Summary
Aqui apresentamos um protocolo para avaliar a sobrevivência de sementes, germinação e dormência em condições de campo, utilizando enterrado, tiras de sementes rotuladas e testes de viabilidade cloreto de tetrazólio (TZ).
Introduction
O objetivo geral deste método é avaliar de forma confiável sobrevivência de sementes ao longo do tempo em condições de campo.
Bancos de sementes do solo são uma reserva de sementes dispersas e viáveis ainda não germinadas distribuídas tanto na superfície do solo, dentro da maca superfície ou dentro do perfil do solo, que podem persistir transitoriamente ou por muitos anos 1,2. Quando os métodos de enterro de sementes semelhantes aos aqui apresentados foram aplicados a um estudo de 17 anos usando várias dezenas de espécies, sementes viáveis foram encontradas em muitas das espécies testadas 3. Dormência das sementes é um bloco para a germinação das sementes até a combinação apropriada de condições para a sobrevivência da muda surgem 4. Restante dormente pode permitir que sementes para sobreviver a condições adversas, tais como baixas temperaturas do inverno, limitação de nutrientes, ou seca sazonal, até que um gatilho externo para a dormência de libertação permite a germinação. Gatilhos para a dormência de libertação pode variar de exposição a estendidos frias, compostos deixadas por fire, ou ataque físico no revestimento de semente por abrasão ou de contacto com os ácidos do estômago de animais 5. Como pistas de germinação pode ser géneros ou espécies específicas e muitas vezes resultam da seleção natural passado, a germinação das sementes maladaptive é o que ocorre em um momento inadequado, e pode resultar em sementes ou mudas de mortalidade ou crescimento das mudas pobres. Enquanto dormência foi classificada em vários tipos com base nos mecanismos de liberação de dormência (por exemplo, dormência física, dormência fisiológica), 6 dormência de sementes continua a ser uma das menos compreendidas tópicos em biologia vegetal. Assim, estudos de campo que permitem a avaliação do estado de sementes ou grupos de sementes em condições ecológicas relevantes individuais têm maior poder explicativo do que aqueles que simplesmente confiar em testes de germinação em laboratório.
Exploração de sementes de características conhecidas podem fornecer insights sobre os mecanismos de dormência. Controle de dormência das sementes é complex, incluindo controle genético de fatores fisiológicos e morfológicos. Enquanto uma plena compreensão da amplitude de mecanismos de dormência ainda não foi elucidado, um modelo geral surgiu, envolvendo uma relação de retroalimentação entre os dois hormônios vegetais ácido giberélico (GA) e ácido abscísico (ABA) 7. Neste modelo generalizado de sementes com um componente fisiológico a sua dormência, serve como sinal de GA para a libertação de dormência, enquanto ABA serve para manter o estado de dormência. Efeitos genéticos materno bem como o ambiente de crescimento materna pode influenciar a dormência e outros traços de sementes, tais como tamanho, através de tecidos maternalmente gerados e sinais de desenvolvimento 8. Maternalmente gerado estruturas externas (ou revestimentos de sementes) podem manter a dormência, às vezes em combinação com sinais fisiológicos. Desde revestimentos de sementes de origem materna são controlados por genes da planta mãe, elas podem não refletir real nuclear composição genética da semente. Temos nósed aquênios Helianthus annuus de uma matriz de híbrido lavoura-selvagem cruza trazer à tona esses efeitos genéticos maternal vs. embrião sobre as características da semente 9,10. Assim, projetos de estudo que incluem diversas espécies, tipos de cruz, ou genótipos pode recolher informações sobre o ecologia e genética de dormência das sementes, germinação e sobrevivência.
Um exemplo importante de como germinação e sobrevivência de sementes fenótipos podem afetar a dinâmica da população pode ser visto nas zonas híbridas de culturas-selvagem. Seleção durante a domesticação de plantas cultivadas elimina a maioria de dormência e reduz a capacidade de uma semente de sobreviver fora da estação de crescimento. No entanto, o fluxo de genes, ou hibridação, entre os tipos de cultivo e selvagens nas zonas híbridas de culturas-selvagem pode reintroduzir alelos de culturas (ou variantes genéticas) em uma população selvagem, com potenciais efeitos na dinâmica do banco de sementes. Os híbrido entre parentes cultivadas e silvestres potencialmente encontrados em zonas híbridas de culturas-wild pode possuiruma variedade de fenótipos dormência intermediários, com apenas alguns fenótipos esperados para sobreviver a condições fora do cultivo (por exemplo, meses de inverno) 11.
O objetivo deste artigo é mostrar como, utilizando o método tira o enterro de sementes, podemos avaliar a germinação, dormência, e a sobrevivência de uma gama de tipos de sementes em diferentes períodos de tempo para investigar sua variação natural em condições de campo. No nosso exemplo, utilizamos sementes de girassol a partir de 15 tipos híbrido transversais de culturas-wild uma vez que estamos interessados em efeitos genéticos maternos e do embrião em sementes de características.
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Protocol
1. Reunir Semente de múltiplas espécies ou cruzamentos controlados de uma única espécie
Nota: Este exemplo de sementes utilizado, a partir de 15 tipos cruzadas no âmbito da annuus Helianthus espécies (girassol), utilizando selvagem, híbrido, e tipos de culturas como o maternal (produtoras de sementes) pai.
- No final da estação de crescimento, recolher cabeças de sementes maduras em sacos etiquetados. Sementes limpas do joio e local de sementes em envelopes etiquetados com o tipo de cruz parental no formato padrão (ou seja, maternal x paterna).
- sementes a granel juntos em grandes envelopes utilizando quantidades iguais de sementes de um número igual de tipos cruz parentais idênticos. Por exemplo, 100 sementes de 10 tipos cruzados com os mesmos pais maternos e paternos. Rotular os envelopes com a identificação (tipo cruzado) informações. Estes grandes envelopes são mestres de sementes para uso em preencher tiras de sepultamento na Seção 2.
| Pai materno | |||
| Pai paterna | Wild: WXW | F 1: WXC | Colheita: CXC |
| Wild: WXW | 0% WXW | 25% F 1 xW † | 50% CXW † |
| BC: WxF1 ou F1xW | 12,5% WxBC | 37,5% F 1 XBC | 62,5% CxBC |
| F 1: WXC | 25% WxF 1 † | 50% F 1 xF 1 | 75% CxF 1 † |
| F 2: F 1 1 xF | 25% 2 WxF | 50% F 1 xF 2 | 75% 2 CxF |
| Colheita: CXC | 50% WXC † | 75% F 1 x C † | 100% CXC |
Tabela 1. cruz t Parentalypes produzidos a partir de lado a polinização. girassol tipos cruz híbridos de culturas-selvagem foram produzidos com mão-de polinização para uso no experimento enterro de sementes. Para todos os tipos cruz, o pai materno listado primeiro eo pai paternal listada em segundo lugar. tipos Cruz marcados com † fazem parte de pares tipo cruzado recíprocas com os mesmos alelos% das culturas, mas os pais maternas diferentes. Tabela foi publicado anteriormente em: Pace, BA et al. (2015) 15.
2. Criar tiras costumam sepultar Semente
NOTA: Para este exemplo, nós tivemos três tratamentos data de remoção e 15 repetições, por isso, necessário 45 tiras total. Este exemplo usa 15 compartimentos por tira-lo, o que é necessário tecido de poliéster malha fina o suficiente ou mosquiteiro para abrigar 15, 7 x 10 cm compartimentos. Veja a Figura 1.
- Comece cortando a 20 x 105 centímetros tira de tecido para cada faixa de semente.
- Medir e marcar compartimentos, em seguida, dobre o tecido ao meio. Usando um higpistola de cola h temperatura, selar um curto (10 cm) end. Depois que a cola esfria um pouco, mas não completamente, pressione as laterais de tecido em conjunto para criar um selo.
CUIDADO: alta temperatura cola e cola dicas arma pode causar queimaduras se o contato com a pele é prolongada. - linhas de cola a partir da borda dobrada para a extremidade curta aberta em cada marca compartimento. Pressione os dois lados de tecido em conjunto ao longo das linhas de cola para garantir a vedação sem buracos entre os compartimentos. Sementes que migram entre compartimentos contribuir para erro experimental.
NOTA: Agora que os compartimentos foram criados, a borda desdobrado deve permanecer aberto e pronto para receber sementes e suas informações de identificação (cross nome do tipo). - Aleatoriamente atribuir tipos de cruz semente para compartimentos para cada faixa.
- Encha compartimentos de sementes com uma série uniforme de sementes (20 para cada compartimento são utilizados neste exemplo). Para etiquetas, use marcadores permanentes industriais em cut-to-fit dardos jardim de plástico de modo que eles são capazes desuportar o enterro.
NOTA: podem ser utilizados métodos de rotulagem alternativos. - Depois de cada compartimento é cheio com a semente e o seu rótulo, selar o compartimento imediatamente com a pistola de cola de alta temperatura. Continuar até que toda a tira de sementes é completamente selado. Rotular tira geral no primeiro compartimento com repetição, bloco e / ou informações sobre o tratamento.
NOTA: Para o nosso estudo, uma vez que tivemos remoções temporais, blocos, e replicar tiras dentro de blocos, incluímos todas essas informações. - Verifique se há lacunas entre os compartimentos e cola local, conforme necessário antes de passar para a próxima faixa.
- Encha compartimentos de sementes com uma série uniforme de sementes (20 para cada compartimento são utilizados neste exemplo). Para etiquetas, use marcadores permanentes industriais em cut-to-fit dardos jardim de plástico de modo que eles são capazes desuportar o enterro.
Figura 1. Enterro tira sementes esquemático. Exemplo de tira enterro mostrando identificação do tipo de cruz por compartimentos individuais. pai materno é listada primeiro com o pai paternal listada em segundo lugar. As cores indicam filiação materna diferente,com amarelo para selvagem, azul para F 1 híbrido, e vermelho para a cultura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Bury Tiras das sementes no campo
- Dig parcelas para a profundidade especificada para tiras de casas. Atribuir tiras para blocos individuais em que tiras são dispostas aleatoriamente para permitir data de remoção para ser usado como a trama principal e identidade compartimento (neste exemplo, tipo cruzado) como a subtrama em análise.
- Cubra com tiras de terra. Corte de metal pano de hardware malha a ser de 10 cm maior do que parcelas e coloque sobre tiras enterrados. Use U-pinos para fixar as bordas e arestas pano de cobertura com terra.
NOTA: Esta cobertura é para excluir escavadores predadores de sementes. Como outra opção, Mercer et al. 13 construídos e caixas de pano de hardware que rodeavam as tiras de sementes devido à pressão Gopher intensa em sua loca campo enterradoção.) - Coloque bandeiras de topografia coloridas para distinguir strip localização e remoção de datas para complementar registros escritas claras.
4. Excavate Tiras e Avaliar Semente
- Desenterrar tiras de sementes atribuídos a uma determinada data remoção. Manter as tiras em um ambiente úmido fresco até que eles atinjam o laboratório onde a avaliação de sementes terá lugar. Isto pode ser realizado por envolvimento das tiras no jornal molhado e colocando-os em um refrigerador para o transporte ou o envio durante a noite.
- Lavar lama e do solo a partir de tiras em água até tiras está limpo o suficiente que os detritos externos sementes não obscuros.
- Utilize uma tesoura para cortar um compartimento aberto de cada vez. Contagem de sementes germinadas e removê-los. Contagem sementes claramente mortos (por exemplo, em decomposição, ou sementes putrefied). Coloque as sementes não germinadas em rotulados, papel mata-borrão Petri porte molhada para distinguir ainda mais sementes não germinadas, dormentes e mortas.
- Coloque placas de Petri com não germinadassementes em um conjunto câmara de crescimento para as condições de germinação: 25 ° C dia / 10 ° C 12 horas / noite. Permitir que as sementes de uma semana para germinar. Tanto que, contá-las como viáveis, mas não germinadas, uma vez que não germinaram em condições de campo.
- Após o tratamento câmara de crescimento, ensaio remanescente sementes não germinadas para a viabilidade usando cloreto de tetrazólio (TZ) 13. Para conseguir isso, tornar-se uma solução por cento dos TZ adequado para a espécie de estudo usando o AOSA tetrazólio Testing Handbook 14. Para este exemplo, uma solução a 1% é utilizado.
- Corte as sementes não germinadas ao meio e coloque uma metade foram o embrião e endosperma são visíveis em uma placa de Petri contendo solução de TZ suficiente para cobrir a semente (sementes podem flutuar, isso é bom).
- Coloque pratos de Petri em TZ uma incubadora a 30 ° C e esperar 3 h. Nota: As temperaturas mais elevadas irão resultar numa reacção mais rápida, se desejado, mas overstaining é um risco.
<li> retirar os pratos de Petri da incubadora e avaliar. Sementes que manchados de vermelho em seus embriões são germinable, enquanto que as sementes não coradas estão mortos. Consulte o AOSA tetrazólio Testing Handbook para obter mais detalhes sobre os casos marginais distintivas e determinadas espécies.
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Representative Results
Tipos cruzadas com variada percentual de parentesco e cultura alelo materno (Tabela 1) diferiu através datas de remoção em percentagem germinadas, não germinadas, e semente morta (Fig. 2 e 3). Usando testes TZ das sementes não germinadas, encontramos algumas sementes verdadeiramente dormentes na segunda remoção (início da primavera) (Tabela 2), enquanto que todas as sementes não germinadas pela terceira remoção (primavera) foram encontrados para ser verdadeiramente dormente.
Em geral, mais baixas percentagens de alelos colheita reduzida germinação maladaptive no final do outono (Fig. 2). Na remoção no início da primavera, todos os tipos cruz teve alta germinação, mas diferem na sua proporção mortos e não germinadas (Fig. 3). Em particular, os tipos cruzadas com filiação materna culturas apresentaram maior mortalidade materna, enquanto tipos cruz selvagens eram mais propensos a permanecer não germinadas. Na primavera,germinação diminuiu para alguns tipos cruzadas. Embora contra-intuitivo, este é provavelmente devido a mortalidade das sementes dentro das faixas de sepultamento para germinar no início tipos cruzadas. Por conseguinte, a mortalidade foi mais alta para mais tipos de culturas cruzadas-like (ou seja, aqueles com percentagens de alelos maior colheita), produzido pelos pais maternos culturas (Fig. 3)
Figura 2. A germinação na primeira remoção no final do outono. Germinação de sementes de girassol tipos transversais de culturas-selvagem na primeira data de remoção, no final do outono. tipos transversais estão organizados no eixo y, aumentando as percentagens de alelos de culturas como marcado. pai materno é o primeiro da lista para cada tipo de cruz. Germinação meios mínimos quadrados (com barras SE) seguidos pela mesma letra não são significativamente diferentes usando um ajuste de Tukey-Kramer para comparações múltiplas. Figura foi publicado anteriormente em: Pace, et al. (2015) 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Percentagem germinada, não germinadas, e mortalidade para a segunda remoção (início da primavera) e em terceiro lugar a remoção (primavera). Percent germinadas para o início da primavera (A), mola (B), a percentagem não germinadas para o início da primavera (C), Primavera ( D), e por cento morto durante o início da primavera (e) e as datas de remoção de mola (F). tipos de culturas híbridas cruzadas-selvagem de girassol são organizadas por percentagens crescentes de alelos de culturas, com o máximo de culturas semelhantes na parte superior do eixo y e a mais selvagem como na parte inferior do eixo y. pai maternal tipo cruzado é listado primeiro. mínimos quadradosmeios para sementes germinadas, não germinadas e mortos (com o SE bares), seguida pela mesma letra não são significativamente diferentes usando um ajuste de Tukey-Kramer para comparações múltiplas. Figura foi publicado anteriormente em: Pace, et al (2015) 15.. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| tipo cruzado | TZ Dormant | Erro padrão |
| WXW | 0,071 | 0,0131 |
| WxBC | 0,041 | 0,0126 |
| WxF1 | 0,089 | 0,0136 |
| WxF2 | 0,054 | 0,0126 |
| F1xW | 0 | 0,0126 |
| F1xBC | 0,013 | 0,0126 |
| WXC | 0,075 | 0,0131 |
| F1xF1 | 0,007 | 0,0126 |
| F1xF2 | 0,013 | 0,0126 |
| CXW | 0 | 0,0126 |
| CxBC | 0 | 0,0126 |
| F1xC | 0 | 0,0126 |
| CxF1 | 0 | 0,0126 |
| CxF2 | 0 | 0,0126 |
| CXC | 0 | 0,0126 |
Tabela 2. As sementes que possam contribuir para um banco de sementes persistente. Mínimos significam para o cento fração dormente de sementes não germinadas na segunda (início da primavera) remoção. As sementes foram determinados para ser viável utilizando tetrazólio cloroide após incubação em condições favoráveis de germinação. Tabela foi publicado anteriormente em: Pace, et al (2015) 15..
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Discussion
Aqui nós apresentamos métodos para usar tiras de enterro de sementes para observar a germinação das sementes, dormência e mortalidade de diversos stocks de sementes em períodos de tempo pré-selecionados no campo. As vantagens da utilização de tiras, em vez de pacotes individuais se encontram em (1) a velocidade da tira e a construção do compartimento sobre a criação de pacotes individuais; e (2) a facilidade e a velocidade de remoção de vários compartimentos em um movimento sem o perigo de omitir um pacote ou removendo uma forma não intencional. Como duas das datas de remoção, no exemplo aqui apresentados foram durante os meses de inverno, quando o solo é duro e condições de campo são frios, este método reduz o trabalho e o potencial de erro humano. tiras de sementes também ajuda logística experimentais, permitindo que os investigadores a randomizar locais compartimentados no laboratório de um modo que não pode ser alterada por erro humano no campo. Através da seleção de tempos de remoção que englobava a amplitude dos tempos de germinação naturais previstos estávamoscapaz de fazer inferências sobre o banco de sementes dinâmica em nosso exemplo o potencial de sementes híbridas de persistir no banco de sementes e contribuir para as populações futuras. Uma limitação deste método é que alguma migração de semente entre os compartimentos pode ser inevitável, dependendo do tamanho da semente. Por esta razão, (e tal como constam do protocolo), é importante que os investigadores verifique as altas selos de cola de temperatura entre os compartimentos para minimizar a migração de sementes.
Alguns problemas com experimentos de enterro de sementes pode ser evitado pelo pensamento astutamente questão de tempo. Seleccione datas de sepultamento e remoção em momentos relevantes para os ciclos naturais da espécie de estudo e os objetivos do estudo. É melhor plantar, logo após a semente natural derramou possível. Datas de saída devem ser selecionados com base na observação do tempo de emergência de plântulas de pico para avaliação do comportamento normal de germinação; a adição de datas anteriores, também permite que os pesquisadores para capturar germinação precoce. Because nosso trabalho anterior tinha indicado que alguns germinação maladaptive estava ocorrendo devido à completa falta de dormência em alguns tipos de cruz, foi selecionada uma data de remoção muito precoce apenas algumas semanas após o enterro (remoção 1, final do outono) 15, 16.
A vantagem de tiras mais pacotes individuais é que uma dúzia ou mais compartimentos podem ser enterrados, removidos e avaliados como um, permitindo desenhos experimentais complexos envolvendo tudo, desde várias datas de remoção para irrigação ou tratamentos de nutrientes. Os investigadores devem ter o cuidado de construir blocos que permitem que os tratamentos que estão mais preocupados com a compreensão de ser o principal efeito. Nosso exemplo enfatizou o comportamento de sementes ao longo do tempo, mas outros tratamentos podem aplicada que exigiria a consideração de layout de campo e replicar arranjo dentro de blocos durante a fase de delineamento experimental. Ao atribuir aleatoriamente posição enterro tira dentro de blocos, o tempo de remoção pode ser analisada como o principal efeito.
<p class = "jove_content"> Após a remoção das tiras de sementes, preparar uma pilha pré-rotulados de papel mata-borrão Petri de tamanho para toda a faixa antes da avaliação começa reduz erro humano. Do mesmo modo, a abertura e avaliar um único compartimento de cada vez ajuda a manter a precisão. Ao colocar sementes não germinadas para as câmaras de crescimento, certifique-se que as temperaturas diurnas e nocturnas corresponder condições de germinação de sementes ideais para as espécies de estudo. Embora as condições de germinação (25 ° C / 10 ° C 12 horas dia / noite) pode ser adequado para uma ampla variedade de espécies, este não é o caso para todas as espécies.Consideram que a aplicação de tratamento TZ e avaliação dos padrões de coloração de sementes influencia fortemente resultado do estudo. Ao avaliar as sementes não germinadas após o tratamento câmara de crescimento, consultar a literatura (ou o AOSA tetrazólio Testing Handbook 14) para a concentração correta de TZ para uma dada espécie. Enquanto a julgar indivíduo TZ manchado seeds, é importante lembrar a diferença entre a viabilidade das sementes e a capacidade de uma semente germine-fracamente sementes manchadas pode indicar respiring tecidos, o que pode não ser capaz de emergir do solo e produzir uma muda. Dito isto, realmente sementes dormentes são aqueles que permanecem não germinadas em condições de germinação ideais, mas quando testado ainda são fortemente viável. Estas sementes são as únicas sementes que possam contribuir para um banco de sementes persistente e germinam em anos futuros.
Um número de aplicações para esses métodos são possíveis para além daqueles descritos aqui. tiras de enterro de sementes pode ser personalizado para praticamente qualquer número de unidades experimentais e modelos experimentais. Eles podem ser aplicados para comparar espécies diferentes tamanhos, semente, ou condições / tratamentos. Com base nestes métodos tem o potencial para aprofundar o conhecimento da biologia sementes de base de muitas espécies em um contexto ecologicamente relevantes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small coin envelopes | Any | ||
| Large coin envelopes | Any | ||
| fine meshed polyester mosquito netting | Any | ||
| high-temperature glue gun | Any | ||
| high-temperature glue stick refills | Any | ||
| Industrial permenant markers | Any | ||
| plastic garden labels | Any | ||
| scissors | Any | ||
| Shovel | Any | ||
| Metal mesh hardward cloth | Any | ||
| Surveyor's flags, multiple colors | Any | ||
| Wet newspaper | Any | ||
| cooler | Any | ||
| blotter paper | Any | ||
| petri dishes | Any | ||
| Temp. controlled growth chamber | Any | ||
| razor blades | Any | ||
| Petri dishes | Any | ||
| Tetrazolium chloride | Any | ||
| water | Any | ||
| heat incubator | Any |
References
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