Summary
Este manuscrito describe varios protocolos para la administración de agentes farmacológicos para las abejas, incluyendo métodos no invasivos simples para las abejas de vuelo libre, así como variantes más invasivos que permiten el tratamiento localizado precisa de abejas restringidos.
Abstract
Las abejas de miel demuestran sorprendentes capacidades de aprendizaje y el comportamiento social avanzada y la comunicación. Además, su cerebro es pequeño, fácil de visualizar y estudiar. Por lo tanto, las abejas han sido durante mucho tiempo un modelo favorecida entre los neurobiólogos y neuroethologists para el estudio de las bases neuronales del comportamiento social y natural. Es importante, sin embargo, que las técnicas experimentales utilizadas para estudiar las abejas no interfieren con los comportamientos que se estudian. Debido a esto, ha sido necesario desarrollar una serie de técnicas para la manipulación farmacológica de las abejas melíferas. En este trabajo se demuestra métodos para el tratamiento de las abejas de miel o restringidas de vuelo libre con una amplia variedad de agentes farmacológicos. Estos incluyen tanto métodos no invasivos, tales como los tratamientos orales y tópicos, así como métodos más invasivos que permiten la administración de fármacos precisa, ya sea en la manera sistémica o localizada. Finalmente, se discuten las ventajas y desventajas de cada método y describimosobstáculos comunes y la manera de superar la mejor manera. Se concluye con una discusión sobre la importancia de adaptar el método experimental a las cuestiones biológicas en lugar de al revés.
Introduction
Desde Karl von Frisch dilucidado su lenguaje de la danza 1, las abejas de miel han mantenido una especie de estudio populares para los investigadores en el comportamiento animal y la neurobiología. En los últimos años un gran número de nuevas disciplinas han surgido en la intersección de estos dos campos, y varias otras disciplinas (por ejemplo, la biología molecular, la genómica y la informática) han surgido junto a ellos. Esto ha llevado a un rápido desarrollo de nuevas teorías y modelos para entender cómo se traduce el comportamiento de la actividad dentro de los sistemas nerviosos. Debido al estilo de vida único, rico repertorio de conducta, y la facilidad de manipulación experimental y farmacológico, las abejas se han mantenido a la vanguardia de esta revolución.
Las abejas de miel están siendo utilizados para estudiar las cuestiones básicas tales como neurobiológicos que subyacen en el aprendizaje y la memoria de 2,3, por lo que la decisión 4, 5 olfativa, o el procesamiento visual 6. En los últimos años, el honabeja ey incluso se ha utilizado como modelo para el estudio de temas generalmente reservados para la investigación médica, tales como los efectos de las drogas adictivas 7 - 11, 12 del sueño, el envejecimiento 13, o los mecanismos subyacentes a la anestesia 14.
A diferencia de los organismos modelo genético clásicos (por ejemplo, D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), hay muy pocas herramientas genéticas disponibles para la manipulación de las funciones neuronales en las abejas melíferas, aunque esto está cambiando 15. En cambio, los estudios de abejas se han basado principalmente en las manipulaciones farmacológicas. Esto ha sido muy exitosa; Sin embargo, la diversidad de la investigación de abeja es tal que se necesitan una serie de métodos para la administración farmacológica. La investigación con abejas melíferas aborda cuestiones muy diversas, es estudiada por los investigadores de diferentes disciplinas y procedencias, y utiliza una variedad de enfoques experimentales. muchos resepreguntas arco requieren abejas a estar libre-vuelo, interactuando libremente en su colonia, o ambos. Esto puede hacer que sea difícil mantener un registro de los animales de experimentación individuales, y hace inviable restricción o canulación.
Para dar cabida a la diversidad de la investigación abeja de la miel, se necesita una variedad de métodos de administración de fármacos, lo que permite la administración robusta y flexible al tiempo que garantiza que los perfiles farmacocinéticos y farmacodinámicos, la invasividad del método, y su fiabilidad, traje el paradigma de que se trate. Debido a estas diversas necesidades, la mayoría de los grupos de investigación han desarrollado sus propios métodos de administración de fármacos únicos. Hasta ahora, esto ha sido una fortaleza de la comunidad investigadora de abeja; que ha llevado al desarrollo de matrices de métodos que permitan la administración del mismo medicamento en diferentes circunstancias. Nuestro objetivo aquí no es desarrollar un único método estandarizado para la manipulación farmacológica de las abejas, sino más bien para poner de relieve que los métodoshan demostrado ser particularmente exitoso, y ayudar a los investigadores adoptar estos. Se discuten los principios básicos de cómo funcionan, así como sus ventajas y desventajas.
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Protocol
1. Administración de Medicamentos para abejas Enjaezó
- El tratamiento oral
- Preparar la solución de 1,5 M de sacarosa mediante la mezcla de 257 g de sacarosa con 500 ml de agua (que es más fácil de disolver esta cantidad de sacarosa en agua hirviendo). Almacenar solución de sacarosa a 4 ° C hasta su uso.
Nota: La solución de sacarosa proporciona un ambiente muy hospitalario para ciertos microorganismos, y por lo tanto se convierte fácilmente contaminada y desagradable para las abejas. solución de sacarosa a granel se puede dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C hasta su uso. - Decidir sobre una dosis de fármaco apropiada (la forma de lograrlo, se trata en la sección de discusión más adelante), y preparar una solución tal que la dosis de medicamentos preferidos se disuelve en 20 l de solución de sacarosa (por ejemplo, para proporcionar 20 mg, diluir la droga en una proporción de 1 mg / ml). abejas arnés según Felsenberg et al. (2011) 16. Hacer este paso al menos 12 horas antes del tratamiento de drogas para asegurar que ya no están estresados o abejasut de aprovechamiento cuando se presenta la solución de fármaco.
NOTA: Para obtener resultados más consistentes, es mejor que morir de hambre abejas (mediante la colocación de abejas enganchados en una incubadora a 34 ° C y 70% de humedad) S / N. - Usando una micropipeta, toque una gota de agua de 1,5 M de sacarosa a la antena de una abeja aprovechado. Cuando se extiende la trompa, toque una gota de 20 l de sacarosa 1,5 M que contiene el fármaco directamente a la trompa de la abeja. Asegúrese de que la abeja consume todo. Como control del vehículo usar solución 1,5 M de sacarosa sin fármacos añadidos.
NOTA: puede ser necesario ajustar la base de planes experimentales La cantidad de solución de sacarosa. Si el condicionamiento apetitivo se pretende, la alimentación de las abejas justo antes de la formación va a interferir con la capacidad de respuesta de las abejas. - Desechar o dejar de lado las abejas que no consumen la totalidad de la sacarosa.
NOTA: Si hay un gran número de abejas dejar de beber la solución de sacarosa, podría ser necesario ajustar el horario de alimentación.
- Preparar la solución de 1,5 M de sacarosa mediante la mezcla de 257 g de sacarosa con 500 ml de agua (que es más fácil de disolver esta cantidad de sacarosa en agua hirviendo). Almacenar solución de sacarosa a 4 ° C hasta su uso.
- La inyección en el tórax
- Preparar las drogas en la miel de abeja Ringer 17 de la siguiente manera:
- Mezclar y autoclave 7,45 g de NaCl, 0,448 g de KCl, 0,812 g de MgCl 2, 0,735 g de CaCl 2, 54,72 g de sacarosa, 4,95 g de D-glucosa, y 2,48 g de HEPES en 1.000 ml de agua. Tenga cuidado al almacenar en dos colores, ya que se contamina con facilidad. Alícuota y almacenar Ringer a -20 ° C hasta su uso.
- Se disuelve el fármaco en solución Ringer y luego se diluye de modo que la cantidad deseada está presente en 5 l. Como un ejemplo, si las abejas deben ser tratados con 5 mg de un fármaco, 1 g puede inicialmente ser disuelto en 1 ml en Ringer, antes de ser diluida 1: 1000 en Ringer para una solución final de 1 g / l.
NOTA: Como alternativa, disponible comercialmente PBS (fosfato tamponada Salin) se puede utilizar en lugar de la solución de Ringer.
- Hacer una microscalpel por la ruptura de la esquina de una hoja de doble filo de afeitar conun soporte de la cuchilla. Una el fragmento de la hoja con el soporte de la hoja de manera que tenga una buena cuchilla con un punto extremo afilado.
- Bajo un microscopio estereoscópico, usar cuidadosamente el microscalpel para cortar un agujero 2 mm por encima de la escutelo, junto con el proceso de ala posterior del tórax de una abeja. Evitar que se corte demasiado profundo ya que esto podría dañar los músculos de vuelo, y tener cuidado de evitar las bisagras de las alas. Idealmente, sólo el corte de tres lados, de modo que la solapa de cutícula más tarde se puede plegar de nuevo para cerrar el sitio de la lesión.
- Usando una micropipeta, el depósito 5 μlL Ringer (o PBS) que contiene el fármaco en la parte superior del agujero en el tórax. supervisar cuidadosamente bajo el microscopio para asegurar toda la gota se absorbe en la hemolinfa. Use Ringer (o PBS) como un control del vehículo.
- Si es posible, mueva la aleta de la cutícula hacia atrás sobre el agujero. Después de 5-10 horas, se vuelva a fijar y sellar.
NOTA: Como alternativa a esta técnica, se inyecta 1 l directamente en el tórax usando una jeringa de vidrio, después de la apertura de una smaagujero ll en el medio del frenillo (línea transversal en la región posterior de la escutelo) con una aguja de la jeringa (diámetro: 0,6 mm, G: 23). Esto evita la necesidad de cortar primero el tórax con un bisturí y el sitio de inyección es más pequeño, pero este método dejará el sitio de la inyección expuesta.
- Preparar las drogas en la miel de abeja Ringer 17 de la siguiente manera:
- inyección ocelo
NOTA: Este es un método adecuado para la entrega de moléculas a través de la cápsula de la cabeza, en la hemolinfa.- Prepare las drogas como en 1.2.1, pero ajustar las concentraciones de fármaco de manera que la dosis deseada estará contenida en 1 l de Ringer o PBS (menos volumen puede ser absorbido por el agujero ocelo que a través del tórax).
- Preparar una microscalpel como en 1.2.2. Bajo un microscopio estereoscópico, bloquear la cabeza de una abeja aprovechado en su lugar llenando la grieta cuello con cera. Use cera de fusión a baja temperatura (por ejemplo, cera dental) con el fin de evitar los receptores olfativos antenales perjudiciales u otras células que pueden ser importante para evaluar el comportamiento (por ejemplo, el aprendizaje olfativo). A continuación, retire con cuidado la lente del ocelo medio mediante la inserción de la punta de la microscalpel debajo de la lente y romper suavemente la lente libre de la cápsula de la cabeza.
NOTA: También es posible colocar la cera con cuidado sobre las antenas para evitar el movimiento. - Con cuidado la pipeta fármaco sobre el agujero ocelo. Espere hasta que todo se tiene en la cápsula de la cabeza. Quitar la cera dental de las antenas y permite la abeja para descansar un rato antes de continuar el procedimiento experimental. Use Ringer (o PBS) como un control del vehículo.
- La inyección en el tracto ocelar
NOTA: El tracto ocelar contiene fibras grandes, que conecta a la mayoría de las regiones del cerebro central 18. Este método de tratamiento permite la aplicación de compuestos para sólo el cerebro, pero no la orientación subregiones específicas del cerebro.- Preparar abeja como en 1.3.2. y quitar la lente del ocelo medio con el tIP de un microscalpel como en 1.3.3.
NOTA: Esto se puede hacer hasta 2 horas antes de la inyección. Sobre la base de nuestra experiencia, las abejas alimentadas son más capaces de hacer frente a este tipo de cirugía que las abejas hambrientas - Llene una jeringa de vidrio de 10 l equipado con un calibre pequeño (por ejemplo, 33, diámetro: 210 micras) de la aguja con solución de fármaco preparó como en 1.3.1.
- El uso de un micromanipulador manual, inserte la punta de la jeringa a través de la retina ocelar en la cápsula de la cabeza a una profundidad de 50 micras y se inyecta 250 nl de solución.
- Después del uso de la jeringa 3 veces con agua destilada, luego 3 veces con etanol al 75%.
- Preparar abeja como en 1.3.2. y quitar la lente del ocelo medio con el tIP de un microscalpel como en 1.3.3.
- Microinyección en estructuras cerebrales particulares
NOTA: Además de los tratamientos sistemáticos mencionados anteriormente, es posible realizar microinyecciones en las estructuras particulares del cerebro. Esto permite la manipulación farmacológica de una o más regiones del cerebro, mientras que deja otras no afectado. Esto funcionamejor con las regiones del cerebro que son fáciles de reconocer desde la superficie del cerebro anterior (por ejemplo, los lóbulos antenales, cálices setas corporales o lóbulos verticales, o los lóbulos ópticos), pero otras regiones han sido blanco. Tenga en cuenta que la orientación (anterior / posterior, dorsal / ventral) se refiere al eje del cuerpo, más bien, que al neuroeje 19.- Preparar el fármaco en Ringer o PBS en la misma manera que en 1.2.1, la adición de un fluorescente (por ejemplo, 0,5 mg / ml de dextrano, Alexa 546 o 568 fluor) o colorante no fluorescente (por ejemplo, metileno 1 mM azul).
NOTA: La adición de un colorante fluorescente se permite la verificación de la ubicación de la inyección después de que el experimento ha terminado (usando microscopía confocal, después de la disección del cerebro), mientras que los colorantes no fluorescentes permiten la monitorización directa durante el experimento. - Para hacer pipetas de vidrio para inyección, insertar capilares de vidrio de diámetro correcto en abrazaderas titular de un extractor de electrodos (1.0 mm para la bodega normaer incluido con el microinyector mencionado en la lista de materiales). Para ajustar la configuración de tracción y de calor para producir una punta de aproximadamente 0,5 cm de longitud (ajustes serán diferentes para cada tirador, incluso si se utiliza el mismo modelo).
NOTA: Idealmente, las dos pipetas tirado de un vidrio debe tener la misma longitud y forma, de manera que ambos pueden ser utilizados. - Bajo un microscopio estereoscópico, romper la punta para obtener un diámetro exterior de aproximadamente 10 a 15 micras, sobre la base de la estimación visual utilizando una escala en una retícula insertado en el ocular. Los pasos en la escala están definidos por el fabricante y pueden ser corregidos por el aumento que se usa.
- A continuación, llenar las pipetas de vidrio con la solución para la inyección. Si se utilizan tubos capilares de vidrio con filamentos, llenar la pipeta colocando la cara de nuevo en la solución de fármaco, si no llenar la punta utilizando puntas Microloader.
- Insertar la pipeta de vidrio lleno en el soporte capilar de un microinyector, que está controlado por un mi manual o electrónicocromanipulator.
- Calibrar el microinyector para inyectar el volumen deseado (0,5 a 2 nl, dependiendo del tamaño de la estructura del cerebro específica). Para esto, inyectar directamente en un pequeño plato de Petri que contiene aceite mineral y medir el diámetro de la gotita con la retícula. Cambiar la configuración hasta que se alcance el volumen deseado.
- Fijar la cabeza de una abeja aprovechado el uso de cera dental suave como en 1.3.2, antes de cortar una abertura en la parte anterior de la cápsula de la cabeza, usando un microscalpel, con tres cortes: uno justo debajo del ocelo mediano (ventral), uno en la frontera del ojo derecho o izquierdo y uno por encima de la antena se deriva (dorsal). Use un pedazo de cera dental para mantener la solapa abierta en su lugar.
- Empuje con cuidado las glándulas y la tráquea acostado en la parte superior del cerebro a un lado el uso de unas pinzas finas, a continuación, hacer una pequeña rotura en el neurilema (membrana muy delgada alrededor del cerebro) por encima de la estructura cerebral específica.
NOTA: Si muchas abejas se equipare a una a la vez, este procedimientopuede realizarse antes; Sin embargo, tenga cuidado de no dejar las abejas en este estado demasiado tiempo (no más de 30 minutos), ya que sus cerebros pueden desecar. - Inserte la punta en la región del cerebro se desea, y ajustar la profundidad perpendicular a la superficie del cerebro (por ejemplo, 60 micras de cálices de setas cuerpo). Inyectar el volumen preestablecido. Por regiones cerebrales laterales, inyectar de forma bilateral (es decir, hacer una inyección a cada hemisferio). Si se utiliza un colorante no fluorescente, garantizar la inyección producido en la región de la derecha en la observación mientras se inyecta. Si se utiliza un colorante fluorescente hacer lo mismo bajo una luz fluorescente usando un microscopio estereoscópico con un sistema de visualización de fluorescencia.
- A continuación, coloque la tapa trasera abierta sobre la cabeza de la abeja. Fundir un cristal de eicosano, que es aproximadamente 1 mm de diámetro, utilizando un alambre delgado envuelto alrededor de la punta de un soldador micro (temperatura de fusión es 35-37 ° C) y sellar los cortes. Esto reducirá en gran medida la mortalidad.
- Liberar elabeja del arnés para el análisis del comportamiento (pero véase el debate), o mantenerse en el arnés para los experimentos en las abejas restringidos - por ejemplo, la extensión probóscide reflejo (PER) 20 pruebas.
- Si se utilizó un colorante fluorescente, asegurarse de que la inyección ha golpeado el área de interés después del experimento es sobre el uso de un microscopio de barrido confocal láser (. Figura 1).
NOTA: Esto es particularmente útil cuando la orientación de las áreas cerebrales más profundas (en los que sería difícil ver colorante fluorescente durante la fase de inyección).
- Preparar el fármaco en Ringer o PBS en la misma manera que en 1.2.1, la adición de un fluorescente (por ejemplo, 0,5 mg / ml de dextrano, Alexa 546 o 568 fluor) o colorante no fluorescente (por ejemplo, metileno 1 mM azul).
2. Métodos de administración del fármaco para las abejas de vuelo libre
- El tratamiento oral
- Preparar fármaco de la misma manera que en los pasos 1.1.1-1.1.2. Añadir solución de fármaco a un alimentador y coloque en el refrigerador para el almacenamiento.
NOTA: Cualquier alimentador va a hacer, tal como una tapa de la botella boca abajo o de un frasco invertida sobre papel de seda. - Capacitar a las abejas a un alimentador por gravedad que contiene 1 M o 0,5M solución de sacarosa mediante la colocación de un alimentador de cerca de la colmena. Una vez que las abejas comienzan búsqueda de alimento en el comedero, mueva gradualmente más lejos hasta que esté a una distancia cómoda para evitar ser picado (mínimo 5 m).
- abejas de pintura para la marca con el fin de hacer un seguimiento de las abejas individuales. Haga una lista de todas las combinaciones de colores que se van a utilizar. Cuando una abeja aterriza en el alimentador, marcan cuidadosamente su abdomen con dos colores, y hacer una nota en la lista que se toma la combinación.
- Cambie el alimentador por gravedad para un alimentador que contiene la solución de fármaco / sacarosa. Tomar nota de las abejas marcadas que visitan el alimentador. La captura de cualquier abeja sin marcar visitar el alimentador ya que las abejas son prolíficos de selección de personal, y el número de abejas que visitan el alimentador drogado puede obtener rápidamente fuera de control. Esto es especialmente problemático si el mismo experimento se va a realizar en días sucesivos, ya que las abejas no tratados previamente ya no podrían ser ingenua.
NOTA: Como alternativa a la formación de abejas individuales a un alimentador, autor anteriors se han alimentado con éxito el agua sacarosa mezclada con las drogas a toda una colmena 21 - 23.
- Preparar fármaco de la misma manera que en los pasos 1.1.1-1.1.2. Añadir solución de fármaco a un alimentador y coloque en el refrigerador para el almacenamiento.
- El tratamiento tópico
NOTA: El objetivo es disolver el compuesto de interés en un disolvente que puede penetrar la cutícula de los insectos ceroso. Diferentes solventes se pueden utilizar para este propósito. Los más comúnmente utilizados incluyen acetona, dimetilformamida (DMF) y dimetilsulfóxido (DMSO).- Evaluar la que funciona mejor disolvente para el compuesto en cuestión. Si se espera que un fenotipo fuerte de una sobredosis (por ejemplo, parálisis o la muerte), las abejas tratar (paso 2.2.2) con una dosis alta (por ejemplo, 20 g de cocaína 7) disuelto en cada uno de los diferentes disolventes y cuidadosamente controlar el tiempo hasta la parálisis o la muerte.
- El uso de un microcapilar 1 l (o una microjeringa, que se puede instalar en un dispensador de repetición apropiada) y el soporte microcapilar, dibujar 1 l de la solución de fármaco (por ejemplo, 381; g / l de la cocaína) en el capilar. Expulsar a la caída, y la pintura con cuidado en el tórax de una abeja marcada. Cubra tan grande de un área de una posible con la solución, en lugar de dejar una gota sólida, como la abeja es entonces probable que el novio fuera. Tenga cuidado de no permitir que el compuesto en contacto con el ala bisagras, o esto puede sacarla fuera del tórax ya lo largo de las alas donde se evaporará sin ser absorbido en la hemolinfa.
NOTA: En función del objetivo de la investigación, este método también se puede utilizar para administrar medicamentos al abdomen de la abeja. Sin embargo, los fármacos lleguen a la CNS más rápido y en mayor cantidad cuando se aplica al tórax método 24 .Este funciona igual de bien con aprovechado como con las abejas de vuelo libre.
- tratamiento volatilizado
- Disolver drogas (anteriormente este método ha sido utilizado para entregar la cocaína a las abejas de miel 10) en etanol al 100%. Para asegurar la solubilidad, no utilice un hidrocloruro u otras formas de sal de ladrogas si es posible. Al hacer una dilución de prepararlo para que la cantidad que se entregará a una abeja está presente en 100 l. El uso de etanol puro como un vehículo de control.
- Para crear un filamento, utilice el mismo procedimiento que McClung y Hirsh 25.
- Explicó brevemente: terminar alambre de nicromo con fuerza alrededor de un clavo y se unen a dos cables eléctricos (uno en cada extremo del filamento). Retire el clavo. La bobina de nicromo restante se conoce como el filamento.
- Pase los dos cables a través de orificios cuidadosamente perforados en la tapa de un tubo de centrífuga de 50 ml, que debe ser resistente a la temperatura elegida. Pegue los cables en su lugar con silicona líquida.
NOTA: Esto hará que el tubo hermético. Esto es esencial para evitar la exposición secundaria al experimentador y asegurarse de que las abejas son tratados con la dosis apropiada.
- Fije los cables que conducen al filamento a una fuente de alimentación. El uso de un termopar para medir la temperatura deel filamento, experimentar con diferentes combinaciones de tensión / corriente hasta una que da como resultado un perfil de temperatura apropiado para el fármaco en cuestión, a ser posible, una que permite durante 10 segundos de calentamiento o menos. Esto es muy importante, se refiere a la bibliografía pertinente (por ejemplo, con el fin de la cocaína para volatilizar necesita ser calentado a al menos 200 ° C, pero a temperaturas superiores a 350 ° C se descompone en compuestos secundarios 26).
- cuidadoso pipeteado 100 l de fármaco que contiene una solución de etanol sobre el filamento. Extender el líquido sobre la superficie de filamento tanto como sea posible ya que esto aumentará la eficiencia de evaporación. Deja el filamento expuesto a temperatura ambiente hasta que todo el etanol se ha evaporado.
NOTA: Si el etanol no se evapora suficientemente, las abejas serán tratados tanto con el fármaco de elección y etanol. Las abejas son extremadamente sensibles al etanol, y algunos medicamentos tienen interacciones sinérgicas con etanol, lo que sesga exLos resultados experimentales. - Una vez que el etanol se ha evaporado por completo (precipitado de drogas por lo general se puede ver en el filamento seco bajo un microscopio), coger una abeja en vuelo libre en un tubo de 50 ml. Cierre con cuidado la tapa que contiene el filamento.
- A su vez en el poder durante 10 segundos, la unidad encendida y espere otros 50 segundos (para permitir que el compuesto volatilizado enfriar y con ello se condensan o depósito). Liberar la abeja.
NOTA: Si bien este método de tratamiento funciona de manera excelente para las abejas de vuelo libre, que puede ser utilizado con la misma eficacia con las abejas enjaezados. Simplemente conecte la abeja aprovechado el interior de un tubo de 50 ml. Actualizar el filamento como se describe en 2.3.4 entre las abejas. Para un mayor rendimiento, varios filamentos se pueden utilizar en paralelo.
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Representative Results
Una selección de los resultados representativos de los métodos descritos anteriormente se muestran, principalmente para demostrar que los métodos permiten a los agentes farmacológicos para alcanzar el cerebro y afectan el comportamiento abeja de la miel.
efectos específicos sobre los procesos cerebrales se pueden obtener fácilmente después de la inyección tórax.
Dado que los agentes farmacológicos inyectaron a través del tórax pueden actuar en múltiples objetivos en el cuerpo, y diluirse en el cuerpo antes de alcanzar el cerebro, esta técnica puede plantear posibles problemas de especificidad. Sin embargo, se ha utilizado ampliamente en la literatura para interferir con los procesos cognitivos, sin la necesidad de utilizar dosis muy altas que podrían producir importantes efectos secundarios. Por ejemplo, los bloqueadores de la transcripción se han administrado mediante esta técnica, con el fin de identificar las fases de memoria que requieren genexpresión. Inyección Thorax de tales moléculas es compatible con la supervivencia durante varios días 27, lo que significa que su acción tóxica potencial sobre otros objetivos se puede limitar, siempre que la concentración está bien elegido. En tales condiciones, efectos selectivos y dependientes del tiempo en la memoria se pueden obtener, mostrando así una selección eficaz del cerebro (. Figura 2).
Difusión de las moléculas en la hemolinfa cabeza conduce a efectos rápidos, dependientes de la dosis.
inyección ocelo es una manera de permitir una difusión rápida de las moléculas de interés en toda la cabeza a través de la hemolinfa, especialmente si pueden tener muchos objetivos generalizados en el cerebro. Este método fue utilizado para administrar allatostatins, neuropéptidos que pueden actuar también como neurohormonas 28). Como consecuencia, una reducción del rendimiento se observó en un ensayo de aprendizaje olfatorio, en consonancia consugerido la presencia de allatostatin receptores en diferentes regiones del cerebro implicadas en el procesamiento olfativo y el aprendizaje 28. Una curva dosis-dependiente de este efecto se pudo establecer, mediante la inyección de diferentes concentraciones de grupos independientes se desarrollan en paralelo (. Figura 3).
Diferentes formas de administración pueden producir efectos similares sobre la función cerebral.
Emetina, un bloqueador de la síntesis de proteínas, se utiliza para impedir la formación de memoria a largo plazo memoria olfativa temprano, lo cual es normalmente expresada 1-2 días después del acondicionamiento. En mayoría de estudios publicados se ha inyectado en el tórax 29. Hemos demostrado que los efectos similares se podrían obtener mediante la administración directamente al cerebro a través del tracto ocelar (Figura 4).: Proporcionar un ajuste de parámetros de inyección (volumen menor, una concentración más alta y más cortoretraso antes acondicionado), se obtiene una disminución (~ 20%) similar a la encontrada en la literatura utilizando la misma cantidad de drogas (10 nM) - comparar con la figura 4 en Stollhoff et al, 2005 29..
Los efectos de las inyecciones localizadas están confinados en el tiempo y en el espacio
Para probar las propiedades espaciales y temporales de las drogas microinyección en regiones específicas del cerebro, las abejas enjaezados fueron entrenados en un olfativa POR paradigma de condicionamiento, y luego se inyectan bilateralmente con 0,5 nl de procaína 740 mM (un anestésico) en los cálices de setas cuerpo o lóbulos verticales ( solución salina se utilizó como control). Cuando las abejas se probaron sucesivamente para la recuperación 1, 2, y 3 horas después de la inyección, el rendimiento sólo fue afectada en abejas con inyecciones bilaterales en los lóbulos (. Figura 5). salida intactos los nervios de los lóbulos, pero no de los cálices, se sabe quesea necesario para la recuperación de la memoria olfativa, así que esto sugiere que la procaína se mantuvo localizado en el lóbulo en el que había sido inyectado durante al menos 3 h. También muestra que, cuando se inyecta en los cálices, la difusión en los lóbulos cercanos se limitó durante el mismo período, ya que una inyección de procaína calycal no dio lugar al bloqueo de los lóbulos.
Fenotipos de comportamiento después de la administración de fármacos a menudo son dependientes del contexto
Los experimentos anteriores han demostrado que después del tratamiento con las abejas de la cocaína sobre-estimar la calidad de una solución de sacarosa 10,30. Para ver si este efecto fue dependiente de contexto (en este caso, la calidad de la línea de base de sacarosa), en vuelo libre abejas melíferas fueron tratados con cocaína volatilizado. Individualmente se les permitió marcados abejas de la miel de vuelo libre al forraje en un alimentador que contiene una solución de sacarosa 1 M. En el alimentador, las abejas fueron capturados suavementeun tubo de centrífuga de 50 ml, ya que estaban a punto de apearse del alimentador. Las abejas fueron tratados con 100 mg de cocaína base o de control del vehículo (etanol se evapora). Después del tratamiento, el alimentador de sacarosa fue reemplazado o bien por un 0,5 M o un alimentador de sacarosa 2,0 M, y los recolectores de tasa regresó al alimentador se registró. El uso de este paradigma, las abejas tratadas con cocaína aumentaron su esfuerzo de búsqueda de alimento en el comedero 0,5 M, pero no en el alimentador de 2,0 M (Figura 6). La diferencia en el efecto visto con las dos concentraciones de sacarosa demuestra muy bien la importancia de tomar las señales ambientales en cuenta al estudiar el comportamiento de las abejas.
Figura 1: El escaneo láser confocal imagen del sitio de inyección. dextrano Alexa 546 marcado con se inyecta junto con la solución de fármaco (rojo). Para identificar el neurópilaSe añade sa contra-tinción con DAPI (verde). En el hemisferio derecho el punto de inyección se encuentra en el lóbulo vertical (VL), que se muestra como un ejemplo para una inyección exitosa. En el hemisferio izquierdo del sitio de inyección se encuentra dorsal del lóbulo vertical en el neuropilo anillo, que se muestra como un ejemplo para una inyección sin éxito. Barra de escala = 100 micras, MB: Cuerpos de setas, AL: antenales lóbulos, d: dorsal, v: ventral, L: izquierdo, R: Sí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efecto dependiente del tiempo de actinomicina D (Transcripción Bloqueador) en la memoria a largo plazo, cuando se inyecta en el tórax En diferentes retrasos siguientes condi olfativo apetito. namiento (6, 9 o 12 h), 1 l actinomicina D (1,5 mM en PBS) se inyectó en el tórax. Memoria (LTM) de recuperación a largo plazo se evaluó después de 3 d acondicionado (n = 25 - 65). Rendimiento de la memoria se redujo de una manera dependiente del tiempo, en comparación con la de los controles tratados con PBS: el efecto fue significativo cuando la inyección demasiado colocar 6 h después del acondicionamiento (χ 2 = 18,04, p <0,005), pero no a retardos más largos ( 9 h: chi 2 = 0,95; 12 h: χ 2 = 0,47), lo que sugiere que la formación de LTM requiere una ola de transcripción que tiene lugar durante una ventana de tiempo definido después del acondicionamiento. Las barras de error representan los errores estándar. Los datos se publicó anteriormente 27 y se vuelve a crear aquí con permiso. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3:. La inhibición dependiente de la dosis de rendimiento de aprendizaje después de la inyección ocelar de un neuropéptido El neuropéptido allatostatin C se inyectó en la hemolinfa de la cabeza (200 nl en PBS), a través de la ocelo mediana, 1 hr antes de acondicionado olfativo. Se capacitó a grupos independientes de los animales inyectados con diferentes concentraciones (o PBS durante los controles). tratamiento allatostatin C condujo a una disminución en el rendimiento de aprendizaje, tal como se evaluó por el porcentaje de respuestas condicionadas en el último acondicionado, de una manera dependiente de la dosis después de una curva en forma de U (n = 70-78). Esta disminución fue significativa a las 10 -6 M, pero no a otras concentraciones. Las barras de error representan los errores estándar. Los datos se publicó anteriormente 28, y está adaptado aquí con permiso. Por favor, haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.
Figura 4:. El bloqueo de memoria ay 1 D después de la inyección de emetina (Traducción inhibidor) a través de la ocelar Tracto La emetina proteína inhibidora de la síntesis de (50 mM en PBS, 200 nl) se inyectó en el cerebro, a través del tracto ocelar, 20 min antes de acondicionado olfativo. a continuación, se puso a prueba de memoria 24 h más tarde. El deteriorado significativamente la retención de tratamiento de memoria (χ 2 = 7,03, p <0,01) en comparación con los controles tratados con PBS (n = 57-70). Las barras de error representan los errores estándar. JM Devaud, datos no publicados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. Anatómico y temporal Especificidad de microinyecciones Después del acondicionamiento olfativo apetito, procaína se inyectó bilateralmente en cualquiera de los cálices de setas cuerpo o lóbulos verticales. Recuperación de la memoria se evaluó 1 hora después de la inyección y sólo se vio afectada por las inyecciones de procaína en los lóbulos (1 hora después del tratamiento: vs. solución salina: χ 2 = 10,00, p <0,005; vs procaína al cálices: χ 2 = 32,92, p < 0,005). El efecto todavía se podía ver 2 horas (χ 2 = 6,65, p <0,01) y 3 (χ 2 = 27,22, p <0,005) después de la inyección, y seguía siendo ubicación específica (2 h: χ 2 = 8,60, p < 0,05; 3 hr: χ 2 = 17,15, p <0,0001), lo que sugiere que sólo la zona de inyección se vio afectada por la procaína. Las proporciones son en relación con nivel de acondicionamiento dusonar el último ensayo de condicionamiento. Las barras de error representan los errores estándar (n = 23-28). Los datos se publicó anteriormente 31, y se recrea aquí con permiso. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6:. Efectos de la cocaína en las abejas que vuelan libremente tasa Visitación (número de visitas de un determinado / el promedio de visitas de abejas para todas las abejas durante el periodo de prueba) se incrementó después del tratamiento de cocaína volatilizado en una fuente de calidad baja (0,5 M: t = 70 5,0710, p = 0,00003), pero no a una fuente de alta calidad (2 M: t 70 = -0,2087, p = 0,8353). Las cajas representan 1º y 3º cuartiles con la línea media que muestra la mediana. Los bigotes se extienden a 1,5x el rango intercuartil. Los valores atípicos no se representan como se superponen todos los puntos de datos individuales. Los datos se publicó anteriormente 10, y se recrea aquí con permiso. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tratamiento | Se puede hacer con las abejas voladoras de libre? | Pros | Contras |
| El tratamiento oral | Sí. | Fácil, mínimamente invasiva. | la digestión de abeja no es sencillo |
| El tratamiento tópico | Sí. | Fácil, mínimamente invasivo, rápido. | Los tratamientos repetidos pueden ser problemáticos. |
| La inyección en el tórax | Complicado,afecta a las abejas habilidades de vuelo | Coherente y sólida. | Un poco invasiva. Potencial de daño / abeja estrés. |
| La inyección en el ocelo mediana | No recomendado. | Coherente y sólida, algo localizada. | Un poco invasiva. Potencial de daño / abeja estrés. |
| La inyección en el tracto ocelar | No recomendado. | muy localizado | Muy invasiva. Potencial de daño / abeja estrés. |
| Micro-inyección en las regiones del cerebro | No recomendado. | muy localizado | Muy invasiva, difícil de realizar. Potencial de daño / abeja estrés. |
| de suministro de fármaco volatilizados | Sí. | Fácil, mínimamente invasivo, rápido. | No funciona para todos los medicamentos. |
Tabla 1: Comparihijo de los diferentes métodos de tratamiento y sus propiedades.
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Discussion
Los métodos descritos anteriormente permiten un tratamiento sencillo, eficaz y robusta de cualquiera de vuelo libre o abejas de la miel con arnés. Estos métodos son compatibles con muchos paradigmas experimentales y cuestiones biológicas (Tabla 1). Todos los métodos de vuelo libre puede aplicarse fácilmente a las abejas con arnés. La inversa es menor éxito, sin embargo, ya que la restricción temporal y métodos de tratamiento invasivo a menudo pueden comprometer la capacidad de vuelo de las abejas.
Los métodos se han presentado desde una perspectiva centrada en el cerebro. Esto no es debido a las limitaciones inherentes de las técnicas, sino más bien debido a intereses personales de los autores. No hay razón por la que estos métodos no se pueden utilizar para el estudio de otros órganos. Sin embargo, pequeñas modificaciones podrían ser necesarias para hacer el método más adecuado para otros sistemas de órganos. Por ejemplo, mientras que el tratamiento tópico destinado a llegar al cerebro es típicamente aplicada al tórax, podría ser mejor aplicar This en el abdomen si el objetivo perseguido es que los ovarios. Del mismo modo, las inyecciones pueden aplicarse fácilmente a otras áreas que el tórax o la cabeza (por ejemplo, órganos abdominales se pueden dirigir mediante la inyección de entre los escleritos abdominales).
En términos de los cuales los compuestos se pueden administrar a las abejas, realmente no hay límites. Normalmente, las personas han administrado compuestos farmacológicos tales como moléculas de señal 21 o sus antagonistas 32, y péptidos a medida 28. Sin embargo, ha habido un aumento reciente en la administración de compuestos de abejas con preguntas aplicadas en mente, tales como pesticidas y contaminantes antropogénicos 33 34. Recientemente, los compuestos administrados han empezado a incluir moléculas de ARN que interfieren con la expresión de genes directamente, como dsRNA activación de la vía de interferencia de ARN 35 o incluso 36 microRNAs y antagomirs 37. No todos los métodos funcionan igual de bien para todos los compuestos.Este es quizás el mejor ejemplo de compuestos amargos o agrios que hacen que el agua azucarada sabor desagradable para las abejas, lo que les impide consumirlo. moléculas frágiles, tales como ARN o ciertos polipéptidos, se descomponen cuando se calientan durante un procedimiento de volatilización o colocado en un disolvente como DMF dura. Por tanto, es importante comprender la química de lo que se administra a asegurarse de que sobrevive el procedimiento de tratamiento.
Conseguir un agente farmacológico en una abeja es la parte fácil, pero hay tres grandes preocupaciones que nunca debe tomarse a la ligera cuando se realizan experimentos farmacológicos. El primero es averiguar una buena dosis para el experimento en cuestión. Dependiendo del medicamento, ya sea anunciado literatura disponible, pero en su mayor parte, esto tendrá que ser resuelta por una mezcla de búsquedas bibliográficas, conjeturas informadas, y las curvas de dosis-respuesta. Dependiendo de la complejidad del protocolo experimental es, podría ser útil paraprimera generar una curva dosis-respuesta en un bioensayo sencillo (por ejemplo, la cuantificación de movimiento global o la supervivencia) para tener una mejor idea de un rango de dosis vale la pena probar en un bioensayo más elaborado. En nuestro laboratorio, una dosis inicial se encuentra en los folletos de abeja o haciendo una conversión mg / kg en base a datos de la literatura de roedores. Desde este punto de partida, las abejas son tratados con la dosis de inicio, además de 2 o 3 dosis 10 veces más grandes y más pequeñas que la dosis inicial (por ejemplo, si la dosis inicial es de 1 mg, 0,01, 0,1, 10, y 100 mg también sería se utiliza), y por supuesto, un vehículo de control apropiado.
El segundo problema es un poco más meticuloso: especificidad de drogas. La mayoría de las drogas no se desarrollaron con las abejas de miel, o cualquier otro insecto, en la mente. Debido a esto, fuera de objetivo efectos son comunes (por ejemplo, mianserina, un antagonista del receptor de serotonina vertebrado 38, mucho tiempo se pensó que sea un insecto octopaminergic antagonista de los receptores, pero reciente fihallazgos muestran que en las abejas también es un antagonista del receptor dopaminérgico 39). Una solución común a este problema es, en lugar de depender de un solo fármaco, para repetir el mismo experimento con un conjunto de fármacos que tienen el objetivo de interés en común. Básicamente, si se conocen varios fármacos para bloquear un determinado objetivo, observando los resultados similares a través de diferentes drogas debe dar mayor confianza en que el fármaco tiene el efecto esperado, ya que los diferentes fármacos a menudo tienen perfiles únicos fuera de objetivo.
La última cuestión consiste en asegurar que el medicamento está actuando donde se supone que está actuando. En este sentido, siempre habrá un equilibrio entre la especificidad y capacidad de invasión. los métodos de tratamiento sistemáticos son generalmente el menos invasivo, pero no hay control de dónde en el cuerpo de la abeja el medicamento está teniendo su efecto. Incluso para la microinyección de tejidos diana fármacos pueden viajar con la hemolinfa a otras partes del cuerpo de la abeja. ¿Cómo se trata esta cuestión neeDS para recibir información de las preguntas formuladas. Para ciertos experimentos localización anatómica es irrelevante, mientras que para otros se trata de la única cuestión de importancia. La mejor manera de abordar esto es comenzar con los tratamientos sistémicos y gradualmente reducir a una localización anatómica mediante el uso de métodos cada vez más específicas. Si el comportamiento que se está estudiando es particularmente incompatible con los métodos de tratamiento invasivo, podría valer la pena tratar de deconstruir en componentes más simples antes de hacer toda una serie de experimentos con tratamientos farmacológicos muy específicas.
Este problema de las fugas de drogas es aún más exagerada con el tratamiento oral de las abejas de vuelo libre, donde las drogas pueden afectar a las abejas no objetivo. abejas recogen el néctar para cosechadoras de forraje en el campo para traer de vuelta a su colonia. Ellos descargar la mayor parte de su solución de sacarosa en la colmena al regresar en lugar de absorberla. En la colmena se embala en las células, deshidratado, y se almacena como la miel. Porqueesto, las drogas pueden afectar potencialmente a las abejas no objetivo. Con los métodos más específicos (tales como microinyección), este problema se reduce al mínimo.
Con estas advertencias en mente, y se abordan adecuadamente, la manipulación neurofarmacológico de las abejas puede ser una herramienta muy poderosa. Mientras que las herramientas transgénicos están siendo desarrollados para las abejas de miel 15, debido a su estilo de vida social, es poco probable que los transgénicos será nunca una manera fácil y confiable para llevar a cabo este tipo de experimentos. Por tanto, es probable que la farmacología seguirá siendo un elemento importante de la investigación de la abeja en el futuro. Mientras que algunos investigadores de abejas han hecho llamadas a los métodos experimentales estandarizados 40, en este caso, esto sería un error. Parte de la potencia del sistema de abeja ha sido siempre la diversidad de enfoques experimentales, y cómo se han desarrollado técnicas con cuestiones biológicas reales en la mente en lugar de al revés. Sin embargo, es importante que garanticemosel uso del método más apropiado para la cuestión que nos ocupa. Si las comparaciones con estudios anteriores son claves, protocolos normalizados deberán cumplirse estrictamente. Sin embargo, utilizando el protocolo establecido por el bien de la utilización de métodos normalizados no se debe permitir a interponerse en el camino del desarrollo de nuevos métodos que pueden abrir nuevas posibilidades experimentales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Any supplier will do |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydrate | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Protection Wax | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Glass capillary | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G NanoFil needle | WPI | NF33BV-2 | |
| Very fine forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| Electrode puller | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| manual micromanipulator | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| electronic micromanipulator | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Junior unit XYZ | |
| stereomicroscope | Leica | M80 | |
| soldering iron | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| small Petri dish | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 50 ml Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| forceps | Australian Entomological Supplies | ||
| Blade holder and breaker | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Feather double edged razor blade | ThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Nichrome wire | Any supplier will do | ||
| Electrical wires | Any supplier will do | ||
| Model paint | Tamiya USA | Depends on colour | |
| Repeating dispenser | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Glass syringe | WPI | NANOFIL | |
| flourescence viewing system | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillary with holder | Drummond | 1-000-0010 | |
| Liquid silicone | Any supplier will do | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
References
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