Abstract
Ce protocole décrit la génération d'une à trois dimensions (3D) modèle ex vivo du foie et de son application à l'étude et le développement de systèmes de vecteurs viraux. Le modèle est obtenu par repeupler la matrice extracellulaire d'un foie de rat décellularisé avec une lignée cellulaire hépatocytaire humain. Ce modèle permet d'études dans un système de cellules 3D vascularisé, en remplaçant les expériences potentiellement nuisibles des animaux vivants. Un autre avantage est la nature du modèle humanisé, qui est plus proche de la physiologie humaine que les modèles animaux.
Dans cette étude, nous démontrons la transduction de ce modèle de foie avec un vecteur viral dérivé de virus adéno-associé (vecteur AAV). Le circuit de perfusion qui fournit le modèle du foie 3D avec les médias fournit un moyen facile d'appliquer le vecteur. Le système permet le contrôle des principaux paramètres métaboliques du foie. Pour l'analyse finale, les échantillons de tissus peuvent être prélevés pour déterminer l'étendue de recellularization par des techniques histologiques. La distribution du vecteur viral et l'expression du transgène délivré peut être analysé par PCR quantitative (qPCR), transfert de Western et immunohistochimie. De nombreuses applications du modèle vectoriel dans la recherche fondamentale et dans le développement des applications de thérapie génique peuvent être envisagées, y compris le développement de nouveaux traitements antiviraux, la recherche sur le cancer, et l'étude des vecteurs viraux et de leurs effets secondaires potentiels.
Protocol
NOTE: RL a obtenu l' approbation éthique pour l'explantation des organes de la Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Foies ont été explantées à partir de rats Wistar. La veine cave inférieure et la veine porte du foie ont été canulées avec 22 g d'une canule. Des procédés pour la décellularisation des foies explants ont été décrits précédemment. Les matrices extracellulaires 4,5 utilisées ici ont été obtenues par une perfusion excessive d'un foie de rat avec du désoxycholate de sodium à 1%.
1. Recellularization de la matrice extracellulaire (ECM) d'un foie de rat
- Expansion du foie HepG2 lignée cellulaire
- La culture de la lignée cellulaire d'hépatome HepG2 à Roswell Memorial Institute Park (RPMI) 1640 milieu additionné de 10% de sérum de veau foetal, 2 mM de glutamine, et 2 mM de pénicilline et de la streptomycine, chacune d'elles.
- Ensemencer 1,5 x 10 7 cellules dans des flacons T175 et faire croître les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 2.
- Isoler les cellules à 300 xg et les remettre en suspension dans 4 ml de PBS et de compter les cellules avec une chambre Neubauer sous un microscope. Une bouteille de T175 donnera environ 4,5 x 10 7 cellules.
REMARQUE: Assurez -vous de la culture contient le nombre de cellules suffisant pour recellularization du rat ECM du foie avec 6 x 10 8 cellules HepG2 par ECM (10 x 175 cm 2 flacons de culture avec 4-5 x 10 8 cellules chacun).
Figure 1. Système bioréacteur. A) Ce système de bioréacteur a été fait sur mesure. Il maintient les modèles d'orgue à 37 ° C et 5% de CO 2. Les débits des pompes péristaltiques d'écoulement peuvent être réglés individuellement. B) Le foie est placé dans une chambre de croissance et se connectented au circuit de perfusion, qui se compose d'une pompe péristaltique, un réservoir de fluide, un piège à bulles et un capteur de pression. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Recellularization de l'ECM
- Mettre en place le système de bioréacteur contenant une chambre de perfusion du foie, d'un système de perfusion, un réservoir de milieu et d'un piège à bulles. Stériliser le système de bioréacteur (121 ° C, 15 min).
- Connecter le système de bioréacteur avec une pompe péristaltique et le placer dans un incubateur offrant des conditions appropriées (37 ° C, 5% de CO 2). Placer décellularisé échafauds de foie de rat 8 dans la chambre de perfusion du foie du système de bioréacteur (figure 1).
- Connectez la veine porte et la veine cave canulée en utilisant des clips de tube au système de perfusion. Equilibrer échafaudage avec 150 ml de milieu RPMI (comme décrit au point 1.1)pendant 5 jours avec un débit de 1,25 ml / min de débit.
- Déconnecter l'échafaudage de foie provenant du circuit de support et inoculer l'échafaudage avec 3 x 10 8 cellules HepG2 (dans 5 ml) via la veine portale en utilisant une seringue de 5 ml, d' éviter la formation de bulles d'air et laisser les cellules repeupler les ECM en les incubant 1 h dans l'échafaudage avec la pompe hors tension.
- Augmenter progressivement le débit en ajustant la pompe, à partir de 1,25 ml / min pendant 10 min; 2,5 ml / min pendant 20 min, et enfin 3,75 ml / min pendant 30 min.
- Répétez les étapes 1.2.4-1.2.5 pour atteindre un nombre total de cellules de 6 x 10 8.
- Faire fonctionner le système de bioréacteur à un débit de 3,75 ml / min de débit. Culture du foie de rat recellularized pendant 2 semaines.
REMARQUE: Remplacer un tiers du milieu avec du milieu frais (50 ml) tous les deux jours. Échantillonner le milieu de culture pour mesurer des paramètres physiologiques tels que l'activité de lactate déshydrogénase, le pH des échantillons de milieu et de la concentration de glucose et de lactate.
2. transduction du Recellularized de foie de rat
- Production à grande échelle de vecteurs AAV
- Produire, purifier et quantifier des vecteurs AAV comme décrit précédemment: 11
- En bref, produire des vecteurs AAV dans des flacons roulants et les purifier par gradient de centrifugation iodixanol. Retirer iodixanol résiduel par filtration sur PD10 colonnes de filtration sur gel. Déterminer la concentration du vecteur AAV par qPCR en utilisant l'ADN génomique de l'AAV en tant que norme.
NOTE: L'auto-complémentaire, pseudotypé AAV2 / 6 vecteur utilisé dans la présente étude codée EmGFP en tant que journaliste pour démontrer l' efficacité de transduction et une cassette d'expression shRNA pour le knockdown d'un gène exprimé de manière endogène (cyclophiline humaine B (hCycB), Figure 2) . S'assurer qu'une quantité suffisante de vecteurs pseudotypés scAAV de sérotype 6 (2,7 x 10 13 vecteurs d'AAV par modèle du foie).
- En bref, produire des vecteurs AAV dans des flacons roulants et les purifier par gradient de centrifugation iodixanol. Retirer iodixanol résiduel par filtration sur PD10 colonnes de filtration sur gel. Déterminer la concentration du vecteur AAV par qPCR en utilisant l'ADN génomique de l'AAV en tant que norme.
- Produire, purifier et quantifier des vecteurs AAV comme décrit précédemment: 11
Figure 2. Carte de l'auto-complémentaire, pseudotypés AAV2 / 6 vecteur utilisé dans la présente étude. Le génome est constitué des répétitions terminales inversées (ITR) de AAV2 et code pour EmGFP sous le contrôle du promoteur CMV ainsi que d' un shRNA sous contrôle d'un promoteur U6. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Transduction du foie Modèle
- Ajuster la solution de vecteur AAV à une concentration finale de 2,7 x 10 13 génomes vecteurs dans 5 ml en ajoutant le volume respectif de PBS.
- Déconnecter le foie du circuit des médias en retirant le tube de la canule. Connecter une seringue de 5 ml à la canule de la veine porte et injecter la solution d'un vecteur AAV complet (5 ml).
NOTE: Optionally ajouter du rouge de phénol (5 pg / ml) pour suivre la distribution de la solution de vecteur AAV à travers le foie. - Incuber pendant 1 heure sans pompage. Peu à peu, augmenter le débit, à partir de 1,25 ml / min pendant 10 min; 2,5 ml / min pendant 20 min et 3,75 ml / min pendant 30 min. Culture du foie de rat recellularized sur 6 jours.
REMARQUE: Remplacer un tiers du milieu comme indiqué dans NOTA sous 1.2.7
3. Évaluation du foie Recellularized transduites Rat
- Hématoxyline et éosine (HE) coloration et analyse immunohistochimique
- Prélever des échantillons (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) de chaque lobe du foie à l'aide d'un scalpel.
- Incuber les échantillons (de 3.1.1) dans 4% de paraformaldehyde (PFA) + solution de saccharose à 4% pendant 1,5 heure à 4 ° C. (Attention: PFA est toxique et cancérigène Toujours garder PFA dans une hotte et porter des vêtements de protection appropriés..) Laver trois fois avec du PBS (1 min par étape de lavage) et incuber dans 8%nuit de saccharose à 4 ° C.
- Verser la fixation milieu dans cryomoules plastique, placer les échantillons dans la fixation du milieu exempt de bulles d'air. Ajouter moyen de fixation jusqu'à ce que l'échantillon est bien couvert. Magasin échantillons embarqués à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
- Préparer cryo-sections (10 pm) avec un cryotome 12. Évaluer recellularization par hématoxyline + éosine 8. Évaluer l'efficacité de transduction par coloration immunohistochimique pour l'intérêt gène-de-(ici: EmGFP).
- échantillonnage biologique moléculaire
- Exemple de chaque lobe du foie avec un poinçon de biopsie (4 mm de diamètre). Isoler l' ARN total, l' ADN et les protéines selon les instructions du fabricant pour l'évaluation de l' expression du transgène de EmGFP et hCycB abattre 8.
Representative Results
Pour l'évaluation de l'étendue des recellularization, cryo-sections ont été préparées à partir de chaque lobe de chaque modèle de foie recellularized. Les sections ont ensuite été analysées par coloration à l'hématoxyline et à l'éosine. Comme on peut le voir sur la figure 3, chaque lobe des trois modèles de foie, désigné comme SLT1, TLM2 (transduite modèles hépatiques 1 2) et Ctrl (modèle du foie de contrôle qui a été recellularized, mais non transduits), ont été repeuplée avec des cellules HepG2. Cette lignée de cellules de carcinome hépatocellulaire a été établie à partir du tissu tumoral d'un 15-year-old boy argentin. Certaines zones des modèles de foie ont été plus intensivement recellularized que d'autres. Les raisons de ces variations restent à déterminer.
Figure 3. hématoxyline et éosine de chaque lobe des trois modèles analysés hépatiques SLT1 + 2:. Foie transductionles modèles 1 et 2; Le modèle de contrôle de foie Ctrl qui a été recellularized mais pas transduction. Barre d'échelle: 200 um. (Re-imprimé avec la permission de Ref. 8.) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Dans l'étape suivante, la transduction des modèles hépatiques a été évaluée. A cet effet, l'ADN a été préparé à partir de 28 biopsies poinçonnées de chacun des modèles de foie et le titre du vecteur a été quantifié par PCR quantitative. En moyenne, 55 et 90 génomes de vecteur internalisées par cellule (VG / cellule) ont été mesurées pour les deux modèles de foie transduites. Les expériences en culture cellulaire ont montré 2D 30 VG / cellule sont suffisantes pour l'expression du transgène fort et silençage ARNi à médiation. La production de EmGFP a été analysée par RT-PCR et transfert de Western. En fait, l'expression du rapporteur a été détectée dans 80 à 90% des biopsies sur les niveaux d'ARNm et de protéine, respectivement.8 Pour obtenir une image complète de l'efficacité de la transduction, cryo-sections ont été immunohistologically analysés. Comme on peut le voir sur la figure 4, les zones du modèle du foie qui ont été recellularized avec succès, comme visualisé par coloration DAPI, ont également donné des signaux fluorescents solides dans l'analyse immunohistochimique de l' expression EmGFP. Comme prévu, le modèle du foie de contrôle, ne sont pas traités avec des vecteurs AAV, n'a montré aucune expression EmGFP.
Figure 4 Analyse immunohistochimique de l' expression des cellules qui EmGFP repeuplé les modèles de foie ont été visualisées par coloration au DAPI (bleu). EmGFP expression a été visualisée par coloration immunochimique (rouge). SLT1 + 2: Des modèles de foie transduites 1 et 2; Le modèle de contrôle de foie Ctrl qui a été recellularized mais pas transduction. Barre d'échelle: 200 um. (Re-imprimée avec la permissionde Réf. 8.) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Dans un test final, knockdown AAV-médiée de hCycB a été analysée par qRT-PCR. Le knock - down de hCycB a été trouvée être comprise entre 70 et 90%, en moyenne sur tous les lobes des deux modèles de foie transduites (figure 5).
Figure 5. ARNi à médiation knockdown de hCycB dans les modèles de foie 3D AAV-transduction. Silencing de hCycB a été déterminée par qRT-PCR. Les valeurs moyennes et les écarts-types (SD) ont été calculées pour tous les échantillons de chaque modèle 3D du foie transduites (SLT1 et 2, respectivement) et normalisées par rapport à la valeur moyenne du témoin non transduites (Ctrl.). (Re-imprimée avec la permission de Ref. 8.) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Les foies 3D reconstitués décrits ici fournissent un modèle pour l'étude des vecteurs viraux dans un système humanisé. Repopulation de la MEC d'un foie de rat avec une lignée de cellules de carcinome hépatocellulaire humain vascularisé génère un système qui permet l'étude des grands produits biologiques. Ces résultats fournissent une preuve de concept que le modèle du foie reconstitué peut être efficacement transduites avec un vecteur viral.
Pour les expériences montrées ici, chaque lobe du foie a été transduite par le vecteur AAV. Cependant, dans certains essais préliminaires, les lobes individuels ne sont pas repeuplée avec des cellules. Il est donc important d'éviter que les débris cellulaires ou d'autres composants du système d'occlusion vasculaire. Pour tester si tous les lobes peuvent être perfusés, un colorant non toxique, tel que le rouge de phénol peut être envoyé à travers le modèle du foie.
Une autre question cruciale est de garder l'échafaud du foie stérile. Bien que le traitement avec de l'éthanol ou des antibiotiques est disadvantageous pour le système vasculaire, l'irradiation de la matrice extracellulaire avec un rayonnement γ-a conservé les récipients et on stérilise l'échantillon.
En outre, la taille des foies explantées varie, de sorte que le nombre de cellules utilisées pour la procédure d'recellularization et le temps de repopulation peut être ajustée pour obtenir des résultats reproductibles.
Les foies de rats utilisés dans la présente étude sont relativement grandes et exigent de grandes quantités de cellules et les réactifs d'essai (par exemple, les vecteurs AAV). En outre, la procédure de repopulation a fallu plus de deux semaines. Cela limite le nombre de répétitions qui peut être fait avec un effort raisonnable. Nous sommes en train d'établir le modèle de foies de souris qui ne sont que d'environ un cinquième du volume de foie de rat, ce qui permet l'utilisation de moins de cellules et moins de réactifs d'essai. Bien que proportionnelle à échelle réduite du nombre de cellules semble raisonnable, les montants exacts doivent être déterminés en furtses expériences.
Un autre inconvénient du modèle actuel est l'utilisation de la lignée cellulaire HepG2 hépatocellulaire. Des expériences sont en cours pour développer l'utilisation des hépatocytes différenciés à partir de cellules souches pluripotentes induites, qui fournira un modèle physiologiquement plus pertinent. De plus, le foie est constitué de plusieurs types de cellules , en plus des hépatocytes, par exemple, des cellules de Kupffer et sinosoids. Nous supposons que les différents types de cellules repeupleront leurs milieux naturels quand un ECM est recellularized avec plusieurs types de cellules.
Le modèle du foie 3D combine plusieurs avantages. Un inconvénient majeur de classiques dans des modèles in vivo est que la physiologie animale diffère sensiblement de la physiologie humaine. des effets secondaires toxiques du traitement d'un patient humain peuvent donc ne pas être détectés. Cet inconvénient peut être surmonté en reconstituant le modèle 3D du foie avec des cellules humaines qui reflète plus étroitement la biologie de hupatients de l'homme.
Le deuxième avantage du modèle de foie est sa contribution au bien-être animal. Bien que les composants d'origine animale sont nécessaires pour les expériences de reconstitution, l'approche suit encore les objectifs du principe des 3R (remplacement, réduction, raffinement), car les animaux excédentaires peuvent être utilisés qui ont été sacrifiés pour d' autres expériences sur les animaux, à savoir, pas d' animaux supplémentaires sont nécessaires et l'approche évite complètement la souffrance des animaux qui est fréquemment associés à des expériences in vivo. Spheroids sont un autre outil pour étudier les processus cellulaires dans un système 3D. Cependant, les sphéroïdes sont pas vascularisées alors que les grandes substances et agents biologiques ne pénètrent pas profondément dans les parties internes de la structure. Ces problèmes ont été surmontés avec le modèle 3D du foie vascularisée.
Dans les expériences décrites ici, des vecteurs AAV ont été étudiés, étant donné qu'ils font partie des candidats les plus prometteurs pour la thérapie géniqueapplications. Que de nombreuses approches thérapeutiques géniques ont pour but de cibler le foie, par exemple, pour le traitement des infections provoquées par les virus de l' hépatite ou d' une déficience en alpha-1-antitrypsine, le foie 3D peut être utilisée dans le processus de développement de celles - ci d' un vecteur AAV. Il est, bien entendu, également approprié pour l'étude d'autres vecteurs viraux, par exemple hépatotropes, des vecteurs adénoviraux. En outre, il peut être utilisé pour étudier les virus des hépatites infectieuses telles que l'hépatite B ou C. Il peut, par exemple, être utilisée pour concevoir de nouvelles stratégies antivirales. De plus, les modèles d'organes 3D représentent des outils prometteurs pour développer de nouveaux produits thérapeutiques cytostatiques pour traiter le cancer et de mener des études toxicologiques. Sur le long terme, les foies artificiels peuvent être utilisés dans la médecine régénérative comme les transplantations. Pris ensemble, le modèle du foie 3D offre une large gamme d'applications dans l'infection de la biologie et d'autres domaines de la recherche biomédicale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Fraunhofer | / | |
| Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
| Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
| O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
| Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
| Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
| Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
| Screw Cap | Duran | 2924013 | |
| Screw Cap | Duran | 2924008 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
| Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
| Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
| Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
| Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
| T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicillin/streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15 x 15 x 5 mm | Sakura | 4566 | |
| Biopsy punch 4 mm | pfm medical | 48401 | |
| Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |
References
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