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Neuroscience

रोका और मुक्त उड़ान मधु मक्खियों की Neuropharmacological हेरफेर, Published: November 26, 2016 doi: 10.3791/54695
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 5, 3
1Department of Science and Mathematics, Volda University College, 2Department of Biology, Washington University in St. Louis, 3Department of Biological Sciences, Macquarie University, 4Department of Biology, University of Konstanz, 5Research Center on Animal Cognition, CNRS, Universite de Toulouse
* These authors contributed equally

Summary

यह पांडुलिपि मधु मक्खियों को औषधीय एजेंटों प्रशासन, मुक्त उड़ान मधुमक्खियों के लिए सरल noninvasive तरीकों, साथ ही अधिक आक्रामक वेरिएंट कि संयमित मधुमक्खियों की सटीक स्थानीय उपचार के लिए अनुमति देने सहित कई प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Abstract

मधु मक्खियों आश्चर्यजनक सीखने की क्षमता और उन्नत सामाजिक व्यवहार और संचार प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, उनके मस्तिष्क, छोटे कल्पना करने के लिए और अध्ययन करने के लिए आसान है। इसलिए, मधुमक्खियों लंबे neurobiologists और सामाजिक और प्राकृतिक व्यवहार के तंत्रिका आधार के अध्ययन के लिए neuroethologists के बीच एक इष्ट मॉडल किया गया है। यह महत्वपूर्ण है, तथापि, कि प्रयोगात्मक मधुमक्खियों का अध्ययन करने के व्यवहार के साथ हस्तक्षेप नहीं करते इस्तेमाल की तकनीक का अध्ययन किया जा रहा है। इस वजह से, यह आवश्यक हो गया है मधु मक्खियों के औषधीय हेरफेर के लिए तकनीकों की एक श्रृंखला विकसित करने के लिए। इस पत्र में हम औषधीय एजेंटों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संयमित या मुफ्त उड़ान मधु मक्खियों के इलाज के लिए तरीकों का प्रदर्शन। ये ऐसे मौखिक और सामयिक उपचार के रूप में दोनों noninvasive तरीकों, साथ ही और अधिक आक्रामक तरीके है कि या तो प्रणालीगत या स्थानीय फैशन में सटीक दवा वितरण के लिए अनुमति शामिल हैं। अंत में, हम फायदे और प्रत्येक विधि के नुकसान पर चर्चा और वर्णनआम बाधाओं और कैसे सबसे अच्छा उन पर काबू पाने। हम दूसरी तरह के आसपास जैविक सवालों के बजाय करने के लिए प्रयोगात्मक विधि अनुकूल ढालने के महत्व पर चर्चा के साथ समाप्त।

Introduction

चूंकि कार्ल वॉन Frisch उनके नृत्य भाषा 1 elucidated, मधु मक्खियों पशुओं के व्यवहार और तंत्रिका जीव विज्ञान में शोधकर्ताओं के लिए एक लोकप्रिय अध्ययन प्रजातियों बने हुए हैं। हाल के वर्षों में नए विषयों की एक बहुत बड़ी संख्या में इन दो क्षेत्रों, और कई अन्य विषयों (जैसे, आणविक जीव विज्ञान, जीनोमिक्स, और कम्प्यूटर साइंस) उनके साथ पैदा हुई है के चौराहे पर उभरा है। यह समझ से कैसे व्यवहार नर्वस सिस्टम के भीतर गतिविधियों का परिणाम के लिए नए सिद्धांतों और मॉडलों के तेजी से विकास के लिए प्रेरित किया। अद्वितीय जीवन शैली, अमीर व्यवहार प्रदर्शनों की सूची, और प्रयोगात्मक और औषधीय हेरफेर की आसानी के कारण, मधुमक्खियों इस क्रांति के मामले में सबसे आगे बने हुए हैं।

मधु मक्खियों जैसे उन अंतर्निहित सीखने और स्मृति 2,3, निर्णय 4 बना रही है, घ्राण 5, या दृश्य प्रसंस्करण 6 के रूप में बुनियादी neurobiological सवालों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। हाल के वर्षों में, माननीय, 11, 12 13 नींद की उम्र बढ़ने, या तंत्र संज्ञाहरण 14 अंतर्निहित - ey मधुमक्खी भी इस तरह के नशे की लत दवाओं 7 के प्रभाव के रूप में आम तौर पर चिकित्सा अनुसंधान के लिए आरक्षित विषयों, अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है।

शास्त्रीय आनुवंशिक मॉडल जीवों के लिए विपरीत (जैसे, मेलानोगास्टर, एलिगेंस, एम मस्कुलस), बहुत कुछ आनुवंशिक उपकरणों मधु मक्खियों में तंत्रिका कार्यों से छेड़छाड़ के लिए उपलब्ध है, हालांकि यह वर्तमान में 15 से बदल रहा है, देखते हैं। इसके बजाय, मधु मक्खी के अध्ययन मुख्य रूप से औषधीय जोड़तोड़ पर भरोसा किया है। यह बहुत सफल रहा है; हालांकि, मधुमक्खी अनुसंधान की विविधता है कि औषधीय प्रशासन के लिए तरीकों की एक श्रृंखला की जरूरत है इस तरह की है। मधु मक्खियों के साथ अनुसंधान अत्यधिक विविध सवालों के पते, विभिन्न विषयों और पृष्ठभूमि से शोधकर्ताओं द्वारा अध्ययन किया है, और प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की एक किस्म का उपयोग करता है। कई अनुसंधान कौशलमेहराब सवाल या तो मुक्त उड़ान होना करने के लिए मधुमक्खियों की आवश्यकता होती है, स्वतंत्र रूप से उनकी कॉलोनी, या दोनों में बातचीत। यह मुश्किल व्यक्तिगत प्रायोगिक पशुओं का ट्रैक रखने के लिए बना है, और संयम या केन्युलेशन अव्यावहारिक बना देता है सकते हैं।

मधु मक्खी अनुसंधान की विविधता को समायोजित करने के लिए, दवा वितरण के तरीकों की एक किस्म है, जबकि यह सुनिश्चित करना कि फ़ार्माकोकायनेटिक और pharmacodynamic प्रोफाइल, विधि के invasiveness, और इसकी विश्वसनीयता, प्रश्न में प्रतिमान सूट मजबूत और लचीली प्रशासन की अनुमति के लिए आवश्यक हैं। क्योंकि इन विभिन्न आवश्यकताओं की है, सबसे अधिक अनुसंधान समूहों को अपने अद्वितीय औषधि प्रशासन के तरीकों को विकसित किया है। अब तक, इस मधुमक्खी अनुसंधान समुदाय की एक ताकत किया गया है; यह अलग परिस्थितियों में एक ही दवा के प्रशासन की अनुमति के लिए तरीकों की सरणियों के विकास के लिए प्रेरित किया है। यहाँ हमारा लक्ष्य मधुमक्खियों के औषधीय जोड़तोड़ के लिए एक एकल मानकीकृत विधि विकसित करने के लिए नहीं है, बल्कि तरीकों पर प्रकाश डाला है किविशेष रूप से सफल साबित किया है, और मदद के शोधकर्ताओं ने इन अपनाने। हम वे कैसे काम के बुनियादी सिद्धांतों, साथ ही अपने फायदे और नुकसान पर चर्चा की।

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Protocol

1. इस्तेमाल मधुमक्खियों के लिए औषधि प्रशासन

  1. मौखिक उपचार
    1. पानी की 500 मिलीलीटर के साथ सुक्रोज के 257 ग्राम के मिश्रण से 1.5 एम सुक्रोज समाधान तैयार है (यह उबलते पानी में सुक्रोज की इस राशि को भंग करने के लिए आसान है)। 4 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक सूक्रोज समाधान स्टोर।
      ध्यान दें: सुक्रोज समाधान कुछ सूक्ष्मजीवों के लिए एक बहुत मेहमाननवाज वातावरण प्रदान करता है, और इस तरह आसानी से दूषित और मधुमक्खियों के लिए कड़ा हो जाता है। थोक सूक्रोज समाधान aliquoted और -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर संग्रहित किया जा सकता है।
    2. एक उचित दवा की खुराक के बारे में फैसला (यह कैसे प्राप्त करने के लिए, नीचे चर्चा खंड में संबोधित किया है), और जैसे, 20 माइक्रोग्राम प्रति वितरित करने के लिए एक समाधान है कि इस तरह वरीय दवा की खुराक 20 μL में भंग कर रहा है सुक्रोज समाधान तैयार (एक पर दवा पतला 1 मिलीग्राम / एमएल के अनुपात)। Felsenberg एट अल के अनुसार हार्नेस मधुमक्खियों। (2011) 16। इस कदम दवा इलाज से पहले कम से कम 12 घंटा करते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए मधुमक्खियों को अब जोर दिया जाता हेजब दवा समाधान प्रस्तुत किया है दोहन से संघ राज्य क्षेत्र।
      नोट: अधिक अनुरूप परिणाम के लिए, यह मधुमक्खियों को भूखा हे / एन (34 डिग्री सेल्सियस और 70% आर्द्रता पर एक मशीन में इस्तेमाल मधुमक्खियों रखकर) सबसे अच्छा है।
    3. एक micropipette का प्रयोग, एक दोहन मधुमक्खी के एंटीना 1.5 एम सुक्रोज पानी की एक बूंद स्पर्श करें। जब सूंड बढ़ाया है, 1.5 एम मधुमक्खी की सूंड को सीधे दवा युक्त सुक्रोज के एक 20 μl छोटी बूंद स्पर्श करें। सुनिश्चित करें कि मधुमक्खी सब कुछ भस्म बनाओ। वाहन पर नियंत्रण के रूप में जोड़ा दवाओं के बिना 1.5 एम sucrose के समाधान का उपयोग करें।
      नोट: सुक्रोज समाधान की राशि प्रायोगिक योजना के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। भूख बढ़ाने वाला कंडीशनिंग का इरादा है, तो प्रशिक्षण के लिए मधुमक्खियों को खिलाने से पहले सिर्फ मधुमक्खियों 'जवाबदेही के साथ हस्तक्षेप करेगा।
    4. त्यागें या एक तरफ मधुमक्खियों कि सुक्रोज के सभी उपभोग नहीं करते निर्धारित किया है।
      नोट: मधुमक्खियों की एक बड़ी संख्या sucrose के समाधान के लिए पीने के लिए असफल हो, तो खिला समय समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  2. छाती में इंजेक्शन
    1. इस प्रकार के रूप में मधु मक्खी दवा तैयार की घंटी 17:
      1. मिक्स और आटोक्लेव 7.45 छ NaCl, 0.448 जी KCl, 0.812 जी 2 MgCl, 0.735 जी 2 CaCl, 54.72 छ सूक्रोज, 4.95 ग्राम डी ग्लूकोज, और पानी के 1000 मिलीलीटर में 2.48 जी HEPES। सावधान रहो, जब घंटी के भंडारण के रूप में यह आसानी से दूषित है। अशेष और -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक दुकान घंटी।
      2. घंटी समाधान में दवा भंग और फिर तो पतला है कि वांछित राशि 5 μl में मौजूद है। 1 माइक्रोग्राम / μl के अंतिम समाधान के लिए घंटी में 1000: एक उदाहरण के रूप में, अगर मधुमक्खियों एक दवा की 5 माइक्रोग्राम के साथ इलाज किया जा रहे हैं, 1 ग्राम शुरू में घंटी, 1 मिलीलीटर में 1 पतला होने से पहले भंग किया जा सकता है।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीबीएस (फॉस्फेट बफर सलिन) घंटी समाधान के बजाय प्रयोग किया जा सकता है।
    2. के साथ एक दोधारी धार के कोने बंद तोड़कर एक microscalpel बनाओएक ब्लेड धारक। एक ब्लेड धारक को ब्लेड टुकड़ा संलग्न इतना है कि यह एक तेज अंत बिंदु के साथ एक अच्छा ब्लेड बनाता है।
    3. एक stereomicroscope के तहत, ध्यान microscalpel का उपयोग सिर्फ स्कुटेलम ऊपर एक 2 मिमी छेद में कटौती करने के लिए, अगले एक मधुमक्खी की छाती के पीछे विंग की प्रक्रिया के लिए। बहुत गहरी काटने से बचने के रूप में इस उड़ान की मांसपेशियों घायल हो सकता है, और दक्षिणपंथी टिका से बचने के लिए सावधान रहना होगा। आदर्श रूप में, केवल, तीन पक्षों में कटौती इतना है कि छल्ली की फ्लैप बाद में चोट की साइट को बंद करने के लिए वापस मुड़ा हुआ जा सकता है।
    4. एक micropipette, जमा 5 μlL घंटी (या पीबीएस) छाती में छेद के शीर्ष पर दवा युक्त का उपयोग करना। ध्यान से खुर्दबीन के नीचे की निगरानी सुनिश्चित करने के लिए पूरे बूंद hemolymph में लीन है। एक वाहन पर नियंत्रण के रूप में की घंटी (या पीबीएस) का प्रयोग करें।
    5. यदि संभव हो तो, छल्ली फ्लैप वापस छेद पर चलते हैं। 5-10 घंटे के बाद, इसे पुनः अनुलग्न और सील होगा।
      नोट: इस तकनीक के लिए एक विकल्प के रूप में, 1 μl सीधे छाती में, एक गिलास सिरिंज का उपयोग कर इंजेक्षन एक SMA खोलने के बादएक सिरिंज सुई के साथ फीता (स्कुटेलम के पीछे क्षेत्र में अनुप्रस्थ लाइन) के बीच में छेद करूँगा (व्यास: 0.6 मिमी, जी: 23)। यह पहला एक छुरी और इंजेक्शन साइट छोटा होता है के साथ छाती में कटौती की जरूरत गतिरोध उत्पन्न, लेकिन इस विधि इंजेक्शन उजागर साइट छोड़ देंगे।
  3. Ocellus इंजेक्शन
    नोट: यह एक विधि सिर कैप्सूल भर अणुओं पहुंचाने, hemolymph में लिए उपयुक्त है।
    1. 1.2.1 में के रूप में दवाओं को तैयार है, लेकिन दवा सांद्रता समायोजित ऐसी है कि वांछित खुराक घंटी या पीबीएस के 1 μl में शामिल किया जाएगा (कम मात्रा छाती के माध्यम से ocellus छेद के माध्यम से अवशोषित किया जा सकता है)।
    2. 1.2.2 के रूप में एक microscalpel तैयार करें। एक stereomicroscope के तहत, मोम के साथ गर्दन दरार भरने के द्वारा जगह में एक दोहन मधुमक्खी के सिर ताला। आदेश हानिकारक antennal घ्राण रिसेप्टर्स या अन्य कोशिकाओं है कि मैं हो सकता है से बचने के लिए कम तापमान के पिघलने मोम (जैसे, दंत मोम) का प्रयोग करेंव्यवहार (जैसे, घ्राण सीखने) का आकलन करने के लिए mportant। तो ध्यान लेंस के तहत microscalpel की नोक डालने से मंझला ocellus के लेंस को हटा दें और धीरे लेंस सिर कैप्सूल से मुक्त तोड़ने।
      नोट: यह भी एंटीना के ऊपर ध्यान से मोम जगह करने के आंदोलन को रोकने के लिए संभव है।
    3. ध्यान से ocellus छेद पर दवा विंदुक। जब तक सभी सिर कैप्सूल में ले लिया है रुको। एंटीना से दंत मोम निकालें और मधुमक्खी प्रयोगात्मक प्रक्रिया जारी रखने से पहले कुछ समय के लिए आराम करने के लिए अनुमति देते हैं। एक वाहन पर नियंत्रण के रूप में की घंटी (या पीबीएस) का प्रयोग करें।
  4. Ocellar पथ में इंजेक्शन
    ध्यान दें: ocellar पथ बड़े फाइबर होता है, केंद्रीय मस्तिष्क 18 के अधिकांश क्षेत्रों को जोड़ने। इस उपचार विधि केवल मस्तिष्क को यौगिकों को लागू करने में सक्षम बनाता है, लेकिन मस्तिष्क के विशिष्ट उपक्षेत्र को लक्षित नहीं।
    1. 1.3.2 के रूप में मधुमक्खी तैयार करें। और टी के साथ मंझला ocellus के लेंस को हटा दें1.3.3 के रूप में एक microscalpel के आईपी।
      नोट: यह इंजेक्शन से पहले 2 घंटा तक किया जा सकता है। हमारे अनुभव के आधार पर, फेड मधुमक्खियों बेहतर भूखे मक्खियों की तुलना में इस सर्जरी के साथ सामना करने में सक्षम हैं
    2. एक 10 μl गिलास एक छोटे गेज के साथ सुसज्जित सिरिंज भरें (जैसे, 33, व्यास: 210 माइक्रोन) दवा समाधान के साथ सुई 1.3.1 के रूप में तैयार किया।
    3. एक मैनुअल micromanipulator का प्रयोग, 50 माइक्रोन की गहराई तक सिर कैप्सूल में ocellar रेटिना के माध्यम से सिरिंज टिप डालने और समाधान के 250 nl इंजेक्षन।
    4. प्रयोग करने के बाद, सिरिंज 3 गुना आसुत जल के साथ 75% इथेनॉल के साथ 3 बार कुल्ला, फिर।
  5. विशेष रूप से मस्तिष्क संरचना में microinjection
    नोट: व्यवस्थित ऊपर उल्लेख उपचार करने के लिए इसके अलावा, यह विशेष रूप से मस्तिष्क संरचना में microinjections प्रदर्शन करने के लिए संभव है। जबकि दूसरों को अप्रभावित छोड़ने यह एक या एक से अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों के औषधीय हेरफेर के लिए अनुमति देता है। यह सही हैमस्तिष्क क्षेत्रों कि पूर्वकाल मस्तिष्क की सतह (जैसे, antennal पालियों, मशरूम शरीर calyces या खड़ी पालियों, या ऑप्टिक पालियों) से पहचान करने के लिए आसान कर रहे हैं, लेकिन अन्य क्षेत्रों के साथ सबसे अच्छा लक्षित किया गया है। कृपया ध्यान दें कि अभिविन्यास (पूर्वकाल / पीछे, पृष्ठीय / उदर), शरीर के अक्ष को दर्शाता है बल्कि, neuraxis से 19 से अधिक है।
    1. एक फ्लोरोसेंट जोड़ने, 1.2.1 के रूप में एक ही तरीके से घंटी या पीबीएस में दवा तैयार (जैसे, 0.5 मिलीग्राम / एमएल dextran, एलेक्सा 546 या 568 स्त्राव) या nonfluorescent डाई (जैसे, 1 मिमी methylene नीले)।
      नोट: एक फ्लोरोसेंट रंजक के अलावा जबकि nonfluorescent रंगों के प्रयोग के दौरान प्रत्यक्ष निगरानी की अनुमति के बाद प्रयोग खत्म हो गया है (confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग, मस्तिष्क विच्छेदन के बाद) इंजेक्शन स्थान के सत्यापन की अनुमति देगा।
    2. इंजेक्शन के लिए कांच pipettes बनाने के लिए, मानक पकड़ के लिए एक इलेक्ट्रोड खींचने के धारक अकड़न में सही व्यास का गिलास केशिकाओं डालने (1.0 मिमीएर microinjector सामग्री सूची में उल्लिखित) के लिए शामिल थे। एक लगभग 0.5 सेमी लंबी टिप उत्पादन करने के लिए पुल और गर्मी सेटिंग्स समायोजित (सेटिंग्स हर खींचने के लिए अलग अलग हो जाएगा, भले ही एक ही मॉडल का इस्तेमाल किया जाता है)।
      नोट: आदर्श रूप में, दो pipettes एक गिलास से खींच लिया, एक ही लंबाई और आकार दिया जाना चाहिए, ताकि दोनों का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. एक stereomicroscope के तहत, के बारे में 10-15 माइक्रोन के एक बाहरी व्यास प्राप्त करने के लिए सुझावों को तोड़ने के दृश्य आकलन एक रेखाजाल आंख में डाला पर एक पैमाने का उपयोग पर आधारित है। पैमाने पर कदम निर्माता द्वारा परिभाषित कर रहे हैं और इस्तेमाल के लिए बढ़ाई सुधारा जा सकता है।
    4. फिर, समाधान इंजेक्षन करने के साथ कांच pipettes भरें। तंतु के साथ कांच केशिकाओं इस्तेमाल कर रहे हैं, तो दवा के समाधान में पीछे की ओर रखकर पिपेट भरने अन्यथा microloader युक्तियों का उपयोग टिप भरें।
    5. एक microinjector की केशिका धारक है, जो एक मैनुअल या इलेक्ट्रॉनिक Mi से नियंत्रित किया जाता है में भरा गिलास पिपेट डालेंcromanipulator।
    6. microinjector जांचना (0.5-2 nl लक्षित मस्तिष्क संरचना के आकार पर निर्भर करता है) वांछित मात्रा इंजेक्षन करने के लिए। इस के लिए, खनिज तेल युक्त एक छोटा सा पेट्री डिश में सीधे इंजेक्षन और रेखाजाल साथ छोटी बूंद के व्यास को मापने। सेटिंग्स बदल जब तक वांछित मात्रा तक पहुँच जाता है।
    7. पर (उदर) बस मंझला ocellus नीचे एक, एक: 1.3.2 में के रूप में मुलायम दंत मोम का उपयोग कर, सिर कैप्सूल के पूर्वकाल भाग में एक खोलने के काटने, एक microscalpel उपयोग करने से पहले एक इस्तेमाल मधुमक्खी के सिर फिक्स, तीन में कटौती के साथ सही या बाईं आंख और एंटीना के ऊपर एक के सीमावर्ती उपजी (पृष्ठीय)। दंत मोम के एक टुकड़े का उपयोग जगह में खोला फ्लैप धारण करने के लिए।
    8. ध्यान से धक्का ग्रंथियों और श्वासनली मस्तिष्क के शीर्ष पर झूठ बोल रही है एक तरफ ठीक संदंश का उपयोग करें, तो लक्षित मस्तिष्क संरचना ऊपर (मस्तिष्क के चारों ओर बहुत पतली झिल्ली) neurilemma में एक छोटे से संबंध विच्छेद कर सकते हैं।
      नोट: कई मधुमक्खियों एक बार में इलाज किया जा रहे हैं, तो इस प्रक्रियापहले किया जा सकता है; हालांकि, के लिए, इस राज्य में भी लंबे समय (कोई 30 से अधिक मिनट) में मधुमक्खियों नहीं छोड़ के रूप में उनके दिमाग सूखना सकता है सावधान रहना।
    9. वांछित मस्तिष्क क्षेत्र में टिप डालें, और मस्तिष्क की सतह को सीधा गहराई को समायोजित (जैसे, मशरूम शरीर calyces के लिए 60 माइक्रोन)। पूर्व निर्धारित मात्रा इंजेक्षन। पार्श्व मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए, द्विपक्षीय इंजेक्षन (यानी प्रत्येक गोलार्द्ध के लिए एक इंजेक्शन करते हैं)। एक nonfluorescent डाई का इस्तेमाल किया जाता है, इंजेक्शन अवलोकन पर सही क्षेत्र में हुई है, जबकि इंजेक्शन लगाने के किया जाता है। एक फ्लोरोसेंट डाई का इस्तेमाल किया जाता है तो एक प्रतिदीप्ति देखने की व्यवस्था के साथ एक stereomicroscope का उपयोग फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत एक ही है।
    10. बाद में, खुले फ्लैप वापस मधुमक्खी के सिर पर जगह है। eicosane की एक क्रिस्टल, जो व्यास में लगभग 1 मिमी है पिघला, एक पतली तार एक माइक्रो टांका लोहे की नोक के चारों ओर लिपटा का उपयोग कर (पिघलने के तापमान 35-37 डिग्री सेल्सियस) और कटौती सील। यह बहुत मृत्यु दर कम हो जाएगा।
    11. इसे जारी करेंजैसे, सूंड विस्तार पलटा (प्रति) परीक्षण 20 - व्यवहार के विश्लेषण के लिए दोहन से मधुमक्खी (लेकिन चर्चा देखें), या संयमित मधुमक्खियों पर प्रयोगों के लिए दोहन में रहते हैं।
    12. अगर एक फ्लोरोसेंट डाई का इस्तेमाल किया गया था, यह सुनिश्चित इंजेक्शन हित के क्षेत्र मारा कि उसके बाद प्रयोग एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग (चित्रा। 1) का उपयोग खत्म हो गया है।
      नोट: यह विशेष रूप से उपयोगी है जब गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों (जहां यह इंजेक्शन चरण के दौरान nonfluorescent डाई देखने के लिए मुश्किल हो जाएगा) को लक्षित है।

के लिए मुक्त उड़ान मधुमक्खियों 2. औषधि प्रशासन के तरीके

  1. मौखिक उपचार
    1. चरणों में उसी तरह के रूप में दवा तैयार 1.1.1-1.1.2। एक फीडर को दवा समाधान जोड़ें और भंडारण के लिए फ्रिज में रख दें।
      नोट: किसी भी फीडर इस तरह के एक ऊपर से नीचे की बोतल टोपी या एक जार टिशू पेपर पर उल्टे रूप में, क्या करेंगे।
    2. 1 एम या 0.5 से युक्त एक गुरुत्वाकर्षण फीडर के लिए मधुमक्खियों को प्रशिक्षितएक फीडर छत्ते के करीब रखकर एम सुक्रोज समाधान। एक बार जब मधुमक्खियों फीडर पर foraging शुरू, धीरे-धीरे इसे आगे दूर ले जाते हैं, जब तक यह एक आरामदायक दूरी पर है डंक मार दिया जा रहा से बचने के लिए (कम से कम 5 मीटर)।
    3. क्रम में पेंट-निशान मधुमक्खियों व्यक्ति मधु मक्खियों का ट्रैक रखने के लिए। सभी रंग संयोजन है कि इस्तेमाल किया जाएगा की एक सूची बनाओ। फीडर पर एक मधुमक्खी की भूमि है, ध्यान से दो रंगों के साथ अपने पेट का प्रतीक है, और सूची है कि संयोजन लिया जाता है पर एक नोट बनाने है।
    4. एक फीडर दवा / सूक्रोज समाधान युक्त लिए गुरुत्वाकर्षण फीडर स्वैप। चिह्नित मधुमक्खियों कि फीडर की यात्रा का ध्यान रखना। किसी भी अगोचर मधुमक्खी फीडर के रूप में विजिटिंग मधुमक्खियों विपुल नियोक्ताओं रहे हैं, और नशा फीडर जल्दी नियंत्रण से बाहर हो सकते हैं दौरा मधुमक्खियों की संख्या पकड़ो। इस रूप में भोले मधुमक्खियों नहीं रह भोले हो सकता है, अगर एक ही प्रयोग लगातार दिन पर प्रदर्शन किया जा रहा है, विशेष रूप से समस्याग्रस्त है।
      नोट: एक फीडर को अलग-अलग मधुमक्खियों प्रशिक्षण, पिछले लेखक के लिए एक विकल्प के रूप में23 - सफलतापूर्वक एक पूरे छत्ते से 21 दवा सजी सुक्रोज पानी खिलाया है।
  2. सामयिक उपचार
    नोट: उद्देश्य के लिए एक विलायक कि मोमी कीट छल्ली घुसना कर सकते हैं में ब्याज की यौगिक भंग करने के लिए है। विभिन्न सॉल्वैंट्स इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सबसे अधिक इस्तेमाल किया एसीटोन, dimethylformamide (DMF) और dimethylsulphoxide (DMSO) शामिल हैं।
    1. मूल्यांकन जो विलायक हाथ में परिसर के लिए सबसे अच्छा काम करता है। एक मजबूत phenotype एक ज्यादा (जैसे, लकवा या मौत), एक उच्च खुराक के साथ इलाज मधुमक्खियों (कदम 2.2.2) (जैसे, 20 माइक्रोग्राम कोकीन 7) विभिन्न सॉल्वैंट्स के प्रत्येक और ध्यान में भंग से उम्मीद की जाती है तो पक्षाघात जब तक समय की निगरानी या मौत।
    2. एक 1 μL microcapillary (या एक microsyringe है, जो एक उचित दोहरा निकालने की मशीन पर फिट किया जा सकता है) और microcapillary धारक का प्रयोग, दवा समाधान के 1 μl (जैसे, 3 आकर्षित81, केशिका में कोकीन की जी / μl)। बूंद निष्कासित, और ध्यान से एक चिह्नित मधुमक्खी की छाती पर यह रंग। एक क्षेत्र समाधान के साथ एक संभव है, बल्कि एक ठोस बूंद छोड़ने से एक के रूप में बड़े कवर, के रूप में मधुमक्खी फिर इसे बंद दूल्हे की संभावना है। करने के लिए यौगिक विंग टिका है, या यह इसे बंद छाती आकर्षित और पंखों जहां यह hemolymph में समाहित किया जा रहा बिना लुप्त हो जाएगा के साथ कर सकते हैं संपर्क करने की अनुमति नहीं सावधान रहें।
      ध्यान दें: अनुसंधान लक्ष्य पर निर्भर करता है, इस पद्धति का भी मधुमक्खी के पेट के लिए दवाओं के प्रशासन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, दवाओं सीएनएस तेज और बड़ी मात्रा में पहुँचने जब समान रूप से अच्छी तरह से छाती 24 .इस विधि करने के लिए आवेदन काम करता है मुक्त उड़ान मधुमक्खियों के साथ के रूप में इस्तेमाल किया।
  3. volatilized उपचार
    1. दवाओं भंग 100% इथेनॉल में (पहले इस विधि मधु मक्खियों 10 कोकीन देने के लिए इस्तेमाल किया गया है)। घुलनशीलता सुनिश्चित करने के लिए, एक हाइड्रोक्लोराइड या के अन्य रूपों नमक का उपयोग नहीं करतेदवा यदि संभव हो तो। जब एक कमजोर पड़ने इसे तैयार ताकि राशि एक मधुमक्खी के लिए दिया जाना बना 100 μl में मौजूद है। एक वाहन पर नियंत्रण के रूप में शुद्ध इथेनॉल का प्रयोग करें।
    2. एक रेशा बनाने के लिए, McClung और हिर्ष 25 के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग करें।
      1. संक्षेप में समझाया: एक नाखून के आसपास कसकर Nichrome तार हवा और दो बिजली के तारों (रेशा के प्रत्येक के अंत पर एक) को देते हैं। नाखून निकालें। शेष निक्रोम कुंडल फिलामेंट के रूप में जाना जाता है।
      2. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब, जो तापमान चुना करने के लिए प्रतिरोधी किया जाना चाहिए के ढक्कन में ध्यान से drilled छेद के माध्यम से दो तारों थ्रेड। तरल सिलिकॉन के साथ जगह में तारों गोंद।
        नोट: इस ट्यूब वायुरोधी कर देगा। यह प्रयोगकर्ता को माध्यमिक जोखिम से बचने के लिए और सुनिश्चित करें कि मधुमक्खियों उचित खुराक के साथ व्यवहार कर रहे हैं करने के लिए आवश्यक है।
    3. तारों के एक शक्ति के स्रोत के लिए फिलामेंट के लिए अग्रणी संलग्न। के तापमान को मापने के लिए एक thermocouple का उपयोगरेशा, एक है कि प्रश्न में दवा के लिए एक उपयुक्त तापमान प्रोफाइल में यह परिणाम है, आदर्श, एक है कि हीटिंग या उससे कम के 10 सेकंड के लिए अनुमति देता है जब तक अलग वोल्टेज / वर्तमान संयोजन के साथ प्रयोग। यह बहुत महत्वपूर्ण है, (यह कम से कम 200 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने की जरूरत है भाप बनकर उड़ करने के लिए कोकीन के क्रम में जैसे, है, लेकिन 350 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान पर इसे माध्यमिक यौगिकों 26 में टूट गया है) प्रासंगिक साहित्य को देखें।
    4. ध्यान से इथेनॉल समाधान रेशा पर युक्त दवा के 100 μl विंदुक। के रूप में इस वाष्पीकरण दक्षता में वृद्धि होगी जितना संभव हो उतना रेशा सतह पर तरल बिखरा हुआ है। रेशा कमरे के तापमान पर उजागर छोड़ दें जब तक सभी इथेनॉल सुखाया गया है।
      नोट: इथेनॉल पर्याप्त सुखाया नहीं है, तो मधुमक्खियों दोनों चुनाव और इथेनॉल की दवा के साथ इलाज किया जाएगा। मधुमक्खियों इथेनॉल के प्रति बेहद संवेदनशील हैं, और कुछ दवाओं, इथेनॉल के साथ synergistic बातचीत की है जो पूर्वाग्रह पूर्व होगाperimental का परिणाम है।
    5. एक बार पूरी तरह से इथेनॉल (दवा वेग आमतौर पर एक खुर्दबीन के नीचे सूखी रेशा पर देखा जा सकता है) हवा हो गया है, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक मुक्त उड़ान मधुमक्खी पकड़ने के लिए। ध्यान से रेशा युक्त ढक्कन बंद कर दें।
    6. 10 सेकंड के लिए सत्ता पर बारी, बिजली बंद कर देते हैं और एक और 50 सेकंड प्रतीक्षा (volatilized यौगिक शांत और इस तरह गाढ़ा या जमा करने के लिए अनुमति देने के लिए)। मधुमक्खी रिलीज।
      नोट: इस उपचार विधि मुक्त उड़ान मधुमक्खियों के लिए उत्कृष्ट काम करता है, यह बस के रूप में प्रभावी ढंग से इस्तेमाल मधुमक्खियों के साथ प्रयोग किया जा सकता है। बस एक 50 मिलीलीटर ट्यूब के अंदर इस्तेमाल मधुमक्खी देते हैं। रेशा पुनः लोड मधुमक्खियों के बीच 2.3.4 में वर्णित है। उच्च throughput के लिए, कई तंतु समानांतर में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Representative Results

ऊपर वर्णित विधि के लिए प्रतिनिधि परिणाम का दिखाया जाता है, मुख्य रूप से प्रदर्शित करने के लिए है कि तरीकों औषधीय एजेंटों मस्तिष्क तक पहुंचने के लिए अनुमति देते हैं और मधु मक्खी व्यवहार प्रभावित करते हैं।

मस्तिष्क प्रक्रियाओं पर विशेष प्रभाव आसानी से छाती इंजेक्शन के बाद प्राप्त किया जा सकता है।

क्योंकि औषधीय एजेंटों छाती इंजेक्शन के माध्यम से शरीर में कई ठिकानों पर कार्य कर सकते हैं, और मस्तिष्क तक पहुंचने से पहले शरीर में पतला हो, इस तकनीक से संभव विशिष्टता चिंताओं को बढ़ा सकता है। फिर भी, यह व्यापक रूप से साहित्य में संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप करने के लिए बहुत उच्च खुराक है कि प्रमुख माध्यमिक प्रभाव उपज सकता का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, आवश्यकता के बिना। उदाहरण के लिए, प्रतिलेखन के ब्लॉकर्स इस तकनीक का उपयोग प्रशासित किया गया है, आदेश है कि जीन की आवश्यकता स्मृति के चरणों की पहचान करने मेंअभिव्यक्ति। इस तरह के अणुओं की छाती इंजेक्शन कई दिनों 27, जिसका मतलब है कि अन्य ठिकानों पर उनकी संभावित विषाक्त कार्रवाई, सीमित किया जा सकता एकाग्रता अच्छी तरह से चुना जाता है प्रदान के लिए अस्तित्व के साथ संगत है। इस तरह की स्थितियों में, स्मृति पर चयनात्मक और समय पर निर्भर प्रभाव प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रकार मस्तिष्क (चित्रा। 2) के कुशल लक्ष्यीकरण दिखा।

सिर hemolymph में अणुओं के प्रसार त्वरित, खुराक पर निर्भर प्रभाव होता है।

Ocellus इंजेक्शन खासकर अगर वे मस्तिष्क में कई व्यापक लक्ष्यों को हो सकता है hemolymph के माध्यम से पूरे सिर में ब्याज के अणुओं की एक त्वरित प्रसार सक्षम करने के लिए, एक ही रास्ता है। इस विधि allatostatins, neuropeptides कि के रूप में भी कार्य कर सकते हैं neurohormones 28) प्रबंधन के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक परिणाम के रूप में, एक कम प्रदर्शन एक घ्राण सीखने की परख में मनाया गया, साथ सुसंगतअलग मस्तिष्क घ्राण प्रसंस्करण में शामिल क्षेत्रों में रिसेप्टर्स allatostatin और 28 सीखने का सुझाव दिया उपस्थिति। इस आशय के लिए एक खुराक पर निर्भर वक्र (चित्रा। 3) समानांतर में चलाने के लिए स्वतंत्र समूहों के लिए अलग सांद्रता इंजेक्शन लगाने के द्वारा, स्थापित किया जा सकता है।

प्रशासन के विभिन्न तरीके मस्तिष्क समारोह पर समान प्रभाव को उपज कर सकते हैं।

इमेटिन, प्रोटीन संश्लेषण की एक अवरोधक, जल्दी घ्राण स्मृति लंबे समय तक याद है, जो आम तौर पर 1-2 दिनों कंडीशनिंग के बाद व्यक्त की है के गठन को ख़राब करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सबसे प्रकाशित अध्ययन में यह छाती 29 में इंजेक्ट किया गया है। हम पता चला कि इसी तरह के प्रभावों ocellar तंत्र के माध्यम से सीधे इसे का प्रबंध करने के लिए मस्तिष्क द्वारा प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 4।): इंजेक्शन मानकों (छोटी मात्रा का एक समायोजन, उच्च एकाग्रता और कम उपलब्ध करानेकंडीशनिंग से पहले देरी), हम एक कमी (~ 20%) साहित्य एक ही दवा राशि (10 एनएम) का उपयोग में पाया है कि इसी तरह प्राप्त -। Stollhoff एट अल, 2005 29 में चित्रा 4 के साथ तुलना करें।

स्थानीय इंजेक्शन के प्रभाव को समय और अंतरिक्ष में ही सीमित हैं

विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में microinjected दवाओं के स्थानिक और लौकिक गुणों का परीक्षण करने के लिए, इस्तेमाल मधुमक्खियों कंडीशनिंग प्रतिमान प्रति एक घ्राण में प्रशिक्षित किया गया है, और फिर मशरूम शरीर calyces या खड़ी पालियों में 740 मिमी procaine (एक संवेदनाहारी) के 0.5 nl साथ द्विपक्षीय इंजेक्शन ( खारा) एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। मधुमक्खियों क्रमिक याद करते हैं 1, 2, और इंजेक्शन के बाद 3 घंटे के लिए परीक्षण किया गया है, प्रदर्शन केवल खण्डों में द्विपक्षीय इंजेक्शन (चित्रा। 5) के साथ मधुमक्खियों में बिगड़ा हुआ था। calyces से पालियों से बरकरार तंत्रिका उत्पादन है, लेकिन नहीं, करने के लिए जाना जाता हैघ्राण स्मृति पुनः प्राप्ति के लिए आवश्यक हो, तो यह पता चलता है कि procaine पालि जिसमें यह कम से कम 3 घंटे के लिए इंजेक्शन दिया गया था करने के लिए स्थानीय बने रहे। यह भी पता चलता है कि, जब calyces में इंजेक्शन, पास खण्डों में प्रसार इसी अवधि में सीमित था, के बाद से procaine की एक calycal इंजेक्शन पालियों की नाकाबंदी करने के लिए नेतृत्व नहीं किया था।

औषधि प्रशासन निम्नलिखित व्यवहार phenotypes अक्सर संदर्भ पर निर्भर हैं

पिछले प्रयोगों से पता चला है कि कोकीन मधुमक्खियों के साथ इलाज के बाद एक sucrose के समाधान 10,30 की गुणवत्ता को लेकर अनुमान। अगर इस आशय संदर्भ (यहाँ, आधारभूत सुक्रोज गुणवत्ता) पर निर्भर था देखने के लिए, मुक्त उड़ान मधु मक्खियों volatilized कोकीन के साथ इलाज किया गया। व्यक्तिगत रूप से चिह्नित मुक्त उड़ान मधु मक्खियों एक फीडर 1 एम सुक्रोज समाधान युक्त पर चारा की अनुमति दी गई। फीडर में मधुमक्खियों धीरे में कब्जा कर लिया गयाएक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के रूप में वे के बारे में करने के लिए उतरना फीडर से थे। मधुमक्खियों या तो फ्रीबेस कोकीन या वाहन नियंत्रण (सुखाया इथेनॉल) के 100 माइक्रोग्राम प्रति के साथ इलाज किया गया। उपचार के बाद, सूक्रोज फीडर या तो एक 0.5 एम या एक 2.0 एम सुक्रोज फीडर द्वारा बदल दिया गया था, और दर foragers करने के लिए फीडर दर्ज किया गया था लौट आए। इस प्रतिमान का उपयोग करना, कोकीन का इलाज मधुमक्खियों 0.5 एम फीडर पर उनके foraging प्रयास वृद्धि हुई है, लेकिन 2.0 एम फीडर (चित्रा 6) पर नहीं। दो सुक्रोज सांद्रता के साथ देखा प्रभाव में अंतर अच्छी तरह से खाते में पर्यावरण संकेत लेते हुए जब मधुमक्खी व्यवहार का अध्ययन करने के महत्व को दर्शाता है।

आकृति 1
चित्रा 1: इंजेक्शन साइट के Confocal लेजर स्कैनिंग छवि। एलेक्सा 546 लेबल dextran दवा समाधान (लाल) के साथ मिलकर इंजेक्शन है। neuropil पहचान करने के लिएDAPI के साथ SA जवाबी धुंधला जोड़ा जाता है (हरा)। दाएँ गोलार्द्ध में इंजेक्शन साइट खड़ी पालि (वीएल) में स्थित था, एक सफल इंजेक्शन के लिए एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है। बाएँ गोलार्द्ध में इंजेक्शन साइट अंगूठी neuropil में खड़ी पालि, एक असफल इंजेक्शन के लिए एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया के पृष्ठीय स्थित था। स्केल बार = 100 माइक्रोन, एमबी: मशरूम निकायों, अल: Antennal लोब, डी: पृष्ठीय, वी: उदर, एल: छोड़ दिया, आर:। सही कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

आकृति 1
चित्रा 2: लंबे समय तक याद है, जब छाती में इंजेक्शन पर Actinomycin डी (ट्रांसक्रिप्शन अवरोधक) के समय पर निर्भर प्रभाव appetitive घ्राण कब्जा निम्नलिखित विभिन्न देरी पर। tioning (6, 9 या 12 एच), डी actinomycin 1 μL (पीबीएस में 1.5 मिमी) छाती में इंजेक्ट किया गया था। दीर्घकालिक स्मृति (LTM) पुनर्प्राप्ति 3 डी कंडीशनिंग के बाद (- 65 एन = 25) मूल्यांकन किया गया था। मेमोरी प्रदर्शन, एक समय पर निर्भर फैशन में कम हो गया था पीबीएस इलाज नियंत्रण की तुलना में: प्रभाव महत्वपूर्ण था जब इंजेक्शन भी कंडीशनिंग (χ 2 = 18.04, पी <0.005) के बाद जगह 6 घंटे, लेकिन नहीं अब देरी पर ( 9 घंटे: χ 2 = 0.95; 12 एच: χ 2 = 0.47), सुझाव है कि LTM गठन प्रतिलेखन की एक लहर कि कंडीशनिंग के बाद एक निर्धारित समय खिड़की के दौरान जगह लेता है की आवश्यकता है। त्रुटि सलाखों के मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा पहले 27 प्रकाशित किया गया था और अनुमति के साथ यहां निर्मित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3:। एक neuropeptide की Ocellar इंजेक्शन के बाद लर्निंग प्रदर्शन की खुराक पर निर्भर निषेध neuropeptide सी allatostatin घ्राण कंडीशनिंग से पहले 1 घंटा मंझला ocellus के माध्यम से, सिर hemolymph (पीबीएस में 200 NL) में इंजेक्ट किया गया था। (नियंत्रण के लिए या पीबीएस) विभिन्न सांद्रता के साथ इंजेक्शन पशुओं की स्वतंत्र समूहों को प्रशिक्षित किया गया। Allatostatin सी उपचार के रूप में एक यू के आकार की अवस्था (एन = 70-78) के बाद, पिछले कंडीशनिंग में वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं का प्रतिशत द्वारा मूल्यांकन एक खुराक पर निर्भर ढंग से सीखने प्रदर्शन में कमी करने के लिए नेतृत्व। यह कमी 10 -6 एम में महत्वपूर्ण है लेकिन अन्य सांद्रता में नहीं था। त्रुटि सलाखों के मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा पहले प्रकाशित किया गया था 28, और अनुमति के साथ यहां अनुकूलित है। देखें एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा के सायन।

आकृति 1
चित्रा 4:। 1 डी प्र मेमोरी की नाकाबंदी Ocellar तंत्र के माध्यम से इमेटिन (अनुवाद एफडीए) के इंजेक्शन के बाद प्रोटीन संश्लेषण अवरोध इमेटिन (पीबीएस में 50 मिमी, 200 NL) ocellar तंत्र के माध्यम से मस्तिष्क में इंजेक्ट किया गया था, 20 मिनट पहले घ्राण कंडीशनिंग। मेमोरी तो 24 घंटे के बाद में परीक्षण किया गया था। उपचार काफी बिगड़ा स्मृति बनाए रखने (χ 2 = 7.03, पी <0.01) के रूप में पीबीएस इलाज नियंत्रण (एन = 57-70) की तुलना में। त्रुटि सलाखों के मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। जेएम Devaud, अप्रकाशित डेटा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

"चित्रा चित्रा 5:। संरचनात्मक और Microinjections के टेम्पोरल विशिष्टता appetitive घ्राण कंडीशनिंग के बाद, procaine या तो मशरूम शरीर calyces या खड़ी खण्डों में द्विपक्षीय इंजेक्ट किया गया था। स्मृति पुनर्प्राप्ति इंजेक्शन के बाद 1 घंटा मूल्यांकन किया गया था और केवल (उपचार के बाद 1 घंटा खण्डों में procaine इंजेक्शन से प्रभावित किया गया था: बनाम खारा: χ 2 = 10.00, पी <0.005; बनाम procaine calyces: 2 = 32.92, पी χ < 0.005)। प्रभाव अभी भी इंजेक्शन के बाद 2 घंटा (χ 2 = 6.65, पी <0.01) और 3 (χ 2 = 27.22, पी <0.005) से देखा जा सकता है, और अभी भी स्थान विशेष (2 घंटा था: χ 2 = 8.60, पी < 0.05; 3 घंटा: 2 = 17.15 χ, पी <0.0001), सुझाव है कि केवल इंजेक्शन क्षेत्र procaine से प्रभावित था। अनुपात कंडीशनिंग स्तर डु के सापेक्ष हैंपिछले कंडीशनिंग परीक्षण की अंगूठी। त्रुटि सलाखों के मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करते हैं (एन = 23-28)। डेटा पहले 31 प्रकाशित किया गया था, और अनुमति के साथ यहां निर्मित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आकृति 1
चित्रा 6:। पर मुक्त उड़ान मधुमक्खियों कोकीन के प्रभाव मुलाक़ात दर (परीक्षण अवधि के दौरान सभी मधुमक्खियों के लिए एक दिया मधुमक्खी / औसत दर्शक से यात्राओं की संख्या) एक कम गुणवत्ता स्रोत पर volatilized कोकीन इलाज के बाद वृद्धि की गई थी (0.5M: टी 70 = 5.0710, पी = 0.00003), लेकिन एक उच्च गुणवत्ता के स्रोत पर (2 एम: टी 70 = -0.२,०८७, पी = 0.8353)। बक्से 1 सेंट प्रतिनिधित्व करते हैं और 3 मंझला दिखा midline के साथ चतुर्थांश। मूंछ से 1.5 विस्तारx अन्तःचतुर्थक सीमा होती है। Outliers साजिश रची नहीं कर रहे हैं के रूप में सभी व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं आरोपित कर रहे हैं। डेटा पहले प्रकाशित किया गया था 10, और अनुमति के साथ यहां निर्मित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इलाज फ्री- उड़ान मधुमक्खियों के साथ किया जा सकता है? पेशेवरों विपक्ष
मौखिक उपचार हाँ। आसान, कम आक्रामक। बी पाचन सीधा नहीं है
सामयिक उपचार हाँ। आसान, कम आक्रामक, जल्दी। दोहराया उपचार समस्याग्रस्त किया जा सकता है।
छाती में इंजेक्शन उलझा हुआ,क्षमताओं उड़ान मधुमक्खियों को प्रभावित करता है लगातार और मजबूत। कुछ आक्रामक। संभावित नुकसान के लिए / तनाव मधुमक्खी।
मंझला ocellus में इंजेक्शन सिफारिश नहीं की गई। लगातार और मजबूत, कुछ हद तक स्थानीय। कुछ आक्रामक। संभावित नुकसान के लिए / तनाव मधुमक्खी।
ocellar पथ में इंजेक्शन सिफारिश नहीं की गई। बहुत स्थानीयकृत बहुत आक्रामक। संभावित नुकसान के लिए / तनाव मधुमक्खी।
मस्तिष्क क्षेत्रों में सूक्ष्म इंजेक्शन सिफारिश नहीं की गई। बहुत स्थानीयकृत बहुत आक्रामक, प्रदर्शन करने के लिए मेहनत की है। संभावित नुकसान के लिए / तनाव मधुमक्खी।
Volatilized दवा वितरण हाँ। आसान, कम आक्रामक, जल्दी। सभी दवाओं के लिए काम नहीं करता।

तालिका 1: Compariविभिन्न उपचार विधियों और उनके गुणों का बेटा।

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Discussion

ऊपर उल्लिखित तरीकों या तो मुक्त उड़ान या इस्तेमाल मधु मक्खियों का सरल, प्रभावी और मजबूत उपचार अनुमति देते हैं। इन तरीकों में कई प्रयोगात्मक मानदंड और जैविक सवाल (तालिका 1) के साथ संगत कर रहे हैं। मुक्त उड़ान तरीकों के सभी आसानी से इस्तेमाल मधुमक्खियों के लिए लागू किया जा सकता है। रिवर्स के बाद से अस्थायी संयम और आक्रामक उपचार विधियों अक्सर मधुमक्खियों 'उड़ान क्षमता समझौता कर सकते हैं, कम सफल है लेकिन है।

तरीकों के लिए एक मस्तिष्क केंद्रित नजरिए से प्रस्तुत किया गया है। इस तकनीक के निहित सीमाओं की वजह से नहीं है, बल्कि 'लेखक निजी हितों की वजह से। कोई वजह नहीं कि इन तरीकों के अन्य अंगों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। हालांकि, छोटे संशोधनों के अन्य अंग प्रणालियों के लिए विधि अधिक उपयुक्त बनाने के लिए आवश्यक हो सकता है। उदाहरण के लिए, जबकि सामयिक उपचार मस्तिष्क तक पहुंचने के लिए इरादा आम तौर पर छाती के लिए लागू किया जाता है, यह बेहतर हो सकता है thi लागू करने के लिएपेट के लिए है, तो इच्छित लक्ष्य अंडाशय है। इसी तरह, इंजेक्शन आसानी से छाती या सिर के अलावा अन्य क्षेत्रों के लिए लागू किया जा सकता है (जैसे, पेट अंगों पेट sclerites के बीच इंजेक्शन द्वारा निशाना बनाया जा सकता है)।

शर्तों जिनमें से यौगिकों मधुमक्खियों को दिलाई जा सकती है, वहाँ वास्तव में कोई सीमा नहीं है। आमतौर पर, लोगों को इस तरह के संकेत अणुओं 21 या उनके विरोधी 32, और कस्टम बनाया पेप्टाइड्स 28 के रूप में औषधीय यौगिकों दिलाई है। हालांकि, इस तरह के कीटनाशकों 33 और मानवजनित दूषित पदार्थों को 34 के रूप में मन में लागू किया सवाल, साथ मधुमक्खियों यौगिकों के लिए प्रशासन में हाल ही में वृद्धि की गई है। हाल ही में, प्रशासित यौगिकों आरएनए अणुओं, ऐसे dsRNA आरएनए हस्तक्षेप मार्ग को सक्रिय 35 या यहां तक कि microRNAs 36 और 37 के रूप में antagomiRs कि जीन अभिव्यक्ति के साथ सीधे हस्तक्षेप शामिल करने के लिए शुरू कर दिया है। नहीं सभी तरीकों सभी यौगिकों के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करते हैं।यह शायद सबसे अच्छा है, कड़वा या खट्टा यौगिकों कि चीनी पानी मधुमक्खियों को कड़ा बनाने से यह साफ है इस प्रकार उन्हें इसे लेने से रोकता है। ऐसे RNAs या कुछ polypeptides के रूप में कमजोर अणुओं, टूट रहे हैं जब एक वाष्पीकरण की प्रक्रिया के दौरान गर्म या DMF की तरह एक कठोर विलायक में रखा। ऐसा नहीं है कि यह उपचार प्रक्रिया बचता सुनिश्चित करने के लिए प्रशासित किया जा रहा है की रसायन विज्ञान को समझने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है।

एक मधुमक्खी में एक औषधीय एजेंट पाना आसान हिस्सा है, लेकिन वहाँ तीन बड़ी चिंता है कि हल्के से जब औषधीय प्रयोगों प्रदर्शन कभी नहीं लिया जाना चाहिए रहे हैं। पहले प्रश्न में प्रयोग के लिए एक अच्छी खुराक पता लगाना है। दवा पर निर्भर करता है, वहाँ पहले से ही साहित्य उपलब्ध प्रकाशित किया जा सकता है, लेकिन सबसे अधिक भाग के लिए, यह साहित्य खोजों, सूचित अटकलबाजी, और खुराक प्रतिक्रिया घटता का एक मिश्रण द्वारा हल किया जाना होगा। कैसे जटिल प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है पर निर्भर करता है, यह करने के लिए उपयोगी हो सकता हैपहले (, जैसे समग्र आंदोलन या अस्तित्व बढ़ाता) एक सरल bioassay में एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न एक अधिक विस्तृत bioassay में कोशिश कर रहा लायक एक खुराक रेंज की एक बेहतर विचार पाने के लिए। हमारी प्रयोगशाला में, एक प्रारंभिक खुराक या तो मधुमक्खी साहित्य में या एक मिलीग्राम / किग्रा कृंतक साहित्य से डेटा के आधार पर रूपांतरण कर रही द्वारा पाया जाता है। इस शुरुआती बिंदु से, मधुमक्खियों प्रारंभिक खुराक, प्लस 2 या 3 खुराक से 10 गुना बड़ा है और प्रारंभिक खुराक (तुलना में छोटे के साथ व्यवहार कर रहे हैं जैसे, यदि प्रारंभिक खुराक 1 मिलीग्राम, 0.01, 0.1, 10, और 100 मिलीग्राम भी होगा ) का इस्तेमाल किया, और निश्चित रूप से एक उचित वाहन पर नियंत्रण।

दूसरी समस्या यह थोड़ा अधिक नकचढ़ा है: दवा विशिष्टता। अधिकांश दवाओं के मन में, मधु मक्खियों, या किसी भी अन्य कीट के साथ विकसित नहीं थे। इस वजह से, बंद लक्ष्य प्रभाव आम (जैसे, mianserin, एक कशेरुकी सेरोटोनिन रिसेप्टर प्रतिपक्षी 38, लंबे समय से एक कीट octopaminergic रिसेप्टर प्रतिपक्षी, लेकिन हाल फाई होने लगा था रहे हैंndings चलता है कि मधुमक्खियों में यह भी एक डोपामिनर्जिक रिसेप्टर प्रतिपक्षी 39) है। इस समस्या का समाधान नहीं बल्कि एक आम केवल एक ही दवा पर निर्भर है, आम में ब्याज के लक्ष्य के लिए जाना जाता दवाओं का एक सूट के साथ ही प्रयोग दोहराने के लिए की तुलना में, है। असल में, कई दवाओं के लिए एक निश्चित लक्ष्य को ब्लॉक करने के लिए, विभिन्न दवाओं भर में इसी तरह के परिणाम को देख अधिक आत्मविश्वास दवा की उम्मीद प्रभाव पड़ता है, क्योंकि विभिन्न दवाओं अक्सर अद्वितीय बंद लक्ष्य प्रोफाइल है देना चाहिए जाना जाता है।

पिछले अंक सुनिश्चित करना है कि दवा के लिए जहां यह अभिनय माना जाता है काम कर रहा है शामिल है। इस संबंध में, वहाँ हमेशा विशिष्टता और invasiveness के बीच एक व्यापार बंद हो जाएगा। व्यवस्थित उपचार के तरीकों आम तौर पर कम से कम आक्रामक हैं, लेकिन वहाँ जहां मधुमक्खी के शरीर में दवा इसका प्रभाव पड़ रहा है पर कोई नियंत्रण नहीं है। यहाँ तक कि लक्षित ऊतकों के microinjection के लिए दवाओं मधुमक्खी शरीर के अन्य भागों में hemolymph के साथ यात्रा कर सकते हैं। कैसे इस समस्या को संबोधित किया है Neeडी एस सवाल पूछा द्वारा सूचित किया जाएगा। कुछ प्रयोगों के लिए संरचनात्मक स्थान जबकि दूसरों के लिए यह महत्व का एक ही सवाल है, अप्रासंगिक है। यह पता करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है प्रणालीगत उपचार के साथ शुरू करते हैं और धीरे-धीरे तेजी से और अधिक विशिष्ट तरीकों का उपयोग करके एक संरचनात्मक स्थान के लिए नीचे संकीर्ण करने के लिए है। व्यवहार अध्ययन किया जा रहा इनवेसिव उपचार के तरीकों के साथ विशेष रूप से असंगत है, तो यह बहुत ही विशेष औषधीय उपचार के साथ प्रयोगों की एक पूरी श्रृंखला को करने से पहले सरल घटकों में यह deconstruct करने के लिए कोशिश कर रहा लायक हो सकता है।

दवा रिसाव की इस समस्या को भी मुक्त उड़ान मधुमक्खियों, जहां दवाओं गैर लक्ष्य मधुमक्खियों को प्रभावित कर सकते हैं की मौखिक उपचार के साथ और अधिक अतिशयोक्तिपूर्ण है। भोजन के लिये घूमनेवाला मधु मक्खियों उनकी कॉलोनी को वापस लाने के लिए क्षेत्र में अमृत इकट्ठा। वे बजाय लौटने यह अवशोषित पर छत्ते में उनकी sucrose के समाधान के बहुमत के बोझ उतार लेना होगा। छत्ते में यह कोशिकाओं में पैक निर्जलित, और मधु के रूप में जमा है। वजह सेइस, ड्रग्स संभावित गैर लक्ष्य मधुमक्खियों को प्रभावित कर सकते हैं। (जैसे microinjections के रूप में) और अधिक विशिष्ट तरीकों के साथ इस समस्या को कम से कम है।

मन में इन निरंतर, और ठीक से संबोधित साथ, मधु मक्खियों के neuropharmacological हेरफेर एक बहुत शक्तिशाली उपकरण हो सकता है। ट्रांसजेनिक उपकरण उनके सामाजिक जीवन शैली की वजह से, मधु मक्खियों 15 के लिए विकसित किया जा रहा है जबकि यह संभावना नहीं है कि ट्रांसजेनिक्स कभी प्रयोगों के इन प्रकार का संचालन करने के लिए एक आसान और विश्वसनीय तरीके से किया जाएगा। इसलिए यह संभावना है कि भविष्य में औषध विज्ञान मधुमक्खी अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण तत्व होने के लिए जारी करेगा। कुछ मधुमक्खी शोधकर्ताओं मानकीकृत प्रयोगात्मक विधियों 40 के लिए फोन किया है, वहीं इस मामले में यह एक गलती होगी। मधुमक्खी प्रणाली की शक्ति का हिस्सा हमेशा प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की विविधता की गई है, और कैसे तकनीक असली जैविक बजाय दूसरी तरह के आसपास के मन में सवालों के साथ विकसित किया गया है। फिर भी यह महत्वपूर्ण है कि हम यह सुनिश्चित करनाहाथ में प्रश्न के लिए सबसे उपयुक्त विधि का उपयोग। पिछले अध्ययनों की तुलना कुंजी हैं, मानकीकृत प्रोटोकॉल का कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए। हालांकि, मानकीकृत तरीकों का उपयोग कर की खातिर स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग उपन्यास तरीकों कि नई प्रयोगात्मक संभावनाएं खोल सकते हैं के विकास के रास्ते में खड़ा करने के लिए अनुमति नहीं दी जानी चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Sigma-Aldrich S8501 Any supplier will do
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Calcium Chloride dihydrate Sigma-Aldrich C8106
Dextrose monohydrate Sigma-Aldrich 49159
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
Protection Wax Dentaurum 124-305-00
HEPES Sigma-Aldrich H3375
dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
95% Ethanol Sigma-Aldrich 493511
Glass capillary WPI 1B100F-3
23 G NanoFil needle WPI NF33BV-2
Very fine forsceps Dumont 0208-55-PO
Electrode puller SRI 2001
FemtoJet Microinjector Eppendorf 5247 000.01
Eicosane Sigma-Aldrich 219274
manual micromanipulator Brinkmann Instrumentenbau MM-33
electronic micromanipulator Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik Junior unit XYZ
stereomicroscope Leica M80
soldering iron Weller WESD51
Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW ThermoFisher Scientific D-22911
Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW ThermoFisher Scientific D-22912
small Petri dish Sigma-Aldrich P5481
mineral oil Sigma-Aldrich M5904
50 ml Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339652
forceps Australian Entomological Supplies
Blade holder and breaker Australian Entomological Supplies E130
Feather double edged razor blade ThermoFisher Scientific 50-949-135
Nichrome wire Any supplier will do
Electrical wires Any supplier will do
Model paint Tamiya USA Depends on colour
Repeating dispenser Hamilton company PB-600-1
Glass syringe WPI NANOFIL
flourescence viewing system Nightsea SFR-GR
graticule ProSciTech S8014-24
microcapillary with holder Drummond 1-000-0010
Liquid silicone Any supplier will do
Thermocouple Digitech QM-1324
Micropipette Eppendorf

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 117 neuropharmacology, सीखने स्मृति कोकीन नशीली दवाओं के उपचार
रोका और मुक्त उड़ान मधु मक्खियों की Neuropharmacological हेरफेर,<em&gt; एपीआई mellifera</em
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Søvik, E., Plath, J. A.,… More

Søvik, E., Plath, J. A., Devaud, J. M., Barron, A. B. Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera. J. Vis. Exp. (117), e54695, doi:10.3791/54695 (2016).

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