The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.
Detta protokoll beskriver generering av en tredimensionell (3D) ex vivo lever modell och dess tillämpning till studier och utveckling av virala vektorsystem. Modellen erhålls genom återinplantering den extracellulära matrisen av en decellulariserad råttlever med en human hepatocyt-cellinje. Modellen tillåter studier i en vaskulariserad 3D cellsystem, som ersätter potentiellt skadliga experiment med levande djur. En annan fördel är den humaniserade karaktär av modellen, som ligger närmare människans fysiologi än djurmodeller.
I denna studie visar vi transduktion av denna levermodell med en viral vektor härledd från adenoassocierade virus (AAV vector). Perfusionskretsen som levererar 3D levermodell med media ger ett enkelt sätt att tillämpa vektorn. Systemet tillåter övervakning av de stora metaboliska parametrar i levern. För slutlig analys kan vävnadsprover tas för att bestämma omfattningen av recellularizaning av histologiska tekniker. Fördelning av virusvektor och expression av den levererade transgen kan analyseras genom kvantitativ PCR (qPCR), Western blotting och immunohistokemi. Ett stort antal tillämpningar av vektormodellen i grundforskning och utveckling av genterapeutiska applikationer kan förutses, inklusive utveckling av nya antivirala läkemedel, cancerforskning, och studiet av virala vektorer och deras potentiella biverkningar.
Most current biomedical research relies on one of two approaches, either two-dimensional (2D) cell culture experiments or animal models, which are three-dimensional (3D) by their very nature. However, these approaches have some severe drawbacks. Cells grown in 2D culture have been shown to differ in gene expression patterns and cell physiology from those cultivated under 3D conditions.1 Animal models, in addition to being associated with ethical concerns, often do not model human physiology well. Although the lack of obvious toxic effects of a compound must be confirmed in animal models prior to the first dosing in humans, multiple cases have been documented in which severe, sometimes fatal, adverse effects have occurred in clinical trials.2
To overcome these shortcomings, humanized 3D ex vivo organ models have become important research tools. When cultivated under suitable conditions, cells self-assemble into 3D structures known as spheroids. However, these spheroids lack a vascular system, which limits the distribution of small molecular compounds, large biologics and viral vectors alike. For example, adenoviral vectors only transduced the outer cell layers of spheroids prepared from human glioblastomas.3 A solution to this problem is the use of an organ model containing a vascular system. To this end, the organ of interest can be explanted from an animal, and the animal cells can be replaced by human cells. Various methods for decellularization of animal livers by treatment with detergents or sodium cholate have been described.4-6 The resulting extracellular matrix (ECM) harbors cytokines and growth factors which regulate various cellular processes.7 It can be used as a scaffold for recellularization with human cells to obtain a functional organ model.
In a recent study, we used a humanized 3D liver model to study distribution and transgene expression of an adeno-associated virus (AAV) vector.8 AAV vectors belong to the most promising viral vectors for gene therapeutic applications.9 The first, and to date only, approved gene therapeutic intervention in the Western world uses an AAV vector for the transfer of lipoprotein lipase.10
De ombildade 3D lever beskrivs här ger en modell för att studera virala vektorer i en humaniserad systemet. Återplantering av ECM av en råttlever med en human hepatocellulär cancer cellinje genererar en vaskulariserad system som möjliggör studier av stora biologiska. Dessa resultat ger en proof-of-concept som den rekonstituerade levermodellen kan effektivt omvandlas med en virusvektor.
För experimenten som visas här, var varje leverloben transducerad genom AAV-vektor. Men i vissa preliminära experiment, enskilda lober inte nyinsatta med celler. Det är därför viktigt att förhindra celldebris eller andra komponenter från ockludera det vaskulära systemet. För att testa om alla lober kan perfusion, kan en giftfri färgämne, såsom fenolrött spolas genom levern modell.
En annan viktig fråga är att hålla levern ställningen steril. Även behandling med etanol eller antibiotika är disadvantageous för det vaskulära systemet, bestrålning av den extracellulära matrisen med γ-strålning bevarade kärlen och steriliserades provet.
Dessutom kommer storleken på explanterade levrar variera, så att antalet celler som används för den recellularization förfarandet och återpopulations tiden kan behöva justeras för att erhålla reproducerbara resultat.
De råttlevrar som användes i föreliggande studie är förhållandevis stora och kräver stora mängder av celler och testreagens (t.ex. AAV vektorer). Dessutom tog återplantering förfarandet mer än två veckor. Detta begränsar antalet replikat som kan göras med rimlig arbetsinsats. Vi håller på att inrätta en modell för mus lever, som är endast omkring en femtedel av volymen av råttlever, medger användning av färre celler och mindre testreagensen. Även proportionell skala ned antalet celler verkar rimligt, de exakta beloppen måste fastställas i furthennes experiment.
En annan brist med den föreliggande modellen är användningen av hepatocellulär HepG2-cellinjen. Experiment pågår för att utveckla användningen av hepatocyter differentierade från inducerade pluripotenta stamceller, som kommer att ge en fysiologiskt mer relevant modell. Vidare levern består av flera celltyper utöver de hepatocyter, t.ex., Kupffer-celler och sinosoids. Vi antar att de olika celltyper kommer återbefolka deras naturliga miljöer när en ECM recellularized med flera celltyper.
3D lever modellen kombinerar flera fördelar. En stor nackdel med konventionella in vivo-modeller är att djurfysiologi skiljer sig avsevärt från den mänskliga fysiologin. Toxiska biverkningar av behandling av en human patient kan därför förbli oupptäckt. Denna brist kan övervinnas genom beredning av den 3D lever modellen med mänskliga celler som närmare återspegla biologi human patienter.
Den andra fördelen av levern modellen är dess bidrag till djurens välbefinnande. Även om djur komponenter behövs för beredning experiment fortfarande följer den strategi målen i 3R-principen (ersättning, begränsning och förbättring), som överskottsdjur kan användas som offrades för andra djurexperiment, dvs inga ytterligare djur som krävs och tillvägagångssättet undviker helt lidande djur som ofta förknippas med in vivo experiment. Sfäroider är ett alternativt verktyg för att studera cellulära processer i ett 3D-system. Emellertid är sfäroider inte vaskulariserade så att stora ämnen och bioläkemedel inte tränger djupt in i de inre delarna av konstruktionen. Dessa problem har övervunnits med den vaskulariserade 3D levermodell.
I de experiment som beskrivs här, var AAV-vektorer som undersökts, eftersom de är bland de mest lovande kandidaterna för genterapeutiskaapplikationer. Lika många genterapeutiska tillvägagångssätt syftar till att rikta levern, t.ex., för behandling av infektioner med hepatitvirus eller av alfa-1-antitrypsinbrist, kan 3D-lever användas i förfarandet enligt dessa AAV-vektor utveckling. Det är, naturligtvis, även lämplig för studier av andra hepatotropiskt virala vektorer, till exempel, adenovirusvektorer. Dessutom kan den användas för att studera infektionshepatitvirus såsom hepatit B eller C virus. Den kan till exempel användas för att designa nya antivirala strategier. Dessutom 3D-modeller organ utgör lovande verktyg för att utveckla nya cytostatika behandlingar för cancer och att genomföra toxikologiska studier. På lång sikt, kan konstgjorda levrar användas i regenerativ medicin som transplantat. Sammantaget erbjuder 3D lever modellen ett brett spektrum av tillämpningar inom infektionsbiologi och andra områden av biomedicinsk forskning.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Bernd Krostitz for technical assistance, Radoslaw Kedzierski for initial contributions to the project, Erik Wade for proofreading and giving helpful comments, and Prof. Heike Walles for providing the bioreactor and sharing her valuable experience with organ decellularization. We are also thankful for funding of the project and publication by the Berlin University of Technology.
Incubator | Fraunhofer | / | |
Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
Screw Cap | Duran | 2924013 | |
Screw Cap | Duran | 2924008 | |
Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
penicillin/ streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
Cryomold 15x15x5mm | Sakura | 4566 | |
Biopsy punch 4mm | pfm medical | 48401 | |
Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |