Introduction
環境汚染は、具体的には、これらのナノ粒子（NP）の範囲の（1から20 nmの直径）、肥満および血液脳関門1-3を通過する能力に起因する他の神経変性疾患にリンクされています。汚染への高められた曝露は視床下部1を含む中枢神経系の炎症を誘発することができます。これが発生した一つの潜在的メカニズムは、ミクログリア（脳の免疫細胞）4のナノ粒子誘導活性化を介して可能性があります。以前の研究は、時間がかかり、高価であり、脳の健康上のNPの効果を研究するためにin vivoモデルで使用されており、直接NPはミクログリアにどのように影響するかの質問に答えていません。ミクログリアは、脳の微小環境の維持と分泌因子およびサイトカインの放出を介して、周囲のニューロンとの通信などの中枢神経系における多面的な役割を、果たしています。刺激に応じて、ミクログリアは、M1の広報に活性化することができますO-炎症またはM2抗炎症状態。 M2は、インターロイキン-4（IL-4）を含むミクログリア放出抗炎症性サイトカインを活性化しながら、例えば、M1は、ミクログリアは、腫瘍壊死因子α（TNF-α）などの炎症性サイトカインを放出する活性化しました。大気汚染物質の神経毒性を決定するためのインビトロのバイオセンサーにおける当社の代理を検証するために、我々は、20nmの銀ナノ粒子（AgNPs）へのミクログリアの応答を測定しました。この記事の目的は、in vitroミクログリア細胞株は、マウスミクログリアのNPに対応し、どのようにミクログリアの活性化は、視床下部の細胞に影響を与えるをテストするための代理バイオセンサーのマーカーとして使用する方法を説明することです。この検証モデルの長期的な意図されたアプリケーションは、脳の健康と神経変性疾患に実世界の汚染物質の影響をテストすることです。我々は、マイクの暴露後のミクログリア活性化および視床下部の細胞の生存を測定するためのインビトロの 96ウェルフォーマットアッセイの詳細な説明を提供します馴化培地をroglial。
ミクログリア活性化は、免疫吸着アッセイ（ELISA）結合されたTNF-αの酵素を用いAgNP暴露後測定しました。視床下部細胞上の活性化ミクログリアの効果を決定するために、AgNPsは濾過装置を用いて、ミクログリア上清（馴化培地）から削除されました。サイズに基づいてAgNPsを排除しながら濾過装置は、サイトカインを保持します。簡潔には、AgNPsの有無にかかわらず処理されたミクログリアからの上清を、収集し、フィルタに添加し、そして15分間、14,000×gで遠心分離しました。我々は、次に、視床下部の細胞生存率に対するミクログリア分泌されるサイトカインの影響を決定することができました。以前に5,6に記載されているように馴化培地（サイトカインを含む）への曝露後の細胞毒性はレサズリンベースのアッセイによって測定しました。代謝活性細胞はレザズリンを減少させ、生存細胞7の数に比例した蛍光シグナルを生成します。
NT ">（例えば、またはin vivo実験で共培養、トランスウェルのセットアップのような）他のものよりも、この技術を使用することのいくつかの利点がある。我々のモデルは、直接ミクログリアを活性化し、分泌された因子は、ニューロン8に毒性であるかどうかを決定する能力を提供します現在のプロトコルの使用は、BV2ミクログリアは、このプロトコルは、これらの特定の状況のために最適化されているが、方法があることができる。それに続く応答の決意9（mHypo-A1 / 2と命名）20 nmの直径のナノ粒子で刺激し、そしてマウスの視床下部の細胞を不死化し、不死化ミクログリア誘導細胞死の他のモデルにおいて、または一次ミクログリアおよびニューロンを含む他の細胞型で使用される改変されました。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.ミクログリア細胞培養のメンテナンス
- 温かい細胞培地（ダルベッコ改変イーグル培地、DMEM）、37℃、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン（PSN）を補充しました。
- -80℃での貯蔵から25 - 通路18でBV2ミクログリア細胞の凍結ストックを入手します。急速に37℃の水浴中で細胞を解凍します。
- 穏やかに75cm 2のセルへの転送10mLの細胞培養培地を含有するフラスコをベント。
- 37℃、5％CO 2中でフラスコをインキュベートします。培地を吸引し、24時間後に、新鮮な培地と交換します。 80％の密集度 - 約70になるまで細胞を増殖させます。
2.カウントおよびめっきセル
- 37℃の水浴、暖かいDMEMおよび1×トリプシン-EDTA溶液です。
- 吸引細胞からの培地とトリプシンの500μlを添加します。 5分 - 2、37℃でインキュベートします。
- スクレーパーを使用して、フラスコから細胞を除去し、5ミリリットルに懸濁DMEMの。 50ミリリットルチューブに3回を70μmのストレーナーを介して細胞を渡します。
- 血球計数器を用いて細胞を計数し、10％FBSおよび1％PSNを補充した200μlのDMEMの最終容量で透明底板を壁/ウェル黒色に8,000細胞を播種します。 24時間、37℃で5％CO 2でプレートをインキュベートします。
- 古いDMEMを削除し、ミクログリアを餓死血清を1％PSNを補っ温めたDMEM200μlで交換してください。 24時間、37℃で5％CO 2でプレートをインキュベートします。
3.活性化ミクログリア
- 別々のチューブ、AgNPs（0.01、0.05または0.1μgの/ ml）を希釈し、車両/ニュートラル制御（クエン酸ナトリウム、0.04ミリモル）の最終作業濃度1％のPSNを補充した無血清DMEMインチ
- 各ウェルから培地100μlのを削除し、適切な治療化合物の100μlで交換してください。
- 24時間、37℃で5％CO 2でプレートをインキュベートします。
4. Fiの馴化培地をltering
- 各ウェルから培地上清の200μLを収集し、収集チューブ（1.5〜2ミリリットルの容量）とフィルタ（10キロダルトンの分子量カットオフ）に移します。
- 室温で15分間14,000×gで遠心分離します。
- フロースルー（粒子と上清）を捨て、新しいコレクションチューブにフィルター逆さまに置きます。
- 2分間室温で千×gで遠心分離します。
注：得られた濾過媒体は、（分泌されたサイトカインを含む）6倍濃縮されています。 - 10％FBSおよび氷上で1％のPSNと店を補充した新鮮なDMEMで400μlに濃縮物の体積を持参。
注：約390で特徴的なピークに基づいて、AgNPの濃度を生成し、残留AgNPsを濾過した培地から除去されるようにするには- 420 nmの10。 （ステップ3.1で説明したように0、0.01、0.025、0.05、0.1、および0.2μgの/ mlで）し、濾過簡単に説明すると、フィルタリングされていないAgNPsのアリコートを準備無血清DMEM中にビヒクル対照（クエン酸ナトリウム、0.04ミリモル）。黒に小分けし、ろ過サンプルおよび標準の50μlを透明底板を壁。分光光度計を使用して、390での吸光度を測定 - 410 nmおよびAgNPの濃度曲線に測定値を比較します。濾過したサンプルは、ビヒクルコントロールサンプルと同じ吸光度値を使用している場合、残留AgNPsが除去されると仮定することができます。 - 市販のキットからの指示に従って、TNF-αの分泌を決定するために濾過した培地の半分を使用してください。
5.視床下部細胞培養のメンテナンス
- 暖かいDMEM細胞培養培地は、37℃に10％FBSおよび1％PSNを補充しました。
- 80℃で保存された25 - 視床下部の凍結ストック（mHypo-A1 / 2）通路18の細胞を取得します。急速に37℃の水浴中で細胞を解凍します。
- 穏やかに75cm 2のセルへの転送10mLの細胞培養培地を含有するフラスコをベント。
- CO 2 5％でフラスコをインキュベート
6.視床下部の細胞毒性を決定します
- 暖かいDMEMと37℃の水浴中で1×トリプシン-EDTA溶液。
- 視床下部細胞から培地を吸引し、トリプシンの500μlを添加します。 5分 - 2、37℃でインキュベートします。ステップ2で前述したようにスクレーパーを用いてフラスコから細胞を除去します。
- 血球計数器を用いて細胞を計数し、10％FBSおよび1％PSNを補充した200μlのDMEMの最終容量で透明底板を壁/ウェル黒色に5,000細胞で視床下部の細胞をプレートし、37℃で5％CO 2で一晩インキュベート。
- マルチチャンネルピペッターを使用して、古いメディアの100μlのを削除し、1倍の最終濃度になるように、濾過し、濃縮馴化培地を100μlを追加します。
- 24時間、37℃で5％CO 2でプレートをインキュベートします。
- 22を追加します。1;レサズリン試薬のリットル、37℃で5％CO 2で20分間静置します。
- マルチ分光光度計、記録蛍光（560nmのEX / 590 nmのEM）を使用して細胞生存率を測定しました。相対蛍光単位（RFU）として結果を報告します。
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Representative Results
私たちは、上記のプロトコルを使用してナノ粒子に脳の反応のための代理バイオセンサーとしてそのミクログリアの機能を示します。我々の結果は、下流の神経細胞死に対するミクログリアの活性化の毒性作用の測定を含む。 図1は、ミクログリアを活性化し、分泌されたサイトカインは、視床下部ニューロンの生存率を低下させるかどうかを判断するためのプロトコルのワークフローを示しています。 TNF-αの分泌が大幅にAgNP露出（ 図2）以下に増加しました。視床下部ニューロンはAgNP-活性化ミクログリアから馴化培地にさらされている場合には、細胞の生存率が有意（ 図3）が低減される。 図4 AgNPsがミクログリアを活性化し、視床下部細胞死に貢献する潜在的なメカニズムの概要を説明します。
フィギュア活性化ミクログリアからAgNP濾過方法1.ワークフロー。上清を濾過装置に加え、メディアからAgNPsを除去するために遠心分離されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. TNF-α分泌はAgNP曝露後に増加する。ミクログリアBV2細胞を、ビヒクル対照または2時間AgNPsで処理しました。 TNF-αの分泌を大幅にAgNPsへの曝露後に増加しました。データは、平均±SEMとして提示されています。 **はp <コントロール対 0.001スチューデントの不対のt検定によって評価される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. 視床下部の細胞の生存率は、ミクログリア馴化メディア接触に続いて還元される。視床下部の細胞は、AgNPで刺激ミクログリアからの馴化培地への曝露後の細胞死の増加を示しています。データは、平均±SEMとして提示されている。*はp <コントロール対 0.05スチューデントの不対のt検定によって評価される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
AgNP誘起ミクログリア活性化と視床下部神経毒性への影響の 図4. 潜在的な経路。銀ナノ粒子への曝露に続いて、マイクログラムLIAが増加分泌および炎症誘発性サイトカインおよびメーカーの発現によって特徴づけられる、M1プロ炎症状態に活性化されます。炎症性サイトカインやメーカーのリリースでは、神経細胞死を周囲に貢献しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
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