Abstract
Этот протокол описывает генерацию трехмерной (3D) модель ех естественных условиях печени и его применение к изучению и развитию вирусных векторных систем. Модель получается заселив внеклеточного матрикса в decellularized печени крыс с линией гепатоцитов клеток человека. Модель позволяет исследования в васкуляризированной системе 3D клеток, заменяя потенциально опасные эксперименты с живыми животными. Еще одним преимуществом является гуманизированным характер модели, которая ближе к физиологии человека, чем на животных моделях.
В данном исследовании мы демонстрируем трансдукции этой модели печени с вирусным вектором, полученной из аденосателлитные вирусов (AAV вектор). Схема перфузия, которая поставляет 3D модель печени со средствами массовой информации обеспечивает легкое средство для применения вектора. Система позволяет осуществлять мониторинг основных параметров метаболизма печени. Для окончательного анализа, образцы тканей могут быть приняты, чтобы определить степень recellularizaции с помощью гистологических методов. Распределение вектора вируса и экспрессию доставленного трансгена могут быть проанализированы с помощью количественной ПЦР (КПЦР), Вестерн-блоттинга и иммуногистохимии. Многочисленные применения векторной модели в области фундаментальных исследований, так и в развитии генной терапевтических применений могут быть предусмотрены, в том числе разработки новых противовирусных терапевтических средств, исследования рака и изучения вирусных векторов и их возможных побочных эффектов.
Protocol
Примечание: RL получено этическое разрешение на УВК органов от Landesamt für Gesundheit унд Soziales (LaGeSo). Печени эксплантировали от крыс Wister. Нижней полой вены и воротной вены печени были канюлю с канюлей 22 G. Методы decellularization эксплантированной печени были описаны ранее. 4,5 внеклеточном матрицы , используемые здесь , были получены при чрезмерной перфузии печени крыс с 1% дезоксихолате натрия.
1. Recellularization внеклеточного матрикса (ECM) крысы Печень
- Расширение печени клеточной линии HepG2
- Культура гепатоцеллюлярной карциномой линия клеток HepG2 в Институте Roswell Park Memorial (RPMI) 1640, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 2 мМ пенициллина и стрептомицина, каждый.
- Семенной 1,5 х 10 7 клеток в Т175 бутылки и растут клетки при 37 ° С и 5% CO 2 2.
- Спин вниз клетки при 300 мкг и ресуспендирования их в 4 мл PBS и подсчета клеток с камерой Нойбауэра под микроскопом. Одна бутылка T175 получается примерно 4,5 х 10 7 клеток.
Примечание: Убедитесь , что культура содержит достаточное количество клеток для recellularization ЕСМ печени крыс с 6 × 10 8 HepG2 клеток на ECM (10 х 175 см 2 колбы для культивирования с 4-5 × 10 8 клеток каждая).
Рисунок 1. Система биореактора. A) Эта система была биореактор на заказ. Он поддерживает модели органа при температуре 37 ° С и 5% CO 2. Скорости потока перистальтических насосов может регулироваться индивидуально. Б) Печень помещают в ростовую камеру и подключитье изд к схеме перфузионного, которая состоит из перистальтического насоса, средний резервуар, пузырьковой ловушки и датчик давления. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Recellularization ЕСМ
- Настройте систему биореактора, содержащую перфузионного камеру печени, систему перфузии, резервуар среды и пузырь ловушку. Стерилизацию систему биореактора (121 ° C, 15 мин).
- Подключите систему биореактора с использованием перистальтического насоса и поместить его в инкубатор обеспечения соответствующих условий (37 ° C, 5% CO 2). Поместите decellularized крысу каркасах печени 8 в перфузионной печени камеры системы биореактора (рисунок 1).
- Соедините каннюлирован воротной вены и полую вену с помощью трубки клипов в перфузионной системы. Равновесие леску с 150 мл среды RPMI (как описано в разделе 1.1)в течение 5 дней со скоростью потока 1,25 мл / мин.
- Отсоедините леску печени от схемы медиа и инокуляции леску с 3 × 10 8 клеток HepG2 (в 5 мл) через воротную вену с помощью 5 мл шприца, во избежание образования пузырьков воздуха и позволяют клеткам заселить ECM инкубировании их в течение 1 час в эшафот с при выключенном насосе.
- Постепенно увеличивают скорость потока путем регулировки насоса, начиная с 1,25 мл / мин в течение 10 мин; 2,5 мл / мин в течение 20 мин и, наконец, 3,75 мл / мин в течение 30 мин.
- Повторите шаги 1.2.4-1.2.5 для достижения общего количества клеток 6 × 10 8.
- Запуск системы биореактора со скоростью потока 3,75 мл / мин. Культура recellularized печени крыс в течение 2 недель.
Примечание: Заменить одну треть среды со свежей средой (50 мл) через день. Образец культуральной среды для измерения физиологических параметров, таких как активность лактатдегидрогеназы, рН среды образцов и концентрации глюкозы и лактата.
2. трансдукции Recellularized печени крысы
- Крупномасштабная Производство AAV векторов
- Продукты, которые очищают, и количественно векторы AAV , как описано выше: 11
- Если коротко, то производят векторы AAV в бутылей и очищают их от иодиксанол градиентного центрифугирования. Удалите остатки иодиксанол фильтрацией через PD10 гелевые фильтрационные колонки. Определить концентрацию ААВ вектора кПЦР с использованием геномной ДНК AAV в качестве стандарта.
Примечание: самокомплементарными, pseudotyped AAV2 / 6 вектор , используемый в настоящем исследовании , закодированные EmGFP в качестве репортера , чтобы продемонстрировать эффективность трансдукции и кассету экспрессии shRNA для нокдауна эндогенно выраженного гена (человеческого циклофилин B (hCycB), рис 2) , Обеспечить достаточное количество pseudotyped scAAV векторов серотипа 6 (2,7 × 10 13 AAV векторов в модели печени).
- Если коротко, то производят векторы AAV в бутылей и очищают их от иодиксанол градиентного центрифугирования. Удалите остатки иодиксанол фильтрацией через PD10 гелевые фильтрационные колонки. Определить концентрацию ААВ вектора кПЦР с использованием геномной ДНК AAV в качестве стандарта.
- Продукты, которые очищают, и количественно векторы AAV , как описано выше: 11
Рисунок 2. Карта самодополнительных, pseudotyped AAV2 / 6 вектор , используемый в настоящем исследовании. Геном состоит из инвертированных концевых повторов (ITR) из AAV2 и кодирует EmGFP под контролем промотора CMV , а также в качестве shRNA под контролем из U6 промотора. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Трансдукция печени Модель
- Отрегулировать ААВ вектор раствора до конечной концентрации 2,7 х 10 13 векторных геномов в 5 мл путем добавления соответствующего объема PBS.
- Отсоедините печень от цепи медиа путем удаления трубки из канюли. Подключение 5 мл шприц с канюлей воротной вены и вводят полный ААВ вектор раствор (5 мл).
Примечание: OptionallY, добавляют фенол красный (5 мкг / мл), чтобы следовать за распределение ААВ вектора решения по всей печени. - Инкубировать в течение 1 часа без прокачки. Постепенно увеличивают скорость потока, начиная с 1,25 мл / мин в течение 10 мин; 2,5 мл / мин в течение 20 мин и 3,75 мл / мин в течение 30 мин. Культура recellularized печени крыс в течение 6 дней.
Примечание: Заменить одну треть среды, как указано в примечании под 1.2.7
3. Оценка печени Recellularized трансдуцированных Rat
- Гематоксилином и эозином окрашивания (HE) и анализ Иммуногистохимическое
- Возьмите образцы (0,5 х 0,5 х 1,5-2 см) от каждой доли печени с помощью скальпеля.
- Инкубируйте образцы (от 3.1.1) в 4% параформальдегида (PFA) + 4% раствора сахарозы в течение 1,5 ч при температуре 4 ° С. (Внимание: PFA является токсичным и канцерогенным Всегда держите PFA в вытяжном шкафу и носить соответствующую защитную одежду.) . Wash три раза PBS (1 мин на стадии промывки) и инкубировать в 8%в течение ночи сахарозы при температуре 4 ° С.
- Налейте фиксируя среду в пластиковые cryomolds, поместите образцы в фиксируя среде без пузырьков воздуха. Добавить фиксирующую среду до тех пор, пока образец хорошо освещена. Хранить встроенные образцы при температуре -80 ° С до дальнейшего использования.
- Подготовка крио-секций (10 мкм) с замораживающий микротом 12. Оценка recellularization гематоксилином + эозином 8. Оценка эффективности трансдукции путем иммуногистохимического окрашивания для гена представляющей интерес (здесь: EmGFP).
- Молекулярно-биологические выборки
- Образец каждой доли печени с трепанобиопсия (4 мм в диаметре). Изолировать тотальной РНК, ДНК и белки в соответствии с инструкциями изготовителя для оценки трансгенной экспрессии EmGFP и hCycB сбить 8.
Representative Results
Для оценки степени recellularization, криопроводники срезы готовили из каждой доли каждой recellularized модели печени. Затем срезы анализировали с помощью гематоксилином и эозином. Как видно на рисунке 3, каждая лопасть из трех моделей с печенью, обозначается как TLM1, TLM2 (трансдуцированная модели печени 1 + 2) и Ctrl (модель печени управления , которая была recellularized, но не трансдуцированных), были заселены с клетками HepG2. Эта печеночно-клеточная карцинома линия была создана из опухолевой ткани 15-летнего аргентинского мальчика. Некоторые области модели печени были более интенсивно recellularized, чем другие. Причины этих вариаций, еще предстоит определить.
Рисунок 3. гематоксилином и эозином пятно каждой доли трех анализировались модели печени TLM1 + 2:. Трансдуцированная печениМодели 1 и 2; Ctrl .: модель управления печени, которая была recellularized, но не трансдуцированная. Шкала бар: 200 мкм. (Перепечатана с разрешения из работы. 8.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
На следующем этапе, оценивали трансдукции моделей печени. С этой целью ДНК получали из 28 пробивных биопсий каждой из моделей печени и вектор титр определяли количественно кПЦР. В среднем, 55 и 90 интернализированные векторных геномов на клетку (VG / клетки) были измерены для двух преобразованных моделей печени. Эксперименты в клеточной культуре 2D показали 30 VG / клетка достаточно для сильной экспрессии трансгенов и RNAi опосредованного глушителей. Производство EmGFP анализировали с помощью ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга. На самом деле, выражение репортер был обнаружен у 80-90% биопсий на уровни мРНК и белка, соответственно.8 Для того, чтобы получить полное представление об эффективности трансдукции, крио-срезы immunohistologically проанализированы. Как видно на фиг.4, области модели печени , которые были успешно recellularized, как и визуализировали с помощью DAPI окрашивания, также дали сильные флуоресцентные сигналы в иммуногистохимического анализа экспрессии EmGFP. Как и ожидалось, модель печени контроль, не обработанный AAV векторов, не показывают никакого выражения EmGFP.
Рисунок 4. Иммуногистохимическое анализ экспрессии EmGFP Клетки , которые заселяются модели печени визуализировали с помощью окрашивания DAPI (синий цвет). Выражение EmGFP визуализировали с помощью иммунохимического окрашивания (красный). TLM1 + 2: трансдуцированных модели печени 1 и 2; Ctrl .: модель управления печени, которая была recellularized, но не трансдуцированная. Шкала бар: 200 мкм. (Перепечатана с разрешенияиз работы. 8.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
В качестве последнего теста, ААВ-опосредованной нокдаун hCycB анализировали с помощью QRT-PCR. Было обнаружено , что нокдаун hCycB составляет от 70 до 90%, в среднем по всем мочки двух преобразованных моделей печени (рисунок 5).
Рисунок 5. RNAi-обусловленный нокдаун hCycB в моделях AAV-трансдуцированных 3D печени. Сайленсинг hCycB определяли с помощью QRT-PCR. Средние значения и стандартные отклонения (SD) были рассчитаны для всех образцов каждой модели трансдуцированную 3D печени (TLM1 и 2, соответственно) и нормированы к среднему значению, не трансдуцированных контроля (Ctrl.). (Перепечатана с разрешения Rэф. 8.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Восстановленные 3D Печень, описанные здесь, представляют собой модель для изучения вирусных векторов в гуманизированного системе. Репопуляции ЕСМ печени крыс с человеческим печеночно-клеточной линии карциномы формирует васкуляризированных систему, которая позволяет исследовать большие биопрепаратов. Эти результаты обеспечивают доказательство правильности концепции, что воссозданная модель печени может быть эффективно трансдуцированную вирусным вектором.
Для экспериментов, показанных здесь, каждый лепесток печени трансдуцированных вектором AAV. Тем не менее, в некоторых предварительных экспериментах, одиночные мочки были не заселена с клетками. Поэтому очень важно, чтобы предотвратить остатки клеток или других компонентов от закупоривания сосудистой системы. Чтобы проверить, может ли быть перфузию все лепестка, нетоксичный краситель, такой как фенол красный цвет может быть промыта через модель печени.
Другим важным вопросом является сохранение эшафот печени стерильными. В то время как лечение с этанолом или антибиотиками disadvantageous для сосудистой системы, при облучении внеклеточного матрикса с гамма-излучением сохранились сосуды и стерилизовать образца.
Кроме того, размер эксплантированной печенки будет отличаться, так что число клеток, используемых для процедуры recellularization и время репопуляция, возможно, придется быть отрегулирована, чтобы получить воспроизводимые результаты.
Печень крысы , используемые в настоящем исследовании , являются сравнительно большими и требуют большого количества клеток и контрольных реагентов (например, AAV векторы). Кроме того, процедура репопуляция потребовалось более двух недель. Это ограничивает число повторов, которые могут быть сделаны с разумными усилиями. Мы в настоящее время создание модели для печени мышей, которые являются лишь около одной пятой части объема печени крыс, что позволяет использовать меньшее количество клеток и меньше тестовых реагентов. Несмотря на то, пропорциональный масштаб вниз числа клеток представляется разумным, точные суммы должны быть определены в Furtее эксперименты.
Другим недостатком данной модели является использование гепатоцеллюлярной линии HepG2 клеток. Эксперименты продолжаются развивать использование гепатоцитов дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которые будут обеспечивать физиологически более соответствующую модель. Кроме того, печень состоит из нескольких типов клеток в дополнение к гепатоцитов, например, клетки Купфера и sinosoids. Мы предполагаем, что различные типы клеток будут заселить их естественной среде, когда ЕСМ recellularized с несколькими типами клеток.
Модель сочетает в себе 3D печени несколько преимуществ. Основным недостатком обычных в естественных условиях модели является то , что физиология животных существенно отличается от физиологии человека. Поэтому Токсические побочные эффекты лечения у пациента-человека, могут остаться незамеченными. Этот недостаток может быть преодолен путем восстановления модели печени 3D с человеческими клетками, которые более точно отражают биологию Huчеловек больных.
Второе преимущество модели печени является его вклад в благополучие животных. Хотя компоненты животного происхождения необходимы для экспериментов , восстановление влагосодержания, подход все еще следует цели принципа 3Р (замена, восстановления, рафинирования), а избыток животных можно использовать , которые были умерщвлены для других экспериментов на животных, то есть никаких дополнительных животные не нужны и подход полностью исключает страдания животных , которые часто ассоциируется с экспериментами в естественных условиях. Spheroids являются альтернативным инструментом для изучения клеточных процессов в системе 3D. Тем не менее, сфероиды не васкуляризации, так что большие вещества и биопрепараты не проникают глубоко во внутренние части конструкции. Эти проблемы были преодолены с сосудами 3D модели печени.
В экспериментах, описанных здесь, векторы AAV были исследованы, так как они являются одними из наиболее перспективных кандидатов для генной терапевтическихПриложения. Поскольку многочисленные генные терапевтические подходы направлены на нацеливание на печень, например, для лечения инфекций, вызванных вирусами гепатита или недостаточности альфа-1-антитрипсина, 3D печени может быть использован в процессе этих ААВ вектора развития. Это, конечно, подходит также для изучения других гепатотропными вирусных векторов, например, аденовирусные векторы. Кроме того, он может быть использован для изучения инфекционных вирусов гепатита, таких как гепатит В или вирусом C. Он может, например, быть использованы для разработки новых противовирусных стратегий. Кроме того, 3D-модели органа представляют перспективные инструменты для разработки новых цитостатических терапии для лечения рака и для проведения токсикологических исследований. На конечном счете, искусственные Печени могут быть использованы в регенеративной медицине в качестве трансплантатов. Взятые вместе, 3D модель печени предлагает широкий спектр применения в биологии инфекции и других областях биомедицинских исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Fraunhofer | / | |
| Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
| Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
| O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
| Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
| Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
| Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
| Screw Cap | Duran | 2924013 | |
| Screw Cap | Duran | 2924008 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
| Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
| Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
| Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
| Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
| T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicillin/streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15 x 15 x 5 mm | Sakura | 4566 | |
| Biopsy punch 4 mm | pfm medical | 48401 | |
| Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |
References
- Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes. Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).
- Butler, D., Callaway, E. Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal. Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).
- Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029 (2015).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).
- Wagner, A., et al. Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors. J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).
- Kay, M. A. State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).
- Yla-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard. Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).
- Takagi, H., et al. Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR. J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).
