La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em> En Vivo</em> El uso de un ensayo basado en citometría de flujo
Summary
fagocitosis microglial es crítica para el mantenimiento de la homeostasis del tejido e inadecuada función fagocítica se ha implicado en la patología. Sin embargo, la evaluación de la función de la microglia in vivo es un desafío técnico. Hemos desarrollado una técnica sencilla pero robusto para el seguimiento y cuantificar el potencial fagocítica de microglia en un entorno fisiológico con precisión.
Abstract
Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer’s and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.
Introduction
El objetivo general de este método consiste en evaluar y cuantificar la fagocitosis microglial vivo con precisión. La microglía son los macrófagos residentes tejido del sistema nervioso central (SNC). Se realizan una variedad de funciones para asegurar el mantenimiento de la homeostasis del tejido. Estos incluyen la vigilancia inmunológica, la secreción de factores neurotróficos y, de importancia fundamental, la fagocitosis 1. Fagocitosis microglial es clave en varios eventos importantes durante el desarrollo del cerebro y la retina, tales como fagocitosis de las sinapsis irrelevantes (poda sináptica) y la eliminación de las neuronas apoptóticas 2-4. Además, la fagocitosis microglial de las neuronas dañadas o apoptóticos, restos celulares, y los microbios invasores se ha demostrado ser esencial para el mantenimiento de la homeostasis del SNC a través de la edad adulta 5. Por último, la fagocitosis microglial ha sido implicado en la patogénesis de varias enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y relacionados con la edaddegeneración macular, donde se ha sugerido que la capacidad de fagocitosis defectuosa o insuficiente puede contribuir a la acumulación de amiloide-beta placas (Aß) y drusas, respectivamente 6,7.
función Microglial está estrechamente regulada por su microentorno, en particular por factores solubles, tales como el factor de crecimiento del tumor interacciones célula-célula o β. Las neuronas expresan constitutivamente varios ligandos de la superficie celular, tales como CD200 y CX3CL1, mientras microglia exclusivamente expresan los respectivos receptores CD200R y CX3CR1. Estos receptores contienen inmunorreceptoras motivos de inhibición basado en tirosina (ITIM) en su porción intracelular. Estos inhibidor de los receptores son críticas para la prevención de la estimulación más de microglia, que puede contribuir a la neuroinflamación. Por lo tanto, en condiciones fisiológicas normales, las interacciones célula-célula entre las neuronas y la microglia mantienen microglia en un estado de reposo. Durante la lesión tisular, sin embargo, las neuronas pueden regular a la baja expresión de estos ligandos, la eliminación de su efecto inhibidor sobre la activación de la microglia. Función microglial (incluyendo la fagocitosis) está por lo tanto estrechamente vinculada a su microambiente 8. Sin embargo, hasta la fecha, no hay ensayos estandarizados para estudiar la fagocitosis microglia en un contexto fisiológico o de una manera que se replica completamente su microambiente del SNC.
Varios ensayos han sido desarrollados para medir la actividad fagocítica de microglia in vitro, donde microglia primarias o líneas de células de microglia se cultivan con las células diana (por ejemplo, neuronas apoptóticas) o perlas marcadas fluorescentemente. Captación objetivo es evaluada mediante microscopía de imágenes fluorescentes o citometría de flujo 9-12. Estos ensayos permiten realizar pruebas de cómo la manipulación farmacológica o genética puede afectar a la fagocitosis microglial y, mientras informativa, no logran replicar completamente el complejo entorno en vivo. Los métodos indirectos para el examen de la fagocitosis microglialin vivo se han reportado: estos se llevan a cabo por tinción de las moléculas se cree que participan en la fagocitosis (por ejemplo, CD68), la evaluación de la proximidad física de la microglía y los objetivos para la fagocitosis (por ejemplo, neuronas comprometidas o elementos sinápticas), o por detección inmunohistoquímica de fagocítica los objetivos dentro de las células microgliales (por ejemplo, Aß) 13-17. Dos estudios han utilizado métodos más directos para evaluar la fagocitosis microglia in vivo. Hughes y sus colegas han utilizado técnicas de imagen para determinar el consumo de microglial de cuentas entregadas por vía intracraneal 18. Sierra et al. Desarrolló un método perfeccionado para evaluar cuantitativamente la fagocitosis de las células apoptóticas microglia utilizando técnicas de imagen complejas 4. Sin embargo, estos métodos implican protocolos complicados para la preparación del tejido, seccionamiento, proyección de imagen, y el análisis. Hemos utilizado anteriormente análisis de citometría de flujo para evaluar la fagocitosis de los fotorreceptores a caboer segmentos de células de la retina epitelio pigmentario (RPE) en cultivo 19. A continuación, se describe un protocolo para evaluar rápidamente la captación de partículas marcadas con fluorescencia por la microglía de la retina como una medida cuantitativa de la fagocitosis in vivo microglia.
El protocolo se describe aquí permite una medición fiable y cuantitativa de la fagocitosis microglial de la retina en poco menos de seis horas en tres pasos fundamentales: (1) la entrega intravítrea de partículas marcadas con fluorescencia, (2) la cosecha y preparación de tejido de la retina, y (3) el flujo de análisis de citometría. El método que hemos desarrollado es un método robusto para evaluar la fagocitosis microglial en la retina, y puede ser utilizado con éxito para probar cómo varios compuestos o manipulación genética alteran esta función microglial clave en la configuración fisiológicas. Como un área especializada del sistema nervioso central, la retina es un modelo de sistema de fácil acceso para estudiar la función de la microglia 20. Si bien este método fue desarrollado en tque ojo, creemos que puede ser útil para todos los neurólogos que investigan la función microglía fagocítica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay tres pasos críticos en este método: (1) la inyección intravítrea de partículas marcadas con fluorescencia; (2) la recolección y preparación de tejido de la retina; y (3) análisis citométrico de flujo. Recomendamos que los investigadores practican inyecciones intravítreas antes de realizar el método que aquí presentamos. Ratones albinos (por ejemplo, BALB / c) y una solución de color (por ejemplo, partículas marcadas con fluorescencia) pueden ser utilizados para una fácil visualizaci?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 – 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
- Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
- Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
- Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
- Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
- Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
- Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
- Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
- Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
- Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
- Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
- Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
- Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
- Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
- abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
- Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
- O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
- Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).
