Introduction
Экологические загрязнения, в частности , те из наночастиц (NP) диапазоне (1 - 20 нм в диаметре), были связаны с ожирением и других нейродегенеративных заболеваний из - за способности пересечь барьер 1-3 гематоэнцефалический. Повышенные воздействие загрязнения может вызвать воспаление в центральной нервной системе , включающей в гипоталамусе 1. Один потенциальный механизм , в котором это происходит , может быть через наночастицами индуцированной активации микроглии (мозговые клетки иммунной системы ) 4. Предыдущие исследования используются в естественных условиях модели для изучения влияния NPs на здоровье мозга , которые отнимают много времени, дорого, и непосредственно не ответить на вопрос о том , как влияют на NPs микроглии. Микроглии играют многогранную роль в центральной нервной системе, в том числе поддержание микроокружение головного мозга и общения с окружающими нейроны посредством высвобождения секретируемых факторов и цитокинов. В зависимости от раздражителей, микроглии может быть активирован к пр M1о-воспалительное или M2 противовоспалительное состояние. Например, М1 активированный микроглии релиз провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухолей альфа (TNF-альфа), в то время как М2 активации и выделения микроглии противовоспалительными цитокинами, включая интерлейкин-4 (IL-4). Для того, чтобы подтвердить нашу суррогат в пробирке биосенсора для определения нейротоксичности загрязнителей воздуха, мы измеряли микроглии ответ на 20 нм наночастиц серебра (AgNPs). Цель данной статьи состоит в том, чтобы описать , как в пробирке микроглии клеточная линия может быть использована в качестве суррогатного маркера биосенсора для тестирования мышиного микроглии ответ на Соседства и как микроглии активации влияет на гипоталамические клетки. В долгосрочной перспективе предусматривается применение этой модели является проверенной, чтобы проверить влияние реальных загрязнителей на здоровье мозга и нейродегенеративных заболеваний. Мы предоставляем подробное описание в пробирке 96-луночного анализа формата для измерения активации микроглии и выживания клеток гипоталамуса следующие экспозиции микрофона roglial кондиционированной среды.
Активации микроглии определяли следующим AgNP экспозиции с помощью ФНО- твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Для определения влияния активированной микроглии на гипоталамических клеток, то AgNPs были удалены из микроглии супернатант (кондиционированной среды) с использованием фильтрующего устройства. Устройство фильтрации сохраняет цитокины в то время как за исключением AgNPs на основе размера. В кратком изложении, надосадочную жидкость из микроглии, обработанных с использованием или без AgNPs собирали, добавлены к фильтрам, и центрифугировали при 14000 х г в течение 15 мин. Мы тогда были в состоянии определить влияние микроглии секретируемых цитокинов на гипоталамо жизнеспособность клеток. Ячейка токсичности после воздействия кондиционированной среды (содержащей цитокины) определяли с помощью анализа на резазурин основе , как было описано выше 5,6. Метаболически активных клеток уменьшают резазурин и производят флуоресцентный сигнал , пропорциональный количеству жизнеспособных клеток 7.
нт "> Есть несколько преимуществ использования этого метода по сравнению с другими (например, сокультивирования, транс-луночных установок, или в экспериментах естественных условиях). Наша модель дает возможность напрямую активировать микроглии и определить , является ли секретируемые факторы являются токсичными для нейронов 8 . в настоящее время протокол использует увековечены BV2 микроглии стимулировали наночастиц диаметром 20 нм, и увековечил мышиных гипоталамических клеток (обозначенный mHypo-A1 / 2) 9 для определения последующего ответа. Хотя этот протокол был оптимизирован для этих конкретных условий, методы могут быть измененное для использования в других моделях микроглии-индуцированной гибели клеток, или с другими типами клеток, включая первичный микроглии и нейронов.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Техническое обслуживание микроглии Культура клеток
- Теплое среда для культивирования клеток (среда Игла в модификации Дульбекко; DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин / стрептомицин / Неомицин (PSN) до 37 ° С.
- Получение замороженного запаса bv2 клеток микроглии при прохождении 18 - 25 из хранения при -80 ° C. Быстро разморозить клетки в 37 ° С на водяной бане.
- Аккуратно перенести клетки на 75 см 2 вентилируемой колбу , содержащую 10 мл среды для культивирования клеток.
- Выдержите в колбу в 5% СО 2 при 37 ° С. Аспирируйте СМИ после 24 часов и заменить свежей средой. растут клетки примерно до 70 - 80% сплошности.
2. Подсчет и покрытие Клетки
- В водяной бане при 37 ° С, теплой DMEM и раствор 1x-трипсин-ЭДТА.
- Аспирируйте средств массовой информации из клеток и добавить 500 мкл трипсина. Инкубировать при 37 ° С в течение 2 - 5 мин.
- С помощью скребка удалить клетки из колбы и подвесить в 5 млиз DMEM. Проходят клетки через сетчатый фильтр 70 мкм в 50 мл пробирку три раза.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра и семян 8000 клеток / лунку в черный окруженный стеной четкую нижнюю пластину в конечном объеме 200 мкл среды DMEM, дополненной 10% FBS и 1% PSN. Инкубируйте пластины в 5% СО 2 при 37 ° С в течение 24 ч.
- Удалите старую DMEM и заменить 200 мкл подогретого DMEM, дополненной 1% PSN сыворотки голодать микроглии. Инкубируйте пластины в 5% СО 2 при 37 ° С в течение 24 ч.
3. Активирование микроглии
- В отдельные пробирки, разбавленные AgNPs (0,01, 0,05 или 0,1 мкг / мл) и транспортного средства / переключение в нейтральное положение (цитрат натрия, 0,04 мМ) в бессывороточной DMEM, дополненной 1% до ПСН конечных рабочих концентраций.
- Удалить 100 мкл среды из каждой лунки и заменить 100 мкл соответствующего соединения лечения.
- Инкубируйте пластины в 5% СО 2 при 37 ° С в течение 24 ч.
4. Fiфильтрация кондиционированной среды
- Собирают 200 мкл среды супернатанта из каждой лунки и перенесите в фильтр (молекулярная масса отсечки 10 кДа) с коллекторной трубки (от 1,5 до 2 мл мощности).
- Центрифуга при 14000 х г при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Откажитесь проточные (надосадочную с частицами) и поместите фильтр в обратном порядке в новую пробирку для сбора.
- Центрифуга при 1000 х г при комнатной температуре в течение 2 мин.
Примечание: В результате фильтруется носитель (содержащий секретируемые цитокины) концентрируют в шесть раз. - Доведите объем концентрата до 400 мкл свежей среды DMEM, дополненной 10% FBS и 1% PSN и хранить на льду.
Примечание: Для того, чтобы гарантировать , остаточные AgNPs удаляются из отфильтрованных сред, генерируют концентрацию AgNP на основе характеристики пик при примерно 390 - 420 нм 10. Вкратце, готовят аликвоты нефильтрованного AgNPs (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 и 0,2 мкг / мл, как описано в пункте 3.1) и фильтруютуправления транспортным средством (цитрат натрия, 0,04 мМ) в бессывороточной DMEM. Алиготе 50 мкл отфильтрованных образцов и стандартов в черную замурованы четкую нижнюю пластину. С помощью спектрофотометра измерьте оптическую плотность при 390 - 410 нм и сравнить показания к кривой концентрации AgNP. Если отфильтрованные образцы имеют одинаковое значение абсорбции в качестве образца управления транспортным средством, то можно предположить, остаточные AgNPs удаляются. - Используйте половину отфильтрованных сред для определения секреции TNF-α следующие инструкции из коммерчески доступного набора.
5. гипоталамуса Техническое обслуживание Культура клеток
- Теплый DMEM, среда для культивирования клеток, дополненной 10% FBS и 1% PSN до 37 ° С.
- Получение замороженного запаса гипоталамо (mHypo-A1 / 2) клетки при прохождении 18 - 25, хранящиеся при температуре 80 ° C. Быстро разморозить клетки в 37 ° С на водяной бане.
- Аккуратно перенести клетки на 75 см 2 вентилируемой колбу , содержащую 10 мл среды для культивирования клеток.
- Выдержите колбу в 5% CO 2
6. Определение гипоталамуса Cell Токсичность
- Теплый раствор DMEM, и 1x-трипсин-ЭДТА в водяной бане при 37 ° C.
- Аспирируйте средств массовой информации из гипоталамуса клеток и добавляют 500 мкл трипсина. Инкубировать при 37 ° С в течение 2 - 5 мин. Удалить клетки из колбы с помощью скребка, как описано выше, на стадии 2.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра и пластины гипоталамических клеток в количестве 5000 клеток / лунку в черный окруженный стеной четкую нижнюю пластину в конечном объеме 200 мкл среды DMEM , дополненной 10% FBS и 1% PSN и инкубировать в течение ночи в 5% СО 2 при 37 ° C ,
- Удалить 100 мкл старых носителей с помощью многоканального пипеттором и добавляют 100 мкл отфильтрованных сконцентрированных кондиционированной среды до конечной концентрации 1х.
- Инкубируйте пластины в 5% СО 2 при 37 ° С в течение 24 ч.
- Добавить 221; л реагента резазурин и инкубировать пластины в течение 20 мин в 5% СО 2 при 37 ° С.
- С помощью многомодового спектрофотометр, запись флуоресценции (560 нм EX / 590 нм EM) для измерения жизнеспособности клеток. Отчет результаты в виде относительных единицах флуоресценции (РФС).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Покажем, что функция микроглии в качестве суррогатного биосенсора для ответа мозга на наночастицах с использованием протокола выше. Наши результаты включают в себя измерение токсических эффектов активации микроглии на выходе гибели нейронов. Рисунок 1 демонстрирует последовательность действий протокола для активации микроглии и определить , является ли секретируемые цитокины уменьшают жизнеспособность нейронов гипоталамуса. Секреции TNF-α была значительно увеличена следующие AgNP экспозиции (рисунок 2). Когда гипоталамуса нейроны подвергаются кондиционированной среды от AgNP-активированной микроглии, жизнеспособность клеток значительно снижается (рисунок 3). Рисунок 4 описывает потенциальный механизм , в котором AgNPs активации микроглии и внести свой вклад в гипоталамо гибели клеток.
фигура1. Рабочий процесс. AgNP фильтрации Метод супернатанта из активированного микроглии добавляется к фильтрации устройств и центрифугируют для удаления AgNPs из средств массовой информации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. TNF-α секреция Повышена После AgNP экспозиции. Микроглии bv2 клетки обрабатывали управления транспортным средством или AgNPs в течение 2 часов. секреции TNF-α была значительно увеличена после воздействия AgNPs. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. ** р <0,001 по сравнению с контроля по оценке непарного т -TEST Стьюдента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. гипоталамуса Жизнеспособность клеток снижается После микроглии кондиционированной среды экспозиции. Гипоталамические клетки показывают повышенную гибель клеток после воздействия кондиционированной среды от микроглии , стимулированных AgNP. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. * Р <0,05 по сравнению с контролем по оценке непарного т -TEST Стьюдента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Потенциал тропу AgNP Индуцированные активации микроглии и влияние на гипоталамуса Нейротоксичность. После воздействия наночастиц серебра, микрогрLia активируются на М1 провоспалительного состояния, характеризующиеся повышенной секрецией и экспрессии провоспалительных цитокинов и производителей. Высвобождение провоспалительных цитокинов и производителей способствует окружающих гибель нейронов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
- Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
- Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
- Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49 (2014).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
- Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
- Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
- Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
- Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
- Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105 (2011).
- Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
- Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
- Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
- Perry, V. H., Holmes, C.
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
- Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
- Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S.
- Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
- Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
- Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
- PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
- Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
- Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).
