Introduction
זיהומים סביבתיים, במיוחד אלה של הטווח ננו-חלקיקים (NP) (1 - 20 בקוטר ננומטר), נקשרו להשמנה ומחלות ניווניות אחרות בשל היכולת לחצות את מחסום דם מוח 1-3. חשיפה גבוהה לזיהום עלולה לגרום לדלקת במערכת העצבים המרכזית כולל ההיפותלמוס 1. מנגנון אפשרי אחד שבו זה מתרחש יכול להיות באמצעות הפעלת המושרה ננו-חלקיקים של microglia (תאי מערכת החיסון במוח) 4. מחקרים קודמים השתמשו במודלים vivo כדי לחקור את ההשפעות של צירופים על בריאות המוח אשר זמן רב, יקר, ובאופן ישיר לא לענות על השאלה של איך צירופים להשפיע microglia. Microglia לשחק תפקיד רב במערכת העצבים המרכזית, כולל תחזוקה של microenvironment המוח ובתקשורת עם סובבים נוירונים באמצעות שחרור גורמים מופרשים וציטוקינים. בהתאם לגירויים, microglia יכול להיות מופעל כדי יחסי ציבור M1o-דלקתי או מדינה אנטי דלקתית M2. לדוגמה, M1 מופעל microglia לשחרר ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון אלפא tumor necrosis factor (TNF-α), ואילו M2 מופעל ציטוקינים אנטי דלקתיות שחרור microglia כולל interleukin-4 (IL-4). כדי לאמת פונדקאית שלנו biosensor במבחנה לקביעת רעילות עצבית של מזהמי אוויר, מדדנו תגובה microglial עד 20 חלקיקי כסף ננומטר (AgNPs). מטרת מאמר זה היא לתאר כיצד קו תאים במבחנה microglial יכול לשמש כסמן biosensor פונדקאית לבדיקת תגובה microglial בעכברים כדי צירופים ואיך microglial ההפעלה משפיע על תאים ההיפותלמוס. לטווח הארוך נועד יישום של מודל תוקף זה הוא לבחון השפעות של מזהמים לגבי עולם האמיתי בריאות המוח ומחלות ניווניות. אנו מספקים תיאור מפורט של assay בפורמט במבחנה 96-היטב למדידת ההפעלה microglial והישרדות התא ההיפותלמוס בעקבות חשיפת מיקרופון roglial תקשורת מותנית.
הפעלת microglial נקבעה בעקבות חשיפת AgNP באמצעות אנזים TNF-α מקושר immunosorbent assay (ELISA). כדי לקבוע את ההשפעה של microglia מופעל על תאים ההיפותלמוס, את AgNPs הוצא supernatant microglial (מדיה מותנית) באמצעות מכשיר סינון. מכשיר הסינון שומר ציטוקינים ובמקביל לא תכלול AgNPs על בסיס הגודל. בקצרה, supernatant מן microglia מטופלים עם או בלי AgNPs נאסף, להוסיף את המסננים, centrifuged ב 14,000 XG במשך 15 דקות. היינו אז מסוגל לקבוע את ההשפעה של ציטוקינים המופרשים microglial על כדאיות התא ההיפותלמוס. רעילות לתא בעקבות חשיפה בתקשורת מותנית (ציטוקינים המכיל) נקבעו באמצעות assay מבוסס resazurin כפי שתוארו לעיל 5,6. מבחינה מטבולית תאים פעילים להפחית resazurin ולהפיק אות ניאון ביחס ישר למספר התאים קיימא 7.
NT "> ישנם מספר יתרונות של שימוש בטכניקה זו על פני אחרים (כגון שיתוף תרבות, setups היטב טרנס, או בניסויים vivo). המודל שלנו מספק את היכולת להפעיל ישירות המיקרוגליה לקבוע אם גורמים המופרשים רעילים לנוירונים 8 . הפרוטוקול הנוכחי משתמש microglia BV2 הנציח מגורה עם 20 חלקיקים ננומטר בקוטר, והנציח תאים ההיפותלמוס בעכברים (מיועד mHypo-A1 / 2) 9 לקביעה בתגובה שלאחר מכן. בעוד פרוטוקול זה כבר מותאם תנאים ספציפיים האלה, השיטות יכולות להיות שיניתי לשמש מודלים אחרים של מוות תאי מושרה microglial, או עם סוגי תאים אחרים, כולל המיקרוגליה הנוירונים עיקריים.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תחזוקת תא תרבות microglial
- תרבית תאים בינוני חמה (בינוני הנשר השונה של Dulbecco; DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין / neomycin (PSN) ל -37 מעלות צלזיוס.
- השג מלאי קפוא של תאים microglial BV2 ב מעבר 18 - 25 מ אחסון ב -80 ° C. במהירות להפשיר תאים 37 באמבט מים מעלות צלזיוס.
- בעדינות להעביר תאים בבקבוק פרק 75 סנטימטר 2 המכיל 10 מיליליטר תא תקשורת ותרבות.
- דגירת בקבוק ב 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. לשאוב תקשורת לאחר 24 שעות ולהחליף עם תקשורת טריה. לגדל תאים עד כ 70 - 80% confluency.
ספירה 2. תאי ציפוי
- באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, DMEM חם פתרון 1x-טריפסין-EDTA.
- לשאוב מדיה מתאי ולהוסיף 500 μl של טריפסין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 - 5 דקות.
- באמצעות מגרד, להסיר תאים מהבקבוק ו להשעות ב 5 מ"לשל DMEM. Pass התאים דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל שלוש פעמים.
- ספירת תאים באמצעות hemocytometer וזרעי 8,000 תאים / היטב שחור חומת צלחת תחתונה ברורה בנפח סופי של 200 μl DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% PSN. דגירת צלחת ב 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- הסר הישן DMEM ולהחליף עם 200 μl של חימם DMEM בתוספת 1% PSN סרום להרעיב microglia. דגירת צלחת ב 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
3. Microglia הפעלה
- ב צינורות נפרדים, לדלל AgNPs (0.01, 0.05 או 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר) ורכב / שליטה ניטראלית (נתרן ציטרט, 0.04 מ"מ) סרום ללא DMEM בתוספת 1% PSN לריכוזי עבודה סופיים.
- סור 100 μl של תקשורת מכל טוב ולהחליף עם 100 μl של מתחם טיפול מתאים.
- דגירת צלחת ב 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
אלחוטי 4.ltering מדיה אוויר
- אסוף 200 μl של supernatant תקשורת מכל טוב ולהעביר לתוך (הפסקת משקל מולקולרית של 10 KDA) מסנן עם צינור איסוף (1.5 עד אפס מקום מיליליטר 2).
- צנטריפוגה ב 14,000 XG בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- מחק את זרימת הדרך (supernatant עם חלקיקים) ומקום ההפוך המסננת לתוך צינור אוסף חדש.
- צנטריפוגה XG ב 1000 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
הערה: המדיה המסוננת שתעורר (המכיל ציטוקינים מופרשים) מרוכזת על ידי פי שש. - תביא את הנפח של הרכז 400 μl עם DMEM הטרי בתוספת 10% FBS ו -1% PSN ולאחסן על קרח.
הערה: כדי להבטיח AgNPs שיורית יוסר תקשורת מסוננת, ליצור ריכוז AgNP מבוסס על פסגת האופייניים ב כ 390 - 420 10 ננומטר. בקיצור, להכין aliquots של AgNPs בלי פילטר (0, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, ו -0.2 מיקרוגרם / מ"ל כמתואר בשלב 3.1) ומסונניםשליטה ברכב (נתרן ציטרט, 0.04 מ"מ) ב סרום ללא DMEM. Aliquot 50 μl של דגימות וסטנדרטים מסוננים לשחור חומת צלחת תחתונה ברורה. באמצעות ספקטרופוטומטר, למדוד ספיגת 390 - 410 ננומטר ולהשוות את קריאות עקום ריכוז AgNP. אם דגימות מסוננות יש אותו הערך ספיג כמו מדגם השליטה ברכב, ניתן להניח AgNPs שיורית יוסר. - השתמש חץ התקשורת המסונן כדי לקבוע הוראות באות הפרשת TNF-α מתוך ערכה זמינה מסחרי.
5. תחזוקת תרבית תאים ההיפותלמוס
- בינוני תרבות DMEM תא חם בתוספת 10% FBS ו PSN 1% ל -37 מעלות צלזיוס.
- השג מלאי קפוא של ההיפותלמוס (mHypo-A1 / 2) תאים ב מעבר 18 - 25 מאוחסנים על 80 מעלות צלזיוס. במהירות להפשיר תאים 37 באמבט מים מעלות צלזיוס.
- בעדינות להעביר תאים בבקבוק פרק 75 סנטימטר 2 המכיל 10 מיליליטר תא תקשורת ותרבות.
- דגירת בקבוק ב 5% CO 2
6. רעילות לתא ההיפותלמוס קביעה
- DMEM חם פתרון 1x-טריפסין-EDTA באמבט המים 37 מעלות צלזיוס.
- לשאוב מדיה מתאי ההיפותלמוס ולהוסיף 500 μl של טריפסין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 - 5 דקות. הסרת תאים מן הבקבוק באמצעות מגרד כמתואר לעיל בשלב 2.
- ספירת תאים באמצעות hemocytometer צלחת תאי ההיפותלמוס ב 5000 תאים / היטב שחור חומת צלחת תחתונה ברורה בנפח סופי של 200 μl DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% PSN דגירת הלילה ב 5% CO 2 ב 37 ° C .
- הסר 100 μl של המדיה הישנה באמצעות pipetter רב ולהוסיף 100 μl של התקשורת מותנה מרוכזים מסונן, לריכוז סופי של 1x.
- דגירת צלחת ב 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- להוסיף 221; l של מגיב resazurin דגירה צלחת במשך 20 דקות ב 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס.
- באמצעות ספקטרופוטומטר multimode, הקרינה שיא (560 ננומטר EX / 590 ננומטר EM) כדי למדוד כדאיות התא. דווח תוצאות כיחידות קרינה יחסיות (RFU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מראים כי הפונקציה microglia בתור biosensor פונדקאית עבור תגובת המוח חלקיקים באמצעות פרוטוקול לעיל. התוצאות שלנו כוללות מדידה מן ההשפעות הרעילות של הפעלת microglial על מוות של תאים עצביים במורד זרם. איור 1 מדגימה זרימת עבודה של הפרוטוקול להפעיל המיקרוגליה לקבוע אם ציטוקינים המופרשים להפחית כדאיות של נוירונים ההיפותלמוס. הפרשת TNF-α הוגדלה משמעותית בעקבות חשיפת AgNP (איור 2). כאשר נוירונים ההיפותלמוס נחשפים למדיה מותנה מן microglia AgNP המופעל, כדאיות התא מצטמצם משמעותית (איור 3). איור 4 מתאר את מנגנון הפוטנציאל שבו AgNPs להפעיל המיקרוגליה לתרום מוות של תאים ההיפותלמוס.
דמות1. Workflow עבור AgNP סינון שיטה. Supernatant מן microglia מופעל מתווסף התקני סינון centrifuged להסיר AgNPs ממדיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. TNF-α הפרשה מוגברת בעקבות חשיפת AgNP. תאי microglial BV2 טופלו שליטה ברכב או AgNPs עבור שעה 2. הפרשת TNF-α הוגדלה משמעותי בעקבות חשיפת AgNPs. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. ** p <0.001 שליטה מול לפי הערכת -test t המזווג של הסטודנט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כדאיויות תא איור 3. ההיפותלמוס מצטמצמות בעקבות חשיפה תקשורתית אוויר microglial. תאי ההיפותלמוס להראות מוות של תא מוגבר בעקבות חשיפה למדיה מותנים מן microglia מגורה עם AgNP. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM. * P <0.05 לעומת שליטה כפי שהוערך על ידי -test t המזווג של הסטודנט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מסלול איור 4. פוטנציאליים של AgNP מושרה microglial הפעלה והשפעה על ההיפותלמוס עצבי. בעקבות חשיפת חלקיקי כסף, מיקרוגרםליה מופעלת למצב M1 פרו-דלקתי, מאופיינת הפרשה מוגברת וביטוי של הפר דלקתי ציטוקינים ומקבלים. שחרורו של ציטוקינים פרו-דלקתיים וקובעי תורם סביב מוות של תאים עצביים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
- Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
- Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
- Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49 (2014).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
- Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
- Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
- Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
- Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
- Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105 (2011).
- Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
- Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
- Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
- Perry, V. H., Holmes, C.
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
- Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
- Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S.
- Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
- Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
- Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
- PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
- Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
- Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).
