Summary
낮은 - 비용, 사용하기 쉽고 강력한 시스템은 히스타민에 의해 유도 된 혈액 망막 장벽 위반을 개선 할 수 잠재적 인 치료를 평가하기 위해 설립된다. 혈관 누수, 뮐러 세포 활성화 및 신경 프로세스의 연속성 잠재적 약물 폭신 (lipoxin) A4를 갖는 손상 응답 및 역전을 평가하기 위해 이용된다.
Introduction
증거의 성장 몸은 혈액 망막 장벽 (BRB) 1-5과 혈액 뇌 장벽 (BBB) 6,7과의 유사성의 존재를 지원합니다. BBB를의 타협은 단단히 이러한 정신 착란 (10)로 인과 적 또는 알츠하이머 병 (AD)과 같은 만성 신경 퇴행성 질환에 대한 진단 마커로 8,9 급성 조건을 연결되어 있습니다. 잠재적 인 약물 표적에 대한 이러한 병리 및 발견에 기계적인 통찰력은 일반적으로 뇌의 제한된 액세스 및 네트워크 복잡함에 의해 방해된다. 이러한 생체 내 이미징 (11), 뇌의 Organotypic 문화 (12), 차 세포 배양 13, 14 및 공동 문화 시스템 (15)과 같은 대안이 생성되었습니다. 그러나, 이러한 모델의 대부분은 세포를 식별하는 특수 장비, 긴 실험 기간 또는 여러 개의 마커를 필요로한다. 기능적 및 구조적 및 BBB BRB 유사성뿐만 아니라 DY 간의 상관이 둘의 sfunctions는 16-19을 주장하고있다. 또한, 쉽게 액세스 잘 정의 세포 유형 및 적층 구조는 뇌 윈도우로 잘 특성화 망막 수있다. BBB를하고 BRB의 구조적 및 기능적 아이덴티티 상세히 비교 남아. 그러나, 망막 병증은 특히 BRB 파기는 또한 밀접 당뇨병 18-19 및 AD (21, 22)을 포함하는 다양한 질병의 진행과 연관되어있다. 따라서, BRB는 부전 시스템 메커니즘을 묘사 할뿐만 아니라 잠재적 인 약물 스크리닝뿐만 아니라 확립 관심사이다. 이 보고서에서, 단순 급성 망막 문화를 사용하여 프로토콜 가능 BRB 부전을 개발하고 제공됩니다.
증가 BBB 투과성 및 AD와 같은 병리학 적 변화는 히스타민, 프로 염증 중재자 (12)와 함께 배양 뇌의 Organotypic 문화에 설립되었습니다. 따라서, 표시 시스템에서, 히스타민은 APPL이었다BRB 부전을 유도하기 위해 생체 망막 문화 IED. 이러한 뮤스의 musculus과 보스 황소 같은 여러 종에서 망막은, 테스트되었습니다. 때문에 상업적 가용성 및 인체 조직에 유사에 신선한 돼지의 시선은 여기에보고 된 데이터를 제공하기 위해 사용되었다. 히스타민 및 / 또는 다른 약물과 배양 한 후 망막은 면역 글로불린 G (IgG의) 혈액의 주요 구성 요소 중 하나로서 여러 단백질 (12)에 대한 면역 염색으로 평가 처리 하였다; glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP), 아교 활성화를위한 잘 알려진 마커; 및 미세 소관 - 관련 단백질 2 (MAP2), 미세 소관의 조립에 필수적인 신경 세포 특이 적 세포 골격 단백질. 또한, 망막의 적층 구조는 그 폭과 연속성의 변화로 뮐러 세포 및 신경절 세포의 처리를 상세하게 분석 할 수있다. 따라서, 몇 가지 추가 매개 변수의 영향을 평가하기 위해 사용할BRB 위반 초기 단계에서뿐만 아니라 잠재적 인 치료의 반전 효과를 평가하는.
혈관 누출 (이어진), 아교 세포의 활성화 및 신경 세포의 손상 응답이 프로토콜에서, 약물 스크리닝의 전위 반전 효과는 세 가지 관점에서 평가된다. 몇몇 정량화 방법은 예를 들어, 발현이 면역, 프로세스 및 인핸스먼트 필터에 의해 도시 신경 프로세스 연속성 폭 측정 강도에 의해 도시 된 바와 같이, 사용된다. 더 나은 방법을 설명하기 위해 결과를 해석하는 데 도움이, 폭신 (lipoxin) A4 (LXA4), 내생 적 염증 부상에 대한 응답과 내피 기능 장애 (23)를 감쇠에서 합성 된 화합물은 데모 용으로 선택되었다.
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Protocol
모든 프로토콜이 적용 어디에 기관 동물 관리 및 사용위원회의 정책을 준수하여 수행 하였다.
1. 준비
- 75 %로 안정화 매체를 준비 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM), 25 % 행크스 '균형 소금 솔루션 (HBSS). 사용할 때까지 -20 ° C에서 잘 나누어지는 및 저장을 섞는다.
- 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비하고 고압 증기 멸균에 의해 소독. 실온에서 용액을 저장한다. 실험 (물론 당 5 ㎖) 전에 37 ° C로 PBS를 따뜻하게.
- 10 %, 20 % PBS 및 30 % 수 크로즈를 준비한다. 개별적으로 살균에 대한 별도의 0.22 μm의 필터를 통해 모든 솔루션을 필터링합니다. 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.
- 90 mM의 농도로 PBS에 히스타민 스톡 용액을 제조 하였다. 0.22 μM 필터를 통해 용액을 여과에 의해 멸균. 나누어지는 및 -80 ° C에서 솔루션을 저장합니다. 여러 동결 및 해동 사이클을 피하십시오.
- 실험 전에 PBS에 신선한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 확인합니다. 얼음에 놓습니다.
주의 : 흄 후드에서 PFA를 유지하고 적절한 보호 장비를 착용하십시오. - 안정화 매체 (망막 당 20 ml)에 녹여. 100 U / ml의 최종 농도로 페니실린 - 스트렙토 마이신을 추가한다. 실험 전에 인큐베이터에서 37 ° C의 매체 (망막 당 15 ㎖)의 따뜻한 부분입니다. 얼음 매체의 나머지를 남겨주세요.
- 얼음에 HBSS (망막 당 10 ml)에 놓습니다.
2. 망막의 Organotypic 문화
- 조직 문화 후드에 샘플을 전송합니다. 렌즈 주위를 절단하여 아이 컵을 엽니 다. 브러쉬를 사용하여 부드럽게 망막을 당겨없이 유리체 유머를 제거합니다. 조심스럽게 시신경 유두를 노출 브러시로 절단 가장자리에서 망막을 분리합니다. 광학 면도기와 신경과 망막을 해제 심한.
- 페트리 접시에 망막을 전송하고 조심스럽게 차가운 HBSS를 사용하여 한 번 망막을 씻어. i에서 HBSS에서 샘플을 배치가전. 단계 2.1 및이 공정을 반복하여 필요한만큼의 망막 해부.
- 대칭 면도칼로 절반 망막을 잘라. 부드럽게 안정화 미디어의 3 ㎖로 6 웰 플레이트에 샘플을 전송할 당 잘. 5 % CO 2를 함유하는 분위기 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 평형을 허용한다.
- 단계 2.3에서 배양하는 동안 다음과 같은 시약을 준비 : 따뜻한 매체에서 원하는 농도 (450 μM)에 히스타민 원액을 희석. 250 NG / ㎖의 최종 농도로 배지에 (아르곤하에 저장 됨) LXA4을 녹인다.
참고 LXA4의 효과를 측정 할 때, 나머지 절반은 LXA4과 히스타민을 위해 사용되는 반면, 하나의 망막에서 절반이 히스타민 단독으로 사용된다. - 조심스럽게 안정화 매체를 기음과 각 웰 (물론 당 3 ㎖)에 준비된 매체를 추가합니다. 5 % CO 2를 함유하는 분위기 인큐베이터에서 1 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 인큐베이션.
- 린스한 번 따뜻한, 멸균 PBS에서 샘플.
3. 면역 염색에 대한 샘플을 준비
- 접시에서 대기음 PBS. 4 % PFA (웰 당 3 ㎖)를 첨가하고 실온에서 15 분 동안 배양한다.
- 빠르게 PFA를 대기음. 한 번 PBS를 사용하여 샘플을 씻어. 10 % 자당에 샘플 (물론 당 5 ml)에 전송하고 4 ℃에서 2 시간 4 품어.
- 30 %의 자당 (물론 당 5 ㎖)에 샘플을 전송하고 4 ℃에서 하룻밤 배양한다. 작업 동결 매질을 20 % 수 크로스의 두 부분으로 상업용 냉동 매체의 일부를 혼합한다. 거품이 사라 공기까지 4 ° C 하룻밤 이상에서 그것을 둡니다.
- 작업 동결 배지 샘플을 옮기고 실온에서 5 분 동안 평형을 허용한다. 사각형으로 각 망막 (5mm로 약 3mm)를 낸다.
- 조심스럽게 원통형 용기 (약 1cm 반경 × 2 cm 고도) 디바이스에 포함 된 작업 동결 미디어에 샘플을 전송알루미늄 호일에서에 다루지. 망막 슬라이스와 액체 질소에서 그들을 동결 (절편에 망막의 단면을 제공하기 위해 지향) 수직 있는지 확인합니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 블록을 저장합니다.
- 제 각각 14 μm의 두께 조각으로 그라 이오 스탯에 블록은 유리 슬라이드에 섹션을 탑재합니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.
4. 면역 염색
- 한 번에 5 % 자당 인산 완충액 (SPB, PBS에서 5 % 자당, 산도 7.4)와 섹션을 씻으십시오. 실온에서 1 시간 동안 (10 % 정상 염소 혈청과 0.5 % 트리톤 X-100으로 5 % SPB) 버퍼 블록의 섹션을 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 차단.
- 해당 차 항체 (슬라이드) 섹션을 품어 (1 희석 GFAP 또는 MAP2을, 500을 버퍼를 차단에서) 1 시간 동안. 솔루션을 대기음. 5 % SPB에 세 번 씻으십시오. 내생 IgG의 염색의 경우,이 단계를 건너 뜁니다.
- 해당 SECON와 섹션을 품어1 시간 :하기 Dary 항체 (블로킹 완충액 800 Cyanine3 / FITC 접합 된 당나귀 항 - 마우스 / 항 - 토끼 IgG를는 1 희석).
- 철저하게 5 % SPB 3 회 섹션을 씻으십시오. 매체 장착 DAPI를 함유 된 커버로 덮고에서 그들을 장착하여 현미경 샘플을 준비합니다.
- 그룹에서 등, 드웰 시간, 레이저 강도, 게인 값과 동일한 매개 변수 아래 20X 렌즈를 통해 레이저 공 초점 현미경, 캡처 이미지를 사용. 525분의 488 나노 미터로 785분의 561 나노 미터로 (Cyanine3를 검출) 적색 채널, 447분의 408 나노 미터로 (DAPI를 검출) 및 녹색 채널 (FITC를 검출) 블루 채널의 여기 / 방출 파장을 설정 .
5. 이미지 분석
- 다음 조건 (12)에 의하면 새는 혈관의 백분율을 정량화 : 카운트 부에서의면 내의 내피 세포 핵에서만 혈관 포함; 이 AG 표시되면 혈관 누설을 고려용기를 둘러싼 면역 염색의 radient.
- 발현 수준을 결정하기 위해, 관심 영역을 선택하고, 화상 해석 소프트웨어를 사용하여 회색의 평균 값을 측정한다.
- 프로세스의 폭을 측정하기 위해 처리 (예를 들어, 외부 핵 층 ONL) 구별되는 구역의 영역을 선택한다. 다음과 같은 프로세스가 볼과 연속 광학 필드를 선택합니다. , 미세한 설정에 따라 눈금 막대를 설정하는 과정에서 선을 그리고 측정을 수행합니다.
- 프로세스의 연속성을 분석하기 위해, 관심의 선택 영역, 그 주변의 분산과, 각 화소를 대체함으로써 이미지의 에지를 강화 분산이라는 필터를 적용한 자동 콘트라스트 및 밝기를 조정 라인 카운트에 의해 카운트를 정규화 지역.
- 두 꼬리 학생의 t의 -test를 사용하여 통계적 유의성을 계산합니다. * P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001. 피많은 수단으로 결과를 ± SEM.
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Representative Results
우리는 히스타민에 의해 유도 된 BRB 유출을 방지 할 수 잠재적 치료를 평가하는 저비용 시간 효율적이고 사용하기 쉬운 시스템을 제시한다. IgG의 제어 망막 (도 1a)의 용기 내에 구속되지만, 모델이 성공적으로 설정되었음을 확인 히스타민 노출 (도 1b)시 혈관 밖으로 유출.
LXA4는 제시된 시스템의 BRB 위반에 대한 의약품에 대한 심사를 입증하기 위해 선택되었다. BRB 부전은 그 자체로 큰 영향 (그림 1C)가없는 LXA4 (그림 1D)로 치료에 감쇠. 환입 누출 혈관의 비율로 정량하고, 그 결과 상당한 (도 1E)이다. 다른 두 망막 세포 유형, 뮐러 아교 세포 (그림 2)와 신경절 세포 (
그림 1 :. 혈액 망막 장벽이 히스타민 노출에 손상된 및 LXA4 치료에 의해 구출된다 IgG의 면역 염색 (빨간색)을 치료했다 망막 (A)에서 제시 손상에 의한 히스타민 만 (B)와 C (만 LXA4 처리 ), 또는 둘 모두에 노출 histam오프라인 및 LXA4 (D). 제어부 (A) 및 LXA4 처리 된 (C) 군, IgG의 혈관 (이어진) 히스타민 그룹 (B)에있는 동안의 IgG는이 점선 원으로 표시된 누설 구름을 형성 이어진에서 검출 내로 제한된다. LXA4의 추가 첨가는 혈관 장애 (D)를 구출. 스케일 바, 20 μm의. (E) 시험 그룹간에 누설 이어진 도서의 정량적 측정. 통계적 유의성은 두 꼬리 학생의 t의 -test에 의해 결정된다. * P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001. 그래프에 플롯 (N = 18) ± SEM을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :
그림 3 : 신경절 세포 프로세스의 연속성이 LXA4의 영향을받지 않습니다. MAP2 대해 면역 염색 (A)는 (A) 비 처리했다 망막 제시 손상 유발 LXA4 단 (C)로 처리 히스타민 단 (B) 또는 히스타민 및 LXA4 (D) 양쪽에 노출. 양성 염색 공정 및 신경절 세포의 세포체에서 얻어진다. 함께 해당 필터 향상된 화상 (F)와 MAP2 염색 (E)의 샘플 이미지가 제공된다. 연속 공정은 화살촉으로 표시됩니다. 스케일 바, 20 μm의. (G) 모든 그룹에서 연속, MAP2 양성 신경절 세포 프로세스의 밀도는되게됩니다. 통계적 유의성은 두 꼬리 학생의 t의 -test에 의해 결정된다. * P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001. 그래프에 플롯 (N = 18) ± SEM을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
References
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