størrelse-21 glass vevshomogenisator. Ekstraher med 75% acetonitril og 25% vann (800 ul for lever, 300 ul i galleblæren) og sentrifuger ved 12 000 xg i 10 min. Fortynnet ekstrakter som er nødvendig og kvantifisere gallesyreinnholdet ved hjelp av LC / MS / MS 11-13.

3. Levende dyr Proton (1 H) og fluor (19 F) Magnetic Resonance Imaging

  1. For å oppnå maksimal galleblæren fylling, rask mus i minst seks timer før bildebehandling. Ved hjelp av ketamin og xylazin, bedøve mus for å hindre bevegelse i MR-skanner. Fremstille en stamoppløsning av ketamin pluss xylazin i fosfatbufret saltløsning (130 pl ketamin, 42,5 ul xylazin, 827 pl PBS). Én time før MR ved å bruke en 1 ml steril sprøyte til å injisere en mus subkutant med 5 ul / g kroppsvekt av denne oppløsning (65 mg ketamin og 4,25 mg xylazine per kg kroppsvekt). For å hindre tørrhet under narkose gjelder veterinær salve til dyrets øyne.
  2. Etter induksjon med ketamin / xylazin som ovenfor, klipp en 1,5 cm 2 området på venstre nedre halvdel av mus magen ved hjelp av # 40 eller finere elektrisk clipper bladene. Etter pels fjerning, prep området med 8-12% fortynnet jod kirurgisk skrubb og skyll med 70% alkohol - gjenta begge trinn. Sett inn en 24-gauge med 0,75-tommers nål / kateter subkutant og tunnel inn i bukhulen. Sørg for at kateteret ikke er i cecum eller andre mage organ ved å trekke tilbake på stempelet - det bør ikke være noe blod eller avføring i kateteret.
  3. Fjern nålen og la intraperitoneal kateteret. Plasser musen på en temperaturstyrt varmepute i MR skanner dyr kammeret.
  4. Tilbered en 1 ml steril sprøyte som inneholdt ketamin og xylazin i fosfatbufret saltvann (1000 mL ketamin, 300 ul xylazin, 6700 mL PBS) og fyll den ønskede lengden på 72-tommers sterile rør. Koble intraperitoneal kateter på den ferdigfylte sterile rør og utvide den bort fra MR skanner. For å opprettholde anestesi injisere 50 mL av denne løsningen hvert 20 min hvis muse vitale tegn er stabile.
    MERK: Før bildebehandling, gjøre visse ingen metaller er i nærheten av MR skanner.
  5. Bruk en 19 F / 1H dual-tunet lineær volum MRI coil å sende og motta radiofrekvenssignaler på 300,283 MHz for en H og 282,524 MHz for 19 F kjerner.
    1. Utføre systemkalibrering 11, 13 og dyr lokalisering med tre-skive (aksial, mid-sagittal og koronale) speider bilder ved hjelp av en fast lav vinkel skutt sekvens (FLASH). Å starte eksperimentet, klikker du på "lyskrysset" knappen i skanneStyring på programvaren konsollen.
    2. Acquire Multispiral 1 H MR-bilder ved hjelp av raske oppkjøp med avslapning forbedreling (RARE) sekvens i tverriss av prøven eller kroppen til dyret med repetisjonstiden 2200 msek, ekkotid 8,9 msek, SJELDNE faktor 8, synsfelt 4 x 4 cm 2, skjære tykkelse 1,0 mm, matrisestørrelse 266 x 266, in-plane oppløsning 150 x 150 mikrometer 2, og antall gjennomsnitt 6. å starte eksperimentet, klikker du på "lyskrysset" knappen i skanneStyring på programvaren konsollen.
    3. Erverve 19 F bilder med en FLASH sekvens i samme region av en H MR med repetisjon tiden 220 ms, flip vinkel = 30 °, ekko tids 3.078 ms, matrisestørrelse 32 x 32, in-plane oppløsning 1,25 x 1,25 mm 2, skjære tykkelse 4,0 mm, og antall gjennomsnitt 768. Slik starter eksperimentet, klikker du på GOP '(G o- O n- P ipeline) knappen i Spectrometer Control Tool vindu på programvare konsollen.
  6. Etter MR, avlive mus med intraperitoneal injectipå fra 15 pl / g kroppsvekt ketamin / xylazin oppløsning (150 mg ketamin / xylazin 18 mg per kg kroppsvekt), etterfulgt av hjertepunktering for blodtapping.
  7. For å gjenopprette en mus fra anestesi, fjerne intraperitoneal kateteret, men ikke la dyret uten tilsyn til det gjenvinner tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
  8. For å måle 19 F-merket gallesyrekonsentrasjoner 11-13 fra organ avling, opprettholde anestesi med ketamin pluss xylazin som beskrevet ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruken av MFBA for in vivo MR for å "se" gallesyretransport i sanntid har et stort potensial for både forskning og klinisk bruk. Videre er fremgangsmåtene beskrevet her for fjerning av galleblæren og biokjemisk analyse av dens innhold ved hjelp av væske-kromatografi og massespektrometri tilveiebringe et middel til å bekrefte avbildningsresultatene. Men gyldigheten av disse metodene krever nøyaktig dosering, tidspunkt for analyser, og lokalisering av galleblæren for avbildning eller kirurgisk fjerning. For sistnevnte, er det meget viktig at musens abdominale organer bli forstyrret så lite som mulig; milde manipulasjon av galleblæren kan stimulere sammentrekning og tømming. Derfor, for å fange hele dens innhold, er det viktig å plassere klemmen på tvers av den felles gallegang så snart som mulig.

Ved hjelp av den kirurgiske tilnærming foreslått her, galleblærenbør være lett identifiseres bak den høyre fremre flik av leveren i den øvre høyre kvadrant av abdomen (figur 3). Flytte leveren til side, uten å berøre galleblæren utsetter felles gallegang for fastspenning. Når denne klemmen er på plass, bør det ikke være noen problemer fortsetter med de andre trinnene som er beskrevet i protokollen for å fjerne galleblæren intakt.

Dataene i tabell 1 viser svært selektiv konsentrasjon av MFBA i galleblæren 13,14. Organ (lever og galleblæren) konsentrasjoner av MFBA ble beregnet ved å anta en tetthet på 1 g / ml 13,14. I løpet av 7 timer fra oral dosering, gjennomsnittlig akkumulering av MFBA i galleblæren var flere størrelsesordener (1000 ganger) høyere enn det som ble observert i enten lever eller blod 13,14; millimolar nivåer ble observert i galleblæren versus mikromolare nivåer i lever og blod (tabell 1 </ Strong>). Gjennomsnittlig MFBA konsentrasjoner varierte fra 0,4 - 1,4 mikrometer i blodet, 14,5 til 78,8 mm i leveren, og 18,4 til 27,0 mm i galleblæren. Disse funnene er i tråd med MFBA blir behandlet på samme måte som fysiologiske gallesyrer; etter oral dosering, blir MFBA aktivt transportert med ASBT inn i den enterohepatiske sirkulasjon hvorved de føres til leveren for aktiv transport inn i hepatocytter ved natrium / taurocholat ko-transporterende polypeptid (NTCP), og skilles ut i gallen treet for konsentrasjon i galleblæren (Figur 1).

Figur 4 viser tidsavhengige akkumulering av 19 F-signalet i galleblæren etter gavage med MFBA. En mer detaljert tidsforløpet ved hjelp av analytiske metoder (LC / MS / MS) indikerte at maksimal galleblæren konsentrasjoner av MFBA ble observert i området fra 4 til 7 timer etter oral dosering 12, en finne i overensstemmelse med de fysiologiske kinetikkenenterohepatisk sirkulasjon av gallesyrer. Det venstre panelet i figur 4, fått en MR-bilde to og en halv til fire timer etter oral gavage med MFBA, avslører 19 F signal som kommer fra det som synes å være den felles gallegang (stiplet pil) og en mer robust signal som utgår fra galleblæren (pil); ved 7 til 8,5 timer, blir den felles gallegang signal ikke lenger registreres og galleblæren 19F signalet har øket til samme intensitet som den som strømmer ut fra den tilstøtende MFBA fantom (figur 4, høyre panel, pil).

Vi brukte mus med mangelfull ekspresjon av Asbt for å teste evnen til MFBA-MR for å detektere redusert intestinal opptak av gallesyrer. Som illustrert i figur 5A, en tilnærmet 22-gangers reduksjon i konsentrasjonen av MFBA i galleblæren fra Asbt-manglende mus ble målt ved LC / MS 13,14; basert på disse funnene ble det forventet thved MFBA 19F MRI-signal i disse dyrene ville være under påvisningsgrensene. Faktisk, som vist i figur 5B, mens en robust 19 F signal som kommer fra galleblæren ble detektert i et villtype-mus, var det ingen tilsvarende 19 F signal i Asbt-manglende mus 13,14. Disse funnene bekrefter at MFBA behandles på samme måte som fysiologiske gallesyrer og at MFBA-MR kan brukes til å oppdage nedsatt opptak i tarmene av gallesyrer.

Figur 4
Figur 4: Representative MFBA-MR-bilder.
Resultater av eksperimenter i levende mus viser rekonstruksjon overlegg av 19 F og 1 H-bilder viser at 19 F signaler utgå fra murine galleblæren (store piler). Referanse fantomene inneholdende kjente konsentrasjoner av 19 F-merkede gallesyrer varplasseres i MR skanner sammen med musen (venstre pil). I venstre panel, indikerer den stiplede pilen 19 F-merket gallesyre signal som kommer fra felles gallegang. Innspilt over hvert panel er tiden etter sonde med 19 F-merket gallesyre som MRI ble startet til den tid da bildet oppkjøpet ble gjennomført (1,5 timer). Som forventet, galleblæren fylle med 19 F-merket gallesyre øker med tiden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: svekkede MFBA-MRI Signal fra gallbladders av Asbt-mangelfull mus.
(A) bar graf viser at konsentrasjonen av MFBA målt ved LC / MS / MS er omtrent 22 ganger lavere hos Asbt-manglende mus sammenligned å styre mus. (B) Fraværende MFBA-MR-signal fra galleblæren av en Asbt-mangelfull mus. Pilspisser viser 19 F-merket gallesyre fantomer (venstre panel) og 19 F MR signal fra fantomer (høyre panel). Pil i panelet øverst til høyre viser 19 F-merket gallesyre signal som kommer fra galleblæren; Det er ingen tilsvarende 19 F-merket gallesyre signal i Asbt-mangelfull mus (høyre panel lavere). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Galleblæren Vekt (mg) MFBA Konsentrasjon
Galleblæren (MM) Liver (mm) Plasma (mm)
CA-Lys-TFA 25,2 ± 3,2 27,0 ± 2,4 78,8 ± 35,1 0.4 ± 0.2
CA-sar-TFMA 29,2 ± 2,4 18,4 ± 1,6 14,5 ± 0,6 1,4 ± 0,1

Tabell 1: Representative Verdier for galleblæren, leveren og plasmakonsentrasjoner av 19 F-merket gallesyrer.
Gjennomsnitt ± standardfeil (SE) verdier er vist for galleblæren vekt og konsentrasjonene av den indikerte MFBA i galleblæren, lever og plasma 12,13. De angitte verdier ble målt 5 til 7 timer etter gavaging musene med 150 mg / kg kroppsvekt av den angitte MFBA. Legg merke til de millimolare konsentrasjoner av MFBA i galleblæren i forhold til mikromolare konsentrasjoner i lever og plasma. N = 3 mice per verdi for CA-lys-TFA og 5 mus pr verdi for CA-sar-TFMA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Syntesen av CA-Lys-TFA og CA-Sar-TFMA og den in vitro-analyse av deres transport ved hjelp av stabilt transfekterte Madin-Darby hundenyreceller som uttrykker ASBT og humane embryoniske nyreceller som uttrykker natrium / taurocholat ko-transporterende polypeptid (NTCP) er beskrevet andre steder 13,14. Her er det fokus på peroral administrasjon av MFBA med sonde til levende dyr, etterfulgt av høsting av galleblæren, leveren, og blod for analyse av MFBA innhold, og, spesielt, bildebehandling MFBA i galleblæren av levende-dyr MR. Kritiske trinn inkluderer å unngå fluorbasert bedøvelsesmidler som kan skape konkurrerende 19 F signaler, unngår galleblæren manipulering før fastklemming av felles gallegang som kan resultere i galleblæren sammentrekning og tømming før organet er skåret ut, og å unngå plassering av metallene i nærheten av MRI-skanner.

Som beskrevet her og andre steder 13,14, har MFBA-MRI stort potensial to hell analysere gallesyretransport in vivo i henhold til både normale og unormale fysiologiske betingelser. Store styrker av MFBA-MR er at det innebærer ingen ioniserende stråling (verken MFBA merket med naturlig forekommende, ikke-radioaktivt fluor eller MR avgir ioniserende stråling) er og MFBA gis oralt uten at venepunksjon (i motsetning til mus, vil de fleste mennesker ikke behøver parenteral administrasjon av bedøvelse eller beroligende midler for å hindre bevegelsesartefakter i MR skanner). Substitusjon av et hydrolyserbart gallesyre med et syntetisk gallesyremotstandsdyktige mot hydrolyse i tarmen mikroflora 13,14, kan overvinne problemer angående in vivo-stabilitet av MFBA i tarmen. Den innledende prototyp for MFBA involverte tilsetning av tre fluoratomer per molekyl av cholsyre, en naturlig forekommende human gallesyre som blir hydrolysert i tarmen ved clostridial hydrolaser 13,14. En ny tri-fluorerte gallesyre, CA-Sar-TFMA, basert på et sarkosinryggrad som er bestandig mot hydrolyse ved bakterielle enzymer omgått denne begrensning, og forlenger halveringstiden for MFBA 13,14.

Endelig er et potensielt konkurrerende metode, ved bruk av N-metyl- [11 C] cholylsarcosine for PET / CT, begrenset av stråling fra begge de radiomerkede gallesyre og CT, og behovet for å fremstille, skip, og lagre den radioaktive gallesyre 17.

Når det gjelder endringer og feilsøking for denne romanen metoden, kan man vurdere at unnlatelse av å oppdage en MR-signal som kommer fra galleblæren kan skyldes et problem med 19 F-merket gallesyre eller biotilgjengeligheten, timingen av bildet oppkjøpet, eller utilstrekkelig fylling av galleblæren. Som diskutert ovenfor, vi teste den strukturelle integriteten av disse midler ved deres evne til å bli transportert in vitro av cellelinjer som uttrykker de riktige gallesyre transportører. Vi tillater minst 1,5 timerr for image oppkjøpet, men i visse tilfeller varighet kan kreve forlengelse. Vi finner at fastende mus forhånds MR for å sikre maksimal galleblæren fylling er viktig.

Deteksjonsgrensene for 19 F-MR-signaler krever dyr bildebehandling for 90-120 min for tilstrekkelig signal oppkjøpet; Dette er trolig for lang for en praktisk klinisk test - pasienter må ligge stille i MR skanner for at varigheten. Også, avhengig strøm, klinisk MRI primært på proton (1H) avbildning; anvendelsen av fluor (19 F) bildebehandling vil kreve investeringer i maskinvare (19 F pole) og programvare, minst $ 250 000 investering per MR skanner. Inntil andre fluorbaserte MR-programmer er utviklet ved hjelp MFBA-MR for å vurdere pasienter for gallesyre malabsorpsjon er ikke sannsynlig å være kostnadseffektiv.

MFBA-MR gir et lovende alternativ til å måle 75 SeHCAT oppbevaring, plasma 7α-hydroxy-4 -cholesten-3-on (C4), og plasma FGF19, eller utføre en terapeutisk rettssak hjelp gallesyrebindemiddel. I USA 75 SeHCAT testing, som involverer stråling, er ikke FDA-godkjent. C4 og FGF19 testing har lav positiv prediktiv verdi og testing er for øyeblikket kun tilgjengelig gjennom spesialiserte laboratorier. Videre både C4 og FGF19 nivåer reflektere leversyntesen av gallesyrer. Derfor, i motsetning til MFBA-MRI, disse testene kan ikke påvise endret ekspresjon eller mutasjon av ileale gallesyre transportører eller andre mekanismer for gallesyre malabsorpsjon som er uavhengige av øket gallesyresyntese. Terapeutiske studier av gallesyrebindemiddel kan være nyttig, men har usikker prediktiv verdi og kan ikke gi en definitiv diagnose av gallesyre malabsorpsjon 5. Til slutt, selv om direkte måling av fekal gallesyrer er tilsynelatende rimelig dette ble avvist år siden som for tungvint, upraktisk, og upålitelig for rutinemessig klinisk bruk 5.

ent "> Andre utfordringer må overvinnes, slik at denne innovative tilnærmingen kan oversettes til å måle in vivo gallesyretransport i klinikken (f.eks for diagnostisering av gallesyre malabsorpsjon som en årsak til kronisk diaré). En stor utfordring er å maksimere signalintensitet ved å øke antallet av 19 F-atomer pr gallesyre-molekyl uten å forstyrre muligheten for MFBA til å oppføre seg som naturlige gallesyrer, det vil si, en gallesyremolekyl som er for voluminøse på grunn av tilsatte 19 F-atomer ikke vil bli transportert ved enten ASBT eller gallesyre transportører i leveren. muligheten av nye MFBA som skal transporteres in vitro kan testes i cellelinjer som uttrykker human viktige gallesyre transportører 13,14 og bør være prediktiv for in vivo transport. med økt følsomhet, MFBA-MRI har potensial for forbedret avbildning av hele gallegangstreet (som felles gallegang og dens grener), i denne forbindelse, er evnen to image felles gallegang i noen mus virker lovende (figur 4, venstre panel).

Selv om de nåværende grensene for gallesyre påvisning av MFBA-MR tillate deres visualisering bare i galleblæren, forutsatt at følsomheten til teknikken kan bli bedre vi forventer MFBA-MR kunne brukes til å måle gallesyre transport og fordeling in vivo for derved å tilveiebringe omfattende romlig informasjon anatomisk i sanntid; en slik teknologi som ville gå videre molekylær avbildning. MFBA-MR vil også tilby en roman teknologi for å vurdere virkningene av genet polymorfismer og legemidler som svekker gallesyre transporter funksjon. MFBA-MR har translasjonsforskning potensial til å hjelpe klinikere screene for gallesyre malabsorpsjon og dermed identifisere og håndtere sykdommer som følge av økt fekal gallesyrer (f.eks diaré som etterligner irritabel tarm syndrom). Til slutt, bør denne teknikken blir klinisk tilgjengelig det har stor promise å akselerere fremdriften i presisjon medisin ved å gi mulighet for å identifisere endrede tarmgallesyre opptak hos personer med kolon neoplasi eller andre forhold som kan påvirkes av endringer i fecal gallesyrer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health, National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer (tilskudds tall R21 DK093406 og T32 DK067872 til JP.R.) og en VA Merit award (tilskudd nummer 1BX002129 til JP.R.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Duall size-21 all glass tissue grinder Kimble Chase Life Science, Vineland, NJ 885351-0022
Bruker BioSpec 70/30USR Avance III 7T horizontal bore MR Scanner Bruker Biospin MRI GmbH, Germany Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5)
Bruker 40 mm 19F/1H dual-tuned linerar volume coil Bruker Biospin MRI GmbH, Germany Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5)
Waters Acquity UPLC System with Quadrupole Detector Waters Corporation, Milford, MA
Waters Acquity UPLC ethylene bridged hybrid C8 1.7 μm 2.1 x 50 mm column Waters Corporation, Milford, MA
Gavage Needle Braintree Scientific, INC. N-010 20 G-1.5" curved 2.25 mm ball
2 Stainless Steel Hemostats  VWR 10755-018 4 and 5 inch, straight
Ketamine MWI Veterinary Supply 501090 Ketamin zetamine 100 mg/ml
Xylazine Akorn, Inc. 20 mg/ml
Intraperitoneal Catheter Abbott AbbocathTM-T.I.V. G720-A01 4535-42 24-G x 0.75"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomas, C., Pellicciari, R., Pruzanski, M., Auwerx, J., Schoonjans, K. Targeting bile-acid signalling for metabolic diseases. Nat Rev Drug Discov. 7, 678-693 (2008).
  2. Vallim, T. Q., Edwards, P. A. Bile acids have the gall to function as hormones. Cell Metab. 10, 162-164 (2009).
  3. Dawson, P. A., Karpen, S. J. Thematic Review Series: Intestinal Lipid Metabolism: New Developments and Current Insights Intestinal transport and metabolism of bile acids. Journal of Lipid Research. 56, 1085-1099 (2015).
  4. Dawson, P. A., et al. Targeted deletion of the ileal bile acid transporter eliminates enterohepatic cycling of bile acids in mice. J Biol Chem. 278, 33920-33927 (2003).
  5. Pattni, S., Walters, J. R. Recent advances in the understanding of bile acid malabsorption. Br Med Bull. 92, 79-93 (2009).
  6. Walters, J. R., et al. A new mechanism for bile acid diarrhea: defective feedback inhibition of bile acid biosynthesis. Clin Gastroenterol Hepatol. 7, 1189-1194 (2009).
  7. Hofmann, A. F., Mangelsdorf, D. J., Kliewer, S. A. Chronic diarrhea due to excessive bile acid synthesis and not defective ileal transport: a new syndrome of defective fibroblast growth factor 19 release. Clin Gastroenterol Hepatol. 7, 1151-1154 (2009).
  8. Flynn, C., et al. Deoxycholic acid promotes the growth of colonic aberrant crypt foci. Mol Carcinog. 46, 60-70 (2007).
  9. Glinghammar, B., Rafter, J. Carcinogenesis in the colon: interaction between luminal factors and genetic factors. Eur J Cancer Prev. 8, S87-S94 (1999).
  10. Bernstein, C., et al. Carcinogenicity of deoxycholate, a secondary bile acid. Arch Toxicol. 85, 863-871 (2011).
  11. Zheng, X., Ekins, S., Raufman, J. P., Polli, J. E. Computational models for drug inhibition of the human apical sodium-dependent bile acid transporter. Mol Pharm. 6, 1591-1603 (2009).
  12. Vivian, D., et al. Design and characterization of a novel fluorinated magnetic resonance imaging agent for functional analysis of bile Acid transporter activity. Pharm Res. 30, 1240-1251 (2013).
  13. Vivian, D., et al. Design and evaluation of a novel trifluorinated imaging agent for assessment of bile acid transport using fluorine magnetic resonance imaging. J Pharm Sci. 103, 3782-3792 (2014).
  14. Vivian, D., et al. In vivo performance of a novel fluorinated magnetic resonance imaging agent for functional analysis of bile acid transport. Mol Pharm. 11, 1575-1582 (2014).
  15. Raufman, J. P., et al. In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Detect Biliary Excretion of 19F-Labeled Drug in Mice. Drug Metab Dispos. 39, 736-739 (2011).
  16. Ridlon, J. M., Kang, D. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47, 241-259 (2006).
  17. Frisch, K., et al. N-methyl-11C]cholylsarcosine, a novel bile acid tracer for PET/CT of hepatic excretory function: radiosynthesis and proof-of-concept studies in pigs. J Nucl Med. 53, 772-778 (2012).

Tags

Medisin gallesyrer magnetic resonance imaging fluor merking galleblæren mus transport
Bruke Multi-fluorerte gallesyrer og<em&gt; I Vivo</em&gt; Magnetic Resonance Imaging måle gallesyretransport
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Felton, J., Cheng, K., Said, A.,… More

Felton, J., Cheng, K., Said, A., Shang, A. C., Xu, S., Vivian, D., Metry, M., Polli, J. E., Raufman, J. P. Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport. J. Vis. Exp. (117), e54597, doi:10.3791/54597 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter