Introduction
Poluições ambientais, especialmente aqueles da gama de nanopartículas (NP) (1 - 20 nm de diâmetro), têm sido associadas com a obesidade e outras doenças neurodegenerativas, devido à capacidade de atravessar a barreira hemato-encefálica 1-3. Exposição elevada a poluição pode induzir a inflamação do sistema nervoso central, incluindo o hipotálamo 1. Um potencial mecanismo no qual isto ocorre pode ser através da activação induzida por nanopartículas de microglia (células imunes do cérebro) 4. Estudos anteriores têm utilizado em modelos in vivo para estudar os efeitos de NPs sobre a saúde do cérebro, que são consumidoras de tempo, é caro, e não responde directamente à questão de como o NPS influenciar microglia. Microglia desempenhar um papel multifacetado no sistema nervoso central, incluindo a manutenção do microambiente do cérebro e comunicando com circundante neurónios através da libertação de factores secretados e citocinas. Dependendo dos estímulos, microglia pode ser activado a uma pr M1o-inflamatória ou um estado anti-inflamatório M2. Por exemplo, a microglia activada M1 libertar citocinas pró-inflamatórias, tais como o factor de necrose tumoral alfa (TNF-α), enquanto M2 activado libertação microglia citocinas anti-inflamatórias, incluindo a interleucina-4 (IL-4). Para validar o nosso substituto no biossensor vitro para determinar a neurotoxicidade dos poluentes do ar, medimos microglial 20 nanopartículas de prata nm (AGNPS). O objetivo deste artigo é descrever como um in vitro linha de células microgliais pode ser usado como um marcador biossensor substituto para testar a resposta microglial murino para o NPS e como microglial ativação afeta as células do hipotálamo. A longo prazo aplicação pretendida para este modelo validado é testar efeitos dos poluentes do mundo real para a saúde do cérebro e doenças neurodegenerativas. Fornecemos uma descrição detalhada de um ensaio in vitro em formato de 96 poços para a medição da activação da microglia e sobrevivência das células do hipotálamo após a exposição de MIC roglial meios condicionados.
activação da microglia foi determinada após a exposição AgNP usando uma enzima de TNF-α linked immunosorbent assay (ELISA). Para determinar o efeito da microglia activada em células do hipotálamo, os AGNPS foram removidas a partir do sobrenadante da microglia (meio condicionado), utilizando um dispositivo de filtração. O dispositivo de filtração mantém citocinas, excluindo os AGNPS com base no tamanho. Resumidamente, o sobrenadante da microglia tratados com ou sem AGNPS foi recolhido, adicionado aos filtros, e centrifugado a 14000 xg durante 15 min. Foram então capaz de determinar a influência de citocinas secretadas microgliais sobre a viabilidade das células do hipotálamo. Toxicidade celular após a exposição ao meio condicionado (contendo citocinas) foi determinada através de um ensaio baseado em resazurina 5,6 como anteriormente descrito. Metabolicamente activas células reduzir resazurina e produzir um sinal fluorescente proporcional ao número de células viáveis 7.
nt "> Existem várias vantagens de usar esta técnica em detrimento de outros (como co-cultura, configurações trans-bem, ou in vivo). O nosso modelo fornece a capacidade de ativar diretamente microglia e determinar se fatores secretados são tóxicos para os neurônios 8 . O protocolo atual usa imortalizado microglia BV2 estimulados com nanopartículas de 20 nm de diâmetro, e imortalizado células do hipotálamo murino (designado mHypo-A1 / 2) 9 para a determinação da resposta subseqüente. Embora este protocolo foi optimizado para essas condições específicas, os métodos podem ser alterada para ser usado em outros modelos de morte celular induzida por microglia, ou com outros tipos de células, incluindo neurónios e microglia primária.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Manutenção Cultura de Células microglia
- meio de cultura de célula quente (Dulbecco Modified Eagle Médium; DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina / neomicina (PSN) a 37 ° C.
- Obter massa congelada de células microgliais bv2 na passagem 18 - 25 a partir do armazenamento a -80 ° C. Rapidamente descongelar células em 37 ° C banho de água.
- Suavemente transferir as células para um frasco de 75 centímetros ventilado 2 contendo meio de cultura de células de 10 ml.
- Incubar balão em 5% de CO2 a 37 ° C. media aspirado após 24 horas e substituir por meios frescos. Crescer as células até cerca de 70 - 80% de confluência.
2. Contagem e Células chapeamento
- Em um banho de água a 37 ° C, e uma solução de DMEM morno-1x tripsina-EDTA.
- Aspirar meios de células e adicionar 500 ul de tripsina. Incubar a 37 ° C durante 2-5 min.
- Utilizando um raspador, remover as células do frasco e suspender em 5 mlde DMEM. Passar as células através de um filtro de 70 um para um tubo de 50 ml, três vezes.
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro e semear 8000 células / cavidade em uma placa de fundo preto walled clear em um volume final de 200 ul de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de PSN. Incubar a placa em 5% de CO2 a 37 ° C durante 24 h.
- Remover antigo DMEM e substituir com 200 mL de DMEM aquecido suplementado com 1% PSN ao soro fome microglia. Incubar a placa em 5% de CO2 a 37 ° C durante 24 h.
3. Ativação Microglia
- Em tubos separados, diluir AGNPS (0,01, 0,05 ou 0,1 ug / ml) e veículo / controlo neutro (citrato de sódio, 0,04 mM) em DMEM isento de soro suplementado com 1% de PSN para concentrações finais de trabalho.
- Retirar 100 ul de meio de cada poço e substituir com 100 ul de composto de tratamento apropriado.
- Incubar a placa em 5% de CO2 a 37 ° C durante 24 h.
4. Filtragem meios condicionados
- Recolhe 200 ul de sobrenadante de meio de cada poço e transferir para um filtro (corte de peso molecular de 10 kDa) com o tubo de recolha (1,5 a 2 ml de capacidade).
- Centrifugar a 14000 xg à temperatura ambiente durante 15 min.
- Descartar o fluxo de passagem (sobrenadante com partículas) e colocar o filtro de cabeça para baixo para um novo tubo de recolha.
- Centrifugar a 1000 xg à temperatura ambiente durante 2 min.
NOTA: A mídia filtrado resultante (contendo citocinas secretadas) é concentrada por seis vezes. - Levar o volume do concentrado para 400 ul com DMEM fresco suplementado com FBS a 10% e PSN a 1% e armazenar em gelo.
NOTA: Para garantir AGNPS residuais são removidos da mídia filtrados, gerar uma concentração AgNP com base no pico característico em cerca de 390-420 nm 10. Resumidamente, preparar alíquotas de AGNPS não filtradas (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, e 0,2 ug / ml tal como descrito no passo 3.1) e filtradacontrolo de veículo (citrato de sódio, 0,04 mM) em DMEM isento de soro. Alíquota de 50 ul de amostras e padrões filtrada para um preto murado placa de fundo claro. Usando um espectrofotômetro, medir a absorvância a 390-410 nm e comparar as leituras para a curva de concentração AgNP. Se as amostras filtradas têm o mesmo valor de absorvância como a amostra de controlo com veículo, pode-se supor AGNPS residuais são removidos. - Utilizar metade das meios filtrados para determinar seguintes instruções de secreção de TNF-α a partir de um kit disponível comercialmente.
5. hipotálamo Manutenção Cultura de Células
- meio de cultura celular DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de PSN para 37 ° C.
- Obter massa congelada de células no hipotálamo passagem 18 (mHypo-A1 / 2) - 25 armazenados a 80 ° C. Rapidamente descongelar células em 37 ° C banho de água.
- Suavemente transferir as células para um frasco de 75 centímetros ventilado 2 contendo meio de cultura de células de 10 ml.
- Incubar balão em 5% de CO 2
6. Determinar a toxicidade celular hipotálamo
- DMEM morno e solução 1x tripsina-EDTA em um banho de água a 37 ° C.
- Aspirar meios de células hipotalâmicas e adicionar 500 ul de tripsina. Incubar a 37 ° C durante 2-5 min. Remover as células de balão usando um raspador tal como descrito acima no passo 2.
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro e placa células hipotalâmicas a 5000 células / poço num preto walled placa de fundo claro, num volume final de 200 ul de DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de PSN e incubar durante a noite em 5% de CO2 a 37 ° C .
- Retirar 100 ul de meios de idade, utilizando um pipetador multicanal e adicionar 100 ul de meios condicionados concentrados filtrada, para uma concentração final de 1x.
- Incubar a placa em 5% de CO2 a 37 ° C durante 24 h.
- Adicionar 221; L de reagente de resazurina e Incubar a placa durante 20 minutos em 5% de CO2 a 37 ° C.
- Usando um espectrofotômetro multimodo, fluorescência registro (560 nm EX / 590 nm EM) para medir a viabilidade celular. Relatar os resultados como unidades de fluorescência relativas (RFU).
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Representative Results
Mostra-se que a função da microglia como um substituto para o biossensor resposta do cérebro com as nanopartículas utilizando o protocolo anterior. Os resultados incluem a medição dos efeitos tóxicos da activação microglial na morte celular neuronal jusante. A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho do protocolo para ativar a microglia e determinar se as citocinas secretadas reduzir a viabilidade dos neurônios do hipotálamo. Secreção de TNF-α foi significativamente aumentada após exposição AgNP (Figura 2). Quando neurónios hipotalâmicos são expostos a meios condicionados a partir de microglia AgNP-activado, a viabilidade das células é reduzida de forma significativa (Figura 3). Figura 4 descreve o mecanismo potencial em que AGNPS ativar a microglia e contribuem para a morte das células do hipotálamo.
Figura1. Fluxo de trabalho para AgNP Filtration Method. O sobrenadante de microglia activada é adicionada a dispositivos de filtração e centrifugado para remover AGNPS da mídia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. TNF-α secreção é aumentada após exposição AgNP. Bv2 células microgliais foram tratados com controlo de veículo ou AGNPS durante 2 h. secreção de TNF-α foi significativamente aumentada após exposição a AGNPS. Os dados são apresentados como média ± SEM. ** p <0,001 vs controle, avaliada pela não pareado teste t de Student. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. hipotálamo viabilidade celular diminuiu após a exposição de mídia microglia condicionado. Células Hipotalâmicas mostram aumento da morte celular após a exposição aos meios condicionados a partir microglia estimulados com AgNP. Os dados são apresentados como média ± SEM. * P <0,05 vs controle, avaliada pela não pareado teste t de Student. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Caminho Potencial de AgNP Induced microglia activação e Influência no hipotálamo neurotoxicidade. Após a exposição a nanopartículas de prata, microglia são activados para um estado pró-inflamatória M1, caracterizado pelo aumento da secreção e a expressão de citoquinas pró-inflamatórias e tomadores. A liberação das citocinas pró-inflamatórias e tomadores contribui para em torno da morte celular neuronal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
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