Summary
En billig, er nem at bruge og kraftfulde system, der etableres for at vurdere de potentielle behandlinger, som kunne lindre blod nethinde barriere brud fremkaldt af histamin. Blodkar lækage, Müller-celleaktivering og kontinuitet i neuronale processer anvendes for at vurdere skaden respons og dens tilbageførsel med et potentielt lægemiddel, lipoxin A4.
Introduction
En voksende mængde beviser understøtter eksistensen af blod retina-barrieren (BRB) 1-5 og dens lighed med blodhjernebarrieren (BBB) 6,7. Kompromittering af BBB er blevet tæt forbundet kausalt eller som en diagnostisk markør til kroniske neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers sygdom (AD) 8,9 og akutte tilstande, såsom delirium 10. Mekanistiske indsigt i disse patologier og opdagelser for potentielle lægemiddelmål er generelt hæmmet af den begrænsede tilgængelighed og netværk forviklinger af hjernen. Alternativer som in vivo imaging 11, hjerne organotypisk kultur 12, primære cellekulturer 13,14 og co-dyrkningssystemer 15 er blevet genereret. Men de fleste af disse modeller kræver særlige instrumenter, lange eksperimentelle perioder eller flere markører til at identificere celler. Funktionelle og strukturelle ligheder mellem BBB og BRB samt en sammenhæng mellem dysfunctions af de to har været fremført 16-19. Desuden har lettere adgang, veldefinerede celletyper og en lagdelt struktur tillod velkarakteriserede nethinden som et vindue til hjernen. De strukturelle og funktionelle identitet BBB og BRB mangler at blive sammenlignet i detaljer. Imidlertid retinale patologier, især BRB brud, har også været tæt forbundet med progressionen af forskellige sygdomme, herunder diabetes 18-19 og AD 21,22. Det er således af interesse for at etablere en BRB dysfunktion system, ikke kun at afgrænse den mekanisme, men også til at screene potentielle lægemidler. I denne rapport er en protokol, der gør det muligt BRB dysfunktion hjælp af en simpel akut retinal kultur udviklet og præsenteret.
Øget BBB permeabilitet og AD-lignende patologiske ændringer er blevet etableret i en hjerne organotypisk kultur inkuberes med histamin, et pro-inflammatorisk mediator 12. Derfor, i den præsenterede system histamin var applIED til ex vivo retinal kultur at fremkalde BRB dysfunktion. Nethinder fra flere arter, såsom Mus musculus og Bos Taurus, er blevet testet. På grund af deres kommercielle tilgængelighed og lighed med humant væv, blev friske svin øjne udnyttes til at levere de rapporterede data her. Efter inkubering med histamin og / eller andre lægemidler, blev nethinder forarbejdet til evaluering ved immunofarvning for adskillige proteiner 12, såsom immunoglobulin G (IgG), en af de vigtigste bestanddele af blodet; glial fibrillært surt protein (GFAP), en velkendt markør for glial aktivering; og mikrotubulus-associeret protein 2 (MAP2), et neuron-specifikt cytoskeletprotein afgørende for mikrotubulus-samling. Endvidere den lagdelte struktur af nethinden tillader en detaljeret analyse af de processer af Müller celler og ganglieceller, såsom ændringer i deres bredde og kontinuitet. Således flere andre parametre er til rådighed til at vurdere konsekvenserne af denBRB brud på et tidligt tidspunkt, og at evaluere tilbageførsel virkninger af potentielle behandlinger samt.
I denne protokol, er potentielle vending effekter af screenede lægemidler vurderes ud fra tre perspektiver: lækage af blodkar (BvS), aktivering af gliaceller og skaden-respons af neuronale celler. Adskillige kvantificeringsmetoder anvendes for eksempel ekspressionsniveauet vist ved intensiteten af immunfarvning, bredde måling af en proces og kontinuitet i neuronale processer vist ved en forøgelse filter. For bedre at illustrere metoden og til at hjælpe med at fortolke resultaterne, lipoxin A4 (LXA4), en forbindelse endogent syntetiseret som reaktion på inflammatorisk skade og formildende endotel dysfunktion 23, er blevet valgt til demonstration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller blev udført i overensstemmelse med den politik, Institutional Animal Care og brug Udvalg givet fald.
1. Fremstilling
- Forbered stabilisering medier med 75% Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM), 25% Hanks balancerede saltopløsning (HBSS). Bland godt, alikvot og opbevares ved -20 ° C indtil brug.
- Forbered phosphatbufrede saltvand (PBS) og der steriliseres ved autoklavering. opløsningen ved stuetemperatur lagre. Opvarm PBS til 37 ° C før forsøget (5 ml per brønd).
- Forbered 10%, 20% og 30% sucrose i PBS. Filter alle løsningerne individuelt over separate 0,22 um filtre til sterilisation. Gemme opløsningerne ved 4 ° C.
- Forbered histamin stamopløsning i PBS til en koncentration på 90 mM. Sterilisere opløsningen ved filtrering over et 0,22 um filter. Portion og gemme løsningen ved -80 ° C. Undgå flere fryse-og-tø-cykler.
- Lave frisk 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS før eksperimentet. Placer den på is.
Advarsel: Hold PFA i et stinkskab og bære passende beskyttelsesudstyr. - Optø stabilisering medium (20 ml pr nethinden). Tilføj penicillin-streptomycin til en endelig koncentration på 100 U / ml. Varm del af mediet (15 ml pr nethinden) til 37 ° C i inkubatoren før forsøget. Efterlad resten af mediet på is.
- Placer HBSS (10 ml pr nethinden) på is.
2. Retinal organotypiske Kultur
- Overfør prøverne til en vævskultur hætte. Åbn øjestykket ved at skære omkring linsen. Ved hjælp af en pensel, forsigtigt fjerne glaslegemet uden at trække på nethinden. frigøre forsigtigt nethinden fra den afskårne kant med en børste for at blotlægge den optiske disk. Svær synsnerven med en barberkniv og slip nethinden.
- Overfør nethinden i en petriskål og omhyggeligt skylles nethinden én gang med kold HBSS. Prøven anbringes i HBSS på jegce. Dissekere så mange nethinder ud efter behov ved at gentage trin 2.1 og dette trin.
- Skær nethinden i halve symmetrisk med en barberkniv. overføre forsigtigt prøver til en 6-brønds plade med 3 ml stabilisering medier per brønd. Tillad ækvilibrering i 30 min ved 37 ° C i en inkubator med atmosfære indeholdende 5% CO2.
- Fremstille følgende reagenser under inkubationen i trin 2.3: Fortynd histamin stamopløsning til den ønskede koncentration (450 uM) i varmt medium. Opløs LXA4 (opbevaret under argon) i mediet til en slutkoncentration på 250 ng / ml.
BEMÆRK: Ved måling af effekten af LXA4, er den ene halvdel fra en enkelt nethinden anvendes til histamin alene, mens den anden halvdel bruges til histamin med LXA4. - Aspirer stabilisering medium omhyggeligt og tilsæt den forberedte medium til hver brønd (3 ml per brønd). Inkuber prøverne ved 37 ° C i 1 time i en inkubator med atmosfære indeholdende 5% CO2.
- Skylprøver en gang i varmt, sterilt PBS.
3. Forbered Prøver til Immunfarvning
- Aspirer PBS fra pladerne. Tilsæt 4% PFA (3 ml per brønd) og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Hurtigt aspirere PFA. Skyl prøverne en gang ved hjælp af PBS. Overfør prøverne til 10% sucrose (5 ml per brønd) og inkuberes i 2 til 4 timer ved 4 ° C.
- Overfør prøverne til en 30% sucrose (5 ml pr brønd) og inkuberes natten over ved 4 ° C. Bland en del af det kommercielle frysemedium med to dele 20% sucrose til at arbejde frysemedium. Lad det ved 4 ° C natten over eller længere indtil luftboblerne forsvinder.
- Overfør prøverne til arbejde frysemedium og tillade ækvilibrering i 5 minutter ved stuetemperatur. Trim hver nethinden i rektangler (ca. 3 mm med 5 mm).
- overføre omhyggeligt prøverne i arbejdsmiljøet frysning medier anbragt i en cylindrisk beholder (ca. 1 cm radius x 2 cm højde) devseret fra aluminiumfolie. Sikre, at de retina skiver er lodrette (orienteret for at tilvejebringe et tværsnit af nethinden efter sektionering) og fryse dem i flydende nitrogen. Gemme blokkene ved -80 ° C indtil anvendelse.
- Afsnit hver blok på en kryostat i 14 um tykke skiver og montere afsnittene om objektglas. Opbevar objektglassene ved -80 ° C indtil anvendelse.
4. Immunfarvning
- Vask sektioner med 5% sucrose phosphatbuffer (SPB, 5% saccharose i PBS, pH 7,4) én gang. Blokere ikke-specifikke bindingssteder ved inkubering af sektionerne i blokeringsbuffer (5% SPB med 10% normalt gedeserum og 0,5% Triton X-100) i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkubér sektioner (på objektglas) med det relevante primære antistof (GFAP eller MAP2, fortyndet ved 1: 500 i blokeringspuffer) i 1 time. Aspirere opløsningen. Vask tre gange i 5% SPB. Til farvning af endogene IgG, springe dette trin.
- Inkuber sektionerne med den tilsvarende seconDary antistoffer (Cyanine3 / FITC-konjugeret æsel-anti-muse / anti-kanin IgG, fortyndet ved 1: 800 i den blokerende buffer) i 1 time.
- Vask afsnittene grundigt med 5% SPB tre gange. Forbered prøverne for mikroskopi ved at montere dem i montering medie indeholdende DAPI og dækker med dækglas.
- Ved hjælp af en laser konfokal mikroskop, tage billeder gennem en 20X objektiv under identiske parametre såsom laser intensitet, gain værdi, dvæle tid osv tværs grupper. Indstil excitation / emissionsbølgelængder for den blå kanal (til påvisning DAPI) som 408/447 nm, for den røde kanal (til påvisning Cyanine3) som 561/785 nm og for den grønne kanal (til påvisning FITC) som 488/525 nm .
5. Image Analysis
- Kvantificer procentdel af utætte blodkar efter følgende kriterier 12: Medtag kun blodkar med endotel cellekerner inden plan sektion i optællingen; overveje et blodkar utæt, hvis det viser aggradienten af immunfarvning omgiver fartøjet.
- For at bestemme ekspressionsniveauet vælge områder af interesse og måle den gennemsnitlige grå værdi ved hjælp af billedanalysesoftware.
- At måle bredden af processen, vælge et område med det afsnit, hvor processerne er forskellige (det ydre cellekernelag, ONL, for eksempel). Vælg derefter en optisk felt, hvor sådanne processer er synlige og kontinuerlig. Indstil skalalinjen ifølge den mikroskopiske omgivelser, tegne en linie på tværs af processen og udføre målingen.
- For at analysere kontinuiteten i processen, udvalgte områder af interesse, anvende filteret kaldet varians som forbedrer kanterne i billedet ved at erstatte hver pixel med sine nabolande varians, automatisk justere kontrast og lysstyrke, tælle linjerne og normalisere optællingen af areal.
- Beregn statistiske betydninger ved hjælp af en to-tailed Students t-test. *, P <0,05; ** P <0,01; ***, P <0,001. Pparti resultatet som gennemsnit ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi præsenterer en billig, tidsbesparende og nem at bruge systemet til at vurdere potentielle behandlinger, der kunne beskytte mod BRB brud fremkaldt af histamin. IgG er begrænset inden for de fartøjer i kontrol nethinden (figur 1A), men lækker ud af blodkarrene upon histamin eksponering (figur 1B), bekræfter, at modellen med succes er etableret.
LXA4 blev valgt til at demonstrere screening for lægemidler mod BRB brud i den præsenterede system. BRB dysfunktion er svækket ved behandling med LXA4 (figur 1 D), som ikke har nogen signifikant virkning i sig selv (figur 1C). Tilbageførslen kvantificeres som en procentdel af de lækkede blodkar og resultatet er signifikant (figur 1E). To andre retinale celletyper, Müller gliaceller (figur 2) og ganglieceller (
Figur 1:. Blood Retinal Barrier er kompromitteret på histamin Eksponering og Reddet af LXA4 Treatment IgG immunfarvning (rød) præsenteres fra nethinden, som var ubehandlet (A), skade-induceret med kun histamin (B), behandlet med kun LXA4 (C ), eller udsat for både histamine og LXA4 (D). I kontrol (A) og LXA4 behandlet (C) grupper, er IgG restriktioner i blodkarrene (BvS), mens i histamin-gruppen (B), er IgG detekteres ud af BVS hvor den er lækage skyer angivet med stiplede cirkler. Yderligere tilsætning af LXA4 redder fartøjet dysfunktion (D). Scale bar, 20 um. (E) Kvantitativ måling af de utætte BvS tværs af de undersøgte grupper. Statistisk signifikans bestemmes ved en to-halet Students t-test. *, P <0,05; ** P <0,01; ***, P <0,001. Middel ± SEM (n = 18) er afbildet i grafen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:
Figur 3: Kontinuitet i ganglieceller Processer påvirkes ikke af LXA4. (A) Immunfarvning mod MAP2 præsenteres fra nethinden, som var ubehandlede (A), beskadigelse induceret med histamin kun (B) behandlet med kun LXA4 (C) eller udsat for både histamin og LXA4 (D). Positiv farvning opnås i de processer og celle organer ganglieceller. En prøve billede af MAP2 farvning (E) sammen med dens tilsvarende filter-forstærket billede (F) præsenteres. De kontinuerlige processer er angivet med pilehoveder. Scale bar, 20 um. (G) densiteten af den kontinuerlige, MAP2-positive ganglion celleprocesser fra alle grupper præsenteres. Statistisk signifikans bestemmes ved en to-halet Students t-test. *, P <0.05; ** P <0,01; ***, P <0,001. Middel ± SEM (n = 18) er afbildet i grafen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
References
- Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C.
- Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
- Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
- Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
- Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
- Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).
- Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
- Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
- Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
- Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10 (2015).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
- Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).
- Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188 (2014).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
- Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
- Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
- Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
- Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).
- Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
- Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055 (2010).
- Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
- Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
- Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).
