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Medicine

Um Modelo aguda da retina para a Avaliação sanguíneos da retina barreira Descumprimento e potenciais fármacos para o tratamento

Published: September 13, 2016 doi: 10.3791/54619
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rowan University, 2Department of Cell Biology, Rowan University School of Osteopathic Medicine

Summary

Um baixo custo, o sistema easy-to-use e poderoso é estabelecida para avaliar potenciais tratamentos que possam amenizar violação sangue barreira retina induzida pela histamina. vazamento dos vasos sanguíneos, a ativação de células Müller e a continuidade dos processos neuronais são utilizados para avaliar a resposta a danos e sua reversão com uma droga potencial, lipoxina A4.

Introduction

Um crescente corpo de evidências suportam a existência de barreira retiniana sanguínea (BRB) 1-5 e a sua semelhança com a barreira hemato-encefálica (BHE) 6,7. Compromisso da BHE foi firmemente ligado causalmente ou como um marcador diagnóstico para doenças neurodegenerativas crónicas tais como a doença de Alzheimer (AD) e 8,9 agudas condições tais como delírio 10. percepções mecanicistas para estas patologias e descobertas para alvos potenciais da droga são geralmente prejudicada pela acessibilidade e rede limitada complexidade do cérebro. Alternativas tais como imagiologia in vivo 11, cérebro cultura organotípica 12, as culturas de células primárias 13,14 e sistemas de co-cultura com 15 ter sido gerado. No entanto, a maioria destes modelos requerem instrumentos especiais, períodos experimentais longos ou múltiplos marcadores para identificar células. semelhanças estruturais e funcionais entre a certificação e BRB, bem como uma correlação entre o dysfunctions de os dois têm sido argumentado 16-19. Além disso, um acesso mais fácil, tipos celulares bem definidos e uma estrutura em camadas da retina têm permitido bem caracterizado como uma janela para o cérebro. As identidades estruturais e funcionais da BHE e BRB continuam a ser comparado em pormenor. No entanto, as patologias da retina, principalmente a quebra BRB, também foram fortemente associada com a progressão de várias doenças, incluindo a diabetes e 18-19 21,22 AD. Assim, é de interesse para estabelecer um sistema de disfunção BRB não só para delinear o mecanismo, mas também para pesquisar potenciais drogas. Neste relatório, um protocolo que permite a disfunção BRB usando uma cultura aguda de retina simples é desenvolvida e apresentada.

O aumento da permeabilidade da BHE e alterações patológicas ad como foram estabelecidas em uma cultura organotípica cérebro incubadas com histamina, um mediador pró-inflamatório 12. Portanto, no sistema apresentado, a histamina foi Applied para a cultura ex vivo para induzir disfunção da retina BRB. Retinas de várias espécies, como Mus musculus e Bos Taurus, foram testados. Devido à sua disponibilidade comercial e semelhança com o tecido humano, globos oculares suínos frescos foram utilizados para fornecer os dados aqui relatados. Após incubação com histamina e / ou outras drogas, as retinas foram processadas para avaliação por imunocoloração para várias proteínas de 12, tais como a imunoglobulina G (IgG), um dos principais componentes do sangue; proteína ácida fibrilar glial (GFAP), um marcador conhecido para a activação da glia; e proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2), uma proteína do citoesqueleto específica para neurónios essencial para a montagem dos microtúbulos. Além disso, a estrutura em camadas da retina permite uma análise detalhada dos processos de células de Muller e células ganglionares, tais como alterações na sua largura e continuidade. Assim, vários parâmetros adicionais estão disponíveis para avaliar as consequências daBRB violação numa fase inicial e para avaliar os efeitos de reversão de potenciais tratamentos também.

Neste protocolo, os efeitos potenciais de inversão de drogas crivados são avaliadas a partir de três pontos de vista: o vazamento dos vasos sanguíneos (BVS), a activação das células da glia e os danos-resposta de células neuronais. Vários métodos de quantificação são utilizados, por exemplo, o nível de expressão mostrado pela intensidade da imunocoloração, medição da largura de um processo e de continuidade de processos neuronais mostrados por um filtro de reforço. Para melhor ilustrar o método e para ajudar a interpretar os resultados, da lipoxina A4 (LXA4), um composto sintetizado endogenamente em resposta a uma lesão inflamatória e atenuando a disfunção endotelial 23, foi escolhida para fins de demonstração.

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Protocol

Todos os protocolos foram realizados em conformidade com as políticas do Comitê animal Institucional Cuidado e Uso quando aplicável.

1. Preparação

  1. Preparar os meios de estabilização com 75% de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), 25% de Hanks Solução Salina Equilibrada (SSHE). Misture bem, alíquota e armazenar a -20 ° C até à sua utilização.
  2. Prepara-se o tampão fosfato salino (PBS) e esterilizar em autoclave. Guardar a solução à temperatura ambiente. Aquece-se a PBS para 37 ° C antes da experiência (5 ml por poço).
  3. Preparar 10%, 20% e 30% de sacarose em PBS. Filtrar todas as soluções individualmente mais separados 0,22 filtros para esterilização. Salvar as soluções a 4 ° C.
  4. Preparar a solução de estoque de histamina em PBS a uma concentração de 90 mM. Esterilizar a solução por filtração através de um filtro de 0,22 um. Alíquotas e guardar a solução a -80 ° C. Evitar ciclos múltiplos de congelação-e-descongelação.
  5. Adicione fresco paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS antes da experiência. Colocá-lo em gelo.
    Cuidado: Mantenha PFA em um exaustor e usar equipamento de protecção adequado.
  6. Descongelar o meio de estabilização (20 ml por retina). Adicionar penicilina-estreptomicina a uma concentração final de 100 U / mL. parte quente do meio (15 ml por retina) a 37 ° C na incubadora antes da experiência. Deixar o resto do meio em gelo.
  7. Coloque a HBSS (10 ml por retina) em gelo.

2. Retinal Cultura organotípicas

  1. Transferir as amostras de um capuz de cultura de tecidos. Abra a viseira cortando ao redor da lente. Usando um pincel, retire suavemente o humor vítreo, sem puxar a retina. Suavemente descolar a retina a partir do bordo de corte com uma escova para expor o disco óptico. Severa do nervo óptico com uma navalha e solte a retina.
  2. Transferir a retina em uma placa de Petri e lavar cuidadosamente a retina uma vez usando fria HBSS. Colocar a amostra no HBSS na ice. Dissecar como muitos retinas, conforme necessário, repetindo Etapa 2.1 e este passo.
  3. Cortar a retina ao meio simetricamente com uma navalha. Suavemente transferir amostras para uma placa de 6 cavidades com 3 mL de meios de estabilização por poço. Permitir o equilíbrio durante 30 minutos a 37 ° C numa incubadora com atmosfera contendo 5% de CO 2.
  4. Preparar os seguintes reagentes durante a incubação no Passo 2.3: Diluir solução-mãe de histamina para a concentração desejada (450 uM) em meio morno. Dissolve-LXA4 (armazenada sob atmosfera de árgon) para o meio a uma concentração final de 250 ng / ml.
    Nota: Quando se mede o efeito de LXA4, uma metade de um único retina é usado só por histamina, enquanto que a outra metade é usado para a histamina com LXA4.
  5. Aspirar o meio e adicionar estabilização cuidadosamente o meio preparado a cada poço (3 ml por cavidade). Incubar as amostras a 37 ° C durante 1 hora numa incubadora com atmosfera contendo 5% de CO 2.
  6. Lavar oamostras de uma vez em água morna, PBS estéril.

3. Prepare as amostras para imunocoloração

  1. Aspirar PBS a partir das placas. Adicionar PFA a 4% (3 ml por cavidade) e incuba-se durante 15 min à temperatura ambiente.
  2. aspirar rapidamente a PFA. Lavar as amostras de uma só vez utilizando PBS. Transferir as amostras a 10% de sacarose (5 ml) por poço e incubar durante 2 a 4 horas a 4 ° C.
  3. Transferir as amostras para uma sacarose a 30% (5 ml por poço) e incubar durante a noite a 4 ° C. Misturar uma parte do meio de congelamento comercial, com duas partes de 20% de sacarose para tornar o meio de congelação de trabalho. Deixe que a 4 ° C durante a noite ou mais tempo até que as bolhas de ar desaparecer.
  4. Transferir as amostras para o meio de congelação de trabalho e permitir o equilíbrio durante 5 min à temperatura ambiente. Apare cada retina em retângulos (cerca de 3 mm por 5 mm).
  5. transferir cuidadosamente as amostras para o meio de congelação de trabalho contido num recipiente cilíndrico (cerca de 1 cm de raio x 2 cm de altura) devzada da folha de alumínio. Assegure-se que as fatias de retina são verticais (orientada para proporcionar um corte transversal da retina após o corte) e congelá-los em azoto líquido. Guardar os blocos a -80 ° C até à sua utilização.
  6. Seção cada bloco em um criostato em 14 mm fatias grossas e montar as secções em lâminas de vidro. Armazenar as lâminas a -80 ° C até à sua utilização.

4. A imunocoloração

  1. Lavam-se as secções com tampão de fosfato de 5% de sacarose (SPB, 5% de sacarose em PBS, pH 7,4) uma vez. Bloquear os locais de ligação não específicos por incubação das secções em tampão de bloqueio (5% SPB com 10% de soro normal de cabra e 0,5% de Triton X-100) durante 1 h à temperatura ambiente.
  2. Incubam-se as secções em lâminas () com o anticorpo primário apropriado (GFAP ou MAP2, diluído a 1: 500 em tampão de bloqueio) durante 1 h. Aspirar a solução. Lavar três vezes em 5% SPB. Para a coloração da IgG endógena, ignore este passo.
  3. Incubar as secções com o secon correspondentedary anticorpos (IgG anti-ratinho / anti-coelho de burro conjugado Cyanine3 / FITC, diluída a 1: 800 no tampão de bloqueio) durante 1 h.
  4. Lavam-se as secções cuidadosamente com 5% SPB três vezes. Preparar as amostras para microscopia por montá-los no meio de montagem contendo DAPI e cobrindo com lamelas.
  5. Usando um laser microscópio confocal, capturar imagens através de uma lente de 20X sob parâmetros idênticos, como a intensidade do laser, o valor ganho, tempo de permanência, etc. entre os grupos. Definir os comprimentos de onda de excitação / emissão para o canal azul (para detectar DAPI) como 408/447 nm, para o canal vermelho (para detectar Cyanine3) como 561/785 nm e para o canal verde (para detectar FITC) como 488/525 nm .

Análise 5. Imagem

  1. Quantificar percentagem de vasos sanguíneos com vazamentos de acordo com os seguintes critérios 12: Inclua apenas os vasos sanguíneos com os núcleos das células endoteliais dentro do plano de corte na contagem; considerar um leaky vasos sanguíneos se mostra agradient de imunocoloração em torno do navio.
  2. Para determinar o nível de expressão, selecione regiões de interesse e medir o valor de cinza média usando o software de análise de imagem.
  3. Para medir a largura do processo, escolher uma área de secção em que os processos são distintos (a camada externa nuclear, ONL, por exemplo). Em seguida, escolha um campo óptico, onde tais processos são visíveis e contínua. Defina a barra de escala de acordo com a configuração microscópica, desenhar uma linha em todo o processo e realizar a medição.
  4. Para analisar a continuidade do processo, selecione regiões de interesse, aplicar o filtro chamado de variação que melhora as bordas da imagem, substituindo cada pixel com sua variância vizinhança, ajustar automaticamente o contraste e brilho, contar as linhas e normalizar a contagem pela área.
  5. Calcule significância estatística usando teste t de Student de duas caudas. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001. Pmuito o resultado como média ± SEM.

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Representative Results

Apresentamos, um sistema de baixo custo em tempo eficiente e fácil de usar para avaliar potenciais tratamentos que podem proteger contra a violação BRB induzida pela histamina. IgG é limitada dentro dos vasos na retina controle (Figura 1A), mas vaza dos vasos sanguíneos após a exposição de histamina (Figura 1B), confirmando que o modelo seja estabelecida com sucesso.

LXA4 foi escolhido para demonstrar o rastreio de drogas contra BRB violação no sistema apresentado. Disfunção BRB é atenuada após tratamento com LXA4 (Figura 1D), o que não tem nenhum efeito significativo por si só (Figura 1C). A reversão é quantificada como uma porcentagem dos vasos sanguíneos que vazaram eo resultado é significativo (Figura 1E). Dois outros tipos de células da retina, células gliais Müller (Figura 2) e as células ganglionares ( (Figura 2E) mostrados por meio de coloração GFAP (Figura 2, AD), mas não tem efeitos significativos sobre a continuidade dos processos dendríticos em células ganglionares (Figura 3G), mostrado pela coloração MAP2 (Figura 3, AE). É também de notar que não houve alteração significativa no nível de expressão de proteínas, quer seja detectado.

figura 1
Figura 1:. A retina Barreira Sangue é comprometida após exposição histamina e salvados pelo LXA4 Tratamento imunocoloração IgG (vermelho) é apresentado a partir da retina que foi não tratado (A), com apenas histamina (B) induzida por dano, tratados apenas com LXA4 (C ), ou expostos a ambos histamine e LXA4 (D). Em grupos LXA4 tratado (C) controle (A) e, IgG é restrita dentro dos vasos sanguíneos (BVS), enquanto no grupo de histamina (B), IgG é detectado fora das BVs onde forma nuvens de fuga indicados por círculos pontilhados. A adição posterior de LXA4 resgata a disfunção recipiente (D). Barra de escala, 20 mm. (E) A medição quantitativa dos BVs vazamentos entre os grupos testados. A significância estatística é determinada por um teste t de Student bicaudal. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001. A média ± SEM (n = 18) é traçada no gráfico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Rong> processos celulares Müller são comprometidas pela histamina e salvados pelo LXA4 tratamento. marcação para a GFAP é apresentada a partir de retina, que não foi tratado (A), com histamina única (B) tratados apenas com LXA4 (C) ou expostos a ambos histamina induzida por danos LXA4 e (D). A coloração positiva é obtido nos processos de células de Müller através da retina e em todo o VLs. Barra de escala, 20 | im. (E) A largura dos processos celulares Müller de todos os grupos são apresentados. Cerca de 30 processos individuais foram medidos por grupo. A significância estatística é determinada por um teste t de Student bicaudal. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001. A média ± SEM (n = 30) é traçada no gráfico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

t "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Figura 3
Figura 3: a continuidade dos processos Ganglion celular não é afetado por LXA4. (A) A imunocoloração contra a MAP2 é apresentada a partir de retina, que não foi tratado (A), com a única histamina (B) tratados apenas com LXA4 (C) ou expostos a histamina e a LXA4 (D) induzida por danos. A coloração positiva é obtido nos processos e corpos celulares de células ganglionares. Uma imagem da amostra de coloração MAP2 (E) em conjunto com a sua imagem no filtro reforçada correspondente (F) é apresentada. Os processos contínuos são indicados por pontas de seta. Barra de escala, 20 | im. (L) A densidade das células ganglionares processos contínuos, MAP2-positivos a partir de todos os grupos são apresentados. A significância estatística é determinada por um teste t de Student bicaudal. *, P <0.05; **, P <0,01; ***, P <0,001. A média ± SEM (n = 18) é traçada no gráfico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies  11965-092
HBSS Life Technologies  14170-112
Sucrose J.T.Baker 4072-05
Histamine  Sigma H7125-1G
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen
PFA Electron Microscopy Sciences 15710
Freezing Media  Triangle Biomedical Sciences TFM-5
Normal Goat Serum  Rockland D104-00-0050
Triton X-100 Sigma T8787
GFAP Antibody Millipore AB5804
MAP2 Antibody EMD Millipore MAB3418
FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-095-152
Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 715-165-150
mounting medium containing DAPI Vector Laboratories, Inc. H-1200
Laser Confocal Microscope Nikon Eclipse Ti microscope
ImageJ National Institutes of Health 1.45s

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References

  1. Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3 (2011).
  2. Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
  3. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
  4. Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
  5. Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
  6. Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).
  7. Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
  8. Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
  9. Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
  10. Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10 (2015).
  11. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
  12. Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).
  13. Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188 (2014).
  14. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
  17. Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
  18. Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
  19. Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).
  20. Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
  21. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
  22. Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055 (2010).
  23. Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
  24. Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
  25. Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).

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