Introduction
环境污染，特别是那些纳米粒子（NP）范围（1 - 20纳米的直径），已与肥胖症和由于跨越血脑屏障1-3的能力其它神经变性疾病。升高的接触污染可能诱发炎症在中枢神经系统，包括下丘脑1。在发生这种情况可能是通过小胶质细胞的纳米颗粒诱导的激活（脑免疫细胞）4-一个潜在机制。以前的研究已经在体内模型中用于研究纳米颗粒对脑健康这是费时的，昂贵的影响，并且不直接回答的纳米颗粒如何影响小胶质细胞的问题。小胶质细胞在中枢神经系统中发挥着多方面的作用，包括维护脑微环境，并通过的分泌因子和细胞因子的释放周围的神经元进行通信。根据不同的刺激，小胶质细胞可激活到M1的公关邻炎症或M2抗炎状态。例如，M1激活的小胶质细胞释放促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α），而M 2活化的小胶质细胞释放抗炎细胞因子，包括白细胞介素-4（IL-4）。为了验证我们的体外生物传感器替代确定空气污染物的毒性，我们测量到20纳米的银纳米颗粒（AGNPS）小胶质细胞的反应。本文的目的是描述一种体外小胶质细胞系如何可以用作用于测试小鼠小神经胶质响应于NP和如何小胶质细胞活化的影响下丘脑的细胞的替代生物传感器标记。长期打算在验证模型的应用是在测试大脑健康和神经退行性疾病现实世界的污染物的影响。我们提供一种在体外 96孔格式测定的详细说明，用于测量小胶质细胞活化和下丘脑细胞存活麦克风的曝光以下 roglial条件培养基。
测定小胶质细胞活化使用酶联免疫吸附测定（ELISA）以下的TNF-α的酶下列AgNP曝光。以确定对下丘脑细胞中激活的小胶质细胞的效果，AGNPS被使用的过滤装置的小胶质细胞上清液（条件培养基）中除去。该过滤装置保持细胞因子，同时排除根据大小AGNPS。简要地说，从具有或不AGNPS治疗小神经胶质细胞收集上清液，加至过滤器，并在14000×g离心15分钟。那时我们能够确定对下丘脑细胞活力小胶质细胞分泌的细胞因子的影响。如前所述5,6-暴露于条件培养基（含有细胞因子）的细胞毒性通过基于刃天青的测定法来确定。代谢活性细胞减少刃天青并产生正比于活细胞7的数量的荧光信号。
核苷酸“>有使用这种技术比其他（如共培养，反式好设置，或在体内实验）的多个优点。我们的模型提供了直接激活的小胶质细胞，并确定是否分泌的因子是有毒的神经元8的能力。目前的协议采用永生BV2小胶质细胞刺激与20纳米的直径的纳米颗粒，和永生化的鼠下丘脑细胞（指定mHypo-A1 / 2）9，用于测定随后的反应。虽然该协议已经为这些特定的条件进行了优化，该方法可以是改变，以在小胶质诱导的细胞死亡的其它模型一起使用，或与其它类型的细胞包括原代小神经胶质细胞和神经元。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.小胶质细胞培养维护
- 暖细胞培养基（Dulbecco氏改良的Eagle培养基; DMEM）中补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素/新霉素（PSN）至37℃。
- 获取BV2小胶质细胞的冷冻库存的通道18 - 在-80℃，25从存储中。迅速解冻在37℃水浴细胞。
- 轻轻细胞转移到含有10ml细胞培养基一个75cm 2的排出烧瓶。
- 在37℃孵育烧瓶在5％CO 2。吸媒体后24小时，并用新鲜的培养基替换。培养细胞，直到大约70 - 80％汇合。
2.计数和电镀细胞
- 在37℃水浴，温DMEM和1x-胰蛋白酶EDTA溶液。
- 从细胞吸媒体和加入500μl胰蛋白酶。孵育在37℃，2 - 5分钟。
- 使用刮刀从烧瓶除去细胞并在5ml悬的DMEM。通过一个70微米的过滤器的细胞放入50毫升管三次。
- 算使用血球细胞和种子8000个细胞/孔在黑色在补充有10％FBS和1％的PSN200μl的DMEM中，终体积壁透明底板。在37℃下在5％CO 2下孵育板24小时。
- 移除旧的DMEM和用200μl温热的DMEM补充有1％的PSN血清饥饿的小胶质细胞替换。在37℃下在5％CO 2下孵育板24小时。
3.激活小胶质细胞
- 在单独的管中，稀AGNPS（0.01，0.05或0.1微克/毫升）和车辆/空档控制（柠檬酸钠，0.04毫摩尔）在补充有1％的PSN至最终工作浓度无血清DMEM。
- 从每孔中取出100微升媒体和100微升适当的治疗化合物的替代。
- 在37℃下在5％CO 2下孵育板24小时。
4.网络滤波条件培养基
- 收集200μl的培养基上清液从每孔中，并转移到与收集管（1.5至2ml容量）的过滤器（截留分子量为10kDa的）。
- 以14,000 xg离心离心在室温下15分钟。
- 丢弃流过（上清液与颗粒），然后将过滤器倒置到一个新的收集管。
- 在1000 xg离心离心在室温下进行2分钟。
注：将所得的过滤介质（含有分泌的细胞因子）由六倍浓缩。 - 使浓缩物至400微升体积用补充有10％FBS和1％的PSN和存储在冰上新鲜DMEM中。
注：为了确保剩余AGNPS从过滤介质去除，生成基于该特征峰的AgNP浓度在约390 - 420纳米10。简单地说，（如在步骤3.1中描述0，0.01，0.025，0.05,0.1和0.2微克/毫升），并过滤制备未过滤AGNPS等份车辆控制（柠檬酸钠，0.04毫摩尔）在无血清的DMEM中。等份加入50μl过滤样品和标准的成黑壁透明底板。在390使用分光光度计，测定吸光度 - 410 nm和比较读数到AgNP浓度曲线。如果滤波的样本具有相同的吸光度的值作为车辆控制样品，则可以假定残余AGNPS被除去。 - 使用一半的过滤介质，从市售的试剂盒测定TNF-α的分泌以下说明。
5.下丘脑细胞培养维护
- 温暖的DMEM细胞培养基中补充有10％FBS和1％的PSN至37℃。
- 获得下丘脑的冷冻股票（mHypo-A1 / 2）通过18细胞 - 25保存在80℃。迅速解冻在37℃水浴细胞。
- 轻轻细胞转移到含有10ml细胞培养基一个75cm 2的排出烧瓶。
- 在5％孵育烧瓶CO 2的
6.确定下丘脑细胞毒性
- 温暖的DMEM，并在37℃水浴中1×胰蛋白酶-EDTA溶液。
- 从下丘脑细胞吸媒体和加入500μl胰蛋白酶。孵育在37℃，2 - 5分钟。除去使用如步骤2如上所述刮刀从烧瓶的细胞。
- 算使用血球细胞中并在5000个细胞/孔在黑色在补充有10％FBS和1％的PSN200μl的DMEM中，终体积壁透明底板板丘脑细胞中并在37℃在5％CO 2孵育过夜。
- 取出100微升使用多道移液器旧媒体，并添加100微升过滤条件集中媒体，为1X终浓度。
- 在37℃下在5％CO 2下孵育板24小时。
- 添加221;刃天青试剂l的，并在37℃下孵育板在5％CO 2 20分钟。
- 使用多模分光光度计记录荧光（560纳米EX / 590nm处的EM）来测量细胞活力。报告结果为相对荧光单位（RFU）。
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Representative Results
我们表明，小胶质细胞的功能，作为脑响应于使用上述协议的纳米颗粒的替代传感器。我们的结果包括对下游神经元细胞死亡小胶质细胞活化的毒性作用的测量。 图1展示了协议的工作流程来激活的小胶质细胞，并确定是否分泌的细胞因子减少下丘脑神经元的生存力。 TNF-α的分泌显著增加以下AgNP曝光（ 图2）。当丘脑神经元是从AgNP活化的小胶质细胞暴露于条件培养基，细胞活力显著减少（ 图3）。 图4概述了其中AGNPS激活的小胶质细胞和有助于丘脑细胞死亡的潜在机制。
数字1. 工作流从激活的小胶质AgNP过滤方法。上清液加入到过滤装置，离心从介质除去AGNPS。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2 TNF-α的分泌增加继AgNP曝光。小胶质BV2细胞用载体对照或2小时AGNPS处理。 TNF-α的分泌显著增加暴露于AGNPS。数据表示为平均值±SEM表示。 ** P <所评定学生的非配对t检验0.001 对控制权。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 下丘脑细胞活力降低小胶质继空调媒体曝光。下丘脑细胞显示暴露于条件培养基从AgNP刺激的小胶质细胞增加死亡。数据以平均值±SEM。* P <0.05， 相对于控制由学生非配对t检验来评估。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. AgNP诱导小胶质细胞活化的可能途径和影响下丘脑神经毒性。在暴露于银纳米粒子，微克利亚被激活到一个M 1促炎状态，其特征在于增加的分泌和促炎性细胞因子和制造商的表达。促炎性细胞因子和制造商的发布有利于周边神经细胞的死亡。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
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