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El uso de ácidos biliares y Multi-fluorados Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/54597
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 2,6
1Department of Surgery, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 3Department of Radiology, University of Maryland School of Medicine, 4Food and Drug Administration, 5Department of Pharmaceutical Sciences, University of Maryland School of Pharmacy, 6VA Maryland Health Care System

Summary

Herramientas para el diagnóstico de la malabsorción de ácidos biliares y miden transporte de ácidos biliares in vivo están limitados. Un enfoque innovador de animales vivos se describe que utiliza protones combinado (1 H), además de flúor (19F) de formación de imágenes por resonancia magnética; esta novedosa metodología tiene el potencial de traslación para la detección de problemas de absorción de ácidos biliares en la práctica clínica.

Abstract

Junto con su papel tradicional de detergentes que facilitan la absorción de grasa, literatura emergente indica que los ácidos biliares son potentes moléculas de señalización que afectan a múltiples órganos; modulan la motilidad intestinal y la producción de hormonas, y alterar el tono vascular, metabolismo de la glucosa, el metabolismo de lípidos, y la utilización de energía. Los cambios en los ácidos biliares fecales pueden alterar el microbioma intestinal y promover la patología de colon incluyendo diarrea cholerrheic y el cáncer de colon. reguladores clave de la composición de ácido biliar fecal son la pequeña intestinal Apical Bile Acid Transporter dependiente de sodio (ASBT) y factor de crecimiento de fibroblastos-19 (FGF19). La reducción de expresión y función de ASBT disminuye los ácidos biliares del intestino efectos de adopción. Por otra parte, los datos in vitro sugieren que algunos medicamentos aprobados por la FDA inhiben la función ASBT. liberación de FGF19 deficiente aumenta la síntesis de ácido biliar hepática y la liberación en el intestino a niveles que superan ASBT. De cualquier disfunción o deficiencia ASBT FGF19 aumenta fácidos biliares ECAL y pueden causar diarrea crónica y promover la neoplasia de colon. Lamentablemente, herramientas para medir la bilis malabsorción de ácidos y las acciones de los fármacos sobre el transporte de ácidos biliares in vivo son limitadas. Para entender las complejas acciones de los ácidos biliares, se requieren técnicas que permiten la monitorización simultánea de los ácidos biliares en el intestino y los tejidos metabólicos. Esto nos llevó a concebir un método innovador para medir el transporte de ácido biliar en animales vivos usando una combinación de protones (1 H) y flúor (F 19) de formación de imágenes por resonancia magnética (MRI). Trazadores novedosos para flúor (19F) a base de resonancia magnética en vivo de los animales fueron creados y probados, tanto in vitro como in vivo. Ventajas de este enfoque incluyen la falta de exposición a la radiación ionizante y el potencial de traslación para la investigación y la práctica clínica.

Introduction

Junto con su función clásica como detergentes que facilitan la absorción de grasa desde el intestino, los ácidos biliares se han convertido en moléculas de señalización potentes que afectan a múltiples órganos, además de los asociados con su 1,2 circulación enterohepática. Además de controlar su propio metabolismo, los ácidos biliares modulan varios aspectos de la fisiología gastrointestinal (por ejemplo, la motilidad intestinal y la producción de la hormona incretina, fisiología colon, y la susceptibilidad al cáncer) y tienen efectos sistémicos sobre el tono vascular, la glucosa y el metabolismo de los lípidos, y la utilización de energía. Mientras que algunos de estos efectos están mediados en el intestino, otros se deben a cambios en los niveles postprandiales de ácidos biliares sistémicos, como se señaló en los pacientes obesos o después de la cirugía gástrica de derivación. Para dilucidar las acciones metabólicas complejas de los ácidos biliares se requiere nueva tecnología que permite la monitorización simultánea de los niveles de ácidos biliares en diferentes compartimentos anatómicos, en el tracto gastrointestinal y metatejidos metabólicos (hígado, páncreas, músculo esquelético y tejido adiposo). La obtención de dicha información temporal y espacial requiere de una tecnología innovadora - imágenes in vivo utilizando nuevos trazadores de ácidos biliares como se describe aquí es un enfoque novedoso.

composición de ácidos biliares y la distribución en los compartimentos anatómicos están regulados por factores que modulan su síntesis hepática y la absorción ileal, incluyendo la dieta, la cirugía, el uso de antibióticos y los cambios en la flora intestinal. Un regulador clave de la absorción de ácidos biliares intestinal para su circulación enterohepática 3 (Figura 1) es el ileal apical dependiente de sodio del ácido biliar Transporter (ASBT; SLC10A2). Aunque la absorción pasiva se produce a través de los intestinos, ASBT media la absorción de 95% de ácidos biliares intestinales de modo que normalmente existe derrame limitado de ácidos biliares en las heces. ASBT deficientes (Slc10a2 - / -) ratones han aumentado los ácidos biliares fecales y una disminución de la aci bilisd Piscina 4.

Figura 1
Figura 1: la circulación enterohepática de los ácidos biliares.
Ilustración de circulación enterohepática mediante el cual los ácidos biliares se sintetizan en el hígado, se excreta en el árbol biliar, almacena en la vesícula, libera en el intestino delgado proximal con las comidas, y activamente absorbido a través de ASBT en el íleon distal. Mientras que las pequeñas cantidades de ácidos biliares se absorben de forma pasiva a lo largo del intestino, aproximadamente el 95% de los ácidos biliares intestinales son transportados activamente por ASBT lo que resulta en una pérdida mínima (aproximadamente 5%) en las heces que es compensada por una cantidad similar de síntesis de ácidos biliares nuevo en el hígado, manteniendo de este modo un conjunto de ácidos biliares en el estado estacionario. Las flechas a la derecha identificar los factores que pueden afectar la estabilidad de ácidos biliares nativo y marcado con flúor, incluyendo el ácido gástrico, de páncreas y de las enzimas de la mucosa intestinal, y, lo más importantlY, enzimas hidrolíticas liberadas por las especies clostridiales que colonizan el intestino delgado y el colon distal. (Modificado con permiso 16) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

malabsorción de ácidos biliares se pueden clasificar en tres tipos, cada uno de lo que aumenta los ácidos biliares fecales dihidroxi, lo que provoca diarrea intermitente o crónica. Tipo 1 que resulta de la patología del íleon bruto (por ejemplo, la resección, la enfermedad de Crohn) 5. Tipo 3 resultados de la colecistectomía, vagotomía, la enfermedad celíaca, el sobrecrecimiento bacteriano, y la insuficiencia pancreática. Por el contrario, las personas con (tipo 2) malabsorción de ácidos biliares "primaria" plantear un reto diagnóstico formidable, ya que carecen de tales condiciones antecedentes y no tienen evidencia de patología en el íleon. Por lo tanto, problemas de absorción de ácido biliar primario se diagnostica erróneamente comúnmente como diarrea-pEl síndrome del intestino irritable predominante hacía (SII-D), tal vez la razón más común para las visitas relacionadas gastroenterología-ambulatorios. Se ha estimado que un tercio de los pacientes con SII-D tienen problemas de absorción de ácido biliar primaria; en los EE.UU., esto puede representar varios millones de personas 5. ideas recientes indican que BAM primaria se deriva de la inhibición por retroalimentación alteración de la síntesis de ácidos biliares hepáticos por intestinal factor de crecimiento fibroblástico 19 (FGF19), no de la expresión o función de ASBT reducida.

En malabsorción de ácidos biliares primarios, los bajos niveles plasmáticos de FGF19 no se interrumpe la síntesis de ácido biliar hepática - el aumento resultante de los ácidos biliares intestinales satura los transportadores de ácidos biliares, incluyendo ASBT, y el vertido aumentada de ácidos biliares en las heces causa diarrea 6 (Figura 2). Los ratones deficientes en FGF15 (FGF19 murino) tienen un conjunto de ácidos biliares ampliado y el aumento de los ácidos biliares fecales 7.


Figura 2: Mecanismos de malabsorción intestinal de ácidos biliares.
Normalmente, como se muestra en el panel A, aproximadamente el 95% de los ácidos biliares intestinales son absorbidos por el transporte activo en el íleon distal a través de ASBT. Cuando la expresión o actividad ASBT se ve disminuida (panel B), alteraciones intestinales resultados de absorción de ácidos biliares en el derrame de ácidos biliares en el colon. Con una alteración de la señalización FGF19 (grupo C), la falta de inhibición por retroalimentación de la bilis hepática resultados de la síntesis de ácido en el aumento de las concentraciones de ácidos biliares intestinales que agotan la capacidad de transporte ASBT con derrame de ácidos biliares en el colon. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

A largo plazo, la elevación crónica en aci biliares fecalesds puede promover la neoplasia de colon. neoplasia de colon surge de la displasia de la mucosa progresiva asociada a mutaciones genéticas somáticas, pero los factores ambientales que aumentan los ácidos biliares fecales pueden acelera y aumenta este proceso. En los roedores, el aumento de los ácidos biliares fecales ya sea como consecuencia de la administración exógena o deficiencia ASBT promover la displasia de colon y la formación de tumores 8-10.

En particular, los resultados indican que la provocación medicamentos de uso común aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) inhiben potencialmente transporte de ácidos biliares por ASBT in vitro 11. Si estos medicamentos reducen el transporte de ácidos biliares del intestino delgado en vivo y aumentan los niveles de ácidos biliares fecales, el impacto potencial sobre la patología de colon sería preocupante. Incluso un pequeño aumento en la patología de colon atribuye al uso de un medicamento de este tipo podría tener un importante impacto en la salud. Un conjunto de herramientas que pueden evaluar la plausibilidad de estos resultados in vitro y ob epidemiológicavaciones podrían estimular la investigación adicional, incluyendo los estudios de seguridad posteriores a la comercialización.

A pesar de la necesidad, los ensayos prácticos para identificar a las personas con mala absorción de ácidos biliares son insuficientes. La medición directa de los ácidos biliares fecales fue rechazada hace años como engorroso, poco práctico y poco fiable 5. Los enfoques alternativos incluyen la medición de la retención de un derivado radioactivo selenio marcado con ácido cólico (75 SeHCAT) y los niveles plasmáticos de 7α-hidroxi-4-colesten-3-ona (C4), o un ensayo terapéutico de aglutinante de ácidos biliares. 75 pruebas SeHCAT tiene disponibilidad limitada en Europa y no está aprobado por la FDA o estén disponibles para su uso en los EE.UU. Además, incluso modesta exposición a la radiación (0,26 mSv / 75 prueba SeHCAT) a partir de diagnóstico presentan preocupaciones, y el sobrecrecimiento bacteriano y la enfermedad hepática avanzada pueden confundir 75 resultados SeHCAT. pruebas C4 es potencialmente atractiva ya que sólo se requiere plasma, pero tiene baja val predictivo positivoue y la prueba no está ampliamente disponible. La medición de los niveles séricos de FGF19 tiene limitaciones similares. Con frecuencia los médicos recurren a un ensayo terapéutico de secuestradores de ácidos biliares, pero este método no puede proporcionar un diagnóstico definitivo de la malabsorción de ácidos biliares 5.

Por estas razones, un enfoque novedoso MRI fue concebido para medir el transporte de ácido biliar y la distribución in vivo usando ácidos biliares multi-fluorados innovadores (MFBA-RM). MFBA que contiene tres átomos de flúor (19 F), un isótopo estable del 100% de abundancia natural, son transportados de manera similar a los ácidos biliares nativas 12, y se puede utilizar para visualizar el transporte de ácidos biliares con una combinación de protones (1 H) y flúor ( 19 M) MRI, un método sensible, seguro y sin exposición a la radiación ionizante 13,14.

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Protocol

El siguiente protocolo se adhiere a las directrices aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Maryland Escuela de Medicina (IACUC Protocolo # 0415011, aprobada el 18 de junio de, 2015).

1. Los ratones con el gavage Etiquetada F-19 de los ácidos biliares

  1. Los ratones de alimentación por sonda con 150 mg / kg de peso corporal 19 ácidos biliares marcados-F. Llene una jeringa de 1 ml para el volumen necesario con 19 marcado con F solución de ácido biliar de la [cólico ácido-trifluoro-acetil lisina (CA-lys-TFA; en 1: 1 de polietilenglicol 400: fosfato de Dulbecco de solución salina tamponada) o cholylsarcosine- trifluoro-N-metil-acetamida (CA-sar-TFMA; en 60% de polietilenglicol 400 y 40% tampón fosfato salino de Dulbecco] y adjuntar una de calibre 20 de 1,5 pulgadas aguja de sonda gástrica bulbo con punta curvada Asegúrese de que la aguja de sonda. es el tiempo suficiente para alcanzar el nivel de cartílago xifoides del ratón cuando se inserta en el esófago hasta el cubo de la aguja
  2. firmemente graspar el animal por la piel suelta en la parte posterior del cuello entre los dedos pulgar e índice y el uso de los dedos restantes de captar la piel en la parte baja de la espalda y la cola.
  3. Mantenga pulsado el ratón en posición vertical y pasar la aguja de sonda a lo largo del lateral y el techo de la boca hacia el esófago y hasta el estómago. Si la resistencia se encuentra en la faringe, cambiar la posición de la aguja hasta 'traga' el animal que - no empujar contra la resistencia.
  4. Si se requiere anestesia para la alimentación forzada, colocar el ratón en una campana de vidrio que contenía 5 ml de isoflurano y cerrar. Cuando el ratón se cae sobre su lado, esperar 7 seg, eliminar el ratón y realizar sonda. Para proteger al personal de los vapores anestésicos, utilice la campana de vidrio sólo en una campana de humos.
  5. Observe que el animal se recupere de isoflurano en unos pocos minutos.
    NOTA: Dado que el isoflurano se metaboliza en el hígado, una señal de flúor que emana de la droga intacta o sus metabolitos se excreta en el sistema biliar y la vesícula biliar puede confundir fluoRine señales procedentes de 19 ácidos biliares marcados F-15. Una alternativa es el uso de ketamina más xilacina (ver sección 3.1 para las dosis).

2. La recolección de la vesícula biliar, el hígado y la sangre para las mediciones de ácidos biliares Uso de cromatografía líquida / espectrometría de masas

  1. Para conseguir un llenado de la vesícula biliar máxima, los ratones en ayunas durante al menos 6 horas antes de recoger los órganos. Preparar ketamina y xilacina en solución salina tamponada con fosfato (100 l ketamina, xilazina 62,5 l, 840 l de PBS).
  2. Usando una jeringa estéril de 1 ml, inyectar una hr por vía subcutánea ratón 1 antes de la cosecha de órganos con 15 l / g de peso corporal de una solución de ketamina / xilazina (150 mg de ketamina y 18 mg de xilazina por kg de peso corporal).
  3. Una hora después de la administración de ketamina / xilazina confirmar anestesia adecuada por pizca dedo del pie y coloque el ratón anestesiado supino.
  4. Usar 5 o 6 pulgadas tijeras para hacer una incisión en la piel abdominal en la línea media desde el pubis hasta el xifoides y fitijeras ne (4 pulgadas) para cortar el revestimiento peritoneal y exponer los órganos abdominales - no para perforar el diafragma.
  5. Agarre el proceso xifoides con una abrazadera de 5 pulgadas y levantar de nuevo a través del pecho para exponer la cavidad abdominal superior. El uso de fórceps y un instrumento romo para diseccionar y mover el hígado a un lado, dejando al descubierto la vesícula biliar.
    NOTA: No lacerar el hígado o la vesícula biliar tocar ya que el primero va a causar una hemorragia severa y este último puede estimular la contracción de la vesícula biliar y el vaciado.
  6. Coloque una abrazadera de 4 pulgadas a través del conducto biliar común (Figura 3, las flechas de trazos). Cortar el ligamento unir el polo superior de la vesícula biliar hasta el diafragma y mover suavemente la vesícula biliar hacia el lado derecho del abdomen.

figura 3
Figura 3: anatómicos y de protones por resonancia magnética Vistas del ratón de la vesícula biliar.
El panel izquierdo muestra los ME expuestae vesícula biliar a la izquierda de la línea media después de la incisión abdominal. La pinza agarra el proceso xifoides. La vesícula biliar ayuno bilis llena se indica mediante la flecha grande y el conducto biliar común sujeta por las flechas de trazos. [Recuadro: extirpado la vesícula biliar intacta con el conducto biliar común fijada. La regla está marcada en milímetros (mm).] El panel derecho muestra una imagen de resonancia magnética ponderada en densidad de protones de alta resolución de la vesícula biliar murino en ayunas (flecha). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Antes de la escisión de la vesícula biliar realizar punción cardíaca, la sangre de la cosecha, y Exsanguinate el animal para verificar la eutanasia.
    NOTA: La cosecha de la vesícula biliar primera puede lacerar el hígado provocando un colapso cardiovascular y el fracaso para obtener una muestra de sangre adecuada (≥ 200 l).
  2. Exponer la parte inferior del diafragma izquierda yidentificar la superficie latido del corazón. En el punto de la pulsación cardiaca máxima perforar el diafragma y el corazón con una aguja de calibre 23 unida a una jeringa de 1 ml.
    1. Lentamente retire la jeringa mientras se aspira. Cuando la sangre comienza a llenar la jeringa, retirar detener y mantener la succión para recoger 0,2-0,6 ml de sangre. girando suavemente la aguja o retirándolo poco puede restablecer el flujo si cesa.
    2. La transferencia de la sangre a un tubo heparinizado 1,5 ml y centrifugar a 2000 xg durante 15 min. Precipitar el plasma con cuatro partes de acetonitrilo y se centrifuga a 12.000 xg durante 10 min. Analizar el sobrenadante mediante espectroscopía de cromatografía líquida / masas (LC / MS / MS) 11-1312-1412-1412-1412-14. Si es necesario, almacenar el plasma a -80 ° C antes del análisis.
  3. Utilizando disección roma, liberar la vesícula biliar del hígado. Seccionar el colédoco por debajo de la abrazadera, separación y pesado de la vesícula biliar, y colocarlo en un Microcen 1,5 mltrifuge tubo. Se recoge el hígado.
  4. Homogeneizar aproximadamente 100 mg de hígado y la vesícula biliar en todo el hielo en un homogeneizador de tejidos de vidrio de tamaño 21. Se extrae con 75% de acetonitrilo y 25% de agua (800 l para el hígado, los 300 l de vesícula biliar) y se centrifuga a 12.000 xg durante 10 min. Diluir los extractos según sea necesario y cuantificar el contenido de ácidos biliares mediante LC / MS / MS 11-13.

3. Animales Vivos de protones (1 H) y flúor (F 19) Imagen de Resonancia Magnética

  1. Para conseguir un llenado de la vesícula biliar máxima, los ratones en ayunas durante al menos 6 horas antes de formación de imágenes. El uso de ketamina y xilazina, anestesiar a los ratones para evitar el movimiento en el escáner de resonancia magnética. Preparar una solución madre de ketamina más xilazina en solución salina tamponada con fosfato (130 ketamina l, xilazina 42,5 l, 827 l de PBS). Una hora antes de la MRI, el uso de una jeringa estéril de 1 ml para inyectar una vía subcutánea al ratón con 5 l / g de peso corporal de esta solución (65 mg de ketamina y 4,25 mg xylazine por kg de peso corporal). Para evitar la sequedad bajo anestesia se aplica un ungüento veterinario a los ojos del animal.
  2. Después de la inducción con ketamina / xilazina como anteriormente, una pinza de un área de 1,5 cm 2 a la izquierda media inferior del ratón abdomen usando # 40 o hojas de la recortadora eléctrica más finos. Después de la eliminación de la piel, preparar el área con 8 - 12% de solución diluida de yodo lavado quirúrgico y enjuague con alcohol al 70% - repetir las dos etapas. Inserte un calibre 24 por 0,75 pulgadas de aguja / catéter por vía subcutánea y el túnel en la cavidad abdominal. Asegúrese de que el catéter no está en el ciego u otro órgano abdominal tirando el émbolo hacia atrás - no debe haber sangre o materia fecal en el catéter.
  3. Retire la aguja y dejar el catéter intraperitoneal. Coloca el ratón sobre una almohadilla térmica con control de temperatura en la cámara de animales escáner de resonancia magnética.
  4. Preparar una jeringa de 1 ml estéril que contiene ketamina y xilazina en solución salina tamponada con fosfato (1,000 ketamina l, 300 l de xilazina, 6700 l de PBS) y llenar la longitud deseada del tubo estéril de 72 pulgadas. Conectar el catéter intraperitoneal al tubo estéril precargada y se extienden lejos del escáner de resonancia magnética. Para mantener la anestesia inyectan 50 l de esta solución cada 20 minutos si los signos vitales del ratón son estables.
    NOTA: Antes de imagen, asegúrese de que no hay metales están cerca del escáner de resonancia magnética.
  5. Utilice una bobina de MRI volumen lineal de doble sintonizado 19 F / 1 H para transmitir y recibir señales de radiofrecuencia a 300,283 MHz para 1H y 282,524 MHz para 19 núcleos F.
    1. Realizar la calibración del sistema 11, 13 y localización animal con tres cortes (axial, sagital medio, y coronal) imágenes del explorador usando una secuencia de instantáneas de bajo ángulo rápida (FLASH). Para iniciar el experimento, haga clic en el botón de 'semáforo' en la ventana de control de Escaneo en la consola de software.
    2. Adquirir multicorte 1 H imágenes de RM se utiliza la adquisición rápida con la relajación mejorarción (RARE) secuencia en la vista transversal de la muestra o el cuerpo del animal con el tiempo de repetición de 2.200 ms, tiempo de eco de 8,9 ms, el factor RARO 8, campo de visión 4 x 4 cm2, espesor de corte de 1,0 mm, tamaño de la matriz 266 x 266, en el plano de resolución 150 x 150 m 2, y el número de promedios 6. Para iniciar el experimento, haga clic en el botón de 'semáforo' en la ventana de control de escaneo en la consola de software.
    3. Adquirir 19 imágenes F utilizando una secuencia FLASH en la misma región de la 1H RMN con tiempo de repetición de 220 ms, ángulo de rotación = 30 °, tiempo de eco 3.078 ms, tamaño de la matriz 32 x 32, en el plano de resolución 1,25 x 1,25 mm 2, espesor de corte de 4,0 mm, y el número de promedios 768. Para iniciar el experimento, haga clic en el botón (G o- n- O P ipeline) en la ventana Herramienta de control Espectrómetro en la consola de software 'GOP'.
  6. Después de resonancia magnética, sacrificar al ratón con injecti intraperitonealen de 15 l / g de peso corporal de ketamina / xilazina solución (150 mg de ketamina / xilazina 18 mg por kg de peso corporal) seguido por punción cardiaca para la exanguinación.
  7. Para recuperar un ratón de la anestesia, retirar el catéter intraperitoneal pero no dejar desatendido el animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener decúbito esternal.
  8. Para medir las concentraciones de ácidos biliares 19 marcadas con F 11-13 de cosecha de órganos, mantener la anestesia con ketamina más xilazina como se ha descrito anteriormente.

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Representative Results

El uso de MFBA de resonancia magnética in vivo "ver" transporte de ácidos biliares en tiempo real tiene un gran potencial para la investigación y uso clínico. Por otra parte, los métodos descritos aquí para la resección de la vesícula biliar y el análisis bioquímico de su contenido utilizando cromatografía líquida y espectrometría de masas proporcionan un medio para confirmar resultados de las imágenes. Sin embargo, la validez de estos métodos requiere una dosificación precisa, el momento de los ensayos, y la localización de la vesícula biliar para la imagen o la extirpación quirúrgica. En este último caso, es muy importante que los órganos abdominales del ratón ser perturbado lo menos posible; incluso manipulación suave de la vesícula biliar puede estimular la contracción y el vaciado. Por lo tanto, para capturar todo su contenido, es crítico para colocar la abrazadera a través del conducto biliar común, tan pronto como sea posible.

Utilizando el enfoque quirúrgico que aquí se propone, la vesícula biliardebe ser fácilmente identificados por detrás del lóbulo anterior derecho del hígado en el cuadrante superior derecho del abdomen (Figura 3). Mover a un lado el hígado, la vesícula biliar sin tocar expone el conducto biliar común para la sujeción. Una vez que esta pinza está en su lugar, no debería haber ninguna dificultad para continuar con los otros pasos descritos en el Protocolo para extraer la vesícula biliar intacta.

Los datos de la Tabla 1 revelan concentración altamente selectiva de MFBA en la vesícula biliar 13,14. Concentraciones de órganos (hígado y la vesícula biliar) de MFBA se calcularon asumiendo una densidad de 1 g / ml 13,14. Dentro de 7 h de la dosificación oral, la acumulación media de MFBA en la vesícula biliar era varios órdenes de magnitud (1000 veces) mayor que la observada en cualquiera de los dos el hígado o la sangre 13,14; Se observaron niveles milimolar en la vesícula biliar frente a los niveles micromolares en el hígado y la sangre (Tabla 1 </ Strong>). Las concentraciones medias MFBA oscilaron entre 0,4 - 1,4 M en la sangre, 14,5 - 78,8 mM en el hígado, y 18.4 - 27.0 mM en la vesícula biliar. Estos hallazgos son consistentes con MFBA se manejan los mismos que los ácidos biliares fisiológicos; después de la dosificación oral, MFBA son transportados activamente por ASBT en la circulación enterohepática mediante el cual se llevan al hígado para el transporte activo en hepatocitos por el polipéptido / taurocolato co-transporte de sodio (PNCT), y se excreta en el árbol biliar para la concentración en la vesícula biliar (Figura 1).

La figura 4 muestra la acumulación dependiente del tiempo de la señal de 19 M en la vesícula biliar después de sonda con MFBA. Un transcurso de tiempo más detallado utilizando métodos analíticos (LC / MS / MS) indicó que se observaron concentraciones pico de la vesícula biliar de MFBA en el intervalo de 4-7 horas después de la dosificación oral 12, que concuerda con la cinética fisiológicasde la circulación enterohepática de los ácidos biliares. El panel de la izquierda en la Figura 4, una imagen de resonancia magnética adquirió dos y medio a cuatro horas después de la alimentación forzada oral con MFBA, revela 19 señal F que emana de lo que parece ser el conducto biliar común (flecha discontinua) y una señal más robusta que emana de la vesícula biliar (flecha); por 7 a 8,5 horas, la señal del conducto biliar común ya no es detectada y la señal de la vesícula biliar 19 M ha aumentado a la misma intensidad que la que emana del fantasma MFBA adyacente (Figura 4, panel derecho, flecha).

Utilizamos ratones con expresión deficiente de ASBT para probar la capacidad de MFBA-MRI para detectar reducción de la absorción intestinal de ácidos biliares. Como se ilustra en la Figura 5A, una reducción de aproximadamente 22 veces en la concentración de MFBA en la vesícula biliar de los ratones deficientes en ASBT se midió por LC / MS 13,14; sobre la base de estos hallazgos se preveía THen la señal de MRI F MFBA 19 en estos animales estaría por debajo de los límites de detección. De hecho, como se muestra en la figura 5B, mientras que se detectó un robusto 19 de señal F que emana de la vesícula biliar en un ratón de tipo salvaje, no hubo correspondiente 19 de la señal F en el 13,14 ratón ASBT deficientes. Estos resultados confirman que MFBA se manejan de manera similar a los ácidos biliares fisiológicas y que MFBA-MRI se puede usar para detectar alteración de la absorción intestinal de ácidos biliares.

Figura 4
Figura 4: Imágenes representativas MFBA-MRI.
Los resultados de experimentos en ratones vivos muestran superposiciones de reconstrucción de 19 M y 1 H imágenes que demuestran que 19 señales F emanan de la vesícula biliar murino (flechas grandes). Fantasmas de referencia que contienen concentraciones conocidas de 19 ácidos biliares marcados con F fueroncolocado en el escáner de resonancia magnética junto con el ratón (flecha izquierda). En el panel de la izquierda, la flecha punteada indica la señal de ácidos biliares marcado con F 19 que emana del conducto biliar común. De grabación por encima de cada panel es el tiempo después de alimentación forzada con ácido biliar marcado con F 19 que la RM se inició a la vez que se completó la adquisición de imágenes (1,5 h). Como se preveía, la vesícula biliar llenado con los ácidos biliares aumentos marcados F-19 con el tiempo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: atenuada MFBA-RM señal de vesículas biliares de los ratones deficientes en ASBT.
(A) Gráfico de barras que ilustra que la concentración de MFBA medida por LC / MS / MS es aproximadamente 22 veces menor en ASBT ratones deficientes comparand con los ratones control. En ausencia de señal de MFBA-MRI de la vesícula biliar de un ratón deficiente en ASBT (B). Las puntas de flecha indican 19 fantasmas F-etiquetado de ácidos biliares (paneles de la izquierda) y 19 F señal de resonancia magnética de fantasmas (paneles de la derecha). Flecha en el panel superior derecho indica la señal de ácidos biliares marcado con F 19 que emana de la vesícula biliar; no hay una correspondiente señal de ácidos biliares marcado con F 19 en el ratón deficiente en ASBT (panel inferior derecho). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Peso de la vesícula biliar (mg) Concentración MFBA
Vesícula biliar (mM) De hígado (M) Plasma (M)
CA-lys-TFA 25,2 ± 3,2 27,0 ± 2,4 78,8 ± 35,1 0,4 ± 0,2
CA-sar-TFMA 29,2 ± 2,4 18,4 ± 1,6 14,5 ± 0,6 1,4 ± 0,1

Tabla 1: Valores representativos para la vesícula biliar, el hígado y las concentraciones plasmáticas de ácidos biliares marcados 19-F.
La media ± error estándar (SE) se muestran los valores para el peso de la vesícula biliar y las concentraciones de la MFBA se indica en la vesícula biliar, el hígado y el plasma 12,13. Los valores mostrados se midieron 5-7 h después de gavage ratones con 150 mg / kg de peso corporal del MFBA indicado. Tenga en cuenta las concentraciones milimolares de MFBA en la vesícula biliar en comparación con concentraciones micromolares en el hígado y plasma. N = 3 millasce por valor de CA-Lys-TFA y 5 ratones por valor de CA-sar-TFMA.

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Discussion

La síntesis de CA-lys-TFA y CA-sar-TFMA y el análisis in vitro de su transporte utilizando células de riñón canino Madin-Darby transfectadas de forma estable que expresan ASBT y las células embrionarias de riñón humano que expresa el polipéptido / taurocolato co-transporte de sodio (PNCT) se detalla en otras partes 13,14. Aquí, la atención se centra en la administración oral de MFBA por sonda a los animales vivos, seguido de la cosecha de la vesícula biliar, el hígado y la sangre para el análisis del contenido MFBA, y, en particular, la formación de imágenes MFBA en la vesícula biliar por resonancia magnética en animales vivos. Los pasos críticos incluyen evitar los anestésicos basados en flúor que pueden crear competir 19 señales F, evitando la manipulación de la vesícula biliar antes de la sujeción del conducto biliar común que puede resultar en la contracción de la vesícula biliar y el vaciado antes se escinde el órgano, y evitar la colocación de metales cerca del escáner MRI.

Como se detalla aquí y en otras partes 13,14, MFBA-RM tiene un gran potencial to analizar con éxito transporte de ácidos biliares in vivo, tanto en condiciones fisiológicas normales y anormales. Los principales puntos fuertes de MFBA-RM son que se trata de ninguna radiación ionizante (ni MFBA marcado con que ocurren de forma natural, flúor no radiactivo ni RM emiten radiación ionizante) y MFBA se administran por vía oral sin necesidad de punción venosa (a diferencia de los ratones, la mayoría de los humanos no requieren administración parenteral de anestésicos o sedantes para evitar artefactos de movimiento en el escáner de resonancia magnética). La sustitución de un ácido de bilis hidrolizable con un ácido de bilis sintética resistente a la hidrólisis por la microflora intestinal 13,14, puede superar los problemas relativos a la estabilidad in vivo de MFBA en el intestino. El prototipo inicial para MFBA implicado la adición de tres átomos de flúor por molécula de ácido cólico, un ácido biliar humana de origen natural que se hidroliza en el intestino por clostridial hidrolasas 13,14. Una novela de ácidos biliares tri-fluorado, CA-sar-TFMA, basado en una sarcosinacolumna vertebral que es resistente a la hidrólisis por las enzimas bacterianas eludir esta limitación, se extiende la vida media de MFBA 13,14.

Por último, una metodología potencialmente competidores, el uso de N-metil- [11C] cholylsarcosine para el PET / CT, está limitada por la exposición a la radiación tanto del ácido radiomarcado de bilis y la TC, y la necesidad de preparar, enviar y almacenar el radiactiva ácido biliar 17.

En cuanto a las modificaciones y reparación para esta nueva metodología, se puede considerar que el fracaso para detectar una señal de resonancia magnética que emana de la vesícula biliar puede ser debido a un problema con el ácido marcado con F 19 biliar o su biodisponibilidad, el tiempo de adquisición de imágenes, o llenado insuficiente de la vesícula biliar. Como se discutió anteriormente, se prueba la integridad estructural de estos agentes por su capacidad para ser transportados in vitro por las líneas celulares que expresan los transportadores de ácidos biliares adecuados. Nos permitimos al menos 1,5 hr para la adquisición de imagen, pero en ciertos casos esta duración puede requerir la extensión. Encontramos que los ratones en ayunas antes de la IRM para asegurar el llenado de la vesícula biliar máxima es importante.

Los límites de detección de señales 19 F-MRI requieren imágenes de los animales durante 90 - 120 minutos para la adquisición de la señal adecuada; esto es probablemente demasiado tiempo para una prueba clínica práctica - los pacientes tendrían que permanecer inmóvil en el escáner de resonancia magnética de la misma duración. Además, la corriente, la RM clínica se basa principalmente en protones (H 1) de formación de imágenes; la aplicación de flúor (19F) de imágenes será necesario invertir en hardware (19 bobina F) y el software, al menos una inversión de $ 250.000 por escáner de resonancia magnética. Hasta que otras aplicaciones de MRI basados ​​en flúor se desarrollan utilizando MFBA-resonancia magnética para evaluar a los pacientes para la malabsorción de ácidos biliares no es probable que sea rentable.

MFBA-RM ofrece una alternativa prometedora a la medición de la retención de 75 SeHCAT, plasma 7α-hidroxi-4 -cholesten-3-ona (C4), y FGF19 plasma, o la realización de un ensayo terapéutico utilizando aglutinante de ácidos biliares. En la prueba SeHCAT Estados Unidos, el 75, lo que implica exposición a la radiación, no está aprobado por la FDA. las pruebas C4 y FGF19 tiene un valor predictivo positivo bajo y la prueba está actualmente disponible sólo a través de laboratorios especializados. Además, tanto C4 y los niveles de FGF19 reflejan la síntesis hepática de los ácidos biliares. Por lo tanto, a diferencia de MFBA-MRI, estas pruebas pueden no detectar la expresión alterada o mutación de los transportadores de ácidos biliares en el íleon o de otros mecanismos de mala absorción de ácidos biliares que son independientes de la síntesis de ácido biliar aumentado. Los ensayos terapéuticos de aglutinante de ácidos biliares pueden ser útiles, pero tienen valor predictivo incierto y no pueden proporcionar un diagnóstico definitivo de la malabsorción de ácidos biliares 5. Por último, aunque la medición directa de ácidos biliares fecales es aparentemente razonable esto fue rechazado hace años por ser demasiado engorroso, poco práctico y poco fiable para el uso clínico rutinario 5.

ent "> retos adicionales debe ser superada para que este enfoque innovador puede ser traducido a medir el transporte de ácidos biliares in vivo en la clínica (por ejemplo, para el diagnóstico de la malabsorción de ácidos biliares como causa de diarrea crónica). Un desafío importante es maximizar intensidad de la señal al aumentar el número de 19 átomos de F por molécula de ácidos biliares sin interrumpir la capacidad de MFBA a comportarse como los ácidos biliares naturales, es decir, una molécula de ácido biliar que es demasiado voluminoso debido agregó 19 átomos de F no será transportado por cualquiera ASBT o transportadores de ácidos biliares en el hígado. la capacidad de la novela MFBA para ser transportados in vitro pueden ser probados en líneas celulares que expresan transportadores de ácidos biliares humanos clave 13,14 y deben ser predictivo de transporte in vivo. con el aumento de la sensibilidad, MFBA-MRI tiene potencial para mejorar la obtención de imágenes de todo el árbol biliar (por ejemplo, el conducto biliar común y sus ramas); en este sentido, la capacidad de tO la imagen del conducto biliar común en algunos ratones parece prometedor (Figura 4, panel izquierdo).

Aunque los límites actuales de detección de ácidos biliares por MFBA-MRI permiten su visualización sólo en la vesícula biliar, suponiendo que la sensibilidad de la técnica se puede mejorar anticipamos MFBA-MRI podría ser utilizado para medir el transporte de ácido biliar y la distribución in vivo proporcionando de ese modo espacial integral anatómicamente información en tiempo real; una tecnología que permite que avanzaría imagen molecular. MFBA-RM también ofrecería una nueva tecnología para evaluar los efectos de los polimorfismos de genes y fármacos que alteran la función del transportador de ácidos biliares. MFBA-RM tiene el potencial de traslación para ayudar a los clínicos la pantalla de la malabsorción de ácidos biliares y de este modo identificar y manejar enfermedades causadas por el aumento de los ácidos biliares fecales (por ejemplo, diarrea que imita síndrome del intestino irritable). Por último, si esta técnica se vuelve clínicamente disponible que tiene un gran promise para acelerar el progreso en la medicina de precisión, proporcionando la capacidad de identificar la absorción de ácidos biliares intestinal alterado en personas con neoplasia de colon u otras condiciones que pueden ser afectados por los cambios en los ácidos biliares fecales.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (números de subvención R21 y T32 DK093406 DK067872 a JP.R.) y un premio al mérito VA (número de concesión 1BX002129 a JP.R.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Duall size-21 all glass tissue grinder Kimble Chase Life Science, Vineland, NJ 885351-0022
Bruker BioSpec 70/30USR Avance III 7T horizontal bore MR Scanner Bruker Biospin MRI GmbH, Germany Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5)
Bruker 40 mm 19F/1H dual-tuned linerar volume coil Bruker Biospin MRI GmbH, Germany Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5)
Waters Acquity UPLC System with Quadrupole Detector Waters Corporation, Milford, MA
Waters Acquity UPLC ethylene bridged hybrid C8 1.7 μm 2.1 x 50 mm column Waters Corporation, Milford, MA
Gavage Needle Braintree Scientific, INC. N-010 20 G-1.5" curved 2.25 mm ball
2 Stainless Steel Hemostats  VWR 10755-018 4 and 5 inch, straight
Ketamine MWI Veterinary Supply 501090 Ketamin zetamine 100 mg/ml
Xylazine Akorn, Inc. 20 mg/ml
Intraperitoneal Catheter Abbott AbbocathTM-T.I.V. G720-A01 4535-42 24-G x 0.75"

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References

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Medicina No. 117 ácidos biliares resonancia magnética el etiquetado de flúor la vesícula biliar el ratón el transporte
El uso de ácidos biliares y Multi-fluorados<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen de Resonancia Magnética para medir el transporte de ácidos biliares
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Felton, J., Cheng, K., Said, A.,… More

Felton, J., Cheng, K., Said, A., Shang, A. C., Xu, S., Vivian, D., Metry, M., Polli, J. E., Raufman, J. P. Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport. J. Vis. Exp. (117), e54597, doi:10.3791/54597 (2016).

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