Summary
Werkzeuge Gallensäure - Malabsorption zu diagnostizieren und Gallensäuretransport in vivo messen begrenzt sind. Ein innovativer Ansatz in lebenden Tieren beschrieben , das kombinierte Proton (1 H) und Fluor (19 F) Magnetresonanztomographie verwendet; Diese neuartige Methode hat translationale Potenzial für Gallensäure-Malabsorption in der klinischen Praxis zu screenen.
Abstract
Zusammen mit ihrer traditionellen Rolle als Reinigungsmittel, die Fettaufnahme zu erleichtern, gibt Literatur ab, dass Gallensäuren sind starke Signalmoleküle, die mehrere Organe betreffen; Gefäßtonus, Glukosestoffwechsel, den Fettstoffwechsel und Energieausnutzung sie modulieren Darm-Motilität und die Hormonproduktion und zu verändern. Änderungen in fäkale Gallensäuren können den Darm microbiome verändern und Kolon Pathologie einschließlich cholerrheic Durchfall und Darmkrebs zu fördern. Schlüsselregulatoren der fäkalen Gallensäure Zusammensetzung sind die kleinen Darm-Apikale Natrium-abhängigen Gallensäure-Transporter (ASBT) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor-19 (FGF19). Reduzierte Expression und Funktion von ASBT verringert Darm Gallensäure up-nehmen. Darüber hinaus kann in - vitro - Daten deuten darauf hin , dass einige der FDA zugelassene Medikamente ASBT Funktion hemmen. Defizienten FGF19 Freisetzung erhöht Lebergallensäuresynthese und Freisetzung in den Darm zu Ebenen, die ASBT überwältigen. Entweder ASBT Dysfunktion oder FGF19 Mangel erhöht fecal Gallensäuren und können chronische Durchfall verursachen und Kolon Neoplasien fördern. Bedauerlicherweise Werkzeuge Gallensäure - Malabsorption zu messen und die Aktionen von Drogen auf Gallensäuretransport in vivo sind begrenzt. Um die komplexe Aktionen von Gallensäuren zu verstehen, sind Techniken erforderlich, die die gleichzeitige Überwachung von Gallensäuren im Darm und metabolische Geweben ermöglichen. Dies führte uns eine innovative Methode vorstellen Gallensäuretransport in lebenden Tieren zu messen , eine Kombination von Protonen (1 H) und Fluor (19 F) die Kernspintomographie (MRI) verwendet. Neuartigen Tracer für Fluor (19 F) -basierte lebendes Tier MRI wurden erzeugt und getestet, sowohl in vitro als auch in vivo. Stärken dieses Ansatzes gehören die fehlende Belichtungsstrahlung und translationale Potenzial für die klinische Forschung und Praxis zu ionisieren.
Introduction
Zusammen mit ihren klassischen Rolle als Detergentien , die Fettabsorption aus dem Darm zu erleichtern, Gallensäuren wurden als potente Signalmoleküle beeinflussen mehrere Organe zusätzlich zu den mit den enterohepatischen Kreislauf 1,2 zugeordnet entstanden. Zusätzlich zu ihren eigenen Stoffwechsel steuern, modulieren Gallensäuren mehrere Aspekte der gastrointestinalen Physiologie (zB Darmmotilität und incretin Hormonproduktion, Kolon Physiologie und Krebsanfälligkeit) und haben eine systemische Wirkung auf den vaskulären Tonus, Glukose- und Lipidstoffwechsel, und die Energienutzung. Während einige dieser Wirkungen im Darm vermittelt werden, sind andere aufgrund postprandial Veränderungen in systemische Spiegel Gallensäure, bei adipösen Patienten oder nach Magen-Bypass-Operation nicht anderweitig angegeben. Aufzuklären ist die komplexe metabolischen Wirkungen von Gallensäuren neue Technologie benötigt, die gleichzeitige Überwachung von Gallensäureniveaus in verschiedenen anatomischen Abteilen ermöglicht, im Gastrointestinaltrakt und metabolic Geweben (Leber, Bauchspeicheldrüse, Skelettmuskulatur und Fettgewebe). Erhalten eines solchen zeitlichen und räumlichen Informationen erfordert innovative Technologie - in - vivo - Bildgebung neue Gallensäure - Tracer verwendet , wie hier beschrieben ist so ein neuer Ansatz.
Gallensäure Zusammensetzung und Verteilung in anatomischen Kompartimenten werden durch verschiedene Faktoren reguliert, die ihre hepatische Synthese und Ileum-Aufnahme modulieren, einschließlich Ernährung, Chirurgie, den Einsatz von Antibiotika und Veränderungen in der Darmflora. Ein wichtiger Regulator der intestinalen Gallensäureaufnahme für ihre enterohepatischen Kreislauf 3 (Figur 1) ist die Ileum - Apical natrium-abhängigen Gallensäure - Transporter (ASBT; SLC10A2). Obwohl passive Absorption in den Därmen stattfindet, vermittelt ASBT Aufnahme von 95% der intestinalen Gallensäuren, so dass normalerweise beschränkt Verschütten von Gallensäuren in die Faeces ist. ASBT-defizienten (Slc10a2 - / -) Mäusen haben fäkalen Gallensäuren und Gallen eine verminderte aci erhöhted Pool 4.
Abbildung 1: enterohepatischen Kreislauf von Gallensäuren.
Illustration von enterohepatischen Kreislauf , wodurch Gallensäuren werden in der Leber gebildet schieden in den biliäre Baum, Stored in der Gallenblase, Veröffentlicht in den Proximal Duenndarm mit Mahlzeiten und aktiv über ASBT in distaler Ileum aufgenommen. Während geringe Mengen an Gallensäuren passiv ganzen Darm absorbiert werden, etwa 95% der intestinalen Gallensäuren resultierende im Stuhl in minimal (etwa 5%) Verlust aktiv durch ASBT transportiert, die durch eine ähnliche Menge an neuen Gallensäuresynthese kompensiert wird in die Leber, die Aufrechterhaltung dadurch eine Steady-State-Gallensäure-Pool. Die Pfeile auf der rechten Seite identifizieren Faktoren, die native und Fluor-markierten Gallensäurestabilität, einschließlich Magensäure, Bauchspeicheldrüsen- und Darmschleimhaut Enzyme auswirken können, und die meisten importantly, hydrolytische von Clostridien - Spezies freigesetzt Enzyme, die den distalen Dünndarm und Dickdarm besiedeln. (Mit Genehmigung 16) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Gallensäure-Malabsorption können in drei Typen eingeteilt werden, von denen jeder fäkalen dihydroxy Gallensäuren erhöht, wodurch eine intermittierende oder chronischen Durchfall. Typ 1 Ergebnisse von den Brutto - Ileum - Pathologie (zB Resektion, Morbus Crohn) 5. Typ 3 Ergebnisse von Cholezystektomie, Vagotomie, Zöliakie, bakterielle Überwucherung und Pankreasinsuffizienz. Im Gegensatz dazu Personen mit "primären" (Typ 2) Gallensäure-Malabsorption stellen eine gewaltige diagnostische Herausforderung, weil sie solche Vorbedingungen fehlen und haben keine Beweise für Pathologie im Ileum. Daher wird primären Gallensäure-Malabsorption häufig als Durchfall-p falsch diagnostiziertredominant Reizdarmsyndrom (IBS-D), vielleicht der häufigste Grund für Gastroenterologie bezogene ambulante Besuche. Es hat sich gezeigt, dass mit IBS-D haben primäre Gallensäure-Malabsorption ein Drittel der Patienten geschätzt wird; in den USA kann dies mehrere Millionen Personen repräsentieren 5. Neuere Erkenntnisse zeigen, dass die primäre BAM leitet sich von beeinträchtigten Feedback-Hemmung der Lebergallensäuresynthese durch Darm-Fibroblasten-Wachstumsfaktor-19 (FGF19), nicht von einer verminderten Expression oder Funktion von ASBT.
Bei der primären Gallensäure - Malabsorption, versagen niedrige Plasmaspiegel von FGF19 Lebergallensäuresynthese abzusperren - das daraus resultierende Erhöhung der intestinalen Gallensäuren sättigt Gallensäure - Transporter, einschließlich ASBT und das vergrößerte Verschütten von Gallensäuren in den Kot verursacht Durchfall 6 (Abbildung 2). Defiziente Mäuse in Fgf15 (murine FGF19) haben eine Gallensäure Pool erweitert und erhöht fäkale Gallensäuren 7.
Abbildung 2: Die Mechanismen der intestinalen Gallensäure - Malabsorption.
Normalerweise , wie in Tafel A gezeigt ist , etwa 95% der intestinalen Gallensäuren werden durch aktiven Transport im distalen Ileum über ASBT absorbiert. Wenn ASBT Expression oder Aktivität vermindert (Feld B), Beeinträchtigung der Darmgallensäureaufnahme führt Verschütten von Gallensäuren in den Darm. Mit eingeschränkter FGF19 - Signalisierung (Panel C), das Fehlen von Feedback - Hemmung der Lebergallensäuresynthese führt zu einer erhöhten Konzentration von Darmgallensäuren , die ASBT Transportkapazität mit verschütteten Materialien von Gallensäuren in den Darm zu überwältigen. Bitte hier klicken , um eine größere Version zu sehen diese Figur.
Die langfristige, chronische Erhöhung in fäkale Gallen acids kann Kolon Neoplasien fördern. Colon Neoplasie ergibt sich aus progressiven Schleimhaut-Dysplasie mit somatischen Gen-Mutationen assoziiert, aber Umweltfaktoren, die fäkale Gallensäuren erhöhen kann diesen Prozess beschleunigen und zu erweitern. Bei Nagetieren erhöhten fäkalen Gallensäuren entweder als Folge der exogenen Verabreichung oder ASBT Mangel fördern colon Dysplasie und Tumorbildung 8-10.
Bemerkenswert ist , provokativ Ergebnisse zeigen , dass häufig verwendete Medikamente , die von der Food and Drug Administration (FDA) genehmigt Gallensäuretransport durch ASBT in vitro 11 potent inhibieren. Wenn diese Medikamente Dünndarm Gallensäuretransport in vivo und erhöhen fäkale Gallensäurespiegel zu senken, wäre die möglichen Auswirkungen auf die Kolon Pathologie betreffen. Selbst ein kleiner Anstieg der Kolon Pathologie zurückzuführen eines solchen Arzneimittels zu verwenden, könnte eine große Auswirkungen auf die Gesundheit haben. Ein Toolkit, das die Plausibilität dieser in - vitro - Ergebnisse und epidemiologischer ob beurteilenachtungen würde zusätzliche Forschung anspornen, einschließlich Post-Marketing-Studien zur Sicherheit.
Trotz der Notwendigkeit, die praktische Tests identifizieren Menschen mit Gallensäure-Malabsorption fehlen. Eine direkte Messung der fäkalen Gallensäuren wurde Jahre abgelehnt vor als umständlich, unpraktisch und unzuverlässig 5. Alternative Ansätze umfassen die Messung Beibehaltung einer radioaktiven Selen-markiertem Cholsäure - Derivat (75 SeHCAT) und die Plasmaspiegel von 7α-Hydroxy-4-cholesten-3-on (C4) oder einem Therapieversuch von Gallensäurebinder. 75 SeHCAT Tests haben begrenzte Verfügbarkeit in Europa und ist nicht FDA-zugelassen oder für den Einsatz in den USA Außerdem, selbst bescheidene Strahlenexposition (0,26 mSv / 75 SeHCAT Test) von diagnostischen Tests wirft Bedenken, und bakterielle Überwucherung und fortgeschrittener Lebererkrankung kann 75 SeHCAT Ergebnisse durcheinander bringen. C4-Test ist potentiell attraktiv, da nur Plasma erforderlich ist, aber es hat eine geringe positive prädiktive value und Prüfung ist nicht weit verbreitet. Messung der Serumspiegel von FGF19 hat ähnliche Grenzen. Häufig greifen Ärzte auf ein Therapieversuch von Gallensäurebindern, aber dieser Ansatz kann eine endgültige Diagnose von Gallensäure - Malabsorption 5 nicht zur Verfügung stellen.
Aus diesen Gründen wurde ein neuartiges MRI - Ansatz konzipiert Gallensäure Transport und die Verteilung in vivo unter Verwendung von innovativen Multi-fluorierten Gallensäuren (MFBA-MRT) messen. MFBA drei Atome von Fluor (19 F), einem stabilen Isotop von 100% natürlicher Häufigkeit enthält, werden ähnlich zu nativem Gallensäuren 12, transportiert und verwendet werden kann , um Gallensäure - Transport mit einer Kombination von Protonen (1 H) und Fluor visualisieren ( 19 F) MRT, ein sensibles, sicheres Verfahren ohne Strahlenbelastung ionisierender 13,14.
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Protocol
Das folgende Protokoll hält sich an Richtlinien durch die Pflege und Verwendung Committee (IACUC) an der University of Maryland School of Medicine (IACUC Protokoll # 0415011, den 18. Juni genehmigt, 2015) Institutional Animal genehmigt.
1. Gavaging Mäuse , die mit 19 F-markierten Bile Acids
- Gavage Mäuse mit 150 mg / kg Körpergewicht 19 F-markierten Gallensäuren. Füllen einer 1-ml Spritze mit dem erforderlichen Volumen mit 19 F-markierten Gallensäure - Stammlösung [Cholsäure-Trifluor-acetyl Lysin (CA-lys-TFA; in 1: 1 Polyethylenglycol 400: Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung) oder cholylsarcosine- Trifluor-N-methyl-acetamid (CA-sar-TFMA; in 60% Polyethylenglykol 400 und 40% Dulbecco-Phosphat-gepufferte Saline] und fügen Sie eine 20-Gauge 1,5-Zoll gekrümmten lampen~~POS=TRUNC Magensonde Nadel Achten Sie darauf, die Nadel Schlundsonde. ist lang genug, den Pegel der Maus des Xyphoid Knorpels zu erreichen, wenn sie in die Speiseröhre bis zu der Nabe der Nadel eingeführt
- fest graspeln das Tier durch die lose Haut an der Rückseite des Halses zwischen dem Daumen und Zeigefinger und mit den restlichen Fingern die Haut auf den unteren Rücken und Schwanz zu fassen.
- Halten Sie die Maus aufrecht und die Sondennadel an der Seite vorbei und das Dach der Mund in die Speiseröhre und hinunter in den Magen. Wenn der Widerstand bei den Rachen angetroffen wird, setzen Sie die Nadel, bis das Tier "schluckt" es - nicht schieben gegen einen Widerstand.
- Wenn Anästhesie für eine Sonde erforderlich ist, setzen Sie die Maus in einer Glasglocke, die 5 ml Isofluran und zu schließen. Wenn die Maus auf die Seite fällt, warten 7 Sekunden, die Maus zu entfernen und Schlundsonde durchführen. Um Personal von Narkose- dämpfen, verwenden Sie die Glasglocke nur in einem Abzug schützen.
- Beachten Sie das Tier von Isofluran in wenigen Minuten zu erholen.
Hinweis: Da Isofluran in der Leber metabolisiert wird, ein Fluor Signal von Capecitabin ausgeht oder seiner Metaboliten in die Gallenwege ausgeschieden und Gallenblase kann Fluo vermengenrine Signale von 19 F-markierten Gallensäuren 15. Eine Alternative ist, Ketamin und Xylazin zu verwenden (siehe Abschnitt 3.1 für Dosen sehen).
2. Ernten der Gallenblase, die Leber und das Blut für Gallensäure-Messungen mit Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie
- mindestens 6 Stunden für maximale Gallenblase Füllung, schnelle Mäuse Um das zu erreichen, bevor die Organe Ernte. Bereiten Ketamin und Xylazin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (100 ul Ketamin, Xylazin 62,5 & mgr; l, 840 & mgr; l PBS).
- Verwendung einer 1-ml sterile Spritze, injizieren einer Maus subkutan 1 Stunde vor der Organentnahme mit 15 ul / g Körpergewicht Ketamin / Xylazin-Lösung (150 mg Ketamin und 18 mg Xylazin pro kg Körpergewicht).
- Eine Stunde nach der Verabreichung von Ketamin / Xylazin bestätigen ausreichende Anästhesie durch toe Prise und legen Sie den narkotisierten Maus Rücken.
- Verwenden Sie 5 oder 6-Zoll-Schere, um eine Mittellinie Bauchhautschnitt von der pubis machen zum Xyphoid und fine Schere (4 Zoll), um die Peritonealüberzug zu schneiden und Bauchorgane aussetzen - nicht über die Membran zu durchdringen.
- Fassen Sie den Xyphoid Prozess mit einem 5-Zoll-Klemme und heben Sie über die Brust zurück in die obere Bauchhöhle aus. Verwenden einer Pinzette und ein stumpfes Instrument zu sezieren und die Leber zur Seite schieben, Freilegung der Gallenblase.
HINWEIS: Die Leber nicht zerfleischen oder die Gallenblase als ehemaliger berühren zu schweren Blutungen und so kann Kontraktion der Gallenblase und Entleerung stimulieren. - Legen Sie ein 4-Zoll - Klemme über den Gallengang (Abbildung 3, gestrichelte Pfeile). Schneiden Sie das Band den oberen Pol der Gallenblase an der Membran befestigt und sanft die Gallenblase an der rechten Seite des Bauches bewegen.
Abbildung 3: Anatomische und Proton MRI Ansichten der Maus Gallenblasenhydrops.
Die linke Tafel zeigt die freiliegende mouse Gallenblase, die links von der Mittellinie nach Bauchschnitt. Die Klammer greift den Xyphoid Prozess. Die Galle gefüllten Fasten Gallenblase wird durch den großen Pfeil und dem geklemmten Choledochus durch die gestrichelten Pfeile angedeutet. [Inset: exzidiert intakte Gallenblase mit dem Gallengang eingespannt. Der Herrscher in Millimeter markiert ist (mm).] Das rechte Bild zeigt eine hochauflösende Protonendichte-gewichteten MRT - Bild des Fastens murine Gallenblase (Pfeil). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Vor Excision der Gallenblase Herzpunktur führen, Ernte Blut und exsanguinate das Tier zu Euthanasie überprüfen.
HINWEIS: Ernten der Gallenblase zuerst die Leber zerfleischen können Kreislaufkollaps und Versagen verursacht eine ausreichende Blutprobe (≥ 200 & mgr; l) zu erhalten. - Expose die Unterseite der linken Membran unddas Schlagen Oberfläche des Herzens zu identifizieren. Am Punkt der maximalen Herz Pulsation durchstechen die Membran und das Herz mit einer 23-Gauge-Nadel an einer Spritze 1 ml angebracht.
- Langsam die Spritze zurückziehen, während Absaugen. Wenn das Blut beginnt die Spritze zu füllen, zu stoppen zurückzuziehen und halten Sog 0,2 zu sammeln - 0,6 ml Blut. Sanft Drehen der Nadel oder Fluss wieder herzustellen Abziehen kann es leicht, wenn es aufhört.
- Übertragen, um das Blut in ein 1,5-ml heparinisiertes Rohr und Zentrifuge bei 2.000 xg für 15 min. Man fällt das Plasma mit vier Teilen Acetonitril und Zentrifuge bei 12.000 g für 10 min. Analysieren Sie den Überstand durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie (LC / MS / MS) 11-1312-1412-1412-1412-14. Bei Bedarf speichern Sie das Plasma bei -80 o C vor der Analyse.
- Mit stumpfen Dissektion, befreien die Gallenblase von der Leber. TRANSECT den Gallengang unterhalb der Klemme, zu entfernen und wiegen um die Gallenblase, und legen Sie sie in einem 1,5-ml MicroCentrifuge Rohr. Ernten Sie die Leber.
- Homogenisieren etwa 100 mg Leber und die gesamte Gallenblase auf Eis in einer Größe-21-Homogenisator Glasgewebe. Extrakt mit 75% Acetonitril und 25% Wasser (800 & mgr; l für Leber, 300 & mgr; l für Gallenblase) und Zentrifuge bei 12.000 g für 10 min. Verdünnte Extrakte nach Bedarf und zu quantifizieren Inhalt Gallensäure unter Verwendung von LC / MS / MS 11-13.
3. Live Animal Proton (1 H) und Fluorine (19 F) Magnetic Resonance Imaging
- maximal Gallenblase Füllung, schnelle Mäuse für mindestens 6 Stunden vor der Bildgebung zu erzielen. Mit Ketamin und Xylazin anästhesiert Mäuse Bewegung in der MRI-Scanner zu verhindern. Bereiten Sie eine Stammlösung von Ketamin und Xylazin in phosphatgepufferter Salzlösung (130 ul Ketamin, 42,5 ul Xylazin, 827 & mgr; l PBS). Eine Stunde vor der MRI, mit einem 1-ml sterile Spritze eine Maus subkutan mit 5 ul / g Körpergewicht dieser Lösung (65 mg Ketamin und 4,25 mg xylaz einzuspritzenine pro kg Körpergewicht). Trockenheit unter Narkose gelten veterinär Salbe auf die Augen des Tieres zu verhindern.
- Wie oben Nach Induktion mit Ketamin / Xylazin, befestigen ein 1,5 cm 2 Fläche auf der linken unteren Hälfte der Maus Bauch # 40 oder feiner elektrische Schermesser verwenden. Nach Fell Entfernung, prep den Bereich mit 8 bis 12% verdünnte Jod chirurgische schrubben und spülen mit 70% Alkohol - beide Schritte wiederholen. Legen Sie eine 24-Gauge von 0,75-Zoll-Nadel / Katheter subkutan und Tunnel in die Bauchhöhle. Stellen Sie sicher, dass der Katheter nicht in den Blinddarm oder andere Bauchorgan durch Ziehen an den Kolben zurück - es sollte in den Katheter kein Blut oder fäkale Material sein.
- Entfernen Sie die Nadel und lassen Sie die intraperitoneale Katheter. Platzieren Sie die Maus auf einem temperaturgesteuerten Thermal-Pad in der MRI-Scanner Tierkammer.
- Bereiten Sie eine 1-ml sterile Spritze mit Ketamin und Xylazin in phosphatgepufferter Salzlösung (1000 ul Ketamin, 300 ul Xylazin, 6700 & mgr; l PBS) und die gewünschte Länge von 72-Zoll-sterile Schläuche zu füllen. Verbinden Sie den intraperitoneale Katheter in die prefilled sterile Schläuche und verlängern sie von der MRI-Scanner entfernt. Zur Aufrechterhaltung der Anästhesie 50 ul dieser Lösung injizieren alle 20 Minuten, wenn die Vitalfunktionen des Maus stabil sind.
HINWEIS: Vor dem Imaging, stellen Sie sicher, keine Metalle sind in der Nähe der MRT-Scanner. - Verwenden , um eine 19 F / 1 H Dual-tuned linear Volumen MRI - Spule zur Übertragung und Hochfrequenzsignale bei 300,283 MHz für 1 H und 282,524 MHz für 19 F - Kerne zu erhalten.
- Führen Sie die Systemkalibrierung 11, 13 und Tier Lokalisierung mit Drei Scheibe (axial, mittsagittale und koronalen) scout Bilder einen schnellen Low-angle shot - Sequenz mit (FLASH). Um das Experiment zu starten, klicken Sie auf die "Ampel" Taste im Fenster Scan Control auf der Software-Konsole.
- Acquire Multislice - 1 H - MR - Bildern schnelle Erfassung mit Entspannung mit verbessernment (RARE) Sequenz in der Queransicht der Probe oder dem Körper des Tieres mit Wiederholungszeit 2200 ms, Echozeit 8,9 ms, RARE Faktor 8, Sichtfeld 4 x 4 cm 2, Schichtdicke 1,0 mm, Matrixgröße 266 in der gleichen Ebene x 266, Auflösung 150 x 150 & mgr; m 2, und die Anzahl der Mittelwerte 6. das Experiment zu starten, klicken Sie auf die "Ampel" Taste im Fenster Scan Control auf der Software - Konsole.
- Erwerben Sie 19 F Bilder eine FLASH - Sequenz in der gleichen Region des 1 H - MRI mit Wiederholungszeit 220 ms, Flipwinkel = 30 °, Echozeit 3,078 ms verwenden, Matrixgröße 32 x 32, Auflösung in der Ebene von 1,25 x 1,25 mm 2, Schichtdicke 4,0 mm und Anzahl der Mitte 768. das Experiment zu starten, klicken Sie auf den "GOP" (G o- O n- P ipeline) Taste im Spectrometer Control Tool - Fenster auf der Software - Konsole.
- Nach MRI, einschläfern die Maus mit intraperitoneale INJEKTIERTauf 15 ul / g Körpergewicht Ketamin / Xylazin-Lösung (150 mg Ketamin / Xylazin 18 mg pro kg Körpergewicht) durch Herzpunktion zum Ausbluten gefolgt.
- Um eine Maus aus der Narkose erholen, entfernen Sie die intraperitoneale Katheter aber nicht verlassen, das Tier unbeaufsichtigt, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt Brustlage zu halten.
- Zur Messung der 19 F-markierten Gallensäure - Konzentrationen von 11 bis 13 aus Organentnahme, halten Anästhesie mit Ketamin und Xylazin wie oben beschrieben.
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Representative Results
Die Verwendung von MFBA für in vivo - MRT zu "sehen" Gallensäuretransport in Echtzeit hat ein großes Potenzial für die Forschung und die klinische Anwendung. Außerdem beschriebenen Verfahren hier zur Resektion der Gallenblase und biochemische Analyse seines Inhalts unter Verwendung von Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie ein Mittel zur Bildergebnisse bestätigt. Jedoch erfordert die Gültigkeit dieser Verfahren eine genaue Dosierung, Timing von Assays und Lokalisierung der Gallenblase für die Bildgebung oder chirurgische Entfernung. Für letztere ist es sehr wichtig, dass die Bauchorgane der Maus so wenig wie möglich gestört werden; sogar sanfte Manipulation der Gallenblase kann Kontraktion und Entleerung stimulieren. Daher seinen gesamten Inhalt zu erfassen, ist es wichtig, die Klemme über den gemeinsamen Gallengang zu plazieren, so bald wie möglich.
Unter Verwendung der chirurgischen Ansatz hier vorgeschlagen, die Gallenblasesollte leicht hinter dem rechten Vorderlappen der Leber in der rechten oberen Quadranten des Abdomens (Figur 3) identifiziert werden. die Leber bewegen beiseite, ohne die Gallenblase zu berühren macht die Gallengang zum Spannen. Sobald diese Klemme an Ort und Stelle ist, sollte es keine Schwierigkeiten mit den anderen Schritten in dem Protokoll beschrieben fortfahren, um die Gallenblase intakt zu entfernen.
Die Daten in Tabelle 1 zeigen , hoch selektive Konzentration von MFBA in der Gallenblase 13,14. Organ (Leber und Gallenblase) Konzentrationen von MFBA wurden unter der Annahme einer Dichte von 1 g / ml 13,14 berechnet. Innerhalb von 7 Stunden nach oraler Gabe, die durchschnittliche Anreicherung von MFBA in der Gallenblase war mehrere Größenordnungen (1000-fach) höher ist als die entweder in der Leber oder Blut beobachtet 13,14; millimolare Niveaus wurden in der Gallenblase gegenüber mikromolaren Ebenen in Leber und Blut (Tabelle 1 beobachtet </ Strong>). Durchschnittliche MFBA Konzentrationen reichten von 0,4 bis 1,4 & mgr; M im Blut, 14,5-78,8 mM in der Leber und 18,4-27,0 mM in Galle. Diese Ergebnisse sind konsistent mit MFBA wobei der gleiche wie physiologischen Gallensäuren behandelt; nach oraler Dosierung werden MFBA aktiv durch ASBT in den enterohepatischen Kreislauf transportiert werden, wodurch sie für den aktiven Transport in Hepatozyten durch den Natrium / Taurocholat co-transportierende Polypeptid (NTCP) in die Leber transportiert werden, und in der Gallenblase für die Konzentration in den Gallenbaum ausgeschieden (Abbildung 1).
Abbildung 4 zeigt zeitabhängige Akkumulation des 19 F - Signal in der Gallenblase nach der Schlundsonde mit MFBA. Eine detailliertere Zeitverlauf mit analytischen Methoden (LC / MS / MS) zeigte , dass Peak Gallenblase Konzentrationen von MFBA wurden im Bereich von 4 bis 7 Stunden nach oraler Gabe 12, eine Suche im Einklang mit den physiologischen Kinetik beobachtetenterohepatischen Zirkulation von Gallensäuren. Das linke Feld in 4, ein MRT - Bild zwei erworben und eine halbe bis vier Stunden nach der Schlundsonde mit MFBA, zeigt 19 F - Signal von ausgehen , was scheint ausgeht den gemeinsamen Gallengang (gestrichelte Pfeil) und ein robusteres Signal sein , von die Gallenblase (Pfeil); von 7 bis 8,5 h, der Ductus choledochus Signal nicht mehr erkannt wird und die Gallenblase 19 F - Signal auf die gleiche Intensität wie das von der benachbarten MFBA phantom (Abbildung 4, rechte Tafel, Pfeil) ausgeht erhöht.
Wir verwendeten Mäuse, die mit mangelhaften Ausdruck ASBT die Fähigkeit von MFBA-MRT zu testen reduzierten intestinalen Aufnahme von Gallensäuren zu erkennen. Wie in 5A dargestellt ist , wurde eine etwa 22-fache Verringerung in der Konzentration von in MFBA Gallenblase von ASBT-defizienten Mäusen gemessen durch LC / MS 13,14; auf der Grundlage dieser Erkenntnisse wurde erwartet tham MFBA 19 F - MRT - Signal bei diesen Tieren würde unterhalb der Nachweisgrenze liegen. Tatsächlich ist , wie in 5B gezeigt, während ein robustes 19 F - Signal aus der Gallenblase ausgeht , in einer Wildtyp - Maus erkannt wurde, gab es keine entsprechende 19 F - Signal in der ASBT-defizienten Maus 13,14. Diese Ergebnisse bestätigen, dass MFBA ähnlich physiologischen Gallensäuren behandelt werden, und dass MFBA-MRI verwendet werden, zu einer Beeinträchtigung der intestinalen Aufnahme von Gallensäuren detektieren.
Abbildung 4: Repräsentative MFBA-MRI - Bilder.
Die Ergebnisse der Experimente in lebenden Mäusen zeigen Rekonstruktion Overlays von 19 F und 1 H - Bilder zeigen , dass 19 F - Signale von der Maus Gallenblase (große Pfeile) ausgehen. Referenz Phantome bekannte Konzentrationen von 19 F-markierten Gallensäuren enthalten , warenim MRI-Scanner neben der Maus (Pfeil nach links) platziert. In der linken Spalte zeigt die gestrichelte Pfeil 19 F-markierten Gallensäure - Signal aus dem Gallengang ausgeht. Aufgenommen über jeder Platte ist die Zeit , nach der Schlundsonde mit 19 F-markierten Gallensäure , die MRT zu der Zeit war , dass Bild gestartet wurde Akquisition abgeschlossen (1,5 h). Wie erwartet, mit den 19 F-markierten Gallensäure steigt mit der Zeit füllt Gallenblase. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Abgeschwächte MFBA-MRI - Signal von Gallenblasen von ASBT-defizienten Mäusen.
(A) Balkendiagramm zeigt , dass die Konzentration von MFBA durch LC gemessen / MS / MS ist etwa 22-fach niedriger in ASBT-defizienten Mäusen vergleichend zur Bekämpfung von Mäusen. (B) Absent MFBA-MRT - Signal aus der Gallenblase eines ASBT-defizienten Maus. Pfeilspitzen zeigen 19 F-markierten Gallensäure Phantome (linke Felder) und 19 F - MRT - Signal von Phantomen (rechte Felder). Der Pfeil in der rechten oberen Platte zeigt 19 F-markierten Gallensäure - Signal aus der Gallenblase ausgeht; gibt es keine entsprechenden 19 F-markierten Gallensäure - Signal in der ASBT-defizienten Maus (unten rechts). Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Gallenblasenhydrops Gewicht (mg) | MFBA Konzentration | |||
| Gallenblasenhydrops (mM) | Leber (uM) | Plasma (uM) | ||
| CA-lys-TFA | 25,2 ± 3,2 | 27,0 ± 2,4 | 78,8 ± 35,1 | 0,4 ± 0,2 |
| CA-sar-TFMA | 29,2 ± 2,4 | 18,4 ± 1,6 | 14,5 ± 0,6 | 1,4 ± 0,1 |
Tabelle 1: Repräsentative Werte für die Gallenblase, Leber und Plasma - Konzentrationen von 19 F-markierten Bile Acids.
Mittelwert ± Standardfehler (SE) Werte für Gallenblase Gewicht und die Konzentrationen der angegebenen MFBA in der Gallenblase, Leber und Plasma 12,13 gezeigt. Die gezeigten Werte wurden 5 bis 7 h gemessen, nachdem Mäuse mit 150 mg / kg Körpergewicht des angegebenen MFBA gavaging. Man beachte die millimolaren Konzentrationen von MFBA in der Gallenblase gegenüber mikromolaren Konzentrationen in der Leber und Plasma. N = 3 mice pro Wert für CA-lys-TFA und 5 Mäuse pro Wert für CA-sar-TFMA.
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Discussion
Die Synthese von CA-lys-TFA und CA-sar-TFMA und die in - vitro - Analyse der Transport stabil transfizierten Madin-Darby - Hundenierenzellen unter Verwendung von ASBT und humane embryonale Nierenzellen exprimieren , die Expression des Natrium / taurocholate Co-Transport Polypeptid (NTCP) werden an anderer Stelle 13,14 detailliert beschrieben. Hier liegt der Schwerpunkt auf die orale Verabreichung von MFBA mit der Schlundsonde Tiere leben, gefolgt von der Ernte der Gallenblase, Leber und Blut für die Analyse von MFBA Inhalte und insbesondere, Abbilden MFBA in der Gallenblase durch lebende Tiere MRI. Kritische Schritte umfassen die Vermeidung Fluorbasis Anästhetika , die 19 F - Signale im Wettbewerb schaffen kann, Gallenblase Manipulation zu vermeiden , bevor Sie den Gallengang Spann , die in Kontraktion der Gallenblase führen und Entleerung vor dem Organ herausgeschnitten und die Platzierung von Metallen in der Nähe der MRT - Scanner zu vermeiden.
Wie detailliert hier und anderswo 13,14, MFBA-MRT hat ein großes Potenzial to erfolgreich Gallensäuretransport in vivo unter normalen und abnormalen physiologischen Bedingungen zu analysieren. Stärken von MFBA-MRI sind, dass es keine ionisierende Strahlung (weder MFBA mit natürlich vorkommenden, nicht-radioaktiven Fluor oder MRI emittieren ionisierenden Strahlung labeled) und MFBA werden, ohne dass Venenpunktur oral verabreicht umfasst (im Gegensatz zu Mäusen, die meisten Menschen erfordern nicht die parenterale Verabreichung von Anästhetika oder Sedativa Bewegungsartefakten in der MRI-Scanner) zu verhindern. Die Substitution von einer hydrolysierbaren Gallensäure mit einem synthetischen Gallensäure resistent gegen Hydrolyse durch die Darmflora 13,14 kann die in - vivo - Stabilität von MFBA im Darm zu überwinden Fragen in Bezug auf . Der erste Prototyp für MFBA Zugabe beteiligt drei Fluoratome pro Molekül von Cholsäure, einem natürlich vorkommenden menschlichen Gallensäure , die im Darm von Clostridial hydrolysiert Hydrolasen 13,14. Eine neuartige tri-fluorierte Gallensäure, CA-Sar-TFMA, basierend auf einer SarkosinRückgrat, die Hydrolyse durch bakterielle Enzyme resistent ist diese Einschränkung umgangen werden , die Halbwertszeit von MFBA 13,14 erstrecken.
Schließlich eine potentiell konkurrierenden Methodik, die Verwendung von N-methyl- [11 C] Cholylsarcosin für PET / CT, wird durch Strahlungsexposition begrenzt sowohl von der radiomarkierten Gallensäure und CT, und die Notwendigkeit zur Vorbereitung, Schiffs-, und speichern die radioaktive Gallensäure 17.
In Bezug auf Änderungen und Fehlerbehebung für dieses neuartige Methodik kann man , dass ein Scheitern betrachten ein MRI - Signal ausgeht , aus der Gallenblase kann aufgrund eines Problems mit dem 19 F-markierten Gallensäure oder deren Bioverfügbarkeit, den Zeitpunkt der Bildaufnahme oder unzureichende Füllung zu erkennen der Gallenblase. Wie oben diskutiert, wir testen , um die strukturelle Integrität dieser Mittel durch ihre Fähigkeit , durch Zelllinien in vitro transportiert werden die entsprechenden Gallensäure - Transporter exprimieren. Wir erlauben mindestens 1,5 hr für die Bilderfassung, sondern in bestimmten Fällen diese Dauer kann Verlängerung erfordern. Wir finden, dass das Fasten Mäuse vor der MRT maximale Gallenblase Füllung wichtig ist, zu gewährleisten.
Die Nachweisgrenzen für 19 F-MRI - Signale erfordern Tierbildgebung für die 90 - 120 min für eine ausreichende Signalerfassung; Dies ist für einen praktischen klinischen Test zu lang wahrscheinlich - Patienten noch in der MRI-Scanner für die Dauer liegen würde. Auch aktuelle, klinische MRT beruht in erster Linie auf Proton (1 H) Bildgebung; die Anwendung von Fluor (19 F) Bildgebung werden die Investitionen in Hardware erforderlich (19 F - Spule) und Software, mindestens eine Investition $ 250.000 pro MRI - Scanner. Bis andere Fluorbasis MRI-Anwendungen entwickelt werden, unter Verwendung MFBA-MRI Patienten für Gallensäure-Malabsorption zu bewerten ist nicht wahrscheinlich kostengünstiger zu sein.
MFBA-MRT bietet eine vielversprechende Alternative zur Messung 75 SeHCAT Retention, Plasma 7α-Hydroxy-4 -cholesten-3-on (C4) und Plasma-FGF19 oder ein Therapieversuch durchführen Gallensäurebindern. In den USA, Prüfung 75 SeHCAT, die Strahlenbelastung beinhaltet, ist nicht FDA-zugelassen. C4 und FGF19 Tests hat eine geringe positive prädiktive Wert und Prüfung ist derzeit nur durch spezialisierte Labors zur Verfügung. Darüber hinaus spiegeln sowohl C4 und FGF19 Ebenen hepatische Synthese von Gallensäuren. Daher, im Gegensatz zu MFBA-MRT, können diese Tests nicht erkennen veränderte Expression oder Mutation von Ileum-Gallensäure-Transporter oder andere Mechanismen der Gallensäure-Malabsorption, die Synthese von erhöhten Gallensäure unabhängig sind. Therapeutische Studien von Gallensäurebinder können hilfreich sein , aber unsicher prädiktiven Wert haben und 5 eine endgültige Diagnose von Gallensäure - Malabsorption nicht zur Verfügung stellen kann. Schließlich , obwohl die direkte Messung der fäkalen Gallensäuren scheinbar vernünftig wurde diese Jahre abgelehnt vor als zu umständlich, unpraktisch und unzuverlässig für die klinische Routineanwendung 5.
ent "> Zusätzliche Herausforderungen müssen überwunden werden , so dass dieser innovative Ansatz in vivo Gallensäuretransport in der Klinik (zB für die Diagnose von Gallensäure - Malabsorption als Ursache chronischer Durchfall). Eine große Herausforderung zu maximieren übersetzt werden kann zu messen ist Signalintensität durch die Anzahl von 19 F - Atome pro Gallensäuremolekül zu erhöhen , ohne die Fähigkeit der MFBA stören wie natürliche Gallensäuren zu verhalten, das heißt, eine Gallensäure - Molekül , das aufgrund des zugesetzten 19 F - Atome zu sperrig ist , wird nicht durch entweder transportiert werden ASBT oder Gallensäure - Transporter in der Leber. die Fähigkeit der neuartigen MFBA in vitro transportiert werden können , in Zelllinien, die Schlüssel menschlichen Gallensäure - Transporter 13,14 und sollte in vivo Transport prädiktiv getestet werden. mit erhöhter Empfindlichkeit, MFBA-MRI hat das Potential für eine verbesserte Abbildung des gesamten Gallenbaum (zB Gallengang und seine Zweige); in diesem Zusammenhang die Fähigkeit to Bild der Gallengang in einigen Mäusen erscheint vielversprechend (Abbildung 4, links).Obwohl die Stromnachweisgrenzen Gallensäure durch MFBA-MRI deren Visualisierung erlauben nur in der Gallenblase, können die Empfindlichkeit der Technik unter der Annahme verbessert werden , erwarten wir MFBA-MRI verwendet werden könnte , Gallensäure Transport und die Verteilung in vivo zu messen , wodurch umfassenden räumlichen Bereitstellung Informationen anatomisch in Echtzeit; eine Technologie, die die molekulare Bildgebung voranbringen würde. MFBA-MRT wäre auch eine neuartige Technologie bieten die Auswirkungen von Gen-Polymorphismen und Drogen zu bewerten, die Gallensäure-Transporter-Funktion beeinträchtigen. MFBA-MRT hat translationale Potenzial Kliniker für Gallensäure - Malabsorption Bildschirm zu helfen und damit zu identifizieren und Krankheiten verwalten von der erhöhten fäkalen Gallensäuren resultierende (zB Durchfall , die ahmt Reizdarmsyndrom). Schließlich sollte wird diese Technik klinisch verfügbare es große Profi hatmise beschleunigen Fortschritte in der Präzision der Medizin durch die Fähigkeit Bereitstellung veränderte Darmgallensäureaufnahme bei Personen mit colon Neoplasie oder andere Bedingungen zu identifizieren, die durch Veränderungen in der fäkalen Gallensäuren beeinträchtigt werden kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health, National Institute of Diabetes und Magen-Darm-und Nierenerkrankungen (Erteilungsnummern R21 DK093406 und T32 DK067872 zu JP.R.) und ein VA Merit Award (Grantnummer 1BX002129 zu JP.R.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Duall size-21 all glass tissue grinder | Kimble Chase Life Science, Vineland, NJ | 885351-0022 | |
| Bruker BioSpec 70/30USR Avance III 7T horizontal bore MR Scanner | Bruker Biospin MRI GmbH, Germany | Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5) | |
| Bruker 40 mm 19F/1H dual-tuned linerar volume coil | Bruker Biospin MRI GmbH, Germany | Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5) | |
| Waters Acquity UPLC System with Quadrupole Detector | Waters Corporation, Milford, MA | ||
| Waters Acquity UPLC ethylene bridged hybrid C8 1.7 μm 2.1 x 50 mm column | Waters Corporation, Milford, MA | ||
| Gavage Needle | Braintree Scientific, INC. | N-010 | 20 G-1.5" curved 2.25 mm ball |
| 2 Stainless Steel Hemostats | VWR | 10755-018 | 4 and 5 inch, straight |
| Ketamine | MWI Veterinary Supply | 501090 | Ketamin zetamine 100 mg/ml |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 20 mg/ml | |
| Intraperitoneal Catheter | Abbott | AbbocathTM-T.I.V. G720-A01 4535-42 | 24-G x 0.75" |
References
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