Summary
Een low-cost, is makkelijk te gebruiken en krachtige systeem opgezet om potentiële behandelingen die bloed retinale barrière schending geïnduceerd door histamine kon verbeteren evalueren. Bloedvat lekkage Müller celactivering en de continuïteit van neuronale processen worden gebruikt om de schadereactie en de omkering van een potentieel geneesmiddel, lipoxine A4 beoordelen.
Introduction
Een groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal ondersteunt het bestaan van bloed retinale barrière (BRB) 1-5 en de gelijkenis met de bloed-hersenbarrière (BBB) 6,7. Compromis van de BBB is nauw verbonden causaal of diagnostische merker van chronische neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD) 8,9 en acute aandoeningen zoals delirium 10. Mechanistische inzichten in deze pathologieën en ontdekkingen voor potentiële drug targets zijn over het algemeen belemmerd door de beperkte toegankelijkheid en netwerk complexiteit van de hersenen. Alternatieven zoals in vivo beeldvorming 11, hersenen organotypische cultuur 12, primaire celculturen 13,14 en co-cultuur systemen 15 zijn gegenereerd. De meeste van deze modellen vereisen speciale instrumenten, lange experimentele perioden of meerdere markers aan cellen te identificeren. Functionele en structurele overeenkomsten tussen BBB en BRB en een correlatie tussen de DYsfunctions van de twee werden aangevoerd 16-19. Daarnaast zijn gemakkelijker toegang welomschreven celtypen en een gelaagde structuur goed gekarakteriseerde retina als een venster naar de hersenen toegestaan. De structurele en functionele identiteit van de BBB en BRB nog worden vergeleken detail. Echter, retinale aandoeningen, met name de breuk BRB, zijn ook sterk geassocieerd met de progressie van verschillende ziekten, waaronder diabetes 18-19 en AD 21,22. Derhalve is het van belang een BRB disfunctie systeem niet alleen het mechanisme af te bakenen, maar ook potentiële geneesmiddelen te screenen stellen. In dit rapport wordt een protocol waarmee BRB disfunctie met behulp van een eenvoudige acute retinale cultuur ontwikkeld en gepresenteerd.
Verhoogde BBB permeabiliteit en AD-achtige pathologische veranderingen zijn vastgesteld in de hersenen organotypische cultuur geïncubeerd met histamine, een pro-inflammatoire mediator 12. Daarom is in de gepresenteerde systeem histamine was applied de ex vivo netvlies cultuur BRB dysfunctie veroorzaken. Retina's van verschillende soorten, zoals Mus musculus en Bos taurus, getest. Vanwege hun commerciële beschikbaarheid en gelijkenis met menselijk weefsel, werden verse varkens oogappels gebruikt om de gegevens in dit jaarverslag verschaffen. Na incubatie met histamine en / of andere geneesmiddelen werden de retina voor evaluatie verwerkt door immunokleuring voor verscheidene eiwitten 12 zoals Immunoglobuline G (IgG), een van de belangrijkste bestanddelen van het bloed; glia fibrillair zuur eiwit (GFAP), een bekend marker voor glia activering; en microtubule-geassocieerd eiwit 2 (MAP2), een neuron-specifieke cytoskelet eiwit essentieel is voor de assemblage van microtubuli. Voorts is de gelaagde structuur van het netvlies kan een gedetailleerde analyse van de processen van Müllercellen en ganglioncellen, zoals veranderingen in de breedte en continuïteit. Aldus aantal extra parameters om de gevolgen van de te evaluerenBRB breuk in een vroeg stadium en de omkering effecten van mogelijke behandelingen te evalueren.
In dit protocol wordt potentiële omkering effecten van onderzochte geneesmiddelen benaderd vanuit drie perspectieven: lekkage van bloedvaten (BV), de activering van gliacellen en de schade-reactie van neuronale cellen. Verschillende kwantificeringsmethoden worden gebruikt, bijvoorbeeld het expressieniveau getoond door de intensiteit van de immunokleuring, breedtemaat van een proces en continuïteit van neuronale uitlopers getoond door een verbetering filter. Om beter te illustreren de werkwijze en te helpen resultaten te interpreteren, lipoxine A4 (LXA4), een verbinding endogeen gesynthetiseerd in reactie op inflammatoire schade en verzachtende endotheeldysfunctie 23, is gekozen voor demonstratiedoeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid van de Animal Care en gebruik Comite institutionele waar van toepassing.
1. Voorbereiding
- Bereid de stabilisatie media met 75% Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 25% Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Meng goed, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C tot gebruik.
- Bereid de fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en steriliseer in de autoclaaf. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur. Verwarm de PBS tot 37 ° C vóór het experiment (5 ml per putje).
- Bereid 10%, 20% en 30% sucrose in PBS. Filter alle oplossingen individueel via aparte 0,22 pm filters voor sterilisatie. Bewaar de oplossingen bij 4 ° C.
- Bereid de histamine voorraadoplossing in PBS tot een concentratie van 90 mM. Steriliseer de oplossing door te filteren over een 0,22 pm filter. Aliquot en opslaan van de oplossing bij -80 ° C. Vermijd meerdere freeze-and-dooi cycli.
- Voeg vers 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS voor het experiment. Plaats het op ijs.
Let op: Houd PFA in een zuurkast en geschikte kleding te dragen. - Ontdooi de stabilisatie medium (20 ml per retina). Add penicilline-streptomycine tot een eindconcentratie van 100 U / ml. Warme deel van het medium (15 ml per retina) tot 37 ° C incubator voor het experiment. Laat de rest van het medium op het ijs.
- Plaats de HBSS (10 ml per retina) op ijs.
2. het netvlies organotypische Cultuur
- Breng de monsters een weefselkweek kap. Open de oogschelp door te snijden rond de lens. Met behulp van een borstel, verwijdert het glasvocht zonder te trekken aan het netvlies. Voorzichtig los van het netvlies van het snijvlak met een borstel om de optische schijf bloot te leggen. Ernstige de oogzenuw met een scheermes en het netvlies los.
- Breng de retina in een petrischaal en zorgvuldig spoel de retina eenmaal met koud HBSS. Plaats het monster in HBSS op ice. Ontleden zoveel netvliezen als nodig is door het herhalen van stap 2.1 en deze stap.
- Snijd het netvlies doormidden symmetrisch met een scheermes. Voorzichtig doorvoermonsters een 6-well plaat met 3 ml stabilisatie medium per putje. Laten equilibreren gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een incubator met de atmosfeer die 5% CO2.
- Bereid de volgende reagentia tijdens de incubatie bij Stap 2.3: Verdun de histamine stockoplossing aan de gewenste concentratie (450 uM) in warm medium. Oplossen LXA4 (onder argon opgeslagen) in het medium tot een uiteindelijke concentratie van 250 ng / ml.
OPMERKING: Bij het meten van het effect van LXA4 is de helft van één retina voor alleen histamine, terwijl de andere helft wordt gebruikt voor histamine met LXA4. - Zuig de stabilisering medium zorgvuldig en voeg de voorbereide medium aan elk putje (3 ml per putje). Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 1 uur in een incubator met de atmosfeer die 5% CO2.
- Spoel desamples eenmaal in warm, steriele PBS.
3. Bereid de monsters voor Immunokleuring
- Zuig PBS van de platen. Voeg 4% PFA (3 ml per putje) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Snel zuig het PFA. Spoel de monsters tegelijk met behulp van PBS. Breng de monsters tot 10% sucrose (5 ml per putje) en incubeer gedurende 2 tot 4 uur bij 4 ° C.
- Breng de monsters naar een 30% sucrose (5 ml per putje) en incubeer overnacht bij 4 ° C. Meng een deel van de commerciële bevriezing medium met twee delen 20% sucrose om de werkende bevriezing drager. Laat het bij 4 ° C gedurende de nacht of langer totdat de luchtbellen verdwijnen.
- Breng de monsters aan de werkende invriesmedium en laat equilibreren gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Trim elke retina in rechthoeken (ongeveer 3 mm bij 5 mm).
- Breng voorzichtig de monsters in de werkende bevriezing media geborgen in een cilindervormige container (ongeveer 1 cm radius x 2 cm hoogte) devseerd uit aluminiumfolie. Waarborgen dat de retinale schijfjes verticaal (gericht op een dwarsdoorsnede van de retina verlenen op snijden) en invriezen in vloeibare stikstof. Bewaar de blokken bij -80 ° C tot gebruik.
- Sectie elk blok op een cryostaat in 14 micrometer dikke plakken en monteer de secties op glasplaatjes. Bewaar de objectglaasjes bij -80 ° C tot gebruik.
4. Immunokleuring
- Was de secties met 5% sucrose fosfaatbuffer (SPB, 5% sucrose in PBS, pH 7,4) eenmaal. Blokkeert de niet-specifieke bindingsplaatsen door incuberen van de secties in blokkerende buffer (5% SPB met 10% normaal geitenserum en 0,5% Triton X-100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Incubeer de secties (op dia's) met de juiste primaire antilichaam (GFAP of MAP2, verdund 1: 500 in het blokkeren van buffer) gedurende 1 uur. Zuig de oplossing. Was drie keer in 5% SPB. Voor het kleuren van de endogene IgG, deze stap overslaan.
- Incubeer de secties met de bijbehorende Secondaire antilichamen (Cyanine3 / FITC geconjugeerd ezel-anti-muis / anti-konijn IgG, verdund 1: 800 in blokkerende buffer) gedurende 1 uur.
- Was de onderdelen grondig met 5% SPB drie keer. Bereid de monsters voor microscopie door het monteren van hen in de montage medium met DAPI en afdekken met dekglaasjes.
- Met behulp van een laser confocale microscoop, beelden vast te leggen door middel van een 20x lens onder identieke parameters zoals laser intensiteit, gain-waarde, verblijftijd, enz. Over groepen. Stel de excitatie / emissie-golflengten voor het blauwe kanaal (op te sporen DAPI) als 408/447 nm, voor het rode kanaal (tot Cyanine3 detecteren) als 561/785 nm en voor het groene kanaal (tot FITC detecteren) als 488/525 nm .
5. Image Analysis
- Kwantificeren percentage lekkende bloedvaten volgens de volgende criteria 12: alleen bloedvaten met endotheliale celkernen in het snijvlak in de telling; overwegen een bloedvat lek als het ag toontradient van immunokleuring rondom het schip.
- Om de expressie te bepalen, selecteert u regio's van belang en meet de gemiddelde grijswaarde met behulp van de software voor beeldanalyse.
- Om de breedte van het proces te meten, kies een gebied van de sectie waar de processen onderscheiden (de buitenste nucleaire laag, ONL, bijvoorbeeld). Kies dan voor een optische veld waarin dergelijke processen zijn zichtbaar en continu. Zet de schaal bar volgens de microscopische setting, trek een lijn over het proces en het uitvoeren van de meting.
- Om de continuïteit van het proces, analyseren en regio's van belang, gelden de filter genaamd variantie waarin de randen in het beeld versterkt door elke pixel te vervangen met zijn omgeving variantie, automatisch het contrast en de helderheid aan te passen, de telling van de lijnen en het normaliseren van de telling door de gebied.
- Bereken statistische betekenissen met behulp van een tweezijdige Student's t-test. *, P <0,05; **, P <0,01; *** P <0,001. Plot het resultaat als gemiddelde ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We presenteren een goedkope, tijdbesparende en gemakkelijk te gebruiken kunnen mogelijke behandelingen die bescherming kan bieden tegen BRB breuk veroorzaakt door histamine evalueren. IgG wordt beperkt binnen de vaten controle retina (Figuur 1A), maar lekt uit de bloedvaten bij blootstelling histamine (Figuur 1B), hetgeen bevestigt dat het model tot stand is gebracht.
LXA4 werd gekozen om het screenen op geneesmiddelen tegen BRB breuk in de gepresenteerde systeem te demonstreren. BRB disfunctie wordt verzwakt bij behandeling met LXA4 (figuur 1D), die geen significant effect op zichzelf (figuur 1C) heeft. De omkering wordt gekwantificeerd als percentage van de gelekte bloedvaten en het resultaat is significant (figuur 1E). Twee andere retinale celtypen Müller gliacellen (figuur 2) en ganglioncellen (
Figuur 1:. The Blood Retina Barrier in het gedrang komt op Histamine Exposure en Gered door LXA4 Treatment IgG immunokleuring (rood) wordt gepresenteerd vanuit het netvlies, die onbehandeld was (A), beschadiging geïnduceerd met slechts histamine (B), behandeld met alleen LXA4 (C ) of blootgesteld aan zowel histamine en LXA4 (D). In control (A) en behandeld LXA4 (C) groepen, IgG wordt beperkt binnen de bloedvaten (BV), terwijl in de histamine groep (B) wordt gedetecteerd IgG uit de BV vormt daar lekkage wolken gestippeld cirkels. Verdere toevoeging van LXA4 redt het vaartuig dysfunctie (D). Schaal bar, 20 pm. (E) De kwantitatieve meting van de lekkende BV's aan de overkant van de geteste groepen. Statistische significantie wordt bepaald door een tweezijdige Student's t-test. *, P <0,05; **, P <0,01; *** P <0,001. Gemiddelde ± SEM (n = 18) is uitgezet in de grafiek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:
Figuur 3: De continuïteit van Ganglion celprocessen wordt niet beïnvloed door LXA4. (A) Immunokleuring tegen MAP2 wordt voorgelegd retina dat onbehandeld was (A), beschadiging geïnduceerd met histamine alleen (B) behandeld met alleen LXA4 (C) of blootstelling aan zowel histamine en LXA4 (D). Positieve kleuring wordt verkregen in de processen en cellichamen van ganglioncellen. Een monster beeld van MAP2 kleuring (E) met de bijbehorende afbeelding-filter verbeterd (F) wordt gepresenteerd. De continue werkwijzen zijn aangeduid met pijlpunten. Schaalbalk, 20 urn. (G) De dichtheid van de continue, MAP2-positief ganglioncellen Processen van alle groepen worden gepresenteerd. Statistische significantie wordt bepaald door een tweezijdige Student's t-test. *, P <0.05; **, P <0,01; *** P <0,001. Gemiddelde ± SEM (n = 18) is uitgezet in de grafiek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
References
- Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C.
- Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
- Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
- Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
- Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
- Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).
- Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
- Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
- Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
- Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10 (2015).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
- Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).
- Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188 (2014).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
- Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
- Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
- Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
- Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).
- Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
- Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055 (2010).
- Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
- Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
- Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).
