Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.
Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-α) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.
पर्यावरण प्रदूषण, विशेष रूप से nanoparticle (एनपी) रेंज के उन (1 – 20 एनएम व्यास), मोटापा और रक्त मस्तिष्क बाधा 1-3 पार करने की क्षमता की वजह से अन्य neurodegenerative रोगों से जोड़ा गया है। प्रदूषण को ऊपर उठाया जोखिम हाइपोथेलेमस 1 सहित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सूजन उत्पन्न हो सकता है। एक संभावित तंत्र जिसमें यह तब होता है microglia की nanoparticle प्रेरित सक्रियण (मस्तिष्क प्रतिरक्षा कोशिकाओं) 4 के माध्यम से हो सकता है। पूर्व के अध्ययन है जो समय लेने वाली है, महंगे हैं मस्तिष्क स्वास्थ्य पर एनपीएस के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विवो मॉडल में इस्तेमाल किया है, और सीधे कैसे एनपीएस microglia को प्रभावित के सवाल का जवाब नहीं है। Microglia और मस्तिष्क microenvironment के रखरखाव सहित secreted कारकों और साइटोकिन्स की रिहाई के माध्यम से न्यूरॉन्स के आसपास के साथ संवाद स्थापित करने, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में एक बहुमुखी भूमिका निभाते हैं। उत्तेजनाओं पर निर्भर करता है, microglia एक एम 1 जनसंपर्क के लिए सक्रिय किया जा सकताओ भड़काऊ या एक M2 विरोधी भड़काऊ राज्य। उदाहरण के लिए, एम 1 सक्रिय microglia इस तरह के ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNF-α) के रूप में समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स जारी है, जबकि M2 सक्रिय इंटरल्यूकिन -4 (आईएल 4) सहित microglia रिहाई विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स। वायु प्रदूषण के न्यूरोटॉक्सिटी का निर्धारण करने के लिए इन विट्रो biosensor में हमारे सरोगेट मान्य करने के लिए, हम 20 एनएम चांदी नैनोकणों (AgNPs) के लिए microglial प्रतिक्रिया मापा। इस लेख के लक्ष्य को कैसे इन विट्रो microglial सेल लाइन एनपीएस में murine microglial प्रतिक्रिया का परीक्षण और कैसे microglial सक्रियण हाईपोथेलेमिक कोशिकाओं को प्रभावित करता के लिए एक किराए biosensor मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन है। लंबी अवधि का इरादा इस मान्य मॉडल के आवेदन मस्तिष्क स्वास्थ्य और neurodegenerative रोग पर वास्तविक दुनिया प्रदूषण के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए है। हम microglial सक्रियण और हाईपोथेलेमिक सेल अस्तित्व mic के प्रदर्शन के बाद मापने के लिए इन विट्रो 96 अच्छी तरह से परख प्रारूप का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं वातानुकूलित मीडिया roglial।
Microglial सक्रियण AgNP प्रदर्शन के बाद एक TNF-α एंजाइम परख immunosorbent (एलिसा) से जुड़े का उपयोग निर्धारित किया गया था। हाईपोथेलेमिक कोशिकाओं पर सक्रिय microglia के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, AgNPs microglial सतह पर तैरनेवाला (वातानुकूलित मीडिया) एक छानने का काम डिवाइस का उपयोग करने से हटा दिया गया। जबकि आकार के आधार पर AgNPs छोड़कर छानने का काम डिवाइस साइटोकिन्स बरकरार रखती है। संक्षेप में, के साथ या बिना AgNPs इलाज किया microglia से सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था, फिल्टर करने के लिए जोड़ा है, और 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर centrifuged। हम तो हाईपोथेलेमिक सेल व्यवहार्यता पर microglial स्रावित साइटोकिन्स के प्रभाव का निर्धारण करने में सक्षम थे। सेल विषाक्तता (साइटोकिन्स युक्त) वातानुकूलित मीडिया के लिए जोखिम के बाद एक resazurin आधारित परख के माध्यम से निर्धारित किया गया था के रूप में पहले 5,6 वर्णित है। पाचन सक्रिय कोशिकाओं resazurin को कम करने और एक फ्लोरोसेंट संकेत व्यवहार्य कोशिकाओं 7 की संख्या के अनुपात में उत्पादन।
NT "> दूसरों (जैसे सह-संस्कृति, या विवो प्रयोगों में ट्रांस-अच्छी तरह से सेटअप) पर इस तकनीक का उपयोग करने के कई फायदे हैं। हमारे मॉडल सीधे microglia को सक्रिय करने और निर्धारित करती है कि स्रावित कारकों न्यूरॉन्स 8 को विषाक्त कर रहे करने की क्षमता प्रदान करता है । वर्तमान प्रोटोकॉल अमर BV2 microglia 20 एनएम व्यास नैनोकणों के साथ प्रेरित करता है और अमर murine हाईपोथेलेमिक कोशिकाओं (नामित mHypo-A1 / 2) बाद में प्रतिक्रिया के निर्धारण के लिए 9। इस प्रोटोकॉल इन विशेष परिस्थितियों के लिए अनुकूलित किया गया है, हो सकता है तरीकों बदल microglial प्रेरित कोशिका मृत्यु के अन्य मॉडलों में इस्तेमाल किया, या प्राथमिक microglia और न्यूरॉन्स सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ हो।Recent studies support that environmental exposure contributes to obesity and other neurodegenerative diseases 11,12. However, techniques used in previous studies are time consuming and expensive. Economic considerations, physiologically relevant delivery systems, ethical issues with extensive use of in vivo animal models, and difficulty translating findings into meaningful health advisories are a few of the major challenges that have impeded advancements in studying NP-induced neurotoxicity 13</…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the US Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (to TAB), and grants from the University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (to CMD, JPN, and TAB) and the Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (to TAB). We thank Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) and Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) for providing the BV2 cell line.
Cells/Reagents | |||
Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Silver nanoparticles (20nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
Equipment | |||
96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
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Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |