Summary
Un faible coût, système facile à utiliser et puissant est mis en place pour évaluer les traitements qui pourraient améliorer la violation du sang barrière rétinienne induite par l'histamine. navire de fuite de sang, l'activation des cellules Müller et la continuité des processus neuronaux sont utilisés pour évaluer la réponse aux dommages et son inversion avec un médicament potentiel, la lipoxine A4.
Introduction
Un nombre croissant de preuves soutient l'existence de la barrière de la rétine de sang (BRB) 1-5 et sa similitude avec la barrière hémato - encéphalique (BHE) 6,7. Compromission de la BHE a été étroitement liée causalement ou en tant que marqueur diagnostique pour les maladies neurodégénératives chroniques telles que la maladie d'Alzheimer (MA) et 8,9 aiguës des conditions telles que le délire 10. idées mécanistes dans ces pathologies et de découvertes pour les cibles potentielles de médicaments sont généralement entravés par l'accessibilité et réseau intrication limitée du cerveau. Des alternatives telles que l' imagerie in vivo 11, le cerveau organotypique culture 12, des cultures de cellules primaires 13,14 et des systèmes de co-culture 15 ont été générés. Cependant, la plupart de ces modèles nécessitent des instruments spéciaux, de longues périodes expérimentales ou plusieurs marqueurs pour identifier les cellules. similitudes structurelles et fonctionnelles entre BBB et BRB, ainsi qu'une corrélation entre l'dysfunctions des deux ont été soutenu 16-19. En outre, un accès plus facile, les types de cellules bien définies et une structure en couches ont permis à la rétine bien caractérisé comme une fenêtre dans le cerveau. Les identités structurales et fonctionnelles de la BHE et BRB restent à comparer en détail. Cependant, pathologies de la rétine, en particulier la violation BRB, ont également été étroitement associée à la progression de diverses maladies, y compris le diabète 18-19 et AD 21,22. Par conséquent, il est intéressant de mettre en place un système de dysfonctionnement BRB non seulement de délimiter le mécanisme, mais aussi pour cribler des médicaments potentiels. Dans ce rapport, un protocole permettant un dysfonctionnement BRB utilisant une culture rétinienne aiguë simple est élaboré et présenté.
Augmentation de la perméabilité BBB et des changements pathologiques AD-like ont été établis dans une culture du cerveau organotypique incubé avec de l' histamine, un médiateur pro-inflammatoire 12. Par conséquent, dans le système présenté, l'histamine a été applié à la culture ex vivo de la rétine à induire un dysfonctionnement BRB. Les rétines de plusieurs espèces, comme Mus musculus et Bos Taurus, ont été testés. En raison de leur disponibilité commerciale et de ressemblance avec les tissus humains, des globes oculaires du porc frais ont été utilisés pour fournir les données rapportées ici. Après incubation avec de l' histamine et / ou d' autres médicaments, les rétines ont été traitées pour l' évaluation par immunocoloration pour plusieurs protéines 12 telles que l' immunoglobuline G (IgG), l' un des principaux composants du sang; protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), un marqueur bien connu pour l'activation gliale; et la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2), une protéine du cytosquelette spécifique des neurones essentiels pour l'assemblage des microtubules. En outre, la structure en couches de la rétine permet une analyse détaillée des processus de cellules de Müller et les cellules ganglionnaires, tels que des changements dans la largeur et la continuité. Ainsi plusieurs paramètres supplémentaires sont disponibles pour évaluer les conséquences de laviolation BRB à un stade précoce et d'évaluer les effets d'inversion des traitements potentiels.
Dans ce protocole, les effets d'inversion potentiels des médicaments dépistés sont évalués à partir de trois perspectives: la fuite des vaisseaux sanguins (BVS), l'activation des cellules gliales et les dommages-réponse des cellules neuronales. Plusieurs méthodes de quantification sont utilisées, par exemple, le niveau d'expression représentée par l'intensité de l'immunocoloration, mesure de la largeur d'un processus et la continuité des processus neuronaux représentés par un filtre d'amélioration. Pour mieux illustrer la méthode et pour aider à interpréter les résultats, lipoxine A4 (LXA4), un composé synthétisé de manière endogène en réponse à une lésion inflammatoire et atténuer la dysfonction endothéliale 23, a été choisie à des fins de démonstration.
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Protocol
Tous les protocoles ont été effectués en conformité avec les politiques du Comité des soins et l'utilisation des animaux institutionnels, le cas échéant.
1. Préparation
- Préparer le milieu de stabilisation avec 75% de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 25% de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS). Bien mélanger, aliquote et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
- Préparer le tampon phosphate salin (PBS) et stériliser par autoclavage. Conserver la solution à la température ambiante. Chauffer le PBS à 37 ° C avant l'expérience (5 ml par puits).
- Préparer 10%, 20% et 30% de saccharose dans du PBS. Filtrez toutes les solutions individuellement plus de 0,22 um filtres séparés pour la stérilisation. Enregistrer les solutions à 4 ° C.
- Préparer la solution d'histamine stock dans du PBS à une concentration de 90 mM. Stériliser la solution par filtration sur un filtre de 0,22 pm. Aliquoter et sauver la solution à -80 ° C. Évitez de multiples cycles de gel et de dégel.
- Faire frais paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS avant l'expérience. Placez-le sur la glace.
Attention: Gardez PFA dans une hotte et porter un équipement de protection approprié. - Décongeler le moyen de stabilisation (20 ml par rétine). Ajouter pénicilline- streptomycine à une concentration finale de 100 U / ml. partie chaude du milieu (15 ml par rétine) à 37 ° C dans l'incubateur avant l'expérience. Laissez le reste du milieu sur la glace.
- Placez le HBSS (10 ml par rétine) sur la glace.
2. Retinal organotypiques Culture
- Transférer les échantillons dans une hotte de culture tissulaire. Ouvrez l'œilleton en coupant autour de la lentille. Avec un pinceau, retirez délicatement l'humeur vitrée sans tirer sur la rétine. détacher délicatement la rétine à partir du bord de coupe avec une brosse pour exposer le disque optique. Sévère du nerf optique avec un rasoir et de libérer la rétine.
- Transférer la rétine dans une boîte de Pétri et rincer soigneusement la rétine une fois en utilisant HBSS froid. Placer l'échantillon dans HBSS sur ice. Disséquer autant rétines comme nécessaire en répétant l'étape 2.1 et cette étape.
- Couper en deux la rétine de manière symétrique avec un rasoir. transférer doucement échantillons sur une plaque de 6 puits avec 3 ml de milieu de stabilisation par puits. Permettre équilibration pendant 30 min à 37 ° C dans un incubateur avec l'atmosphère contenant 5% de CO 2.
- Préparer les réactifs suivants au cours de l'incubation à l'étape 2.3: Diluer la solution d'histamine des stocks à la concentration désirée (450 uM) dans un milieu chaud. Dissoudre la LXA4 (stocké sous argon) dans le milieu à une concentration finale de 250 ng / ml.
REMARQUE: Lorsque l'on mesure l'effet de LXA4, une moitié d'une seule rétine est utilisée pour l'histamine seul, tandis que l'autre moitié est utilisée pour l'histamine avec la LXA4. - Aspirer le milieu de stabilisation et ajouter soigneusement le moyen disposé à chaque puits (3 ml par puits). Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 heure dans un incubateur avec l'atmosphère contenant 5% de CO 2.
- Rincer leéchantillons une fois dans un endroit chaud, PBS stérile.
3. Préparer les échantillons pour immunocoloration
- Aspirer le PBS des plaques. Ajouter 4% de PFA (3 ml par puits) et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Aspirer rapidement la PFA. Rincer les échantillons une fois à l'aide de PBS. Transférer les échantillons à 10% de saccharose (5 ml par puits) et incuber pendant 2 à 4 heures à 4 ° C.
- Transférer les échantillons à une teneur en saccharose à 30% (5 ml par puits) et on incube pendant une nuit à 4 ° C. Mélanger une partie du milieu de congélation commercial avec deux parties de 20% de saccharose pour rendre le milieu de congélation de travail. Laissez-le à 4 ° C pendant une nuit ou plus jusqu'à ce que l'air des bulles disparaissent.
- Transférer les échantillons dans le milieu de congélation de travail et permettre équilibration pendant 5 min à température ambiante. Coupez chaque rétine en rectangles (environ 3 mm par 5 mm).
- transférer soigneusement les échantillons dans le milieu de congélation de travail contenu dans un récipient cylindrique (environ 1 cm de rayon x 2 cm de hauteur) devnisé de feuille d'aluminium. Veiller à ce que les tranches de la rétine sont verticales (orientées pour fournir une coupe transversale de la rétine sur sectionnant) et les congeler dans de l'azote liquide. Enregistrer les blocs à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Section chaque bloc sur un cryostat en 14 um tranches épaisses et monter les sections sur des lames de verre. Stocker les diapositives à -80 ° C jusqu'à utilisation.
4. immunocoloration
- Laver les sections avec du tampon phosphate 5% de saccharose (SPB, 5% de saccharose dans du PBS, pH 7,4) une fois. Bloquer les sites de liaison non spécifiques par incubation des coupes dans un tampon de blocage (5% SPB avec 10% de sérum de chèvre normal et 0,5% de Triton X-100) pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber les sections () sur des lames avec l'anticorps primaire approprié (GFAP ou MAP2, dilué à 1: 500 dans un tampon de blocage) pendant 1 h. Aspirer la solution. Laver trois fois dans 5% SPB. Pour la coloration de la IgG endogène, sautez cette étape.
- Incuber les sections avec le correspondant de secondeanticorps dary (Cyanine3 / FITC âne conjugué anti-souris / anti-IgG de lapin, dilué à 1: 800 dans le tampon de blocage) pendant 1 h.
- Laver les coupes à fond avec 5% SPB trois fois. Préparer les échantillons pour la microscopie par leur montage dans le montage milieu contenant DAPI et couvrant avec des lamelles.
- En utilisant un laser confocal, de capturer des images à travers un objectif 20X avec des paramètres identiques , tels que l' intensité du laser, la valeur de gain, le temps de séjour, etc. , entre les groupes. Définissez les longueurs d'onde d'excitation / émission pour le canal bleu (pour détecter DAPI) comme 408/447 nm, pour le canal rouge (pour détecter Cyanine3) comme 561/785 nm et pour le canal vert (pour détecter FITC) comme 488/525 nm .
5. Analyse de l'image
- Quantifier pourcentage de vaisseaux sanguins qui fuient selon les critères suivants 12: Inclure seulement les vaisseaux sanguins avec les noyaux des cellules endothéliales dans le plan de coupe dans le compte; envisager une leaky des vaisseaux sanguins si elle montre agradient de immunocoloration entourant le récipient.
- Pour déterminer le niveau d'expression, sélectionner des régions d'intérêt et de mesurer la valeur de gris moyenne en utilisant le logiciel d'analyse d'image.
- Pour mesurer la largeur du processus, pour choisir une zone de la section où les processus sont distinctes (la couche extérieure nucléaire, ONL, par exemple). Ensuite, choisissez un champ optique où ces processus sont visibles et continue. Réglez la barre d'échelle en fonction du réglage microscopique, tracer une ligne sur le processus et effectuer la mesure.
- Pour analyser la continuité du processus, certaines régions d'intérêt, appliquer le filtre appelé variance qui améliore les bords de l'image en remplaçant chaque pixel par sa variance de voisinage, ajuster automatiquement le contraste et la luminosité, compter les lignes et de normaliser le compte par le région.
- Calculer significations statistiques en utilisant ' t -test de Student bilatéral. * P <0,05; **, P <0,01; *** P <0,001. Pbeaucoup le résultat en moyenne ± SEM.
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Representative Results
Nous présentons, un système de temps efficace et facile à utiliser à faible coût pour évaluer les traitements potentiels qui pourraient protéger contre la violation BRB induite par l'histamine. L' IgG est limitée dans les vaisseaux de la rétine témoin (figure 1A), mais les fuites hors des vaisseaux sanguins lors d'une exposition à l'histamine (figure 1B), ce qui confirme que le modèle est établi avec succès.
LXA4 a été choisi pour démontrer le dépistage des médicaments contre la violation BRB dans le système présenté. Dysfonctionnement BRB est atténuée lors du traitement avec la LXA4 (figure 1D), ce qui n'a aucun effet significatif par lui - même (figure 1C). Le retournement est quantifiée en pourcentage de la fuite des vaisseaux sanguins et le résultat est significatif (figure 1E). Deux autres types de cellules rétiniennes, les cellules gliales de Müller (figure 2) et les cellules ganglionnaires (
Figure 1:. Le sang Retinal Barrière est compromise lors de l' exposition histamine et sauvé par traitement LXA4 immunocoloration IgG (rouge) est présenté à partir de la rétine , qui n'a pas été traité (A), les dommages induits par l' histamine seulement (B), traité avec LXA4 seulement (C ), ou exposé à la fois histamine et LXA4 (D). Dans le contrôle (A) et LXA4 traité (C) des groupes, IgG est limité dans les vaisseaux sanguins (BVS) , tandis que dans le groupe de l' histamine (B), IgG est détectée sur les BVs où il forme des nuages de fuite indiquées par des cercles en pointillés. Une addition supplémentaire de la LXA4 sauve le dysfonctionnement de la cuve (D). Barre d'échelle, 20 pm. (E) La mesure quantitative des BVs qui fuient à travers les groupes testés. La signification statistique est déterminée par t la -test de Student à deux queues. * P <0,05; **, P <0,01; *** P <0,001. Moyenne ± SEM (n = 18) est tracée dans le graphique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:
Figure 3: la continuité des processus Ganglion Cell est pas affectée par LXA4. (A) Coloration immunologique contre MAP2 est présenté de la rétine qui n'a pas été traité (A), avec l' histamine uniquement (B) traité avec la LXA4 seule (C) ou exposé à la fois à l' histamine et la LXA4 (D) dégâts. On obtient une coloration positive dans les procédés et les corps cellulaires des cellules ganglionnaires. Une image de l' échantillon de MAP2 coloration (E) conjointement avec l'image de filtre amélioré correspondant (F) est présentée. Les procédés continus sont indiqués par des flèches. Barre d'échelle, 20 pm. (G) La densité des processus cellulaires ganglionnaires continus, MAP2-positifs de tous les groupes sont présentés. La signification statistique est déterminée par t la -test de Student à deux queues. *, P <0.05; **, P <0,01; *** P <0,001. Moyenne ± SEM (n = 18) est tracée dans le graphique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
References
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