Abstract
Dit protocol beschrijft de vorming van een driedimensionaal (3D) ex vivo model lever en de toepassing ervan op het onderzoek en de ontwikkeling van virale vectorsystemen. Het model wordt verkregen door herbevolking de extracellulaire matrix van een gedecellulariseerde rattenlever met humane hepatocyten cellijn. Het model maakt studies in een gevasculariseerde 3D celsysteem vervangen potentieel schadelijke experimenten met levende dieren. Een ander voordeel is het gehumaniseerde aard van het model, dat dichter bij de menselijke fysiologie dan diermodellen.
In deze studie demonstreren we de transductie van de lever model met een virale vector afkomstig van adeno-geassocieerde virussen (AAV vector). De perfusie circuit dat de 3D-lever-model levert met media biedt een eenvoudige manier om de vector toe te passen. Het systeem maakt controle van de belangrijkste metabolische parameters van de lever. Voor de uiteindelijke analyse, kunnen weefselmonsters worden genomen om de omvang van recellularizatie door histologische technieken. Verdeling van de virus vector en expressie van het transgen kan geleverd worden geanalyseerd door kwantitatieve PCR (qPCR), Western blotting en immunohistochemie. Talrijke toepassingen van de vector model in fundamenteel onderzoek en de ontwikkeling van gen-therapeutische toepassingen kunnen worden beoogd, inclusief de ontwikkeling van nieuwe antivirale therapieën, kankeronderzoek, en het onderzoek van virale vectoren en hun mogelijke bijwerkingen.
Protocol
LET OP: RL verkregen ethische goedkeuring voor de explantatie van organen van de Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Levers werden geëxplanteerd uit Wister ratten. De onderste vena cava en de poortader van de lever werden gecannuleerd met een 22 G canule. Werkwijzen voor het van cellen ontdoen van geëxplanteerde levers zijn eerder beschreven. 4,5 Het extracellulaire matrices die hier gebruikt werden verkregen door overmatige perfusie van een rattenlever met 1% natriumdeoxycholaat.
1. hercellularisatie van extracellulaire matrix (ECM) van een rattenlever
- Uitbreiding van de lever cellijn HepG2
- Cultuur hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2 in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 2 mM glutamine en 2 mM penicilline en streptomycine, elk.
- Zaad 1,5 x 10 7 cellen in T175 flessen en groeien de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 5% CO2.
- Spin down de cellen bij 300 xg en resuspendeer ze in 4 ml PBS en tel de cellen met een Neubauer kamer onder een microscoop. Eén T175 fles zal ongeveer 4,5 x 10 7 cellen opleveren.
LET OP: Zorg ervoor dat de cultuur bevat voldoende mobiele nummers voor hercellularisatie van de rat lever ECM met 6 x 10 8 HepG2 cellen per ECM (10 x 175 cm 2 cultuur kolven met 4-5 x 10 8 cellen elk).
Figuur 1. Bioreactor-systeem. A) Deze bioreactor systeem werd op maat gemaakt. Het handhaaft de orgaanmodellen bij 37 ° C en 5% CO2. De stroomsnelheden van de peristaltische pompen individueel regelbaar. B) De lever wordt in een groeikamer en sluitened aan de perfusie circuit, die bestaat uit een peristaltische pomp, een medium reservoir, een zeepbel val en een druksensor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Hercellularisatie van de ECM
- Stel de bioreactor systeem, dat een lever perfusie kamer, een perfusie-systeem, een reservoir van medium en een zeepbel te houden. Steriliseer het bioreactorsysteem (121 ° C, 15 min).
- Sluit het bioreactorsysteem met een peristaltische pomp en plaats deze in een incubator passende omstandigheden (37 ° C, 5% CO2). Plaats ontceld rattenlever scaffolds 8 in de leverperfusie kamer van het bioreactorsysteem (figuur 1).
- Sluit de ader canule portal en vena cava met behulp van slangklemmen aan de perfusie-systeem. Equilibreren steiger met 150 ml RPMI medium (zoals beschreven in 1.1)dan 5 d met een stroomsnelheid van 1,25 ml / min.
- Koppel de lever steiger van de media circuit en het enten van het schavot met 3 x 10 8 HepG2-cellen (in 5 ml) via de poortader met behulp van een 5 ml spuit, vermijd luchtbel vorming en laat de cellen naar de ECM herbevolken door ze te incuberen 1 uur in de steiger met de pomp uitgeschakeld.
- Verhoog geleidelijk de stroomsnelheid door instelling van de pomp, beginnend met 1,25 ml / min gedurende 10 min; 2,5 ml / min gedurende 20 min en tenslotte 3,75 ml / min gedurende 30 min.
- Herhaal de stappen 1.2.4-1.2.5 tot een totaal aantal cellen van 6 x 10 8 te bereiken.
- Voer het bioreactorsysteem met een stroomsnelheid van 3,75 ml / min. Cultuur de recellularized rat lever voor 2 weken.
OPMERKING: Vervang een derde van het medium door vers medium (50 ml) om de dag. Proef het kweekmedium fysiologische parameters, zoals lactaat dehydrogenase activiteit, de pH van mediummonsters en de concentratie van glucose en lactaat meten.
2. Transductie van de Recellularized Rat Liver
- Grootschalige productie van AAV vectoren
- Produceren, zuiveren en kwantificeren van AAV-vectoren zoals eerder beschreven: 11
- In het kort, de productie van AAV-vectoren in rolflessen en te zuiveren hen door iodixanol gradiënt centrifugeren. Resten iodixanol door filtratie over PD10 gelfiltratiekolommen. Bepaal de AAV vector concentratie qPCR gebruikmaking van genomisch DNA AAV als standaard.
Opmerking: Het zelf-complementaire gepseudotypeerde AAV2 / 6 vector gebruikt in de onderhavige studie gecodeerd EmGFP als reporter transductie efficiëntie en een shRNA expressiecassette voor knockdown van een endogeen tot expressie gebracht gen (humaan cyclofiline B (hCycB), figuur 2) tonen . Zorg voor een voldoende hoeveelheid pseudo scAAV vectoren serotype 6 (2,7 x 10 13 AAV-vectoren per lever model).
- In het kort, de productie van AAV-vectoren in rolflessen en te zuiveren hen door iodixanol gradiënt centrifugeren. Resten iodixanol door filtratie over PD10 gelfiltratiekolommen. Bepaal de AAV vector concentratie qPCR gebruikmaking van genomisch DNA AAV als standaard.
- Produceren, zuiveren en kwantificeren van AAV-vectoren zoals eerder beschreven: 11
Figuur 2. Kaart van het zelf-complementaire gepseudotypeerde AAV2 / 6 vector gebruikt in de onderhavige studie. Het genoom bestaat uit de omgekeerde eindstandige herhalingen (ITR) van AAV2 en codeert EmGFP onder controle van de CMV promoter en een onder controle shRNA van een U6 promotor. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Transductie van de lever Model
- Stel de AAV vector oplossing tot een eindconcentratie van 2,7 x 10 13 vector genoom in 5 ml door toevoeging van het desbetreffende volume PBS.
- Koppel de lever van de media circuit door het verwijderen van de slang van de canule. Sluit een 5 ml spuit met de canule van de vena portae en injecteer totale AAV vector-oplossing (5 ml).
LET OP: Optionally, voeg fenolrood (5 ug / ml) verspreiding van de AAV vector oplossing gehele lever volgen. - Incubeer gedurende 1 uur zonder pompen. Verhoog geleidelijk stroomsnelheid, beginnend met 1,25 ml / min gedurende 10 min; 2,5 ml / min gedurende 20 min en 3,75 ml / min gedurende 30 min. Cultuur de recellularized rat lever meer dan 6 dagen.
OPMERKING: Vervang een derde van het medium, zoals aangegeven in OPMERKING onder 1.2.7
3. Beoordeling van de Recellularized getransduceerde Rat Liver
- Hematoxyline en eosine (HE) kleuring en immunohistochemische analyse
- Monsters te nemen (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) van elkaar leverkwab met behulp van een scalpel.
- Incubeer monsters (van 3.1.1) in 4% paraformaldehyde (PFA) + 4% sucrose oplossing 1,5 uur bij 4 ° C. (Let op: PFA is giftig en kankerverwekkend Altijd PFA binnen een zuurkast en draag geschikte beschermende kleding..) Was drie keer met PBS (1 min per wasbeurt stap) en incubeer bij 8%sucrose overnacht bij 4 ° C.
- Giet de vaststelling medium in plastic cryomolds, plaatst de monsters in de vaststelling medium vrij van luchtbellen. Voeg vaststelling medium tot monster goed bedekt is. WINKEL ingebedde monsters bij -80 ° C tot verder gebruik.
- Bereid cryo-secties (10 pm) met een cryotoom 12. Assess hercellularisatie door hematoxyline + eosinekleuring 8. Assess transductie efficiency door immunohistochemische kleuring voor het gen-van-belang (hier: EmGFP).
- Moleculair biologische monsters
- Elk monster leverkwab een biopsie pons (4 mm diameter). Isoleer totaal RNA, DNA en eiwitten volgens de instructies van de fabrikant voor de beoordeling van transgene expressie van EmGFP en hCycB knock down 8.
Representative Results
Voor de beoordeling van de omvang van hercellularisatie werden cryo-secties bereid van elke lob van elk recellularized lever model. De coupes werden daarna geanalyseerd met hematoxyline en eosine kleuring. Zoals te zien in figuur 3, elke lob van de drie levermodellen, aangeduid als TLM1, TLM2 (getransduceerde levermodellen 1 2) en Ctrl (control lever model dat recellularized, maar niet getransduceerd) werden herbevolkt met HepG2 cellen. Dit hepatocellulaire carcinoma cellijn werd vastgesteld op basis van het tumorweefsel van een 15-jarige Argentijnse jongen. Sommige delen van de lever modellen intensiever recellularized dan anderen. De redenen voor deze variaties nog worden vastgesteld.
Figuur 3. hematoxyline en eosine kleuring van elk kwab van de drie geanalyseerde levermodellen TLM1 + 2:. Getransduceerd levermodel 1 en 2; Ctrl .: controle lever model dat werd recellularized maar niet getransduceerd. Schaal bar: 200 pm. (Re-bedrukt met toestemming van Ref. 8) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In de volgende stap wordt de transductie van de lever model werd beoordeeld. Hiervoor werd DNA bereid uit 28 punch biopsieën van elk van de lever modellen en de vector titer werd gekwantificeerd door qPCR. Gemiddeld 55 en 90 geïnternaliseerd vector genomen per cel (VG / cel) werden gemeten voor de twee getransduceerde lever modellen. Experimenten in 2D celkweek hebben aangetoond 30 VG / cel zijn voldoende voor een sterke transgenexpressie en RNAi-gemedieerde silencing. Productie van EmGFP werd geanalyseerd door RT-PCR en Western blotting. In feite, expressie van het werd gedetecteerd in 80-90% van de biopsieën op mRNA en eiwitniveaus respectievelijk.8 Om een volledig beeld van de transductie efficiëntie te verkrijgen, werden cryo-secties immunohistologisch geanalyseerd. Zoals te zien is in figuur 4, de gebieden van de lever model die met succes werden recellularized, zoals gevisualiseerd door DAPI kleuring, gaf sterke fluorescentiesignalen in de immunohistochemische analyse van EmGFP expressie. Zoals verwacht control lever model, niet behandeld met AAV vectoren geen EmGFP expressie vertonen.
Figuur 4. Immunohistochemische analyse van expressie EmGFP Cellen die herbevolkt de levermodellen werden gevisualiseerd door DAPI kleuring (blauw).; EmGFP expressie werd gevisualiseerd door immunochemische kleuring (rood). TLM1 + 2: getransduceerde lever modellen 1 en 2; Ctrl .: controle lever model dat werd recellularized maar niet getransduceerd. Schaal bar: 200 pm. (Re-bedrukt met toestemmingvan Ref. 8.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In een laatste proef AAV-gemedieerde knockdown van hCycB werd geanalyseerd met qRT-PCR. De knockdown van hCycB bleek te liggen tussen 70 en 90%, gemiddeld over alle kwabben van beide getransduceerde levermodellen (Figuur 5).
Figuur 5.-RNAi-gemedieerde knockdown van hCycB in-AAV getransduceerde 3D-lever-modellen. Silencing van hCycB werd bepaald door qRT-PCR. Gemiddelde waarden en standaarddeviaties (SD) werden berekend voor alle monsters van elke getransduceerde 3D lever model (TLM1 en 2, respectievelijk) en genormaliseerd tot de gemiddelde waarde van de niet-getransduceerde control (Ctrl.). (Re-bedrukt met toestemming van Ref. 8.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De gereconstitueerde 3D levers hier omschreven een model om virale vectoren bestuderen in een gehumaniseerd systeem. Herbevolking van de ECM van een rattenlever met een menselijke hepatocellulaire carcinoma cellijn genereert een gevasculariseerde systeem dat de studie van grote biologische toelaat. Deze resultaten vormen een proof-of-concept dat het bereide lever model efficiënt kan worden getransduceerd met een virale vector.
Voor de hier getoonde experimenten, elk leverkwab werd getransduceerd door de AAV vector. In sommige voorlopige experimenten, één lobben niet herbevolkt met cellen. Het is daarom belangrijk om te voorkomen dat celresten of andere componenten van het afsluitorgaan vaatstelsel. Om te testen of alle lobben kan worden geperfundeerd, kan een niet-toxische kleurstof zoals fenol rood worden doorgespoeld lever model.
Een andere cruciale kwestie is het bijhouden van de lever steiger steriel. Terwijl de behandeling met ethanol of antibiotica is disadvantageous het vasculaire systeem, bestraling van de extracellulaire matrix met γ-straling houdt de vaten en gesteriliseerd het monster.
Bovendien zal de omvang van geëxplanteerde lever verschillen, zodat het aantal cellen voor de hercellularisatie procedure en de herbevolking tijd mogelijk moeten worden aangepast om reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
De rat levers gebruikt in deze studie zijn relatief groot en vereisen grote hoeveelheden cellen en testreagentia (bijvoorbeeld AAV vectoren). Bovendien, de herbevolking procedure duurde meer dan twee weken. Dit beperkt het aantal herhalingen die kan met redelijke inspanning. We zetten momenteel het model muizenlevers, die slechts ongeveer een vijfde van het volume van rat lever zijn, die het gebruik van minder cellen en minder testreagentia. Hoewel proportionele afbouw van het aantal cellen lijkt redelijk, moet de exacte bedragen die moeten worden bepaald in furtproefjes.
Een andere tekortkoming van dit model is het gebruik van de hepatocellulaire HepG2 cellijn. Experimenten zijn gaande om het gebruik van hepatocyten opzichte van geïnduceerde pluripotente stamcellen, die een fysiologisch relevanter voorbeeld kan dienen ontwikkelen. Bovendien is de lever uit meerdere celtypen naast de hepatocyten, bijvoorbeeld, Kupffer cellen en sinosoids. We nemen aan dat de verschillende celtypes hun natuurlijke omgevingen bevolken wanneer een ECM recellularized meerdere celtypen.
De 3D-lever model combineert een aantal voordelen. Een groot nadeel van de conventionele in vivo modellen is dat dierlijke fysiologie verschilt wezenlijk van de menselijke fysiologie. Toxische bijwerkingen van de behandeling van een menselijke patiënt kan dus onopgemerkt blijven. Deze tekortkoming kan worden overwonnen door het reconstitueren van het 3D-model met menselijke lever cellen die nauwer bij de biologie van human patiënten.
Het tweede voordeel van de lever model is haar bijdrage aan het welzijn van dieren. Hoewel dierlijke componenten vereist voor de reconstitutie experimenten, de benadering volgt nog steeds de doelstellingen van de 3R principe (vervanging, vermindering, verfijning) als overtollig dieren kunnen worden gebruikt die werden opgeofferd andere dierproeven, dwz dat geen extra dieren nodig en aanpak vermijdt volledig lijden van dieren die vaak gepaard gaat met in vivo experimenten. Sferoïden zijn een alternatief middel om cellulaire processen in 3D te bestuderen. Echter, sferoïden niet gevasculariseerd zodat grote en biologische stoffen niet diep in het binnenste van de structuur. Deze problemen zijn overwonnen met de gevasculariseerde lever 3D-model.
In de hier beschreven experimenten werden AAV vectoren onderzocht, omdat ze behoren tot de meest veelbelovende kandidaten voor gentherapietoepassingen. Talrijke gen therapeutische benaderingen gericht op de lever te richten, bijvoorbeeld voor de behandeling van infecties met hepatitis virussen of alfa-1-antitrypsine-deficiëntie, kan de 3D lever worden gebruikt bij de werkwijze volgens deze AAV vector ontwikkeling. Het is natuurlijk ook geschikt voor de studie van andere hepatotrope virale vectoren, zoals adenovirale vectoren. Bovendien kan het worden gebruikt om infectieuze hepatitis virussen zoals hepatitis B of C virus bestuderen. Het kan bijvoorbeeld worden toegepast om nieuwe antivirale strategieën te ontwikkelen. Bovendien, 3D-orgel modellen vertegenwoordigen veelbelovende instrumenten om nieuwe cytostaticum therapieën voor de behandeling van kanker en toxicologisch onderzoek uit te voeren te ontwikkelen. Op de lange termijn, kan kunstmatige levers worden gebruikt in de regeneratieve geneeskunde als transplantaties. Bij elkaar genomen, het 3D-lever model biedt een breed scala aan toepassingen in infectie biologie en andere gebieden van het biomedisch onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Fraunhofer | / | |
| Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
| Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
| O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
| Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
| Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
| Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
| Screw Cap | Duran | 2924013 | |
| Screw Cap | Duran | 2924008 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
| Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
| Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
| Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
| Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
| T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicillin/streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15 x 15 x 5 mm | Sakura | 4566 | |
| Biopsy punch 4 mm | pfm medical | 48401 | |
| Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |
References
- Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes. Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).
- Butler, D., Callaway, E. Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal. Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).
- Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029 (2015).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).
- Wagner, A., et al. Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors. J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).
- Kay, M. A. State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).
- Yla-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard. Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).
- Takagi, H., et al. Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR. J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).
