Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

כלים כדי ללמוד את התפקיד של HMGB1 חלבון אדריכלי בעיבוד בסילוף Helix, DNA ספציפיים באתר Interstrand Crosslinks

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54678
Automatic Translation
1, 1
1Division of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, The University of Texas at Austin

Abstract

קבוצת תיבת 1 ניידות גבוהה (HMGB1) חלבון הוא חלבון אדריכלי הלא היסטון כי הוא מעורב בויסות תפקידים חשובים רבים בגנום, כגון שעתוק, שכפול הדנ"א, ותיקון דנ"א. HMGB1 נקשר מעוות מבחינה מבנית DNA עם זיקה חזקה יותר מאשר ב-דנ"א הקנונית. לדוגמה, מצאנו כי HMGB1 נקשר ל- DNA interstrand crosslinks (ICLs), אשר קוולנטית לקשר בין שני גדילי הדנ"א, לגרום לעיוות של הסליל, וכל עוד יוסיפו מתוקנות יכול לגרום מוות של תאים. בשל הפוטנציאל ציטוטוקסיות שלהם, כמה סוכנים וישכנע כיל משמשים כיום תרופות כימותרפיות במרפאה. בעוד יוצרי כיל סוכנים להראות העדפות עבור רצפים בסיס מסוים (למשל, 5'-TA-3 "הוא האתר crosslinking המועדף psoralen), הם בעיקר לגרום נזק לדנ"א באופן בלתי מבוקר. עם זאת, על ידי קוולנטית צימוד הסוכן וישכנע כיל על oligonucleotide יוצרי טריפלקס (TFO), אשר נקשר ל- DNA בתוך ספציפי ברצףבאופן, נזק לדנ"א ממוקד יכולה להיות מושגת. כאן, אנו משתמשים TFO מצומדות קוולנטית על 'קץ 4'-hydroxymethyl-4,5' 5, 8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen ליצור כיל אתר ספציפי על פלסמיד מוטציה-הכתב להשתמש ככלי ללמוד את שינוי, עיבוד, ותיקון אדריכלי של נגעים DNA מורכב על ידי HMGB1 בתאים אנושיים. אנו מתארים טכניקות ניסוי להכין ICLs TFO-מכוון על פלסמידים כתב, וכדי לחקור את הקשר בין HMGB1 עם ICLs המכוונת TFO בהקשר הסלולר באמצעות מבחני immunoprecipitation הכרומטין. בנוסף, אנו מתארים מבחני supercoiling DNA להעריך שינוי אדריכלי מסוים של דנ"א פגום על ידי מדידת כמות פניות superhelical הציג על פלסמיד psoralen-crosslinked ידי HMGB1. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי לחקור את התפקידים של חלבונים אחרים המעורבים בעיבוד ותיקון ICLs TFO מכוונת או נזק לדנ"א ממוקדים אחרים בכל שורת תאים של עניין.

Introduction

טריפלקס יוצרי oligonucleotides (TFOs) לאגד דופלקס DNA בצורה רצף ספציפי באמצעות מליטה מימן Hoogsteen ליצירת מבנים משולשת הסליל 1-5. הטכנולוגיה טריפלקס נעשה שימוש כדי לחקור מגוון של מנגנונים biomolecular, כגון שעתוק, תיקון נזק DNA, גן מיקוד (הנסקרת ב אזכור 6-8). TFOs נעשה שימוש נרחב כדי לגרום נזק לאתר ספציפי על פלסמידים כתב 9,10. המעבדה שלנו ואחרים השתמשו בעבר TFO, AG30, קשור מולקולה psoralen לגרום crosslinks interstrand DNA ספציפיים לאתר (ICLs) בגן supF על פלסמיד pSupFG1 5,10-12. ICLs הם ציטוטוקסיים מאוד כשהפצעים קוולנטית crosslink שני גדילי דנ"א, וכל עוד יוסיף מתוקן, יכול לחסום שעתוק גנים ומסכל מכונות שכפול הדנ"א 13,14. בגלל הפוטנציאל ציטוטוקסיות שלהם, סוכנים וישכנע כיל שימשו תרופות כימותרפיות לטיפולשל סרטן ומחלות אחרות 15. עם זאת, העיבוד ותיקון ICLs בתאים אנושיים אינו מובן היטב. לפיכך, הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים בעיבוד של ICLs בתאים אנושיים עשוי לעזור לשפר את היעילות של משטרי כימותרפיות מבוססי כיל. TFO-induced ICLs ביניים תיקון שלהם יש פוטנציאל לגרום לעיוותים מבניים משמעותיים סליל הדנ"א. עיוותים כאלה הן מטרות סבירות עבור חלבונים אדריכליים, אשר נקשרים ל- DNA המעוותת עם זיקה חזקה יותר מאשר ה- DNA דופלקס B-צורה הקנונית 16-20. הנה, למדנו את שיוכה של חלבון אדריכלי בהיקף הנרחב ביותר, HMGB1 עם ICLs בתאים אנושיים באמצעות immunoprecipitation הכרומטין (שבב) מבחנים על פלסמידים-crosslinked psoralen וזיהיתי לחיקוי עבור HMGB1 בויסות את הטופולוגיה של DNA פלסמיד-crosslinked psoralen ב אנושי lysates תאים סרטניים.

HMGB1 הוא שופע מאוד בכל מקום בגוף לידי ביטוי שאינו שלוהטון חלבון אדריכלי הנקשרת דנ"א פגום מצעים DNA מובנים לחילופין עם זיקה חזקה יותר מאשר DNA B-הצורה הקנונית 17-20. HMGB1 מעורב בתהליכים מטבוליים כמה DNA, כגון שעתוק, שכפול הדנ"א, תיקון דנ"א 16,21-23. אנחנו הוכחנו בעבר כי HMGB1 נקשר TFO המכוונת ICLs במבחנה עם זיקה גבוהה 20. יתר על כן, אנו הוכחנו כי חוסר HMGB1 הגדיל את עיבוד מוטגנים של ICLs TFO-ביים HMGB1 מזוהה תיקון כריתת נוקלאוטיד (NER) שיתוף גורם 23,24. לאחרונה, מצאנו כי HMGB1 קשור TFO המכוונת ICLs בתאים אנושיים והגיוס שלה נגעים כאלה תלוי חלבון NER, XPA 16. Supercoiling השלילי של DNA הוכח לקדם את ההסרה היעילה של נגעי DNA על ידי נר 25, ומצאנו כי HMGB1 גורם supercoiling השלילי מועדף על יציקה המכילה כיל מכוון TFOמצעים באמצע (יחסית מצעים פלסמידים שאינם פגומים) 16, מתן הבנה טובה יותר של פוטנציאל התפקיד (ים) של HMGB1 בתור גורם שיתוף NER. העיבוד של ICLs לא מובן לחלוטין בתאים אנושיים; וכך, טכניקות המבחנים שהפותחים מבוססות על הכלים המולקולריים המתוארים כאן יכולים להביא לזיהויו של חלבונים נוספים המעורבים תיקון כיל, אשר בתורו עשוי לשמש מטרות תרופתיות כפי שאפשר לנצל כדי לשפר את היעילות של כימותרפיה לסרטן.

הנה, גישה יעילה כדי להעריך את היעילות של היווצרות כיל TFO מכוונת ב- DNA פלסמיד על ידי denaturing ג'ל אלקטרופורזה agarose נדונה. יתר על כן, באמצעות פלסמידים המכילים את ICLs TFO-המכוון, טכניקות כדי לקבוע את הקשר של HMGB1 עם פלסמידים פגועים כיל בהקשר הסלולר באמצעות מבחני שבב שונים תואר. בנוסף, שיטה קלילה ללמוד שינויי טופולוגי הציגו ידי הדואר אדריכלי חלבון HMGB1, במיוחד על מצעים פלסמיד פגועי כיל lysates התא האנושי נקבע על ידי ביצוע מבחני supercoiling באמצעות דו מימדי ג'ל אלקטרופורזה agarose. הטכניקות המתוארות ניתן להשתמש כדי לקדם את ההבנה של המעורבות של תיקון דנ"א וחלבונים אדריכליים בעיבוד של ניזק לדנ"א ממוקד על פלסמידים בתאים אנושיים.

אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים להקמת ICLs psoralen אתר ספציפי TFO-מכוון על פלסמיד דנ"א, וצ'יפ פלסמיד עתידי supercoiling מבחני לזהות חלבונים מקשרים עם הנגעים, וחלבונים אשר משנים את הטופולוגיה DNA, בהתאמה. מבחנים אלה יכולים להיות שונים כדי לבצע עם סוכנים מזיקים אחרים לדנ"א, TFOs, מצעים פלסמיד, שורות תאים יונקות עניין. למעשה, הראינו כי יש לפחות פוטנציאל אחד זיקה ייחודית גבוהה TFO מחייב אתר בתוך מכל גן מבואר בגנום האנושי 26. אֵיךפעם, לבהירות תיארנו טכניקות אלה לשימושם של psoralen מצומדות TFO ספציפיים (pAG30) על פלסמיד מוטציה-עיתונאי ספציפי (pSupFG1) בתאים אנושיים U2OS כפי שכבר מנוצל מוקהרג'י & ואסקז 2016 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת ICLs מכוונת TFO על מצעים פלסמיד

  1. דגירה כמויות equimolar של pSupFG1 פלסמיד 10,11 DNA (DNA פלסמיד 5 מיקרוגרם הוא נקודת התחלה טובה) עם psoralen מצומדות TFO AG30 ב 8 μl של חיץ מחייב טריפלקס [גליצרול 50%, 10 מ"מ טריס (pH 7.6), 10 מ"מ MgCl 2] ו dH 2 O לנפח סופי של 40 μl בצינור ענבר. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירת התגובה על אמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות.
  2. לחמם את מנורת UVA כדי להבטיח פלט מלוא העוצמה. מניח את התגובה טריפלקס על סרט פרפין, ומניח את סרט פרפין על קרח תחת מנורת UVA (365 ננומטר). מקום מסנן מיילר בין מנורת התגובה.
  3. UVA מקרין על מינון כולל של 1.8 J / cm 2. אחסן את הדגימות ב 4 ° C לשימוש נוסף.
    זהירות: תלבש משקפי מגן נאותים ובגדים עם הקרנת UVA.
  4. Linearize 200 ננוגרם של פלסמיד מוכן לעיל עם מחדשאנזים הִצָרוּת R1 אקו בהיקף כולל 20 μl באמצעות היצרן סיפק חיץ 10x. חום לפגל האנזים במשך 20 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. ספין את הדגימות למשך 10 דקות ב XG 10,000 ולאחסן ב 4 ° C..
  5. כן 50x חיץ אלקליין [1.5 M NaOH, 50 חומצת המ"מ Ethylenediaminetetraacetic (EDTA)]. הוסף 0.5 מ"ג של agarose 50 מ"ל DH 2 O. מרתיחים לפזר את agarose ולמקם אותו באמבט מים C ° 50.
  6. לאחר הטמפרטורה של agarose מומס הוא עד 50 מעלות צלזיוס, להוסיף 1 מ"ל של חיץ 50x אלקליין, לערבב אותו ואז לשפוך את הג'ל לתוך מגש ג'ל. לאפשר זמן הג'ל לחזק בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  7. הוסף 4 μl של 0.5 מ 'EDTA אל 20 μl של דגימת DNA לינארית דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. הוסף חוצץ טעינת ג'ל אלקליין 6x (300 מ"מ NaOH, 6 מ"מ EDTA, 18% (w / v) פוליסכריד משקל מולקולרי גבוה, 0.06% Bromocresol הירוק ב DH 2 O) על דגימות וכדי סולם DNA 1 kb.
    הערה: חשוב להשתמש חיץ טעינת ג'ל 6x אלקליין, אנא ראה דיון.
  9. דגימות טענו על ג'ל בחדר הקר ולהפעיל לילה חיץ אלקליין 1x (12-16 שעות) בשעה 3.2 וולט לסנטימטר. לאחר דגימות נכנסו ג'ל, מניחים צלחת זכוכית על גבי ג'ל כדי למנוע ממנה צף.
  10. לנטרל את דגימות על ידי השריית את הג'ל במאגר נטרול [1 M טריס-Cl (pH 7.6), 1.5 M NaCl, 3 נתרן אצטט M (pH 5.2)] במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. הכתם ג'ל עבור DNA עם 4 μl של ברומיד ethidium 1% (EtBr) ב 50 מ"ל מים עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. Destain עם מים במשך 15 דקות. דמיינו את ה- DNA באמצעות מערכת הדמיה.
    זהירות: EtBr הוא mutagen חזק והוא יכול להיספג דרך העור. יש להימנע ממגע ישיר עם EtBr.

2. Transfection ו- Immunoprecipitation של מכוונת TFO כיל מוצרים המכילים פלסמידים בתאים אנושיים

  1. פלייט 400,000 בתאי יונקים (למשל, U2OS oתאי steosarcoma) לכל 60 צלחת מ"מ הבינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עובר (FBS) ללא אנטיביוטיקה 24 שעות לפני transfection. תאים דגירה לילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2.
  2. לפני transfection, תקשורת צמיחה חמה בופר פוספט (PBS) עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. מומלץ לחמם את מגיב transfection לטמפרטורת החדר.
  3. דגירת 30 μl של מגיב transfection עם 500 μl של תקשורת צמיחת 1x (תערובת 1) ו -2 מיקרוגרם של פלסמידים TFO מכוונות המכיל כיל 500 μl של תקשורת צמיחת 1x (תערובת 2) צינורות תחתיים עגול 14 מיליליטר נפרד עבור 10 דקות ב טמפרטורת חדר.
  4. להוסיף תערובת 1 לערבב 2, ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה של 25-30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. שטוף תאים פעמים עם PBS החם. מוסיף את תערובת transfection בצורת טיפה חכמה הפצה באופן שווה על פני הצלחת של תאים. הוסף 1 מ"ל של התקשורת צמיחה לצלחת ולהביא את נפח סופי 2 מ"ל. מערבבים אנחנוll. מניחים את הצלחות תרבות 37 ° C חממה עם 5% CO 2 למשך 4 שעות.
  6. החלף את המדיה עם התקשורת צמיחה 3 מ"ל בתוספת 10% FBS, דגירה נוספת עבור 16 שעות. אין להשתמש באנטיביוטיקה.
  7. פנקו את התאים עם 80 μl של פורמלדהיד טריים 37% לכל צלחת לריכוז סופי של כ 1% ו דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בהיעדר אור.
    זהירות: פורמלדהיד הוא רעיל צריך להיות מטופלים על פי הוראות הבטיחות שלה. פורמלדהיד החשיפה יכול לגרום נזק לעור, לעיניים ולדרכי הנשימה.
  8. להרוות crosslinking פורמלדהיד על ידי הוספת 300 μl של גליצין המצונן (מסופק ערכות זמינות מסחרי) לכל צלחת הדוגרים במשך 5 דקות. הסר את המדיה ולשטוף פעמיים עם PBS קר, ולאחר מכן לאסוף תאים על ידי גירוד ב 1 מ"ל צונן (4 ° C) PBS לתוך צינור microcentrifuge. שמור על דגימות קרח בכל עת.
  9. כן כדורי תא על ידי צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דק 't 13,400 XG באמצעות צנטריפוגות שולחן בקירור. Pipet את supernatant ומניח התא גלול על קרח.
  10. הומוגנית resuspend גלולה ב 1 מיליליטר צונן (4 ° C) הצפה (מסופק ערכות זמינות מסחרי) דגירה על קרח למשך 10 דקות. מערבבים מדי פעם על ידי צינור היפוך. תאים גלולים כמו קודם (ראה שלב 2.9 לעיל).
  11. הומוגנית resuspend גלולה ב 1 מ"ל צונן (4 ° C) מאגר B (מסופק ערכות זמינים מסחרית) דגירה על קרח למשך 10 דקות עם ערבוב מדי פעם על ידי היפוך. תאים גלולה ידי צנטריפוגה כמו קודם (ראה שלב 2.9 לעיל).
  12. Resuspend התאים שוב 200 μl מקורר הצפת B. הוסף 2 μl של nuclease Micrococcal (MNase) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מערבבים התגובה מדי פעם על ידי מצליף את הצינורית. עצור את התגובה MNase על ידי הנחת הצינור על הקרח והוספת 40 mM EDTA. תאים גלולים כמו קודם (ראה שלב 2.9 לעיל).
  13. תאים Resuspend ב 100 immunopr הכרומטין 1x μlחיץ ecipitation (שבב) חיץ (מסופק ערכות זמינות מסחרי) השלים עם מעכבי פרוטאז קוקטייל.
  14. מניחים את התאים resuspended בתוך שפופרת microfuge בעלי קירות דקים. Sonicate הדגימות ידי צפת אותם על sonicator באמבט מים במשך 20 שניות ואחריו 20 דגירה שנייה על קרח. sonication חוזר על שלבי 9 פעמים כדי ליצור ~ 800-1,200 שברים נ"ב.
    1. עד 20 μl של דגימות sonicated להוסיף 3 μl 5 M NaCl ו 1 μl RNase א ומערבבים היטב על ידי vortexing ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בהמשך לכך, להוסיף 2 μl proteinase K דגירה במשך שעה 2 ב 65 מעלות צלזיוס. לטהר את הדגימות באמצעות ערכת טיהור PCR. הפעל דגימות על ג'ל 1% agarose ולדמיין עם EtBr.
      הערה: עצמה המקסימלית של ה- DNA וכתוצאה מכך צריכה להיות או פחות מ -1,000 נקודות בסיס.
  15. בשלושה צינורות נפרדים, להוסיף 30 μl של lysate בתוך שפופרת siliconized מראש צוננת ולאחר מכן להוסיף 70 μl של חיץ שבב 1x המצונן עם מעכבי פרוטאז הוסיפו. הוסף 1 μגרם של אימונוגלובולינים נגד G (IgG), H3 אנטי היסטון (כביקורת חיובית), או נוגדנים נגד HMGB1 אל צינורות בהתאמה. דגירת הלילה בחדר קר עם סיבוב רציף.
  16. חרוזי החלבון G Resuspend הומוגנית בחדר הקר. הוסף 4 μl של חרוזי חלבון G לכל צינור דגירה במשך 2-4 אחר hr בחדר הקר עם סיבוב.
  17. באמצעות מתלה מגנטית, גלולת החרוזים ולהסיר את supernatant. הוסף 200 μl חיץ 1x שבב מעורבבים עם מעכבי פרוטאז קוקטייל על הגלולה ולשטוף במשך 5 דקות בחדר הקר עם סיבוב. חזור על לשטוף פעמיים.
  18. בצע אחת לשטוף נוסף עם חיץ 1x שבב מלח גבוה (המכיל 70 המ"מ NaCl).
  19. Resuspend את הכדורים עם חיץ elution 160 μl (מסופק ערכות זמינות מסחרי) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רוטציה למשך 30 דקות.
  20. גלולת החרוזים ולאסוף את supernatant בצינור טרי. הוסף 6 μl של 5 M NaCl ו -2 μl של proteinase K, ו דגירה לילה בשעה 65מעלות צלזיוס.
  21. לטהר את הדנ"א בעזרת ערכת טיהור מוצר PCR ו elute את ה- DNA באמצעות 50 μl DH 2 O.
  22. בצע PCR 16 תגובות באמצעות ערכות פריימר לאזור (ים) של עניין, ולפתור את המוצרים על ג'ל 1% agarose מוכתם EtBr.

Agarose ג'ל אלקטרופורזה 3. Assay Supercoiling ו -2 ממדי

  1. הכן חיץ סינתזה תיקון דנ"א (45 מ"מ Hepes-KOH, pH 7.8; 70 מ"מ KCl; 7.4 מ"מ MgCl 2; 0.9 מ"מ DTT; 0.4 mM EDTA; 2 מ"מ ATP, 20 מיקרומטר dNTPs, גליצרול 3.4% ו -18 אלבומין מיקרוגרם שור) . חנות ב -80 מעלות צלזיוס. הפשרה על קרח לפני השימוש להוסיף 40 phosphocreatine מ"מ ו 2.5 מיקרוגרם פוספוקינאז קריאטין.
  2. הכן 10x חיץ supercoiling [500 מ"מ טריס (pH 8.0), 500 מ"מ NaCl, 25 מ"מ 2 MgCl, 1 mM EDTA], ולאחסן בטמפרטורת החדר.
  3. Linearize 300 ננוגרם של DNA pSupFG1 פלסמיד supercoiled לחלוטין באמצעות 1 μl אני topoisomerase Vaccinia (5-15 U / μl) עם 1xחיץ supercoiling בריאקציה 10 μl. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  4. להפשיר תמצית תא ללא הלה 24 על קרח. כדי פלסמידים רגוע לחלוטין, להוסיף 25 μl הלה תא ללא לחלץ תיקון DNA חיץ סינתזה. לערבב היטב. הוסף 1 μl נוסף של Vaccinia topoisomerase שאני לתערובת, דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. לסיים את התגובות על ידי הוספת סודיום דודציל סולפט (SDS) (1% ריכוז סופי) ו proteinase K (0.25 מ"ג / הריכוז הסופי מ"ל). לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  6. עופרת ג'ל agarose 1% עם 1x טריס Borate EDTA חיץ (TBE). להוסיף צבע טעינת דנ"א לטעון את התגובות ישירות על גבי ג'ל לפחות זה מזה 4 נתיבים. הרץ את הג'ל במשך 8-10 שעות ב 2 V / ס"מ TBE 1x (מימד 1) בטמפרטורת החדר כדי לפתור את topoisomers.
    הערה: כן פתרון מניות 5x TBE ב 1 ליטר של DH 2 O על ידי הוספת 54 גרם של טריס בסיס. 27.5 גרם של החומצה הבורית 20 מ"ל של 0.5 מ 'EDTA (pH 8.0).
  7. כן 2 ליטר של 1xTBE עם 3 מיקרוגרם / מ"ל-פוספט chloroquine. משרים את הג'ל 200 מ"ל של פתרון זה עבור 20 דקות. מכסים את המגש ג'ל עם רדיד אלומיניום.
  8. כדי electrophorese הג'ל במימד השני, להפוך את הג'ל 90 ° בצורה כיוון השעון ולהפעיל אותו במשך 4-6 שעות ב 2 V / ס"מ chloroquine המכיל 1x TBE לפתור את supercoils חיוביות ושליליות.
  9. כתם ג'ל עם EtBr במשך שעה 1 על כיסא נדנדה. Destain ג'ל עם DH 2 O למשך 15 דקות ולאחר מכן לדמיין את ההפצה התרמית של topoisomers באמצעות תרמי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כינונה של כיל מכוון TFO הוא קריטי עבור המבחנים מבוססים פלסמיד, אשר משמשים כדי לחקור את התפקידים של חלבונים אדריכליים בעיבוד כיל בתאים אנושיים. Denaturing ג'ל אלקטרופורזה agarose הוא דרך קלילה כדי לקבוע את היעילות של היווצרות כיל מכוונת TFO. פלסמידים מחסה ICLs TFO מכוונת להגר עם ניידות איטי דרך מטריקס ג'ל agarose (איור 1 א ', מסלול 3) כשמשווים את פלסמידים שליטה בלתי-crosslinked (איור 1 א', מסלול 2). כימות densitometric הלהקות במסלולים 2 ו -3 (איור 1 א) מגלה כ 70% מכלל האוכלוסייה פלסמיד נודד דרך ג'ל עם ניידות האטה (מזוהה על ידי חץ שחור), המציין היווצרות כיל TFO-מכוונת על פלסמידים אלה.

מבחני immunoprecipitation הכרומטין שבוצעו על תמציות מן tr תאי U2OS האדםansfected עם פלסמיד מלאה או (P) או פלסמידים המכילים ICLs TFO-מכוונת (P-כיל) הצג העשרה של HMGB1 על האזור P-כיל לעומת באזור הביקורת (P), כאשר immunoprecipitated עם נוגדן אנטי HMGB1 (איור 2 לוח, עליון, נתיבי 2 ו -3). תוצאות אלו מצביעות כי מקורביו HMGB1 עם ICLs בתאים אנושיים. כאשר HMGB1 הידלדלה מחמת התאים באמצעות טיפול siRNA, להעשרת P-כיל ספציפי פחתה (איור 2, בפאנל העליון, נתיבים 4 ו -5), כצפוי. כשאותם הדגימות immunoprecipitated באמצעות נוגדן אנטי IgG כפקד סגולי נוגדנים, לא הגברת PCR זוהתה, כצפוי (איור 2, בפנל עליון, Lanes 6-10). Lanes 10-14 (הפאנל העליון) באיור 2 היו דגימות התשומה ששימשה לנורמליזציה. הפנל העליון מראה הגברה PCR ידי פריימרים סמוך לאתר כיל TFO-ביים הפאנל התחתון מראה הגברה PCR כאשר פריימרים דיסטלי TFO מכוונתאתר כיל ששימשו.

HMGB1 הוא חלבון אדריכלי, אשר נקשר ל- DNA המעוותת עם זיקה חזקה יותר ממה שהוא נקשר DNA ניזוק. מבחני DNA supercoiling נפתרה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose דו מימדי להפגין שינוי אדריכלי של פלסמידים כיל מוצרים המכילים TFO-מכוונת (P-כיל) לעומת שליטה פלסמידים (P) על ידי HMGB1 תמציות תא הלה (איור 3). השינוי הארכיטקטוני המושרה על ידי HMGB1 רצוי על מצעי P-כיל המכיל הוא זוהה כמו גידול supercoiling השלילית. פלסמידים supercoiled להעביר מהר דרך agarose ג'לים ביחס פלסמידים רגוע או ליניארי. חלוקת topoisomers מצביע יותר supercoiling של P-ICLs לעומת P בנוכחות HMBG1 (איור 3). שלילי supercoiled DNA פועל קשת שמאלי במימד השני בנוכחות chloroquine. Supercoiling המושרה על ידי HMGB1 על P-כילנראה מורכב ברובו topoisomers יוצרי קשת שמאלית (~ 14 topoisomers זוהו על כיל TFO המכוונת המכיל פלסמידים לעומת ~ 7 topoisomers מן הפלסמיד השליטה), המציין היווצרות supercoils השלילית. בסך הכל, נתונים אלה מראים כי פלסמידים עם ICLs המכוונת TFO יכולים לשמש ככלי ללמוד העמותה-הזיקה הגבוהה של HMGB1 החלבון האדריכלי עם נגעי DNA בתאים אנושיים באמצעות מבחני immunoprecipitation הכרומטין. בנוסף, שינויים אדריכליים ספציפיים של מצעים-כיל P ידי HMGB1 יכול גם ללמוד באמצעות מבחני supercoiling וג'ל agarose דו מימדי.

איור 1
איור 1: assay ג'ל אלקטרופורזה agarose אלקליין לכמת יעילות היווצרות כיל TFO-מכוונת על פלסמיד pSupFG1 (א) ליין 1, 1 kb הסולם DNA;. מסלול 2, plasmid pSupFG1 (P) משמש כביקורת; וליין 3, TFO מכוונת כיל מוצרים המכילים pSupFG1 (P-כיל). פלסמידים מחסה ICLs להעביר יותר לאט בתוך הג'ל כפי שמודגם מסלול 3 (מסומן בחץ שחור בצד ימין של ג'ל). (ב) כימות densitometric של להקות מסלול 2 וליין 3 עולה כי כ -70% של פלסמידים הם crosslinked. נתון זה יש הבדל בין התייחסות 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: העשרת הוכחת שבב assay של HMGB1 על האזור TFO מכוונת כיל מוצרים המכילים פלסמיד crosslinked (א). הגברת PCR של שברי immunoprecipitated הייתה resolved על ג'ל agarose 1% באמצעות סט של פריימרים הפרוקסימלי סמכו לאתר כיל מכוון TFO (B; P1 ו- P2, פנל עליון) ואת סט שני של פריימרים משמשים כביקורת ספציפית שהיו נוסף (כ -2,000) נ"ב מ כיל באתר ביים (B; P3 ו- P4, הפאנל התחתון). Lanes 2 ו -3 מצביעים העשרת HMGB1 ליד כיל מכוונת TFO (מסלול 3) ביחס ל- DNA ניזוק (מסלול 2). Lanes 4 ו -5 הם פקדים סגוליים נוגדנים באמצעות נוגדן IgG. Lanes 6 ו -7 הם דוגמאות קלט. ליין 8 הוא פקד שלילי על תגובת PCR ואינו מכיל תבנית ה- DNA. P, פלסמיד pSupFG1. P-כיל, TFO מכוונת pSupFG1 פלסמיד המכיל כיל. נתון זה יש הבדל בין התייחסות 16. (ב) תרשים סכמטי של pSupFG1 פלסמיד מראה באתרי פריימר עבור P1 ו- P2 כמו גם P3 ו- P4. אנא לחץ כאן כדי להציג vers גדוליון של נתון זה.

איור 3
איור 3: היווצרות מראה ג'ל אלקטרופורזה 2D agarose של supercoils שלילי TFO מכוונת פלסמידים כיל מוצרים המכילים, בהנחייתם של HMGB1 הג'ל agarose 1x TBE מגלה חלוקת תרמית של topoisomers שנוצר על ידי פלסמיד לבד (P) או psoralen-crosslinked. פלסמיד (P-כיל). הניידות של מיני supercoiled מושווה מהיר יותר פלסמידים הרגועים. להקה מייצגת topoisomer שונה מהלהקה להלן ויותר מאחד פחות או יותר superhelical בתורו, בהתאמה. הקשת השמאלית מייצגת supercoiled שלילי (-ve) מינים ואת הקשת הימנית מייצגת supercoiled חיובי (+ ve) מינים. אוכלוסיית פלסמיד psoralen כיל מוצרים המכילים (P-כיל) מכיל יותר supercoiled מינים מאשר פלסמידים הביקורת (P). R, פלסמידים רגוע; פלסמידים S, supercoiled; 1D,המימד הראשון של ג'ל אלקטרופורזה; 2D, הממד השני של ג'ל אלקטרופורזה. נתון זה יש הבדל בין 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההיווצרות היעילה של ICLs TFO המכוונת תלויה בשני גורמים מכריעים: ראשית, רכיבי חיץ נכון (למשל, MgCl 2) וזמן דגירה של TFO עם מצע DNA היעד שלה (תלוי הזיקה המחייבת של TFO למטרתה דופלקס, ועל ריכוזי בשימוש); ושנית, את המינון הנכון של UVA (365 ננומטר) הקרנה לגבש crosslinks psoralen ביעילות. היווצרות טריפלקס אופטימלית יכולה להיות מושגת על ידי שימוש TFOs מטוהר HPLC או ג'ל. זיהומי זיהום TFO עלולים להוביל מוצרי crosslinked לא רצויים, אשר עוד יכול לסבך את התוצאה הניסיונית. כדי להגביר את היציבות של TFOs המצורפת קוולנטית אל psoralen 5'-HMT, את TFOs צריך להיות מאוחסן aliquots ב -80 ° C, כמו הפשרת הקפאה מרובה של TFOs עלולה לגרום שפלה של oligonucleotides. לאחר היווצרות טריפלקס למקד את psoralen לאתר מסוים (למשל, 5'-TA-3 '5'-AT-3 "הם מראשpsoralen ferred crosslinking אתרים), היווצרות כיל psoralen דורש הקרנה עם UVA. מינון של 1.8 J / cm 2 UVA מספיק ליצירה אופטימלית של ICLs על פלסמידים במבחנה. זמן החשיפה צריך להיקבע באמצעות פוטומטר. בהתאם למקור מנורת UVA, בנוסף פולטת UV ב 365 ננומטר, המנורה עשויה גם פולטים באורכי גל קצרים יותר, דבר שעלול להוביל להיווצרות נזק לדנ"א מכוונות לאורך עמוד השדרה DNA. מכיוון פלסמידים כיל מוצרים המכילים TFO המכוון ישמשו ללימודים הקשורים תיקון DNA של כיל ב אתר ספציפי, photoproducts המכוונת כזו עשויה לבלבל את תוצאות מחקרי תיקון DNA. לכן, מסנן מיילר צריך לשמש כדי למנוע חשיפה של דגימות לאורכי גל קצרים יותר. היווצרות כיל מוצלח תלוי גם על יציבות המבנה טריפלקס במהלך הקרנת UVA. השעה של קרינת UV נדרשת תלויה בהספק של מקור UVA. במקרה שלנו, 20-30 דקות נדרשו ליצור הדואר רצוי מנה של UVA. במהלך תקופה זו, החום שנוצר על ידי המנורה עשויה לגרום לאובדן מים באידוי ממדגמים. אובדן מים כאלה עשויים לשנות את ריכוז חיץ ועלול לגרום היציבות של מבנים טריפלקס. צבת התגובות על קרח במהלך הקרנת UVA תעזור כדי למנוע אידוי של הדגימות.

על מנת לקבוע את היעילות של היווצרות psoralen crosslink על מצעים פלסמיד, דגימות נפתרו ב 1% ג'ל agarose אלקליין (איור 1). רוב הפרוטוקולים עבור ג'ל אלקטרופורזה אלקליין מציעים לצבוע טעינת ג'ל 2x אלקליין, למרות פרוטוקולים מראים כי צבע טעינת אלקליין אין צורך, כתנאי חיץ denaturing של הג'ל הוא מספיק לפגל דגימות. בעוד צבע 2x עובד היטב עם דגימות DNA מרוכזות, פרוטוקול זה דורש טעינת נפח דגימה גדולה. לכן, השתמש צבע טעינת ג'ל אלקליין 6x. כדי להבטיח denaturation התקין של psoralen crosslinked plמצעי asmid, דגירת הדגימות למאגר הטעינה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. בנוסף, Mg 2+ יכולים להיווצר Mg (OH) 2 בתנאים אלקליין, אשר entraps ה- DNA ויכול לגרום לו לזרז. מאגר תגובת יוצרי טריפלקס מכיל Mg 2+, ולכן חשוב דגירת הדגימות עם EDTA כדי להבטיח כי Mg 2+ הוא chelated לפני הוספת צבע טעינת אלקליין על הדגימות. לאחר אלקטרופורזה, חשוב לנטרל את הג'ל, כמו EtBr לא intercalate עם DNA בתנאים אלקליין.

גישה חלופית כדי להעריך את היעילות של היווצרות crosslink המכוונת TFO היא השימוש denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide, אך טכניקה זו היא יותר מייגעת, ודורשת עיכול הגבלה של פלסמידים ואחריו תיוג איזוטופ רדיואקטיבי של הקרעים. הגישה הנוכחית זה מדגים שיטה יעילה פשוטה יחסית, עדיין לא דetermine את היעילות של היווצרות כיל TFO-מכוונת על מצעים פלסמיד. עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מנת להעריך את היווצרות ICLs ידי סוכני crosslink יוצרי אחרים גם כן.

התוצאה המוצלחת של assay שבב פלסמיד תלוי במספר גורמים. השלבים הקריטיים בתוך הצעות פרוטוקול ופתרון בעיות נדונות כאן. צעדים קריטיים מעורב assay זה, כוללים crosslinking פורמלדהיד, עיכול nuclease micrococcal, sonication, שטיפות מדגם, והיפוך של crosslinks חלבון-דנ"א פורמלדהיד בדגימות. עבור crosslinking חלבון-דנ"א היעיל, חשוב להשתמש פורמלדהיד טרי. מאגר בקבוקי 37% פורמלדהיד לא אמור לשמש במשך יותר משישה חודשים לאחר פתיחה, כמו חשיפה לאור ולחמצן מדרדר פורמלדהיד. לכן, הוא גם מועיל כדי לבצע את crosslinking פורמלדהיד ללא אור ב למכסה המנוע תרבית תאים. צעד חשוב נוסף הוא nuclease micrococcal (MNase) digestion של הדגימות. עיכול MNase לא ודבק רק הדנ"א הגנומי לרסיסים קטנים אלא גם מסיר את כל פלסמידים, שחששו כי לא נמסרו לתוך התאים במהלך שיטת transfection, אשר יכול להפחית את הרקע באופן דראמטי. זמן הדגירה של עיכול MNase צריך להיקבע באופן אמפירי. עיכול ארוך יותר עלול לגרום לאובדן של דגימות, ואילו תקופות דגירה קצרות עשויות להוביל להסרה יעילה של DNA לא רצוי. תוצאות מצוינות ניתן לראות לאחר 10 דקות דגירה בטמפרטורת חדר עם ערבוב מדי פעם מהתגובות ידי היפוך הצינורות. עבור immunoprecipitation ביותר, ה- DNA צריך להיות מקוטע לגדלים בין 800-1,200 נ"ב. מידור של דנ"א יכול להיות מושגת על ידי sonication היסודית של הדגימות. sonication היעיל של דגימות יכול להיות מושגת על ידי מחדש השעיית כדורי צינורות דקי דופן PCR ובהמשך הציב sonicator באמבט מים. פולסים סוניק יעילים יותר בהשוואת sonication הרציף. בשנת additיון, חשוב למקם את דגימות קרח בין פולסים כדי למנוע פירוק חלבונים, וזה גם חשוב להשלים למאגר שבב 1x עם מעכבי פרוטאז, כמו חלבונים יציבים נחוצים הכרת הנוגדן וצעדים ממטרים שלאחר מכן. עם זאת, במהלך תהליך immunoprecipitation, בשל אופי הידרופובי של חרוזים מגנטיים, שאינו ספציפי DNA יהיה משכו מטה. כדי להפחית אותות מתבניות שאינן ספציפיות כגון, כביסה קפדנית היא הכרחית. לבסוף, היפוך התקין של crosslinks חלבון-דנ"א של הדגימות הכרח הגברת PCR של תבניות immunoprecipitated. כדי להשיג תוצאות אופטימליות, צריך להיות מודגרות דגימות במשך 12 שעות לפחות עם ק SDS ו proteinase ישנם יתרונות השימוש assay שבב מבוססי פלסמיד מעל מבחני שבב גנטי. לדוגמה, נזק לדנ"א ממוקד יכולה להיות מושגת בקלות באמצעות מצע פלסמיד דנ"א וכן TFO, לעומת היווצרות הנגע במיקוד TFO ב מוקד הגנומי. אהר של המצע ניתן לשלוט גם לווסת את עוצמת האותות בעת שימוש פלסמיד פגום במיקוד TFO. יתר על כן, ניתן להשתמש מצעים כאמור בכל שורת תאים של בחירה ונבדק בשיתוף עם חלבונים מועמד שונים, ובכך להאריך את היקף הלימודים על עיבוד ותיקון ICLs.

את assay supercoiling מבוסס על ההבדל בכושר בין ליניארי ו- DNA פלסמיד supercoiled. פלסמידים DNA supercoiled יותר קומפקטיים להעביר מהר דרך מטריקס ג'ל לעומת פלסמידים רגועים. השלבים הקריטיים בתוך הצעות פרוטוקול ופתרון בעיות נדונות כאן. בגלל חלבונים אדריכלי להקל שינויים טופולוגיים על מצעים של דנ"א פגום שנמדד באמצעות אינדוקציה של supercoiling של פלסמידים רגוע, זה קריטי להירגע פלסמידים לחלוטין עם topoisomerase I. יש צורך לבחון את מידת הרפיה DNA הנגרם על ידי topoisomerase לי דרך ג'ל agarose אלקטרופורזה.הווה MgCl 2 למאגר supercoiling יכול לזרז לאורך זמן, ואת הנוכחות של MgCl 2 משפיעה על ההתפלגות התרמית של supercoils החיובי והשלילי באמצעות הקלת היווצרות supercoils החיובית. לכן, זה מועיל להוסיף MgCl 2 בנפרד לתערובת או להכין חיץ טרי בכל פעם. כדי להפריד את topoisomers של אוכלוסיות פלסמיד, חשוב לבצע את ג'ל אלקטרופורזה במתח נמוך מאוד (~ 2 V / ס"מ) כך הגירה של ה- DNA מבוסס בעיקר על מבנה / צורה של מולקולות. אם הרפיה של פלסמידים ידי topoisomerase אני לא שלם, אז בפעם הדגירה ו / או את כמות אנזים המשמש צריכה להיות מוגברת. יש רגיעה מוחלטת להיות מובטח לפני המעבר לשלב supercoiling DNA עוקבות כי השימוש של assay supercoiling עם פלסמידים רגוע באופן חלקי עלול להוביל לפרשנות שגויה של הנתונים והתוצאות יכולות להיות קשות לשחזור. לאחר Complהרפיה ete הושגה, assay supercoiling קל יחסית לביצוע. אחד המרכיבים החשובים של assay זה הוא השימוש חיץ סינתזה תיקון דנ"א. Phosphocreatine ואת פוספוקינאז קריאטין נדרשים יתווספו לתערובת בכל פעם כדי ליצור ATP. לאחר הצעד supercoiling, חשוב להסיר חלבונים מ- DNA פלסמיד על ידי דוגרים עם SDS ו proteinase ק SDS מסייע מתנער החלבונים מן דנ"א proteinase K מפרק את החלבון, מה שמשאיר את ה- DNA שלמים עם רמות שונות של supercoiling . אם החלבון לא הוסר לחלוטין, חלוקת התרמית של topoisomers לא תהיה נראית בבירור. ה- DNA לא יכול להיות מטוהר על ידי פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl ואתנול זירז מכיוון ששיטה זו (ואחרים) יכול ניק DNA, וכתוצאה מכך אובדן supercoiling. צעד חשוב נוסף הוא תוספת של chloroquine למאגר. Chloroquine הוא סוכן intercalating ו unwinds ה- DNA. עַלעיבור, זה מרגיע את ה- DNA supercoiled השלילי ומציג supercoiling החיובי ל- DNA הרגוע המאפשר פרדה של topoisomers המכיל צפיפות גבוהה של supercoiling. לפיכך supercoils החיובית והשלילית יכולה להיות מובחנת. זהו בדרך כלל ניסוי קליל והוא מאוד לשחזור כאשר כל הנקודות הנ"ל נחשבות.

עם זאת, אם לא supercoiling ברור, ואז יש צורך לקבוע את הפעילות של החלבון של עניין. את assay supercoiling 2D נעשה שימוש כדי ללמוד שינויים טופולוגיים בהנחייתם חלבונים אדריכלי 27. assay זה נוצל בעבר כאן בהקשר של עיבוד נזק לדנ"א של ICLs TFO מכוונת בתאים אנושיים. HMGB1 נקשר ICLs TFO מכוונת עם זיקה גבוהה וספציפיות, כפי שהוכח בעבר באמצעות מבחני ניידות במשמרת electrophoretic ג'ל במבחנה 20 ו בתאים אנושיים באמצעות assay שבב פלסמיד תיאר בתוך 16. כאן, uלשיר את assay 2D supercoiling הוכח כי עם הקשירה של ICLs TFO-המכוון הלה תמציות תא ללא, אסיסט HMGB1 ביצירת supercoiling השלילית על המצעים (איור 3), אשר עשוי להיות צעד חשוב ותיקון הנגע כי ידוע supercoiling שלילית כדי להקל על הסרת נזק לדנ"א באמצעות מסלול NER 25. ישנם חלבונים אדריכליים רבים כי היו מעורבים בעיבוד נזק לדנ"א שאפשר ללמוד באמצעות assay זה. גישה זו מוגבלת במבחנה, בכל זאת, זה הוא assay פשוט ושימושי כדי לחקור את הקשר פונקציה-מבנה של חלבונים אדריכלי בהקשר של תיקון נזק לדנ"א. עם זאת, פרוטוקול השבב ניתן לשנות בקלות ללמוד אינטראקציות חלבון דנ"א בהקשר של הגנום, תוך הערכת ההשפעות על DNA supercoiling ידי אינטראקציות כאלה עשויות להיות די קשות. יש לנו וקבוצות אחרות אכן pטריפלקס המבוסס erformed מחקרי 1) על ידי transfection היציב של DNA פלסמיד לתוך הגנום 28-30 2) על ידי מיקוד מוקד גנומית 31-33 ו 3) על ידי שילוב TFO-modified psoralen (הקרנת UVA) לתאים לאחר transfection פלסמיד 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לחברי מעבדה ואסקז לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים מכון הסרטן בריאות / לאומי [CA097175, CA093279 כדי KMV]; ואת מניעת סרטן מכון המחקר של טקסס [RP101501]. מימון תשלום גישה פתוחה: מכוני הבריאות הלאומיים / המכון הלאומי לסרטן [CA093279 כדי KMV].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'HMT Psoralen-AG30 Midland Certified Reagent Co., Midland, TX Custom order HPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit Cell signaling Inc. 9003 Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq Green Promega M7122 PCR master mix
HMGB1 antibody Abcam Ab18256
Wizard Gel and PCR cleanup kit Promega A9281
Chloroquine-diphosphate salt Sigma C6628-50G For two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRI New England BioLabs R0101S
GenePORTER transfection reagent Genlantis T201015
Vaccinia Topoisomerase I Invitrogen 38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lamp Upland, CA B 100 AP UVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 Epigentek EQC-1100 Water bath sonicator
Mylar filter GE Healthcare Life Sciences 80112939
Agarose Sigma-Aldrich A6111
BIO-RAD Chemidoc BIO-RAD XRS+ system DNA imaging system
Glycine Fisher Scientific BP381-500
37% Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775-25ML Used for crosslinking 
Proteinase K New England Biolabs P8107S
DMEM ThermoFisher 11965092 Cell culture media
PBS ThermoFisher 70013073 Cell culture
Trypsin-EDTA ThermoFisher 25200056 Cell culture
Bromocresol green Sigma-Aldrich 114-359 DNA loading dye
Siliconized tubes Fisher Scientific  02-681-320 Low retention microfuge tube
Tris base Fisher Scientific BP152-1
Boric Acid Fisher Scientific A74-1
EDTA Fisher Scientific BP24731
Photometer InternationalLight Technologies ILT1400-A UVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcoma ATCC ATCC HTB-96 Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLa ATCC ATCC-CCL-2 Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer 5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
  2. Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
  3. Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
  4. Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
  5. Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
  6. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
  7. Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
  8. Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
  9. Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
  10. Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
  11. Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
  12. Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
  13. Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
  14. Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
  15. Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
  16. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
  17. Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
  18. Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
  19. Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
  20. Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
  21. Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
  22. Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
  23. Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
  24. Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
  25. Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
  26. Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
  27. Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
  28. Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
  29. Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
  30. Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
  31. Puri, N., et al. Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
  32. Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
  33. Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).

Tags

גנטיקה גיליון 117 oligonucleotide יוצרי טריפלקס תיקון DNA DNA interstrand crosslinks assay שבב פלסמיד assay supercoiling 2D HMGB1
כלים כדי ללמוד את התפקיד של HMGB1 חלבון אדריכלי בעיבוד בסילוף Helix, DNA ספציפיים באתר Interstrand Crosslinks
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools… More

Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks. J. Vis. Exp. (117), e54678, doi:10.3791/54678 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter