Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Använda Multi-fluorerade gallsyror och Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/54597
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 2,6
1Department of Surgery, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 3Department of Radiology, University of Maryland School of Medicine, 4Food and Drug Administration, 5Department of Pharmaceutical Sciences, University of Maryland School of Pharmacy, 6VA Maryland Health Care System

Summary

Verktyg för att diagnostisera gallsyremalabsorption och mäta gallsyratransporten in vivo är begränsade. En innovativ strategi i levande djur beskrivs som utnyttjar kombinerad proton (1H) plus fluor (19 F) magnetisk resonanstomografi; denna nya metod har translationell potential att screena för gallsyremalabsorption i klinisk praxis.

Abstract

Tillsammans med sin traditionella roll som rengöringsmedel som underlättar fettupptag, tillväxt litteratur visar att gallsyror är potenta signalmolekyler som påverkar flera organ; de modulera tarmmotilitet och hormonproduktion, och ändra kärltonus, glukosmetabolism, lipidmetabolism, och energiutnyttjande. Förändringar i fekala gallsyror kan förändra tarmen microbiome och främja kolon patologi inklusive cholerrheic diarré och koloncancer. Nyckelregulatorer av fekal gallsyra sammansättning är tunntarmens Apikal natriumberoende Bile Acid Transporter (ASBT) och fibroblasttillväxtfaktor-19 (FGF19). Minskad uttryck och funktion ASBT minskar intestinal gallsyror upptagning. Dessutom in vitro-data tyder på att vissa FDA-godkända läkemedel hämmar ASBT funktion. Bristfällig FGF19 frisättning ökar lever gallsyrasyntes och släppa in tarmarna till nivåer som överväldiga ASBT. Antingen ASBT dysfunktion eller FGF19 brist ökar feCAL gallsyror och kan orsaka kronisk diarré och främja kolon neoplasi. Tyvärr, till verktyg mäta gallsyremalabsorption och åtgärder av läkemedel på gallsyratransporten in vivo är begränsade. För att förstå de komplexa åtgärder av gallsyror är tekniker krävs att medge samtidig övervakning av gallsyror i tarmen och metaboliska vävnader. Detta fick oss att tänka sig en innovativ metod för att mäta gallsyratransport med levande djur med användning av en kombination av proton (1 H) och fluor (19 F) magnetisk resonanstomografi (MRI). Nya spårämnen för produktion av fluor (19 F) -baserade levande djur MRI skapades och testades, både in vitro och in vivo. Styrkor med denna strategi är bristen på exponering för joniserande strålning och translationell potential för klinisk forskning och praktik.

Introduction

Tillsammans med sin klassiska roll som rengöringsmedel som underlättar fettupptag från tarmen har gallsyror dykt upp som starka signalmolekyler som påverkar flera organ utöver dem som förknippas med deras enterohepatiska kretsloppet 1,2. Förutom att styra sin egen metabolism, gallsyror modulera flera aspekter av gastrointestinalfysiologi (t.ex. tarmmotilitet och inkretinhormon produktion, kolon fysiologi, och cancerbenägenhet) och har systemiska effekter på kärltonus, glukos och lipidmetabolism, och energiutnyttjande. Medan vissa av dessa effekter förmedlas i tarmen, andra beror på postprandial förändringar i system galla syranivåer, som noterades hos överviktiga patienter eller efter gastric bypass-kirurgi. Att belysa de komplexa metaboliska verkningarna av gallsyror ny teknik krävs att medger samtidig övervakning av galla syranivåerna i olika anatomiska fack, i mag-tarmkanalen och metaBolic vävnader (lever, pankreas, skelettmuskel och adipösa). Erhålla sådan tids och geografisk information kräver innovativ teknik - in vivo imaging med nya gallsyrabindande spårämnen som beskrivs här är en sådan ny metod.

Galla syresammansättning och fördelning i anatomiska fack regleras av faktorer som modulerar deras lever syntes och ileal upptag, inklusive kost, kirurgi, antibiotika och förändringar i tarmfloran. En viktig regulator av intestinal gallsyror upptag för deras enterohepatisk cirkulation 3 (figur 1) är den ileal Apikal natriumberoende Bile Acid Transporter (ASBT, SLC10A2). Även passiv absorption förekommer i hela tarmen, ASBT förmedlar upptag av 95% av tarm gallsyror, så att normalt finns begränsad spill av gallsyror i avföringen. Asbt fattiga (Slc10a2 - / -) möss har ökat fekal gallsyror och en minskad galla acid pool 4.

Figur 1
Figur 1: enterohepatiska kretsloppet av gallsyror.
Illustration av enterohepatisk cirkulation där gallsyror syntetiseras i levern, utsöndras i gallan träd, lagras i gallblåsan, släpps ut i proximala tunntarmen med måltider, och aktivt tagit upp via ASBT i krumtarmen. Medan små mängder av gallsyrorna absorberas passivt genom hela tarmen, ligger ungefär 95% av tarm gallsyror transporteras aktivt genom ASBT vilket resulterar i minimal (ca 5%) förlust i avföringen vilket kompenseras av en liknande mängd ny gallsyrasyntesen i levern, och därigenom bibehålla en steady-state gallsyrepoolen. Pilarna till höger identifiera faktorer som kan påverka infödda och fluor-märkt galla syrastabilitet, inklusive magsyra, bukspottkörtel och tarmslemhinnans enzymer, och de flesta importantly, hydrolytiska enzymer släpptes av Clostridium arter som koloniserar den distala tunntarmen och tjocktarmen. (Ändrad med tillstånd 16) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Gallsyremalabsorption kan kategoriseras i tre typer, vilka var och en ökar fekal dihydroxi gallsyror och därigenom orsakar intermittent eller kronisk diarré. Skriv 1 resultat från brutto ileal patologi (t.ex. resektion, Crohns sjukdom) 5. Skriv 3 resultat från kolecystektomi, Vagotomy, celiaki, bakteriell överväxt och pankreasinsufficiens. I motsats, personer med "primär" (typ 2) gallsyremalabsorption utgör en formidabel diagnostisk utmaning eftersom de saknar sådana antecedent förhållanden och inte har bevis för patologi i ileum. Därför primär gallsyremalabsorption allmänt misdiagnosed som diarré-predominant irritabel tarm (IBS-D), kanske den vanligaste orsaken till gastroenterologi relaterade öppenvårdsbesök. Det har uppskattats att en tredjedel av patienterna med IBS-D har primär gallsyremalabsorption; i USA, kan detta representera flera miljoner personer 5. Nya insikter visar att primär BAM härrör från nedsatt återkoppling hämning av lever gallsyrasyntesen genom tarm fibroblasttillväxtfaktor-19 (FGF19), inte från minskat uttryck eller funktion ASBT.

Vid primär gallsyremalabsorption, låga plasmanivåer av FGF19 misslyckas att stänga lever gallsyrasyntes - den resulterande ökningen av tarm gallsyror mättar gallsyror transportörer, inklusive ASBT och förstärkt spill av gallsyror i avföringen orsakar diarré 6 (Figur 2). Möss som saknar Fgf15 (murin FGF19) har en utökad gallsyrapoolen och ökad fekal gallsyror 7.


Figur 2: Mekanismer för Intestinal gallsyremalabsorption.
Normalt som visas i panel A, är cirka 95% av tarm gallsyror absorberas genom aktiv transport i distala ileum via ASBT. När ASBT uttryck eller aktivitet minskar (panel B), osäkra tarm gallsyra upptagsresulterar i spill av gallsyror i tjocktarmen. Med nedsatt FGF19 signalering (panel C), avsaknaden av återkoppling hämning av lever gallsyrasyntes resulterar i ökade koncentrationer av tarm gallsyror som överväldiga ASBT transportkapacitet med spill av gallsyror i tjocktarmen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Långsiktig, kronisk förhöjning av fekal galla acids kan främja kolon neoplasi. Kolon neoplasi härrör från progressiv mucosal dysplasi i samband med somatiska genmutationer, men miljöfaktorer som ökar fekala gallsyror kan påskynda och förstärker denna process. Hos gnagare ökade fekala gallsyror antingen som en följd av exogen administration eller Asbt brist främjar kolon dysplasi och tumörbildning 8-10.

Noterbart är provocerande fynd tyder på att ofta använda läkemedel som godkänts av Food and Drug Administration (FDA) hämmar potent gallsyratransporten av ASBT in vitro 11. Om dessa läkemedel minska tunntarms gallsyratransporten in vivo och öka fekal gallsyra-nivåer, skulle den potentiella inverkan på kolon patologi vara oroande. Även en liten ökning av kolon patologi tillskrivas användningen av ett sådant läkemedel skulle kunna ha en stor inverkan på hälsan. En verktygslåda som kan bedöma rimligheten i dessa in vitro fynd och epidemiologisk observa skulle sporra ytterligare forskning, inklusive efter marknadssäkerhetsstudier.

Trots behovet praktiska analyser identifiera personer med gallsyremalabsorption saknas. Direkt mätning av fekal gallsyror avvisades år sedan som besvärliga, opraktiska och opålitlig 5. Alternativa metoder innefattar mätning av bibehållande av en radioaktiv selen-märkt cholsyra derivat (75 SeHCAT) och plasmanivåer av 7α-hydroxy-4-kolesten-3-en (C4), eller ett terapeutiskt prov av gallsyrabindare. 75 SeHCAT testning har begränsad tillgänglighet i Europa och är inte FDA-godkända eller tillgänglig för användning i USA även måttlig exponering för strålning (0,26 mSv / 75 SeHCAT test) från diagnostiska tester väcker oro, och bakteriell överväxt och avancerad leversjukdom kan förväxla 75 SeHCAT resultat. C4 testning är potentiellt attraktiv eftersom endast plasma krävs, men det har låg positivt prediktiva value och testning är inte allmänt tillgängliga. Mäta serumnivåer av FGF19 har liknande begränsningar. Vanliga kliniker tillgripa en terapeutisk prövning av gallsyrabindare, men detta tillvägagångssätt kan inte ge en definitiv diagnos av gallsyremalabsorption 5.

Av dessa skäl har en ny MR metod tänkt att mäta gallsyratransporten och distribution in vivo med hjälp av innovativa fler fluorerade gallsyror (MFBA-MRI). MFBA innehållande tre atomer av fluor (19 F), en stabil isotop av 100% naturligt överflöd, transporteras på samma sätt som nativa gallsyror 12, och kan användas för att visualisera gallsyratransport med en kombination av proton (1 H) och fluor ( 19 F) MRI, en känslig, säker metod utan joniserande strålning 13,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Följande protokoll följer riktlinjer som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Maryland School of Medicine (IACUC protokollet # 0.415.011, godkänd 18 juni, 2015).

1. Gavaging möss med 19 F-märkt gallsyror

  1. Sondmatning möss med 150 mg / kg kroppsvikt 19 F-märkta gallsyror. Fyll en 1-ml spruta till den nödvändiga volymen med 19 F-märkta gallsyran stamlösning [cholsyra-trifluor-acetyl lysin (CA-lys-TFA; i 1: 1 polyetylenglykol 400: Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning) eller cholylsarcosine- trifluor-N-metyl-acetamid (CA-sar-TFMA; i 60% polyetylenglykol 400 och 40% Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning] och bifoga en 20-gauge 1,5-tums böjd bulb-tippas magsond nålen Se till att sondmatning nålen. är tillräckligt lång för att nå den nivå på musens xyphoid brosk när de sätts i matstrupen upp till navet i nålen
  2. stadigt grasp djuret genom den lösa huden på baksidan av halsen mellan tummen och pekfingret och använda de återstående fingrarna att få grepp om huden på nedre delen av ryggen och svans.
  3. Håll musen upprätt och passera sondmatning nålen längs sidan och taket i munnen i matstrupen och ner i magsäcken. Om motstånd uppstår vid svalget, flytta nålen tills djurets sväljer "det - inte skjuta mot motstånd.
  4. Om anestesi krävs för sondmatning, placera musen i en glaskupa som innehåller 5 ml isofluran och nära. När musen faller på sin sida, vänta 7 sekunder, ta bort musen och utföra sondmatning. Att skydda personalen från anestetiska ångor, använd glasklockan endast i ett dragskåp.
  5. Observera djuret återhämta sig från isofluran i några minuter.
    OBS: Eftersom isofluran metaboliseras av levern, en fluor signalen från intakt läkemedel eller dess metaboliter utsöndras i galla och gallblåsan kan förväxla fluoRine signaler från 19 F-märkta gallsyror 15. Ett alternativ är att använda ketamin plus xylazin (se avsnitt 3.1 för doser).

2. Skörd gallblåsan, levern och blod för gallsyra mätningar med Liquid Chromatography / Mass Spectrometry

  1. För att uppnå maximal gallblåsan fyllning, snabb möss under minst 6 h före skörd av organ. Förbereda ketamin och xylazin i fosfatbuffrad saltlösning (100 pl ketamin, 62,5 | il xylazin, 840 pl PBS).
  2. Med hjälp av en 1 ml steril spruta, injicera en mus subkutant en timme före organskörd med 15 pl / g kroppsvikt av ketamin / xylazin (150 mg ketamin och 18 mg xylazin per kg kroppsvikt).
  3. En timme efter administrering ketamin / xylazin bekräfta adekvat anestesi genom tå nypa och placera sövd mus liggande.
  4. Använd 5 eller 6 tums sax för att göra en mittlinje bukhuden snitt från pubis till xyphoid och fine sax (4 tum) för att skära peritoneal foder och exponera bukorganen - inte att tränga igenom membranet.
  5. Ta tag i xyphoid processen med en 5 tum klämma och lyft tillbaka över bröstet för att exponera den övre bukhålan. Använd pincett och ett trubbigt instrument för att dissekera och flytta levern åt sidan, exponera gallblåsan.
    OBS: inte SARGA levern eller peka gallblåsan som tidigare kommer att orsaka svåra blödningar och den senare kan stimulera gallblåsan kontraktion och tömning.
  6. Placera en 4-tums klämma över den gemensamma gallgången (Figur 3, streckade pilar). Skära ligamentet fäster den överlägsna pol av gallblåsan till membranet och försiktigt flytta gallblåsan till den högra sidan av buken.

Figur 3
Figur 3: Anatomiska och Proton MRI Utsikt över Mouse gallblåsan.
Den vänstra panelen visar den exponerade mouse gallblåsan till vänster om mittlinjen efter buksnitt. Klämman greppar xyphoid processen. Gallan fyllda faste gallblåsan indikeras av den stora pilen och den fastklämda gemensamma gallgången med de streckade pilarna. [Infällt: utskurna intakt gallblåsan med den gemensamma gallgången fastklämd. Linjalen är markerad i millimeter (mm).] Den högra panelen visar en högupplöst protondensitets viktade MRI-bild av den fasta mus gallblåsan (pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Innan skära gallblåsan utföra hjärtpunktion, skörd blod, och exsanguinate djuret att kontrollera dödshjälp.
    OBS: Skörda gallblåsan först kan SARGA levern orsakar kardiovaskulär kollaps och underlåtenhet att erhålla en adekvat blodprov (≥ 200 ^).
  2. Exponera undersidan av det vänstra membranet ochidentifiera beating hjärtats yta. Vid punkten för maximal hjärtpulse punktera membranet och hjärtat med en 23-gauge nål fäst till en 1-ml spruta.
    1. Sakta dra sprutan medan aspire. När blodet börjar fylla sprutan, sluta dra och upprätthålla sug för att samla in 0,2 till 0,6 ml blod. Försiktigt vrida nålen eller återkalla den något kan återupprätta flödet om den upphör.
    2. Överföra blodet till en 1,5-ml hepariniserat rör och centrifugera vid 2000 xg under 15 min. Fälla ut plasma med fyra delar acetonitril och centrifugera vid 12.000 xg under 10 min. Analysera supernatanten genom vätskekromatografi / masspektroskopi (LC / MS / MS) 11-1312-1412-1412-1412-14. Om det behövs, förvara plasma vid -80 ° C före analys.
  3. Med hjälp av dissektion, befria gallblåsan från levern. Transekt gallgången under klämman, ta bort och väga gallblåsan, och placera den i en 1,5 ml microcentrifuge röret. Skörda levern.
  4. Homogenisera cirka 100 mg av lever och hela gallblåsan på is i en storlek-21 glasvävnadshomogenisator. Extrahera med 75% acetonitril och 25% vatten (800 | il för lever, 300 | j, l för gallblåsan) och centrifugera vid 12.000 xg under 10 min. Späd extrakt som behövs och kvantifiera gallsyrabindande innehåll med hjälp av LC / MS / MS 11-13.

3. Levande djur Proton (1 H) och Fluor (19 F) Magnetic Resonance Imaging

  1. För att uppnå maximal gallblåsan fyllning, snabb möss under minst 6 h före avbildning. Använda ketamin och xylazin, söva möss för att förhindra rörelse i magnetkamera. Bered en stamlösning av ketamin plus xylazin i fosfatbuffrad saltlösning (130 pl ketamin, 42,5 l xylazin, 827 pl PBS). En timme före MRI, använda en 1-ml steril spruta för att injicera en mus subkutant med 5 | j, l / g kroppsvikt av denna lösning (65 mg ketamin och 4,25 mg xylazine per kg kroppsvikt). För att förhindra torrhet under narkos gäller veterinär salva till djurets ögon.
  2. Efter induktion med ketamin / xylazin som ovan, klipp ett 1,5 cm 2 område på vänstra nedre halv av musen buken med användning av # 40 eller finare elektrisk clipper blad. Efter päls avlägsnande, prep området med 8-12% utspädd jod kirurgiska skrubba lösning och skölj med 70% alkohol - upprepa båda stegen. Sätt en 24-gauge med 0,75-tums nål / kateter subkutant och tunnel i bukhålan. Kontrollera att katetern inte är i cekum eller annan abdominal organ genom att dra tillbaka kolven - bör ingen blod eller fekalt material i katetern.
  3. Ta bort nålen och lämna intraperitoneal katetern. Placera musen på en temperaturstyrd värmedyna i magnetkamera djurkammaren.
  4. Bered en 1-ml steril spruta innehållande ketamin och xylazin i fosfatbuffrad saltlösning (1000 il ketamin, 300 pl xylazin, 6700 ^ il PBS) och fylla den önskade längden av 72-tums sterila tuber. Anslut intraperitoneal katetern till förfyllda sterila rör och sträcker sig bort från magnetkamera. För att bibehålla anestesi injicera 50 mikroliter av denna lösning var 20 min om musen vitala är stabila.
    OBS! Innan avbildning, göra vissa inga metaller är nära magnetkamera.
  5. Använd en 19 F / 1 H dubbla trimmad linjär volym MRI pole för att sända och ta emot radiosignaler frekvens 300,283 MHz för en H och 282,524 MHz för 19 F kärnor.
    1. Utför systemkalibrering 11, 13 och djur lokalisering med tre-skiva (axial, mid-sagittal och koronala) scout bilder med hjälp av en snabb låg vinkel sköt sekvens (FLASH). För att starta experimentet genom att klicka på "trafikljus knappen i fönstret Scan kontroll på programvaran konsolen.
    2. Förvärva multisnitts 1 H MR-bilder med hjälp av snabb förvärv med avkoppling förbättraning (sällsynt) sekvens i tvär tanke på provet eller djurkroppen med repetitionstid 2200 ms, eko tid 8,9 ms, SÄLLSYNT faktor 8, synfält 4 x 4 cm 2, skivtjocklek 1,0 mm, matrisstorlek 266 x 266, i planet upplösning 150 x 150 pm 2, och antalet genomsnitt 6. för att starta experimentet genom att klicka på "trafikljus knappen i fönstret Scan kontroll på programvaran konsolen.
    3. Förvärva 19 F bilder med hjälp av ett FLASH-sekvens i samma region av en H MRI med repetitionstid 220 ms, flip-vinkel = 30 °, ekotid 3.078 ms, matrisstorlek 32 x 32, i planet upplösning 1,25 x 1,25 mm 2, snittjocklek 4,0 mm, och antalet genomsnitt 768. för att starta experimentet genom att klicka på "GOP" (G o- O n- P ipeline) knappen Spectrometer Control Tool fönster på programvaran konsolen.
  6. Efter MRI, avliva musen med intraperitoneal injectipå av 15 | il / g kroppsvikt ketamin / xylazin-lösning (150 mg ketamin / 18 mg xylazin per kg kroppsvikt), följt av hjärtpunktion för blodtömning.
  7. Om du vill återställa en mus från anestesi, ta bort den intraperitoneala katetern men inte lämna djuret obevakad tills det återfår tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
  8. För att mäta 19 F-märkta gallsyror koncentrationerna 11-13 från organskörden, upprätthålla anestesi med ketamin plus xylazin som beskrivits ovan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Användningen av MFBA för in vivo MRI för att "se" gallsyratransport i realtid har stor potential för både forskning och klinisk användning. Dessutom är de metoder som beskrivs här för resektion av gallblåsan och biokemisk analys av dess innehåll med hjälp av vätskekromatografi och masspektrometri tillhandahålla ett sätt att bekräfta bildbehandling resultat. Men giltigheten av dessa metoder kräver noggrann dosering, tidpunkt för analyser och lokalisering av gallblåsan för avbildning eller kirurgiskt avlägsnande. För den senare, är det mycket viktigt att musens bukorganen störas så lite som möjligt; även mild manipulation av gallblåsan kan stimulera sammandragning och tömning. Därför, för att fånga hela dess innehåll, är det kritiskt att placera klämman över den gemensamma gallgången så snart som möjligt.

Använda kirurgisk metod som föreslås här, gallblåsanbör lätt identifieras bakom höger främre loben av levern i det övre högra kvadranten av buken (Figur 3). Flytta levern åt sidan, utan att röra gallblåsan exponerar den gemensamma gallgången för fastspänning. När denna klämma är på plats, bör det inte finnas några svårigheter fortsätter med de övriga stegen som beskrivs i protokollet för att ta bort gallblåsan intakt.

Data i tabell 1 avslöjar mycket selektiv koncentration av MFBA i gallblåsan 13,14. Organ (levern och gallblåsan) koncentrationer av MFBA beräknades genom antagande av en densitet av 1 g / ml 13,14. Inom 7 h av oral dosering, i genomsnitt ansamling av MFBA i gallblåsan var flera storleksordningar (1000-faldigt) högre än den som observerades i antingen lever eller blod 13,14; millimolar nivåer observerades i gallblåsan jämfört mikromolära halter i lever och blod (Tabell 1 </ Strong>). Genomsnittlig MFBA koncentrationer varierade från 0,4 - 1,4 mikrometer i blodet, från 14,5 till 78,8 mM i levern, och 18,4-27,0 mM i gallblåsan. Dessa resultat överensstämmer med MFBA som hanteras på samma sätt som fysiologiska gallsyror; efter oral dosering är MFBA aktivt transporteras genom ASBT i den enterohepatiska cirkulationen varigenom de transporteras till levern för aktiv transport i leverceller från natrium / taurokolat co-transporterande polypeptid (NTCP), och utsöndras i gallan träd för koncentration i gallblåsan (Figur 1).

Figur 4 visar tidsberoende ackumulering av 19 F-signalen i gallblåsan efter sondmatning med MFBA. En mer detaljerad tidsförlopp med hjälp av analytiska metoder (LC / MS / MS) indikerade att topp gallblåsan koncentrationer av MFBA observerades i intervallet 4-7 timmar efter oral dosering 12, en iakttagelse överensstämmer med de fysiologiska kinetikenterohepatisk cirkulation av gallsyror. Den vänstra panelen i figur 4, en MRI-bild förvärvat två och en halv till fyra timmar efter oral sondmatning med MFBA avslöjar 19F signalen från vad som verkar vara den gemensamma gallgången (streckad pil) och en mer robust signal som härrör från gallblåsan (pil); med 7-8,5 timmar, är den gemensamma gallgången signalen inte längre detekteras och gallblåsan 19F signal har ökat till samma intensitet som härrör från den intilliggande MFBA fantom (Figur 4, högra panelen, pil).

Vi använde möss med bristfällig expression av Asbt att testa förmågan hos MFBA-MRI för att detektera reducerad intestinal upptagning av gallsyror. Såsom illustreras i figur 5A, en cirka 22-faldig reduktion i koncentrationen av MFBA i gallblåsan från Asbt-brist möss mättes med LC / MS 13,14; baserat på dessa fynd var det förväntade thpå MFBA 19 F MRI signal i dessa djur skulle ligga under gränsen för upptäckt. Faktiskt, som visas i figur 5B, medan en robust 19 F signal som utgår från gallblåsan detekterades i en vildtyp mus, fanns det ingen motsvarande 19 F signal i Asbt fattiga mus 13,14. Dessa fynd bekräftar att MFBA hanteras på liknande sätt som fysiologiska gallsyror och att MFBA-MRI kan användas för att detektera försämrad tarmupptag av gallsyror.

figur 4
Figur 4: representativa MFBA-MRI-bilder.
Resultat från experiment i levande möss visar återuppbyggnadsöver av 19 F och 1 H bilder som visar att 19 F signaler härrör från den murina gallblåsan (stora pilar). Referens fantomer som innehåller kända koncentrationer av 19 F-märkta gallsyror varplaceras i magnetkamera tillsammans musen (vänster pil). I den vänstra panelen indikerar den streckade pilen 19 F-märkt galla syra signalen från den gemensamma gallgången. Registreras ovanför varje panel är tiden efter sondmatning med 19 F-märkt galla syra som MRI startades till den tid som bilden förvärvet genomfördes (1,5 tim). Som väntat, gallblåsan fylla med 19 F-märkta Gallsyrebindande ökar med tiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: försvagat MFBA-MRI signal från gallbladders av Asbt-brist möss.
(A) Stapeldiagram visar att koncentrationen av MFBA mätt genom LC / MS / MS är cirka 22-faldigt lägre i Asbt-deficienta möss jämförad med kontrollmöss. (B) Frånvarande MFBA-MRI-signalen från gallblåsan av en Asbt fattiga mus. Pilspetsar indikerar 19 F-märkt gallsyrabindande fantomer (vänster paneler) och 19 F MRI signal från fantomer (höger sida). Pil i övre högra panelen indikerar 19 F-märkt galla syra signalen från gallblåsan; Det finns ingen motsvarande 19 F-märkt galla syra signal i Asbt fattiga mus (nedre högra panelen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Gallblåsan Vikt (mg) MFBA Koncentration
Gallblåsan (mM) Levern (^ M) Plasma (^ M)
CA-Lys-TFA 25,2 ± 3,2 27,0 ± 2,4 78,8 ± 35,1 0,4 ± 0,2
CA-sar-TFMA 29,2 ± 2,4 18,4 ± 1,6 14,5 ± 0,6 1,4 ± 0,1

Tabell 1: Representativa värden för gallblåsan, lever och plasmakoncentrationer av 19 F-märkta gallsyror.
Medelvärde ± standardfel (SE) värden visas för gallblåsan vikten och koncentrationerna av den indikerade MFBA i gallblåsan, levern, och plasma 12,13. De visade värdena mättes 5-7 h efter gavaging möss med 150 mg / kg kroppsvikt av den angivna MFBA. Notera de millimolära koncentrationer av MFBA i gallblåsan jämfört med mikromolära koncentrationer i lever och plasma. N = 3 mice per värde för CA-lys-TFA och 5 möss per värde för CA-sar-TFMA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Syntesen av CA-lys-TFA och CA-sar-TFMA och analysen in vitro av deras transport med användning av stabilt transfekterade Madin-Darby Canine Kidney-celler som uttrycker ASBT och humana embryonala njurceller som uttrycker den natrium / taurokolat sam-transporterande polypeptid (NTCP) beskrivs någon annanstans 13,14. Här ligger fokus på oral administrering av MFBA genom sondmatning levande djur, följt av skörd av gallblåsan, lever och blod för analys av MFBA innehåll, och, framför allt, avbildning MFBA i gallblåsan i levande djur MRI. Kritiska steg inkluderar att undvika fluorbaserade bedövningsmedel som kan skapa konkurrerande 19 F signaler, undviker gallblåsan manipulation innan kläm gallgången, vilket kan resultera i gallblåsan kontraktion och tömning innan organet skars ut och undvika placering av metaller i närheten av magnetkamera.

Som beskrivs här och annorstädes 13,14, har MFBA-MRI stor potential to framgångsrikt analysera gallsyratransporten in vivo under både normala och onormala fysiologiska tillstånd. Större styrkor MFBA-MRI är att det innebär någon joniserande strålning (varken MFBA märkt med naturligt förekommande, icke-radioaktivt fluor eller MRI utsända joniserande strålning) är och MFBA administreras oralt utan att kräva venpunktion (till skillnad från möss, kommer de flesta människor inte kräver parenteral administration av anestetika eller lugnande medel för att förhindra rörelseartefakt i magnetkamera). Substitution av en hydrolyserbar gallsyra med en syntetisk gallsyra resistent mot hydrolys av tarmen mikroflora 13,14, kan övervinna frågor om in vivo-stabiliteten hos MFBA i tarmen. Den initiala prototyp för MFBA inblandade lägga till tre fluoratomer per molekyl av cholsyra, en naturligt förekommande human gallsyra som hydrolyseras i tarmen genom Clostridial hydrolaser 13,14. Ett nytt tri-fluorerat gallsyra, CA-sar-TFMA, baserad på en sarkosinryggrad som är resistent mot hydrolys av bakteriella enzymer kringgås denna begränsning, förlängning av halveringstiden för MFBA 13,14.

Slutligen är en potentiellt konkurrerande metod, användning av N-metyl- [11 C] cholylsarcosine för PET / CT, begränsad av strålningsexponering från både den radiomärkta gallsyra och CT, och behovet av att förbereda, skepp, och lagra det radioaktiva gallsyra 17.

Beträffande modifieringar och felsökning för denna nya metod kan man överväga att ett misslyckande att detektera en MRI signalen från gallblåsan kan bero på ett problem med 19 F-märkt galla syra eller dess biotillgänglighet, tidpunkten för bild förvärv, eller otillräcklig fyllning i gallblåsan. Såsom diskuterats ovan, testar vi den strukturella integriteten av dessa medel genom deras förmåga att transporteras in vitro genom cellinjer som uttrycker de lämpliga gallsyrabindande transportörer. Vi tillåter åtminstone 1,5 hr för bildtagning men i vissa fall denna varaktighet kan kräva förlängning. Vi finner att fasta möss före MRI för att säkerställa maximal gallblåsan fyllning är viktigt.

Detektionsgränserna för 19 F-MRI signaler kräver djur avbildning för 90 - 120 min tillräcklig signal förvärv; Detta är sannolikt alltför länge för ett praktiskt kliniskt test - patienter skulle behöva ligga stilla i magnetkamera för den varaktighet. Dessutom förlitar sig ström, klinisk MRI i första hand på proton (1 H) imaging; tillämpningen av fluor (19 F) imaging kommer att kräva investeringar i hårdvara (19F spole) och programvara, åtminstone en $ 250.000 investering per magnetkamera. Fram till andra fluorbaserade MRI applikationer utvecklas med hjälp av MFBA-MRI för att utvärdera patienter för gallsyremalabsorption är inte sannolikt att vara kostnadseffektiv.

MFBA-MRI ger ett lovande alternativ till att mäta 75 SeHCAT behålla plasma 7α-hydroxy-4 -cholesten-3-en (C4), och plasma FGF19, eller att utföra en terapeutisk studie med gallsyrabindare. I USA, 75 SeHCAT tester, vilket innebär strålningsexponeringen, inte FDA-godkända. C4 och FGF19 test har låg positiv prediktiva värdet och testning är för närvarande endast tillgänglig genom specialiserade laboratorier. Dessutom både C4 och FGF19 nivåer återspeglar lever syntes av gallsyror. Därför, till skillnad från MFBA-MRI, dessa tester kan inte detektera förändrat uttryck eller mutation av ileal gallsyra-transportörer eller andra mekanismer för gallsyremalabsorption som är oberoende av ökad gallsyrasyntes. Terapeutiska försök av gallsyrabindare kan vara till hjälp men har osäker prediktiva värde och kan inte ge en definitiv diagnos av gallsyremalabsorption 5. Slutligen, även om direkt mätning av fekal gallsyror är till synes rimlig detta avvisades år sedan som alltför besvärliga, opraktiska och opålitlig för rutinmässig klinisk användning 5.

ent "> Ytterligare utmaningar måste övervinnas så att denna innovativa tillvägagångssätt kan översättas till att mäta in vivo gallsyratransporten på kliniken (t.ex. för diagnos av gallsyremalabsorption som en orsak till kronisk diarré). En stor utmaning är att maximera signalintensitet genom att öka antalet av 19 F-atomer per gallsyra molekyl utan att störa förmågan hos MFBA att bete sig som naturliga gallsyror, det vill säga, en gallsyra-molekyl som är alltför skrymmande på grund av tillsatta 19 F-atomer kommer inte att transporteras med antingen ASBT eller gallsyror transportörer i levern. förmågan av nya MFBA att transporteras in vitro kan testas i cellinjer som uttrycker viktiga mänskliga Gallsyrebindande transportörer 13,14 och bör vara förutsägande in vivo transport. med ökad känslighet, MFBA-MRI har potential för förbättrad avbildning av hela gallträd (t.ex. gallgången och dess filialer), i detta sammanhang, förmågan to bild gallgången i vissa möss verkar lovande (Figur 4, vänstra panelen).

Även om de nuvarande gränserna för gallsyror detektering av MFBA-MRI tillåter deras visualisering endast i gallblåsan, förutsatt att känsligheten av tekniken kan förbättras räknar vi MFBA-MRI kan användas för att mäta gallsyratransporten och distribution in vivo varigenom omfattande rumsliga informations anatomiskt i realtid; en möjliggörande teknik som skulle avancera molecular imaging. MFBA-MRI skulle också erbjuda en ny teknik för att bedöma effekterna av genen polymorphisms och läkemedel som försämrar gallsyror transportör funktion. MFBA-MRI har translationell potential att hjälpa kliniker screena för gallsyremalabsorption och därmed identifiera och hantera sjukdomar till följd av ökad avförings gallsyror (t ex diarré som härmar Irritable Bowel Syndrome). Slutligen bör denna teknik blir kliniskt tillgänglig det har stor promise att påskynda utvecklingen i precision medicin genom att ge möjlighet att identifiera förändrad tarm gallsyror upptag hos personer med kolon neoplasi eller andra tillstånd som kan påverkas av förändringar i fekala gallsyror.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive och Kidneysjukdomar (bidragsnummer R21 DK093406 och T32 DK067872 till JP.R.) och en VA Merit tilldelning (licensnummer 1BX002129 till JP.R.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Duall size-21 all glass tissue grinder Kimble Chase Life Science, Vineland, NJ 885351-0022
Bruker BioSpec 70/30USR Avance III 7T horizontal bore MR Scanner Bruker Biospin MRI GmbH, Germany Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5)
Bruker 40 mm 19F/1H dual-tuned linerar volume coil Bruker Biospin MRI GmbH, Germany Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5)
Waters Acquity UPLC System with Quadrupole Detector Waters Corporation, Milford, MA
Waters Acquity UPLC ethylene bridged hybrid C8 1.7 μm 2.1 x 50 mm column Waters Corporation, Milford, MA
Gavage Needle Braintree Scientific, INC. N-010 20 G-1.5" curved 2.25 mm ball
2 Stainless Steel Hemostats  VWR 10755-018 4 and 5 inch, straight
Ketamine MWI Veterinary Supply 501090 Ketamin zetamine 100 mg/ml
Xylazine Akorn, Inc. 20 mg/ml
Intraperitoneal Catheter Abbott AbbocathTM-T.I.V. G720-A01 4535-42 24-G x 0.75"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomas, C., Pellicciari, R., Pruzanski, M., Auwerx, J., Schoonjans, K. Targeting bile-acid signalling for metabolic diseases. Nat Rev Drug Discov. 7, 678-693 (2008).
  2. Vallim, T. Q., Edwards, P. A. Bile acids have the gall to function as hormones. Cell Metab. 10, 162-164 (2009).
  3. Dawson, P. A., Karpen, S. J. Thematic Review Series: Intestinal Lipid Metabolism: New Developments and Current Insights Intestinal transport and metabolism of bile acids. Journal of Lipid Research. 56, 1085-1099 (2015).
  4. Dawson, P. A., et al. Targeted deletion of the ileal bile acid transporter eliminates enterohepatic cycling of bile acids in mice. J Biol Chem. 278, 33920-33927 (2003).
  5. Pattni, S., Walters, J. R. Recent advances in the understanding of bile acid malabsorption. Br Med Bull. 92, 79-93 (2009).
  6. Walters, J. R., et al. A new mechanism for bile acid diarrhea: defective feedback inhibition of bile acid biosynthesis. Clin Gastroenterol Hepatol. 7, 1189-1194 (2009).
  7. Hofmann, A. F., Mangelsdorf, D. J., Kliewer, S. A. Chronic diarrhea due to excessive bile acid synthesis and not defective ileal transport: a new syndrome of defective fibroblast growth factor 19 release. Clin Gastroenterol Hepatol. 7, 1151-1154 (2009).
  8. Flynn, C., et al. Deoxycholic acid promotes the growth of colonic aberrant crypt foci. Mol Carcinog. 46, 60-70 (2007).
  9. Glinghammar, B., Rafter, J. Carcinogenesis in the colon: interaction between luminal factors and genetic factors. Eur J Cancer Prev. 8, S87-S94 (1999).
  10. Bernstein, C., et al. Carcinogenicity of deoxycholate, a secondary bile acid. Arch Toxicol. 85, 863-871 (2011).
  11. Zheng, X., Ekins, S., Raufman, J. P., Polli, J. E. Computational models for drug inhibition of the human apical sodium-dependent bile acid transporter. Mol Pharm. 6, 1591-1603 (2009).
  12. Vivian, D., et al. Design and characterization of a novel fluorinated magnetic resonance imaging agent for functional analysis of bile Acid transporter activity. Pharm Res. 30, 1240-1251 (2013).
  13. Vivian, D., et al. Design and evaluation of a novel trifluorinated imaging agent for assessment of bile acid transport using fluorine magnetic resonance imaging. J Pharm Sci. 103, 3782-3792 (2014).
  14. Vivian, D., et al. In vivo performance of a novel fluorinated magnetic resonance imaging agent for functional analysis of bile acid transport. Mol Pharm. 11, 1575-1582 (2014).
  15. Raufman, J. P., et al. In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Detect Biliary Excretion of 19F-Labeled Drug in Mice. Drug Metab Dispos. 39, 736-739 (2011).
  16. Ridlon, J. M., Kang, D. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47, 241-259 (2006).
  17. Frisch, K., et al. N-methyl-11C]cholylsarcosine, a novel bile acid tracer for PET/CT of hepatic excretory function: radiosynthesis and proof-of-concept studies in pigs. J Nucl Med. 53, 772-778 (2012).

Tags

Medicin Gallsyror magnetisk resonanstomografi fluor märkning gallblåsan mus transport
Använda Multi-fluorerade gallsyror och<em&gt; In Vivo</em&gt; Magnetic Resonance Imaging att mäta gallsyratransporten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Felton, J., Cheng, K., Said, A.,… More

Felton, J., Cheng, K., Said, A., Shang, A. C., Xu, S., Vivian, D., Metry, M., Polli, J. E., Raufman, J. P. Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport. J. Vis. Exp. (117), e54597, doi:10.3791/54597 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter