Introduction
Milieuverontreinigingen, bijzonder diegenen van de nanodeeltjes (NP) range (1-20 nm diameter), zijn gekoppeld aan obesitas en andere neurodegeneratieve ziekten als gevolg van het vermogen om de bloed-hersenbarrière passeren 1-3. Verhoogde blootstelling aan verontreiniging kan ontsteking veroorzaken in het centrale zenuwstelsel waaronder de hypothalamus 1. Een mogelijk mechanisme waarop dit gebeurt kunnen plaatsvinden door middel nanodeeltjes activatie van microglia (hersenen immuuncellen) 4. Voorafgaande studies die in vivo modellen om de effecten van NPs gezondheid hersenen die tijdrovend, kostbaar zijn bestuderen, en niet direct de vraag hoe NPs beïnvloeden microglia beantwoorden. Microglia spelen een veelzijdige rol in het centrale zenuwstelsel, zoals het onderhoud van de hersenen en micro communiceren met omgeving neuronen via de afgifte van uitgescheiden factoren en cytokinen. Afhankelijk van de stimuli, kan microglia worden geactiveerd om een M1 pro-inflammatoire of een M2 anti-inflammatoire toestand. Bijvoorbeeld M1 geactiveerde microglia vrijgeven pro-inflammatoire cytokines zoals tumor necrose factor alpha (TNF-α), terwijl M2 microglia afgifte anti-inflammatoire cytokinen geactiveerd zoals interleukine-4 (IL-4). Om onze surrogaat in vitro biosensor te valideren voor het bepalen van neurotoxiciteit van luchtverontreinigende stoffen, we gemeten microglia respons op 20 nm zilver nanodeeltjes (AgNPs). Het doel van dit artikel wordt beschreven hoe een in vitro microgliacellen cellijn kan worden gebruikt als een surrogaat marker voor biosensor testen muizen microgliale reactie op NPs en hoe microgliale activering beïnvloedt hypothalamus cellen. De lange termijn beoogde toepassing van deze gevalideerd model is om de effecten van real-world stoffen op de gezondheid van de hersenen en neurodegeneratieve ziekte te testen. Wij een gedetailleerde beschrijving van een in vitro 96 putjes format assay voor het meten van microgliale activering en hypothalamus celoverleving na blootstelling van mic roglial geconditioneerde media.
Microgliale activering werd bepaald na AgNP blootstelling door TNF-α enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Om het effect van geactiveerde microglia op hypothalamus cellen te bepalen werden de AgNPs uit microglia supernatant (geconditioneerde media) met een filtreerinrichting. De filtratie-apparaat behoudt cytokines met uitsluiting van de AgNPs op basis van grootte. In het kort supernatans van microglia behandeld met of zonder AgNPs werd verzameld, toegevoegd aan de filters en gecentrifugeerd bij 14.000 xg gedurende 15 min. We konden vervolgens de invloed van microgliale uitgescheiden cytokines op hypothalamus cellevensvatbaarheid te bepalen. Cel toxiciteit na blootstelling aan geconditioneerde media (bevattende cytokines) werd bepaald via een resazurin gebaseerde assay zoals eerder beschreven 5,6. Metabool actieve cellen reduceren resazurin en produceren een fluorescentiesignaal evenredig met het aantal levensvatbare cellen 7.
nt "> Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van deze techniek anderen (zoals co-cultuur, trans-well opstellingen of in vivo). Ons model biedt de mogelijkheid om direct activeren microglia en bepalen of uitgescheiden factoren toxisch voor neuronen 8 . het huidige protocol gebruikt geïmmortaliseerde BV2 microglia gestimuleerd met 20 nm diameter nanodeeltjes en geïmmortaliseerde muizen hypothalamus cellen (aangeduid mHypo-A1 / 2) 9 voor het bepalen van verdere reactie. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor deze specifieke omstandigheden, de werkwijzen kunnen worden veranderd te worden gebruikt in andere modellen van microgliale geïnduceerde celdood of andere celtypen waaronder primaire microglia en neuronen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microgliale Cell Culture Onderhoud
- Warme celkweekmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine / neomycine (PSN) tot 37 ° C.
- Verkrijgen bevroren voorraad van BV2 microglia cellen bij passage 18-25 uit de opslag bij -80 ° C. Snel ontdooien cellen in 37 ° C waterbad.
- Voorzichtig cellen overbrengen naar een 75 cm2 kolf ontlucht met 10 ml celkweekmedium.
- Incubeer kolf in 5% CO2 bij 37 ° C. Zuig media na 24 uur en te vervangen door vers medium. Grow cellen tot ongeveer 70 - 80% samenvloeiing.
2. Tellen en Plating Cellen
- In een 37 ° C waterbad, warm DMEM en 1x-trypsine-EDTA-oplossing.
- Aspireren media van cellen en voeg 500 ul van trypsine. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-5 min.
- Met behulp van een schraper, verwijdert cellen uit de kolf en op te schorten in 5 mlDMEM. Cellen passeren door een 70 urn zeef in een 50 ml buisje driemaal.
- Aantal cellen met een hemocytometer en zaden 8000 cellen / putje in een ommuurde zwarte heldere bodem plaat in een eindvolume van 200 ul DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en 1% PSN. Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Verwijderen oude DMEM en vervangen door 200 ui DMEM aangevuld verwarmd met 1% PSN serum verhongeren microglia. Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur.
3. Activeren Microglia
- In afzonderlijke buisjes verdund AgNPs (0,01, 0,05 of 0,1 ug / ml) en voertuig / neutraal sturingspunt (natriumcitraat, 0,04 mM) in serumvrij DMEM aangevuld met 1% PSN uiteindelijke werkende concentraties.
- Verwijder 100 ul van de media uit elk putje en te vervangen door 100 ul van een passende behandeling verbinding.
- Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur.
4. Filtering geconditioneerde media
- Verzamel 200 pl medium supernatant uit elk putje en over in een filter (molecuulgewicht cutoff van 10 kDa) met verzamelbuis (1,5-2 ml).
- Centrifugeer bij 14.000 xg bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Gooi het doorstroomkanaal (supernatant met deeltjes) en plaats de filter omgekeerd in een nieuwe verzamelbuis.
- Centrifugeer bij 1000 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
Opmerking: Het verkregen gefiltreerde medium (bevattende uitgescheiden cytokinen) wordt geconcentreerd door zesvoudige. - Breng het volume van het concentraat tot 400 ul vers DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% PSN en bewaar op ijs.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen resterende AgNPs zijn van een gefilterde media verwijderd, wordt een AgNP concentratie op basis van de karakteristieke piek bij ongeveer 390-420 nm 10. Kort samengevat, aliquots van ongefilterde AgNPs (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 en 0,2 ug / ml zoals beschreven in stap 3,1) en gefiltreerdmediumcontrole (natriumcitraat, 0,04 mM) in serumvrij DMEM. Aliquot 50 pi gefilterde monsters en standaarden in een zwart ommuurde duidelijk bodemplaat. Met behulp van een spectrofotometer, meet absorptie bij 390-410 nm en vergelijken lezingen aan de AgNP concentratie curve. Indien gefilterde monsters dezelfde absorptiewaarde als het voertuig controle monster, kan worden aangenomen resterende AgNPs verwijderd. - Gebruik de helft van de gefiltreerde media TNF-α secretie volgende instructies bepalen van een commercieel verkrijgbare kit.
5. hypothalamus Cell Culture Onderhoud
- Warme DMEM kweekmedium aangevuld met 10% FBS en 1% PSN tot 37 ° C.
- Verkrijgen bevroren voorraad van de hypothalamus (mHypo-A1 / 2) cellen bij passage 18-25 opgeslagen bij 80 ° C. Snel ontdooien cellen in 37 ° C waterbad.
- Voorzichtig cellen overbrengen naar een 75 cm2 kolf ontlucht met 10 ml celkweekmedium.
- Incubeer kolf in 5% CO 2
6. Het bepalen van de hypothalamus Cell Toxicity
- Warme DMEM en 1 x trypsine-EDTA-oplossing in een 37 ° C waterbad.
- Aspireren media van de hypothalamus cellen en voeg 500 ul van trypsine. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-5 min. Verwijderen cellen van kolf met een schraper zoals hierboven in stap 2.
- Aantal cellen met een hemocytometer en plaat hypothalamus cellen bij 5000 cellen / putje in een zwarte wanden heldere bodemplaat in een eindvolume van 200 ul DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en 1% PSN en overnacht incuberen in 5% CO2 bij 37 ° C .
- Verwijder 100 pl oude media met een multichannel pipet en voeg 100 gl gefiltreerd geconcentreerd geconditioneerd medium tot een uiteindelijke concentratie van 1x.
- Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Voeg 221, l Resazurin reagens en incubeer dienblad 20 min in 5% CO2 bij 37 ° C.
- Met behulp van een multimode spectrofotometer, opnemen fluorescentie (560 nm EX / 590 nm EM) levensvatbaarheid van de cellen te meten. Rapporteren resultaten als relatieve fluorescentie-eenheden (RFU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We laten zien dat microglia fungeren als surrogaat biosensor voor hersenen reactie op nanodeeltjes met het bovenstaande protocol. Onze resultaten zijn onder andere meting van de toxische effecten van microglia activatie op downstream neuronale celdood. Figuur 1 toont een workflow van het protocol bij microglia activeren en bepalen of uitgescheiden cytokines levensvatbaarheid van de hypothalamus neuronen te verminderen. TNF-α secretie was significant toegenomen na blootstelling AgNP (figuur 2). Wanneer hypothalamus neuronen worden blootgesteld aan geconditioneerde media van AgNP-geactiveerde microglia wordt cellevensvatbaarheid aanzienlijk verminderd (figuur 3). Figuur 4 beschrijft de mogelijke mechanisme waarin AgNPs activeren microglia en bijdragen tot hypothalamus celdood.
Figuur1. Workflow voor AgNP Filtration Method. Supernatant van geactiveerde microglia wordt toegevoegd aan filtratie-apparaten en gecentrifugeerd om AgNPs van media te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. TNF-α uitscheiding verhoogd na blootstelling AgNP. Microgliacellen BV2 cellen werden behandeld met vehiculum controle of AgNPs voor 2 uur. TNF-α secretie was significant verhoogd na blootstelling aan AgNPs. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SEM. ** p <0,001 versus controle zoals beoordeeld door Student's ongepaarde t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. hypothalamus levensvatbaarheid van de cellen verminderd na Microgliale Geconditioneerd Media Exposure. Hypothalamus cellen vertonen verhoogde celdood na blootstelling aan geconditioneerde media van microglia gestimuleerd met AgNP. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. * P <0,05 versus controle zoals beoordeeld door Student's ongepaarde t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Potentiële Pathway van AgNP Induced Microgliale Activering en Invloed op de hypothalamus Neurotoxiciteit. Na blootstelling aan zilveren nanodeeltjes, microglia worden geactiveerd om een M1 pro-inflammatoire toestand, gekenmerkt door verhoogde afscheiding en expressie van pro-inflammatoire cytokines en makers. De release van de pro-inflammatoire cytokines en makers draagt bij aan omringende neuronale celdood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
- Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
- Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
- Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49 (2014).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
- Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
- Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
- Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
- Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
- Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105 (2011).
- Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
- Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
- Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
- Perry, V. H., Holmes, C. Microglial priming in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
- Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
- Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways. Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).
- Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
- Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
- Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
- PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
- Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
- Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).
