Introduction
Inquinamenti ambientali, in particolare quelle della gamma di nanoparticelle (NP) (1 - 20 nm di diametro), sono stati collegati a obesità e altre malattie neurodegenerative dovute alla capacità di attraversare la barriera emato-encefalica 1-3. L'esposizione elevata a inquinamento può indurre l'infiammazione del sistema nervoso centrale, tra cui l'ipotalamo 1. Un potenziale meccanismo in cui questo si verifica potrebbe essere attraverso nanoparticelle indotta attivazione di microglia (cellule immunitarie del cervello) 4. Studi precedenti hanno usato modelli in vivo per studiare gli effetti delle NP sulla salute del cervello che sono in termini di tempo, costosa, e non direttamente rispondere alla domanda di come NP influenzano microglia. Microglia svolgono un ruolo poliedrico nel sistema nervoso centrale, compreso il mantenimento del microambiente cerebrale e comunicante con circostanti neuroni tramite il rilascio di fattori secreti e citochine. A seconda degli stimoli, microglia può essere attivato per un pr M1o-infiammatorie o uno stato antinfiammatorio M2. Ad esempio, M1 attivato microglia rilasciano citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), mentre M2 attivato rilascio microglia citochine anti-infiammatorie comprese interleuchina-4 (IL-4). Per convalidare la nostra surrogata in vitro biosensore per la determinazione neurotossicità degli inquinanti atmosferici, abbiamo misurato la risposta della microglia a 20 nm nanoparticelle d'argento (AGNPS). L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere come una linea di cellule microgliali in vitro può essere utilizzato come marcatore surrogato biosensore per testare la risposta della microglia murina di NP e come microglia attivazione colpisce le cellule ipotalamiche. Il lungo termine destinato applicazione di questo modello convalidato è quello di testare gli effetti delle sostanze inquinanti del mondo reale per la salute del cervello e le malattie neurodegenerative. Forniamo una descrizione dettagliata di un test in vitro formato da 96 pozzetti per la misura di attivazione della microglia e la sopravvivenza delle cellule ipotalamico dopo l'esposizione del microfono roglial mezzi condizionati.
attivazione della microglia è stato determinato a seguito di esposizione AgNP utilizzando un enzima TNF-α linked immunosorbent assay (ELISA). Per determinare l'effetto della microglia attivata su cellule ipotalamiche, i AGNPS sono stati rimossi dal surnatante microglia (mezzi condizionati) utilizzando un dispositivo di filtraggio. Il dispositivo di filtraggio mantiene citochine, escludendo i AGNPS in base alle dimensioni. Brevemente, surnatante dal microglia trattate con o senza AGNPS stato raccolto, aggiunto ai filtri, e centrifugato a 14.000 xg per 15 min. Siamo stati quindi in grado di determinare l'influenza delle citochine secrete microgliali sulla vitalità delle cellule ipotalamo. Tossicità cellulare a seguito di esposizione ai media condizionata (contenenti citochine) è stata determinata mediante un saggio resazurin basato come precedentemente descritto 5,6. Metabolicamente attive cellule riducono resazurin e producono un segnale fluorescente proporzionale al numero di cellule vitali 7.
nt "> Ci sono molti vantaggi di utilizzare questa tecnica rispetto ad altri (come co-coltura, messe a punto trans-bene, o esperimenti in vivo). Il nostro modello offre la possibilità di attivare direttamente microglia e determinare se i fattori secreti sono tossici per i neuroni 8 . L'attuale protocollo utilizza immortalato microglia BV2 stimolato con le nanoparticelle di diametro 20 nm, e immortalato cellule ipotalamiche murine (designato mHypo-A1 / 2) 9 per la determinazione della risposta successiva. Anche se questo protocollo è stato ottimizzato per queste condizioni specifiche, i metodi possono essere alterato per essere utilizzato in altri modelli di morte cellulare indotta microgliali, o con altri tipi di cellule inclusi microglia primaria e neuroni.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. microglia Manutenzione Cell Culture
- terreno di coltura cellulare Warm (Dulbecco Modified Eagle Medium; DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina / neomicina (PSN) a 37 ° C.
- Ottenere Stock Frozen di cellule microgliali BV2 al passaggio 18 - 25 da stoccaggio a -80 ° C. Rapidamente scongelare le cellule a 37 ° C bagnomaria.
- Trasferire delicatamente le cellule in un pallone ventilato 75 centimetri 2 terreni di coltura contenente 10 ml di cellule.
- Incubare pallone in 5% di CO 2 a 37 ° C. mezzi Aspirare dopo 24 ore e sostituire con mezzi freschi. Crescere le cellule fino a circa 70 - 80% di confluenza.
2. Conteggio e cellule placcatura
- In un bagno d'acqua a 37 ° C, DMEM caldo e soluzione 1x-tripsina-EDTA.
- supporti Aspirare dalle cellule e aggiungere 500 ml di tripsina. Incubare a 37 ° C per 2 - 5 min.
- Utilizzando un raschietto, rimuovere le cellule dal pallone e sospendere in 5 mldi DMEM. Passare cellule attraverso un filtro 70 micron in un tubo da 50 ml tre volte.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e sementi 8.000 cellule / pozzetto in un nero murate piastra inferiore chiara in un volume finale di 200 microlitri DMEM supplementato con 10% FBS e 1% PSN. Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore.
- Rimuovere la vecchia DMEM e sostituirlo con 200 ml di DMEM riscaldato integrato con 1% PSN al siero morire di fame microglia. Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore.
3. Attivazione microglia
- In tubi separati, diluire AGNPS (0,01, 0,05 o 0,1 mg / ml) e controllo del veicolo / neutro (citrato di sodio, 0,04 mM) in DMEM senza siero addizionato con 1% PSN a concentrazioni finali di lavoro.
- Togliere 100 ml di mezzi di ogni bene e sostituirlo con 100 ml di composto trattamento appropriato.
- Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore.
4. Filtraggio media condizionata
- Raccogliere 200 ml di surnatante dei media da ogni pozzetto e trasferire in un filtro (cutoff peso molecolare di 10 kDa) con tubo di raccolta (1,5 a 2 ml).
- Centrifugare a 14000 xg a temperatura ambiente per 15 min.
- Gettare il flow-through (surnatante con particelle) e inserire il filtro a testa in giù in un nuovo tubo di raccolta.
- Centrifugare a 1000 xg a temperatura ambiente per 2 min.
NOTA: I media filtrato risultante (contenente citochine secrete) è concentrata per sei volte. - Portare il volume di concentrato a 400 ml con DMEM fresco supplementato con 10% FBS e 1% PSN e memorizzare sul ghiaccio.
NOTA: Per assicurare AGNPS residui vengono rimossi dal supporto filtrati, genera una concentrazione AgNP sulla base del picco caratteristico a circa 390-420 nm 10. In breve, preparare aliquote di AGNPS non filtrati (0, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, e 0.2 mg / ml come descritto al punto 3.1) e filtratacontrollo del veicolo (citrato di sodio, 0,04 mM) in DMEM senza siero. Aliquota 50 ml di campioni e degli standard filtrati in un nero murate piastra inferiore chiaro. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare l'assorbanza a 390-410 nm e confrontare le letture per la curva di concentrazione AgNP. Se i campioni filtrati hanno lo stesso valore di assorbanza del campione di controllo del veicolo, si può presumere AGNPS residui vengono rimossi. - Utilizzare la metà dei mezzi filtrati per determinare secrezione TNF-α seguenti istruzioni da un kit disponibile in commercio.
5. ipotalamico Manutenzione Cell Culture
- Warm mezzo di coltura cellulare DMEM supplementato con 10% FBS e 1% PSN a 37 ° C.
- Ottenere Stock Frozen di ipotalamo (mHypo-A1 / 2) le cellule a passaggio 18 - 25 conservati a 80 ° C. Rapidamente scongelare le cellule a 37 ° C bagnomaria.
- Trasferire delicatamente le cellule in un pallone ventilato 75 centimetri 2 terreni di coltura contenente 10 ml di cellule.
- Incubare pallone in 5% di CO 2
6. Determinazione ipotalamica cellulare Tossicità
- DMEM caldo e la soluzione 1x-tripsina-EDTA in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- supporti Aspirare dalle cellule ipotalamiche e aggiungere 500 ml di tripsina. Incubare a 37 ° C per 2 - 5 min. Rimuovere le cellule dal pallone con un raschietto come sopra descritto al punto 2.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e piastra cellule ipotalamiche a 5.000 cellule / pozzetto in un nero murate piastra inferiore chiara in un volume finale di 200 microlitri DMEM supplementato con 10% FBS e 1% PSN e incubare durante la notte in 5% CO 2 a 37 ° C .
- Togliere 100 ml di vecchi media con un pipetter multicanale e aggiungere 100 ml di mezzi condizionati concentrati filtrati, ad una concentrazione finale di 1x.
- Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore.
- Aggiungere 221; l di reagente resazurina e incubare per 20 min piastra in 5% CO 2 a 37 ° C.
- Utilizzando uno spettrofotometro multimodale, registrare la fluorescenza (560 nm EX / 590 nm EM) per misurare la vitalità cellulare. Riportare i risultati come unità di fluorescenza relativa (RFU).
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Representative Results
Abbiamo dimostrato che la funzione microglia come un biosensore surrogato per la risposta del cervello alle nanoparticelle utilizzando il protocollo di cui sopra. I nostri risultati includono la misurazione degli effetti tossici di attivazione della microglia sulla morte delle cellule neuronali a valle. La Figura 1 mostra un flusso di lavoro del protocollo per attivare la microglia e determinare se le citochine secrete ridurre la vitalità dei neuroni ipotalamici. Secrezione di TNF-α è risultato significativamente aumentato dopo l'esposizione AgNP (Figura 2). Quando i neuroni ipotalamici sono esposti ai media condizionata da microglia AgNP attivato, la vitalità delle cellule è notevolmente ridotta (Figura 3). Figura 4 delinea il potenziale meccanismo in cui AGNPS attivano la microglia e contribuiscono alla morte delle cellule dell'ipotalamo.
figura1. Workflow per AgNP filtrazione metodo. Surnatante da microglia attivata viene aggiunta ai dispositivi di filtrazione e centrifugato per rimuovere AGNPS da un supporto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. TNF-α secrezione è aumentato a seguito di esposizione AgNP. Cellule microgliali BV2 sono stati trattati con il controllo del veicolo o AGNPS per 2 ore. secrezione di TNF-α era significativamente aumentato in seguito all'esposizione a AGNPS. I dati sono presentati come media ± SEM. ** p <0.001 vs controllo, come valutato dal spaiati t-test di Student. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. ipotalamico vitalità cellulare è ridotta in seguito alla esposizione mediatica microglia condizionata. Ipotalamici cellule mostrano un aumento della morte cellulare in seguito all'esposizione ai media condizionata da microglia stimolati con AgNP. I dati sono presentati come media ± SEM. * P <0.05 vs controllo come valutato dal spaiati t-test di Student. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Percorso Potenziale di AgNP indotta microglia attivazione e Influenza sulla ipotalamico neurotossicità. A seguito di esposizione alle nanoparticelle d'argento, microglia vengono attivati ad uno stato pro-infiammatorio M1, caratterizzato da un aumento della secrezione e l'espressione di citochine e responsabili pro-infiammatorie. Il rilascio di citochine e responsabili pro-infiammatorie contribuisce alla circostante morte delle cellule neuronali. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
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