Summary
Эта рукопись описывает несколько протоколов для введения фармакологических агентов для медоносных пчел, в том числе простых неинвазивных методов для свободно летающих пчел, а также более инвазивных вариантов, которые позволяют точно локализованную обработку сдержанных пчел.
Abstract
Медоносные пчелы демонстрируют удивительные способности обучения и передовые социального поведения и общения. Кроме того, их мозг мал, легко визуализировать и изучать. Таким образом, пчелы уже давно Одобренный модель среди нейробиологов и neuroethologists для изучения нейронной основы социального и естественного поведения. Важно, однако, что экспериментальные методы, используемые для изучения пчел не мешают поведения изучается. Из-за этого, было необходимо разработать ряд методов фармакологической манипуляции медоносных пчел. В этой статье мы покажем способы лечения сдержанные или свободно летающих пчел меда с широким спектром фармакологических агентов. К ним относятся как неинвазивные методы, такие как устные и актуальные лечения, а также более инвазивных методов, которые позволяют для точной доставки лекарственных средств в любом системном или локализованной моды. И, наконец, мы рассмотрим преимущества и недостатки каждого метода и описатьобщие препятствия и как наилучшим образом преодолеть их. В заключение дискуссии о важности адаптации экспериментального метода к биологическим вопросам, а не наоборот.
Introduction
Так как Карл фон Фриш выяснены их танец язык 1, мед пчелы остаются популярным видом исследования для исследователей в поведении животных и нейробиологии. В последние годы множество новых дисциплин появились на пересечении этих двух полей, а также ряд других дисциплин (например, молекулярной биологии, геномики и информатики) возникли рядом с ними. Это привело к быстрому развитию новых теорий и моделей для понимания того, как результаты поведения от деятельности в пределах нервной системы. Из-за уникального образа жизни, богатый поведенческий репертуар и простота экспериментальной и фармакологической манипуляции, пчелы остаются на переднем крае этой революции.
Медоносные пчелы используются для изучения основных нейробиологических такие вопросы, как те , лежащих в основе обучения и памяти 2,3, принятия решений 4, 5, обонятельной или визуальной обработки 6. В последние годы, хонEY пчелы даже был использован в качестве модели для изучения темы , как правило , отведенные для медицинских исследований, таких как последствия привыкание наркотики 7 - 11, 12 сон, старение 13, или механизмы , лежащие в основе анестезии 14.
В отличие от классических генетической модели организмов (например, дрозофилы, С. Элеганс, М. Musculus), существует очень мало генетических инструментов , доступных для манипулирования нейронные функции в медоносных пчел, хотя это в настоящее время меняется 15. Вместо этого, мед пчелы исследования в основном опирались на фармакологических манипуляций. Это было очень успешным; Тем не менее, разнообразие исследований пчелиного таково, что целый ряд методов для фармакологического управления необходимы. Исследования с медоносных пчел обращается к весьма разнообразные вопросы, изучается исследователями из различных дисциплин и фонов, а также использует различные экспериментальные подходы. Многие ResEарочные вопросы требуют пчел либо свободный полет, свободно взаимодействуя в своей колонии, или обоих. Это может сделать это трудно отслеживать отдельные экспериментальных животных, и делает сдержанность или катетеризацию неосуществимой.
Для размещения разнообразие исследований медоносной пчелы, различные методы доставки лекарственных средств необходимы, что обеспечивает надежную и гибкую администрирования, обеспечивая при этом, что фармакокинетические и фармакодинамические профили, инвазивность метода, и его надежность, подходит парадигму о котором идет речь. Из-за этих разнообразных потребностей, большинство исследовательских групп разработали свои собственные уникальные методы введения лекарственных средств. До сих пор это было сила пчелиного научного сообщества; это привело к разработке массивов методов, позволяющих для введения одного и того же препарата в разных обстоятельствах. Наша цель здесь не разработать единый стандартизованный метод фармакологических манипуляций пчел, а скорее, чтобы подчеркнуть, что методыоказались особенно успешными, и помогает исследователям принять их. Мы обсудим основные принципы того, как они работают, а также их преимущества и недостатки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Администрация Препарат для запряг Пчелы
- пероральное лечение
- Готовят раствор 1,5 М сахарозы путем смешивания 257 г сахарозы с 500 мл воды (это легче растворить такое количество сахарозы в кипящей воде). Хранить раствор сахарозы при 4 ° С до использования.
Примечание: Сахароза решение обеспечивает очень благоприятную среду для определенных микроорганизмов, и, таким образом, легко загрязняется и неприятны для пчел. Основной объем раствора сахарозы может быть аликвоты и хранили при -20 ° С до использования. - Принятие решения о соответствующей дозы препарата (как достигнуть этого, рассматривается в разделе обсуждения ниже), и подготовить решение , такое , что предпочтительная доза препарата растворяют в 20 мкл раствора сахарозы (например, поставить 20 мкг, развести препарат в соотношение 1 мг / мл). Осваивать пчел согласно Felsenberg и др. (2011) 16. Сделайте этот шаг по крайней мере, 12 ч до лечения препаратом, чтобы гарантировать, что пчелы не больше не подчеркнул оут из обуздывать, когда представлен лекарственный раствор.
Примечание: Для получения более стабильных результатов, то лучше голодать пчел (размещая запряженных пчел в термостате при 34 ° С и 70% влажности) O / N. - Использование микропипетки, нажмите каплю 1,5 М сахарозы воды к антенне запряженной пчелы. Когда хоботок удлиняется, сенсорный 20 мкл капли 1,5 М сахарозы, содержащей лекарственное средство непосредственно к хоботок пчелы в. Убедитесь, что пчела потребляет все. В качестве контроля транспортного средства используют 1,5 М раствор сахарозы без добавления препаратов.
Примечание: Количество раствора сахарозы, возможно, должны быть скорректированы на основе экспериментальных планов. Если аппетитивная кондиционирования предназначен, кормление пчел только до тренировки будут мешать отзывчивость пчел. - Выбросить или отставить пчел, которые не потребляют все сахарозы.
Примечание: Если большое количество пчел не пить раствор сахарозы, график кормления, возможно, потребуется скорректировать.
- Готовят раствор 1,5 М сахарозы путем смешивания 257 г сахарозы с 500 мл воды (это легче растворить такое количество сахарозы в кипящей воде). Хранить раствор сахарозы при 4 ° С до использования.
- Инъекция в грудной клетке
- Готовят препарат в медоносной пчелы Ringer 17 следующим образом :
- Смешать и автоклав 7,45 г NaCl, 0,448 г KCl, 0,812 г MgCl 2, 0,735 г CaCl 2, 54,72 г сахарозы, 4,95 г D-глюкозы, и 2,48 г HEPES в 1000 мл воды. Будьте осторожны при хранении Ringer, как она легко загрязняется. Алиготе и хранить Рингера при -20 ° С до использования.
- Растворить препарат в растворе Рингера, а затем разбавленную таким образом, чтобы желаемое количество присутствует в 5 мкл. В качестве примера, если пчелы должны быть обработаны с помощью 5 мкг препарата, 1 г может сначала быть растворено в 1 мл в Ringer, перед тем, как разбавленный 1: 1000 в Рингера для окончательного решения 1 мкг / мкл.
Примечание: В качестве альтернативы, коммерчески доступный PBS (фосфатно-буферном Salin) может быть использован вместо раствора Рингера.
- Сделать microscalpel разрывая угол обоюдоострым лезвием бритвы сдержатель лезвия. Приложить фрагмент лезвия для держателя лезвий таким образом, что он делает хорошее лезвие с острым концом точки.
- Под стереомикроскопа, аккуратно использовать microscalpel отрезать 2 мм отверстие чуть выше щитка, рядом с задним процессом грудной клетки пчелы крыла. Избегайте резки слишком глубоко, так как это может повредить мышцы полета, и быть осторожными, чтобы избежать петли крыла. В идеале, только вырезать три стороны, так что лоскут кутикулы позже можно сложить, чтобы закрыть сайт травмы.
- Использование микропипетки, депозит 5 μlL Ringer (или PBS), содержащую лекарственное средство поверх отверстия в грудной клетке. Тщательно контролировать под микроскопом, чтобы убедиться, что весь капля всасывается в гемолимфе. С помощью звукового сигнала вызова (или PBS) в качестве управления транспортным средством.
- Если это возможно, переместите кутикулы лоскут над отверстием. Через 5-10 ч, он будет снова прикрепить и запечатать.
Примечание: В качестве альтернативы этому способу, вводят 1 мкл непосредственно в грудную клетку с помощью стеклянного шприца, после открытия СМАЛ.Л. отверстие в середине уздечки (поперечной линии в задней области щитком) с помощью шприца с иглой (диаметр: 0,6 мм, G: 23). Это избежать необходимости сначала разрезать грудную клетку с помощью скальпеля и месте инъекции меньше, но этот метод будет оставить место инъекции подвергаются.
- Готовят препарат в медоносной пчелы Ringer 17 следующим образом :
- Глазок инъекции
Примечание: Этот метод пригоден для доставки молекул в течение всего головной капсулы, в гемолимфе.- Готовят наркотики, как в 1.2.1, но регулировать концентрации лекарственного средства таким образом, что требуемая доза будет содержаться в 1 мкл Ringer или PBS (меньше объем может всасываться через отверстие глазка, чем через грудную клетку).
- Приготовьте microscalpel как в пункте 1.2.2. Под стереомикроскопа, зафиксировать голову запряженной пчелы на месте путем заполнения расщелину шеи с воском. С помощью низкотемпературного плавления воска (например, зубной воск), чтобы избежать повреждения антенальный обонятельные рецепторы или другие клетки , которые могут быть , яmportant для оценки поведения (например, обонятельные обучения). Затем осторожно снимите объектив срединного глазка, вставив кончик microscalpel под объективом и аккуратно Освободиться от головной капсулы объектив.
Примечание: Кроме того, можно аккуратно поместить воск над антеннах, чтобы предотвратить движение. - Тщательно пипеткой препарат на глазка отверстие. Подождите, пока все не будет принято в головной капсулы. Удалить зубной воск из усиков и позволяют пчелиный отдохнуть некоторое время, прежде чем продолжить экспериментальную процедуру. С помощью звукового сигнала вызова (или PBS) в качестве управления транспортным средством.
- Инъекции в глазковый тракта
ПРИМЕЧАНИЕ: глазковый тракт содержит крупные волокна, соединяясь большинстве регионов центрального мозга 18. Этот метод лечения позволяет применять соединения только мозга, но не ориентированные на конкретные субрегионы мозга.- Подготовка пчел, как в 1.3.2. и снимите объектив срединного глазка с тф из microscalpel, как в 1.3.3.
Примечание: Это может быть сделано до 2 часов до инъекции. Основываясь на нашем опыте, кормят пчел лучше способны справиться с этой операцией, чем изголодавшимися пчел - Наполните стеклянный шприц 10 мкл оснащен небольшим датчиком (например, 33, диаметр: 210 мкм) игольчатые с раствором лекарственного средства получали , как в версии 1.3.1.
- С помощью ручного микроманипулятор, вставьте кончик шприца через глазковый сетчатки в головной капсулы на глубину 50 мкм и впрыснуть 250 нл раствора.
- После использования промыть шприц 3 раза дистиллированной водой, а затем 3 раза 75% -ным этанолом.
- Подготовка пчел, как в 1.3.2. и снимите объектив срединного глазка с тф из microscalpel, как в 1.3.3.
- Микроинъекции в частности структур мозга
Примечание: В дополнение к систематическим лечения указанных выше, можно выполнять микроинъекций в конкретных структурах мозга. Это позволяет фармакологической манипуляции одной или нескольких областях головного мозга, в то время как оставляя другие без изменения. Это работаетлучше всего с областями мозга, которые легко распознать от передней поверхности головного мозга (например, усиков долей, грибных чашечек тела или вертикальными лопастями, или зрительных долей), но и другие регионы были направлены. Обратите внимание , что ориентация (передний / задний, спинной / вентральный) относится к оси тела, скорее, чем к нейрооси 19.- Готовят препарат в Ringer или PBS таким же образом , как в 1.2.1, при добавлении флуоресцентной (например, 0,5 мг / мл декстрана, Alexa 546 или 568 Fluor) или нефлуоресцентный краситель (например, 1 мМ метиленового синего).
Примечание: Добавление флуоресцентного красителя позволит верификацию места впрыска после моего опыта (с использованием конфокальной микроскопии, после рассечения мозга), в то время как нефлуоресцирующих красители позволяют осуществлять прямое наблюдение в ходе эксперимента. - Для того, чтобы стеклянные пипетки для инъекций, вставьте стеклянные капилляры правильного диаметра в держатель зажимов электрода съемник (1,0 мм для стандартного удержанияэр включены для microinjector, упомянутых в списке материалов). Отрегулируйте тянуть и тепловые параметры, чтобы произвести приблизительно длиной 0,5 см наконечник (настройки будет отличаться для каждого съемника, даже если та же модель используется).
Примечание: В идеале, два пипеток вытащили из одного стекла должны иметь одинаковую длину и форму, так, что оба они могут быть использованы. - Под стереомикроскопа, перерыв кончики, чтобы получить наружный диаметр около 10-15 мкм, на основе визуальной оценки с использованием шкалы на координатной сетке, вставленного в окуляр. Шаги по шкале определяются изготовителем, и может быть скорректировано для увеличения используемого.
- Затем заполняют стеклянные пипетки с раствором, чтобы впрыснуть. Если стеклянные капилляры нитей используются, заполнить пипетку, помещая заднюю сторону в раствор лекарственного средства, в противном случае заполнить наконечник с помощью microloader советы.
- Вставьте заполненный стеклянной пипетки в держатель капилляра в microinjector, который управляется вручную или электронным миcromanipulator.
- Откалибруйте microinjector впрыснуть нужного объема (0,5-2 NL, в зависимости от размера структуры мозга целевого). Для этого вводят непосредственно в небольшую чашку Петри, содержащую минеральное масло, и измерить диаметр капли с координатной сеткой. Изменение настроек до тех пор, пока не будет достигнут желаемый объем.
- Зафиксируйте голову запряженной пчелы с помощью мягкой зубной воск, как в 1.3.2, перед нарезкой отверстие в передней части головной капсулы, используя microscalpel, с тремя разрезами: один чуть ниже срединного глазка (брюшного), по одному граница правого или левого глаза и один над антенной стеблями (спинные). Используйте кусок зубной воска, чтобы держать открытую створку на месте.
- Осторожно придвинуть железы и трахеи лежит на верхней части головного мозга в сторону с помощью тонких щипцов, а затем сделать небольшой разрыв в neurilemma (очень тонкая мембрана вокруг мозга) превышает целевой структуры мозга.
Примечание: Если много пчел лечиться сразу, эту процедуруможет быть выполнена раньше; Однако, будьте осторожны, чтобы не оставить пчел в таком состоянии слишком долго (не более 30 мин), так как их мозг может высыхать. - Вставьте наконечник в нужном участке мозга, и регулировать глубину перпендикулярно к поверхности головного мозга (например, 60 мкм для чашечек грибной тела). Вводят заданный объем. Для боковых областей головного мозга, впрыснуть на двусторонней основе (т.е. делать одну инъекцию в каждом полушарии). Если нефлуоресцентный краситель используется, обеспечивает инъекции произошло в правой области при наблюдении при нагнетании. Если используется флуоресцентный краситель сделать то же самое при флуоресцентном освещении с использованием стереомикроскопа с системой просмотра флуоресценции.
- Затем поместите открытую створку над головой пчелы. Melt кристалл эйкозана, что примерно на 1 мм в диаметре, с помощью тонкой проволоки, свернутой вокруг кончика микро паяльника (температура плавления 35-37 ° С) и запечатать сокращений. Это позволит значительно снизить смертность.
- Выпуститьпчелы от жгута проводов для поведенческого анализа (но обсуждение см), или держать в жгуте для экспериментов по сдержанных пчел - например, расширение хоботок рефлекс (PER) тестирование 20.
- Если флуоресцентный краситель использовали, убедитесь , что инъекции попал в сферу интересов после того, как эксперимент по сравнению с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (рис. 1).
Примечание: Это особенно полезно при ориентации более глубокие области мозга (там, где это было бы трудно увидеть нефлуоресцирующих красителя во время фазы впрыска).
- Готовят препарат в Ringer или PBS таким же образом , как в 1.2.1, при добавлении флуоресцентной (например, 0,5 мг / мл декстрана, Alexa 546 или 568 Fluor) или нефлуоресцентный краситель (например, 1 мМ метиленового синего).
2. Методы введения лекарственных средств для свободно летающих пчел
- пероральное лечение
- Готовят препарат таким же образом, как на этапах 1.1.1-1.1.2. Добавьте лекарственный раствор в фидере и поместить в холодильник для хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любой фидера будет делать, например, перевернутой крышки бутылки или баночки перевернутой на папиросную бумагу. - Поезд пчел гравитационный фидер, содержащим 1 М или 0,5М раствор сахарозы путем размещения устройства подачи близко к улья. После того, как пчелы начинают нагула на фидер, постепенно переместить его дальше, пока не будет на удобном расстоянии, чтобы избежать ужалила (минимум 5 м).
- Краска-знак пчелы для того, чтобы следить за отдельными пчелами меда. Составьте список всех цветовых комбинаций, которые будут использоваться. Когда пчела земли на фидер, тщательно отметьте его живот с двумя цветами, и сделать отметку в списке, который берется комбинация.
- Поменять местами подачи самотеком для питателя, содержащего лекарственный раствор / сахарозы. Обратите внимание на отмеченных пчел, которые посещают кормушку. Уловить без опознавательных знаков пчелы во время посещения фидер, как пчелы плодовитыми рекрутеры, а количество пчел, посещающих наркотическое фидер может быстро выйти из-под контроля. Это особенно проблематично, если тот же самый эксперимент должен быть выполнен в последующие дни, так как наивные пчелы может больше не быть наивными.
Примечание: В качестве альтернативы к обучению отдельных пчел с фидером, предыдущий авторs успешно кормили сахарозы воду наркотиков кружевной ко всему улье 21 - 23.
- Готовят препарат таким же образом, как на этапах 1.1.1-1.1.2. Добавьте лекарственный раствор в фидере и поместить в холодильник для хранения.
- Местное лечение
Примечание: Цель состоит в том, чтобы растворить интерес соединения в растворителе, который может проникать через кутикулу восковой насекомых. Различные растворители могут быть использованы для этой цели. Наиболее часто используемые включают в себя ацетон, диметилформамид (ДМФ) и диметилсульфоксид (ДМСО).- Оценка, которая работает растворитель лучше всего подходит для соединения под рукой. При сильном фенотип , как ожидается , от передозировки (например, паралич или смерть), лечат пчел (этап 2.2.2) с высокой дозой (например, 20 мкг кокаина 7) , растворенного в каждой из различных растворителей и тщательно следить за время до паралича или смерть.
- С помощью 1 мкл микрокапилл (или микрошприца, которые могут быть установлены на соответствующем повторяющемся дозатором) и держатель микрокапиллярной, рисовать 1 мкл лекарственного раствора (например, 381 г / мкл кокаина) в капилляр. Выгнать капли, и осторожно покрасить его на грудную клетку заметному пчелы. Накройте, как большой из области относительно возможного с раствором, а не оставляя твердый капли, как пчела, то, скорее всего, жениху его. Будьте осторожны, чтобы не допустить соединение в контакт крыло петли, или это может сделать его грудную клетку и вдоль крыльев, где она будет испаряться, не будучи поглощены в гемолимфе.
Примечание: В зависимости от цели исследования, этот метод может быть также использован для введения лекарств в брюшной полости пчелы. Тем не менее, наркотики достигают ЦНС быстрее и в больших количествах , когда применяется к грудной клетке 24 .Это метод работает одинаково хорошо с запрягали , как со свободно летающих пчел.
- улетучивается лечение
- Растворите наркотики (ранее этот метод был использован для доставки кокаина пчелам 10) в 100% этаноле. Для того, чтобы обеспечить растворимость, не используют гидрохлорид или другие солевые формынаркотиков, если это возможно. При изготовлении разбавление подготовить его таким образом, чтобы сумма будет доставлен пчела присутствует в 100 мкл. Используйте чистый этанол в качестве управления транспортным средством.
- Чтобы создать нить, используйте ту же процедуру , как и Мак - Кланга Хирш 25.
- Кратко объяснил: ветер нихромовой проволоки плотно вокруг ногтя и прикрепить к двум электрическим проводам (по одному на каждом конце нити). Удалите гвоздь. Оставшийся нихром катушки упоминается как нити.
- Пропустите два провода через тщательно просверленные отверстия в крышке центрифуги трубки 50 мл, который должен быть устойчивым по отношению к выбранной температуры. Клей провода в месте с жидким силиконом.
Примечание: Это сделает герметичную трубку. Это очень важно, чтобы избежать вторичного воздействия экспериментатора и гарантировать, что пчелы обрабатывают соответствующие дозы.
- Приложить провода, ведущие к нити к источнику питания. С помощью термопары для измерения температурынить, эксперимент с различным напряжением / током комбинации, пока один, что приводит к соответствующему профилю температуры для лекарственного средства в вопросе, в идеале, один, что позволяет в течение 10 секунд нагрева или меньше. Это очень важно, обратитесь к соответствующей литературе (например, для того , чтобы кокаина испаряться он должен быть нагрет до по меньшей мере 200 ° С, но при температуре выше 350 ° С она разбивается на вторичных соединений 26).
- Тщательно пипетку 100 мкл лекарственного раствора, содержащего этанол на нити. Спред жидкость на столько же поверхности нити накала, как это возможно, так как это позволит повысить эффективность испарения. Оставьте нить подвергается при комнатной температуре, пока весь этанол не испарится.
Примечание: Если этанол не достаточно испарилась, пчелы будут лечить как препарат выбора и этанола. Пчелы чрезвычайно чувствительны к этанолу, и некоторые препараты имеют синергетические взаимодействия с этанолом, который будет смещения ехриментальные результаты. - После того, как этанол полностью испарится (осадок препарат обычно можно увидеть на сухой нити под микроскопом), поймать свободно летящая пчела в 50 мл трубки. Осторожно закройте крышку, содержащую нити.
- Включите питание в течение 10 секунд, выключите питание и подождите еще 50 секунд (чтобы позволить улетучивается соединение для охлаждения и тем самым уплотнить или депозит). Отпустите пчел.
Примечание: В то время как этот метод лечения прекрасно работает для свободно летающих пчел, он может быть использован так же, как эффективно с обузданные пчел. Просто прикрепите запряженных пчел внутри 50 мл трубки. Обновить нить, как описано в разделе 2.3.4 между пчелами. Для получения более высокой пропускной способностью, несколько нитей могут быть использованы параллельно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выбор репрезентативных результатов для методов, описанных выше, показаны, в основном, чтобы продемонстрировать, что методы позволяют фармакологические средства, чтобы достичь мозга и влияют на поведение мед пчелы.
Конкретные эффекты на мозговые процессы могут быть легко получены после инъекции грудной клетке.
Так как фармакологические средства впрыскивают через грудную клетку, может действовать на нескольких мишеней в организме, а также получить разбавленный в организм до достижения мозга, эта методика может вызвать возможные проблемы специфичности. Тем не менее, он широко используется в литературе, чтобы препятствовать когнитивные процессы, без необходимости использовать очень высокие дозы, которые могут принести серьезные побочные эффекты. Например, блокаторами транскрипции вводили с помощью этой техники, для того, чтобы идентифицировать фазы памяти, которые требуют генавыражение. Инъекции Thorax таких молекул совместима с выживанием в течение нескольких дней 27, а это значит , что их потенциал токсическое действие на другие цели могут быть ограничены, при условии , что концентрация хорошо подобрана. В таких условиях, селективные и зависимые от времени воздействия на память можно получить, показав тем самым эффективное нацеливание мозга (рис. 2).
Диффузия молекул в голову гемолимфы приводит к быстрой, дозозависимое эффектов.
Глазок инъекции является способом для того, чтобы быстро диффузии молекул, представляющих интерес в всей головы через гемолимфы, особенно, если они могут иметь много распространенные цели в головном мозге. Этот метод был использован администрировать allatostatins, нейропептиды , которые также могут выступать в качестве нейрогормонов 28). Как следствие, снижение производительности наблюдалось в обонятельной анализе обучения, в соответствии спредлагаемое наличие allatostatin рецепторов в различных областях головного мозга , участвующих в обонятельной обработки и обучения 28. Зависимый от дозы кривая для этого эффекта может быть установлена, путем введения различных концентраций независимых групп работающих параллельно (рис. 3).
Различные способы введения могут привести к подобным эффектам на функцию мозга.
Эметин, блокатор синтеза белка, используется для ухудшать образование раннего обонятельная памяти долговременной памяти, которая, как правило, выражается через 1-2 дней после кондиционирования. В большинстве опубликованных исследований , она была введена в грудной клетке 29. Мы показали , что подобные эффекты могут быть получены при введении его непосредственно в мозг через глазковый тракта (Рисунок 4) . : Обеспечение корректировки параметров впрыска (меньший объем, высокую концентрацию и корочеЗадержка перед кондиционированием), мы получили снижение (~ 20%) , аналогичный в литературе , используя такое же количество наркотиков (10 нМ) - сравните с рисунком 4 в Stollhoff и др, 2005 29..
Эффекты локализованных инъекций ограничены во времени и пространстве
Чтобы проверить пространственные и временные свойства препаратов микроинъекции в конкретных областях мозга, запряженных пчел прошли обучение в обонятельной PER парадигме кондиционирования, а затем вводят на двусторонней основе с 0,5 нл 740 мМ новокаин (обезболивающее средство) в чашечек грибов тела или вертикальных лопастей ( Физиологический раствор использовали в качестве контроля). Когда пчелы были последовательно испытаны для повторного вызова 1, 2 и 3 ч после инъекции, производительность была нарушена только у пчел с двусторонними вливаниями в долях (рис. 5). Неповрежденными нейронная выход из лепестков, а не из чашечек, как известно,необходимо для обонятельной восстановления памяти, так что это говорит о том, что прокаин оставались локализованными в доле, в которой он был впрыскиваемого в течение по крайней мере 3 часов. Он также показывает, что при введении в чашечек, диффузия в соседние лопасти была ограничена в течение того же периода, так как calycal инъекции новокаин не приводило к блокаде лепестков.
Поведенческие фенотипы после введения лекарственного средства часто являются контекстно-зависимыми
Предыдущие эксперименты показали , что после обработки пчел кокаина переоценивать качество раствора сахарозы 10,30. Для того, чтобы увидеть, если этот эффект зависел от контекста (здесь базового качества сахарозы), свободно летающих пчел обрабатывали улетучивается кокаина. Индивидуально отмечены свободно летающих мед пчелы давали корм в фидере, содержащего 1 М раствор сахарозы. На фидере, пчелы аккуратно захватили вцентрифужные пробирки 50 мл, как они собирались зажженным от кормушки. Пчелы обрабатывали либо 100 мкг свободного основания кокаина или управления транспортным средством (выпаривали этанол). После обработки питатель сахарозы либо заменен на 0,5 м или питателем с 2,0 М сахарозы, а фуражиры возвратилось к питатель был записан. Используя эту парадигму, кокаин обработанных пчел увеличили нагула усилие на фидере 0,5 М, а не на 2,0 М фидера (рисунок 6). Разница в эффекте видели с двумя концентрациями сахарозы хорошо демонстрирует важность принятия экологических сигналы во внимание при изучении поведения пчелы.
Рисунок 1: конфокальной лазерной сканирующей Изображение инъекции. Alexa 546-меченых декстрана вводят вместе с раствором лекарственного средства (красного цвета). Для идентификации нейропиляса против окрашивания DAPI добавляется (зеленый). В правом полушарии участок инъекции был расположен в вертикальной лопастью (VL), показано в качестве примера для успешной инъекции. В левом полушарии участок инъекции располагался дорсальные вертикальной лопастью в кольце нейропиля, показанном в качестве примера для неудачной инъекции. Шкала бар = 100 мкм, MB: грибовидные тела, AL: Усиковые Лопасти, d: спинной, v: вентральный, л: левое, г:. Правый Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Временная зависимость Влияние Актиномицин D (Транскрипция Blocker) на долговременной памяти, когда впрыскивается в Thorax при различных задержках следуя аппетитивной обонятельной кондицион. заплат (6, 9 или 12 ч), 1 мкл актиномицин D (1,5 мМ в PBS) вводили в грудную клетку. Долговременная память (LTM) извлечение оценивали 3 D после кондиционирования (п = 25 - 65). Производительность памяти была уменьшена в зависимости от времени моды, по сравнению с PBS-контрольной группой, обработанной: эффект был значительным , когда инъекции слишком место через 6 часов после кондиционирования (х 2 = 18,04, р <0,005), но не при более длительных задержек ( 9 ч: х 2 = 0,95; 12 ч: χ 2 = 0,47), предполагая , что формирование LTM требует волну транскрипции , которая происходит в течение определенного временного окна после кондиционирования. Столбики ошибок обозначают стандартные ошибки. Данные были ранее опубликованы 27 и воссоздан здесь с разрешения автора . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
4695 / 54695fig3.jpg "/>
Рисунок 3:. Дозозависимое ингибирование Изучения СЛЕДОВАНИЕ глазковый инъекции нейропептид нейропептида allatostatin C вводили в головку гемолимфы (200 нл в PBS), через срединную глазка, 1 час до того обонятельного кондиционирования. прошли обучение Независимые группы животных, которым вводили с различными концентрациями (или PBS для контроля). Лечение Allatostatin С приводило к снижению производительности обучения, как оценено процент условных реакций в последнем кондиционирования, в зависимости от дозы, следуя кривой U-образной формы (n = 70-78). Это снижение было значимым при 10 -6 М , но не при других концентрациях. Столбики ошибок обозначают стандартные ошибки. Данные были опубликованы ранее 28 и адаптирован здесь с разрешения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную верSion этой фигуры.
Рисунок 4:. Блокада 1 D ау памяти после инъекции эметин (Перевод ингибиторной) через глазковый Тракт ингибитором синтеза белка эметин (50 мМ в PBS, 200 нл) вводили в мозг, через глазковый -кишечного тракта, за 20 мин до обонятельная кондиционирования. Затем память была протестирована через 24 часа. Лечение значительно ухудшается сохранение данных в памяти (χ 2 = 7,03, р <0,01) по сравнению с PBS-контрольной группой, обработанной (п = 57-70). Столбики ошибок обозначают стандартные ошибки. JM Devaud, неопубликованные данные. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 5: Анатомические и Temporal Специфичность микроинъекции После аппетитивной обонятельной кондиционирования, прокаин впрыскивали на двусторонней основе в либо на чашечек грибов тела или вертикальных лопастей. Извлечение памяти оценивали через 1 час после инъекции и была затронута только прокаин инъекции в долях (1 час после лечения: по сравнению с физиологическим раствором: χ 2 = 10,00, р <0,005; против новокаин до чашечек: χ 2 = 32,92, р < 0,005). Эффект можно видеть еще 2 ч (х 2 = 6,65, p <0,01) и 3 (х 2 = 27,22, р <0,005) после инъекции, и до сих пор с определенным местоположением (2 ч: χ 2 = 8,60, р < 0,05; 3 ч: χ 2 = 17,15, р <0,0001), предполагая , что только нагнетаемый область была затронута новокаин. Пропорции относительно уровня кондиционирования дюкольцо последнего процесса кондиционирования. Столбики ошибок обозначают стандартные ошибки (п = 23-28). Данные были опубликованы ранее 31, и воссоздан здесь с разрешения автора . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 6: Влияние кокаина на свободно летающих пчел скорость Visitation (число посещений данной пчелиных / среднее количество посещений для всех пчел в течение испытательного периода) было увеличено следующие летучем обработки кокаина у источника низкого качества (0,5М: T 70 = 5,0710, р = 0,00003), но не в качестве источника высокого качества (2М: T 70 = -0,2087, р = 0,8353). Коробки представляют собой 1 - й и 3 - й квартили с средней линии , показывая медиану. Усы продлить до 1,5х межквартильный диапазон. Выпадающие не на графике как все отдельные точки данных накладываются. Данные были опубликованы ранее 10, и воссоздан здесь с разрешения автора . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| лечение | Может быть сделано с летающих пчел на свободных? | Профи | Минусы |
| пероральное лечение | Да. | Легко, минимально инвазивной. | Bee пищеварение не является простым делом |
| Местное лечение | Да. | Легкий, минимально инвазивные, быстро. | Повторные курсы лечения может быть проблематичным. |
| Инъекция в грудной клетке | Сложно,влияет на пчел летать способности | Последовательное и надежный. | Несколько инвазивными. Потенциал вредить / стресс пчел. |
| Инъекция в срединной глазка | Не рекомендуется. | Последовательное и надежный, несколько локализованы. | Несколько инвазивными. Потенциал вредить / стресс пчел. |
| Инъекции в глазковый тракта | Не рекомендуется. | Очень локализованы | Очень инвазивными. Потенциал вредить / стресс пчел. |
| Микро-инъекции в областях мозга | Не рекомендуется. | Очень локализованы | Очень инвазивные, трудно выполнить. Потенциал вредить / стресс пчел. |
| Улетучивается доставки лекарственного средства | Да. | Легкий, минимально инвазивные, быстро. | Не работает для всех препаратов. |
Таблица 1: Compariсын различных методов лечения и их свойства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы, описанные выше, позволяют простое, эффективное и надежное лечение любого свободного полета или запряженных медоносных пчел. Эти методы совместимы со многими экспериментальными парадигмами и биологических вопросов (таблица 1). Все методы свободно летающих можно легко применить к запряженных пчел. Обратное менее успешным, однако, так как временная сдержанность и инвазивные методы лечения часто могут поставить под угрозу способность летающий пчел.
Эти методы были представлены с точки зрения мозга ориентированных. Это не из-за ограничений, присущих технике, а скорее из-за личных интересов авторов. Там нет причин, почему эти методы не могут быть использованы для изучения других органов. Тем не менее, небольшие изменения могут быть необходимы, чтобы сделать этот метод более подходит для других систем органов. Например, в то время как местное лечение предназначено достичь мозга, как правило, применяется к грудной клетке, возможно, было бы лучше применить Тхиs к животу, если намеченная цель яичники. Аналогичным образом , инъекции могут быть легко применены к другим областям , чем грудная клетка или головы (например, органы брюшной полости могут быть направлены путем введения между брюшной склеритах).
С точки зрения которых соединения могут быть введены для пчел, действительно нет никаких ограничений. Как правило, люди вводят фармакологические соединения , такие как сигнальные молекулы 21 или их антагонистов 32 и заказных пептидов 28. Тем не менее, в последнее время наблюдается увеличение введение пчел соединений с прикладных вопросов в виду, таких как пестициды 33 и антропогенных загрязнителей 34. В последнее время соединения , вводимые начали включать молекулы РНК , которые препятствуют экспрессии генов непосредственно, например, дцРНК активируя РНК - интерференция Pathway 35 или даже 36 микроРНК и antagomiRs 37. Не все методы работают одинаково хорошо для всех соединений.Это, пожалуй, лучше всего иллюстрируется горьких или кислых соединений, которые делают сахар вода неприятны для пчел, тем самым предотвращая их от ее потребления. Хрупкие молекулы, такие как РНК или некоторых полипептидов, разлагаются при нагревании во время процедуры улетучивания или помещен в суровом растворителе, таком как ДМФ. Поэтому важно, чтобы понять химию, что мир управляется, чтобы гарантировать ее выживает процедуру лечения.
Получение фармакологического агента в пчела легкая часть, но есть три большие опасения, что никогда не следует воспринимать легкомысленно при проведении фармакологических экспериментов. Первый выяснить хорошую дозу для эксперимента в вопросе. В зависимости от препарата, там уже может быть опубликована литература доступна, но по большей части, это должны быть решены с помощью смеси литературных поисков, сообщил догадок и кривые доза-реакция. В зависимости от того, насколько сложным экспериментальный протокол является, возможно, было бы полезносначала создать кривую доза-ответ в более простом биопроб (например, количественной оценки общего движения или выживание) , чтобы получить более полное представление о дозе диапазона стоит попробовать в более сложном биопроб. В нашей лаборатории, начальная доза либо содержится в пчелином литературе или делая мг / кг преобразование на основе данных из грызунами литературы. С этой отправной точки, пчелы обрабатывают начальной дозы, а также 2 или 3 дозы в 10 раз больше и меньше начальной дозы (например, если начальная доза составляет 1 мг, 0,01, 0,1, 10 и 100 мг также будет используется), и, конечно, соответствующий управления транспортным средством.
Вторая проблема немного более привередливы: препарат специфичность. Большинство препаратов не были разработаны с медоносных пчел, или любого другого насекомого, в виду. Из - за этого, вне цели эффекты являются общими (например, миансерин, антагонист рецептора 38 позвоночное серотонина, Долгое время считалось, что насекомое антагонист рецептора octopaminergic, но недавние фиndings показывают , что у пчел это также антагонист рецептора дофаминергическая 39). Обычным решением этой проблемы, а не полагаться на только один препарат, чтобы повторить тот же эксперимент с набором лекарств, известных иметь цель интереса общего. В принципе, если несколько препаратов, как известно, чтобы блокировать определенную цель, наблюдая аналогичные результаты для разных препаратов следует уделять больше уверенности, что препарат имеет ожидаемый эффект, так как различные препараты часто обладают уникальными пределами целевых профилей.
Последний вопрос включает в себя обеспечение того, чтобы препарат действует, где, как предполагается, будет действовать. В связи с этим, всегда будет компромисс между спецификой и инвазии. Систематические методы лечения, как правило, наименее инвазивным, но нет никакого контроля, где в организме пчелы препарат оказывает свое действие. Даже для микроинъекции целевых тканей препараты могут путешествовать с гемолимфе к другим частям тела пчелы. Как эта проблема решается урожденнаяDS быть проинформировано вопросы. Для некоторых экспериментов анатомическое расположение не имеет значения, в то время как для других это единственный важный вопрос. Лучший способ для решения этой проблемы, чтобы начать с системного лечения и постепенно сужаться вплоть до анатомического расположения, используя все более специфические методы. Если поведение изучается особенно несовместим с инвазивными методами лечения, это может быть стоит пытаться разобрать его на более простые компоненты, прежде чем делать целый ряд экспериментов с очень специфическими фармакологического лечения.
Эта проблема утечки наркотиков еще более преувеличенными при пероральном лечении свободно летающих пчел, где наркотики могут повлиять на нецелевые пчел. Фуражиры мед пчелы собирают нектар в поле, чтобы вернуть в свою колонию. Они будут разгрузить большую часть своего раствора сахарозы в улье по возвращении, а не поглощать его. В улье она упакована в клетках, обезвоженной и хранят как мед. Из-заэто, препараты могут потенциально повлиять на нецелевые пчел. С помощью более специфических методов (таких, как микроинъекции) эта задача сводится к минимуму.
С учетом этих оговорок, а также рассматриваются должным образом, нейрофармакологических манипулирование медоносных пчел может быть очень мощным инструментом. В то время как трансгенные инструменты разрабатываются для медоносных пчел 15, из - за своего социального образа жизни, маловероятно , что трансгены когда - либо будет простой и надежный способ для проведения такого рода экспериментов. Поэтому вероятно, что фармакология будет по-прежнему является важным элементом исследования пчелы в будущем. В то время как некоторые пчелы исследователи сделали звонки для стандартных экспериментальных методов 40, в данном случае это было бы ошибкой. Часть мощности системы пчелиного всегда разнообразие экспериментальных подходов, и как методы были разработаны с реальными биологическими вопросами в памяти, а не наоборот. Тем не менее важно, что мы обеспечиваемиспользование наиболее подходящего метода для рассматриваемого вопроса. Если проводить сравнения с предыдущими исследованиями являются ключевыми, стандартизированные протоколы должны соблюдаться строго. Тем не менее, используя установленный протокол для использования стандартизованных методов не должно быть позволено стоять на пути разработки новых методов, которые могут открыть новые экспериментальные возможности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Any supplier will do |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydrate | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Protection Wax | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Glass capillary | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G NanoFil needle | WPI | NF33BV-2 | |
| Very fine forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| Electrode puller | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| manual micromanipulator | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| electronic micromanipulator | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Junior unit XYZ | |
| stereomicroscope | Leica | M80 | |
| soldering iron | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| small Petri dish | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 50 ml Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| forceps | Australian Entomological Supplies | ||
| Blade holder and breaker | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Feather double edged razor blade | ThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Nichrome wire | Any supplier will do | ||
| Electrical wires | Any supplier will do | ||
| Model paint | Tamiya USA | Depends on colour | |
| Repeating dispenser | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Glass syringe | WPI | NANOFIL | |
| flourescence viewing system | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillary with holder | Drummond | 1-000-0010 | |
| Liquid silicone | Any supplier will do | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
References
- Frisch, K. . von B. ees Their Vision, Chemical Senses, and Language. , Cornell University Press. Itacha, NY. (1971).
- Giurfa, M. The amazing mini-brain: lessons from a honey bee. Bee World. 84 (1), 5-18 (2003).
- Giurfa, M. Behavioral and neural analysis of associative learning in the honeybee: a taste from the magic well. J. Comp. Physiol. 193 (8), 801-824 (2007).
- Perry, C. J., Barron, A. B. Honey bees selectively avoid difficult choices. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (47), 19155-19159 (2013).
- Giurfa, M., Sandoz, J. -C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn. Mem. 19 (2), 54-66 (2012).
- Srinivasan, M. V. Honey bees as a model for vision, perception, and cognition. Annu. Rev. Entomol. 55, 267-284 (2010).
- Søvik, E., Cornish, J. L., Barron, A. B. Cocaine tolerance in honey bees. PLoS One. 8 (5), e64920 (2013).
- Søvik, E., Barron, A. B. Invertebrate models in addiction research. Brain. Behav. Evol. 82 (3), 153-165 (2013).
- Søvik, E. Reward processing and responses to drugs of abuse in the honey bee, Apis mellifera. , Macquarie University. Australia. November (2013).
- Søvik, E., Even, N., Radford, C. W., Barron, A. B. Cocaine affects foraging behaviour and biogenic amine modulated behavioural reflexes in honey bees. Peer J. 2, e662 (2014).
- Abramson, C. I., Stone, S. M., et al. The development of an ethanol model using social insects I: behavior studies of the honey bee (Apis mellifera L.). Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 1153-1166 (2000).
- Sauer, S., Kinkelin, M., Herrmann, E., Kaiser, W. The dynamics of sleep-like behaviour in honey bees. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 189 (8), 599-607 (2003).
- Münch, D., Kreibich, C. D., Amdam, G. V. Aging and its modulation in a long-lived worker caste of the honey bee. J. Exp. Biol. 216 (Pt 9), 1638-1649 (2013).
- Cheeseman, J. F., Winnebeck, E. C., et al. General anesthesia alters time perception by phase shifting the circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. , (2012).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (47), e2282 (2011).
- Burger, H., Ayasse, M., Dötterl, S., Kreissl, S., Galizia, C. G. Perception of floral volatiles involved in host-plant finding behaviour: Comparison of a bee specialist and generalist. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 199 (9), 751-761 (2013).
- Pan, K. C., Goodman, L. J. Ocellar projections within the central nervous system of the worker honey bee, Apis mellifera. Cell Tissue Res. 176 (4), 505-527 (1977).
- Ito, K., Shinomiya, K., et al. A systematic nomenclature for the insect brain. Neuron. 81, 755-765 (2014).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97 (2), 107-119 (1983).
- Barron, A. B., Robinson, G. E. Selective modulation of task performance by octopamine in honey bee (Apis mellifera) division of labour. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 191 (7), 659-668 (2005).
- Schulz, D. J., Sullivan, J. P., Robinson, G. E. Juvenile Hormone and Octopamine in the Regulation of Division of Labor in Honey Bee Colonies. Horm. Behav. 42 (2), 222-231 (2002).
- Schulz, D. J., Elekonich, M. M., Robinson, G. E. Biogenic amines in the antennal lobes and the initiation and maintenance of foraging behavior in honey bees. J. Neurobiol. 54 (2), 406-416 (2003).
- Barron, A. B., Vander Meer, R. K., Maleszka, J., Robinson, G. E., Maleszka, R. Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybees with octopamine. J. Insect Physiol. 53 (2), 187-194 (2007).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr. Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Martin, B. R., Lue, L. P., Boni, J. P. Pyrolysis and volatilization of cocaine. J. Anal. Toxicol. 13 (3), 158-162 (1989).
- Lefer, D., Perisse, E., Hourcade, B., Sandoz, J. -C., Devaud, J. -M. Two waves of transcription are required for long-term memory in the honeybee. Learn. Mem. 20 (1), 29-33 (2012).
- Urlacher, E., Soustelle, L., et al. Honey Bee Allatostatins Target Galanin/Somatostatin-Like Receptors and Modulate Learning: A Conserved Function? PLoS One. 11 (1), e0146248 (2016).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera). J. Neurosci. 25 (18), 4485-4492 (2005).
- Barron, A. B., Maleszka, R., Helliwell, P. G., Robinson, G. E. Effects of cocaine on honey bee dance behaviour. J. Exp. Biol. 212 (2), 163-168 (2009).
- Devaud, J. -M., Papouin, T., Carcaud, J., Sandoz, J. -C., Grünewald, B., Giurfa, M. Neural substrate for higher-order learning in an insect: Mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proc. Natl. Acad. Sci. , 1-9 (2015).
- Vergoz, V., Roussel, E., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Aversive learning in honeybees revealed by the olfactory conditioning of the sting extension reflex. PLoS One. 2 (3), e288 (2007).
- Henry, M., Béguin, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
- Søvik, E., Perry, C. J., LaMora, A., Barron, A. B., Ben-Shahar, Y. Negative impact of manganese on honeybee foraging. Biol. Lett. 11 (3), 20140989 (2015).
- Farooqui, T., Vaessin, H., Smith, B. H. Octopamine receptors in the honeybee (Apis mellifera) brain and their disruption by RNA-mediated interference. J. Insect Physiol. 50 (8), 701-713 (2004).
- Guo, X., Su, S., et al. Recipe for a Busy Bee: MicroRNAs in Honey Bee Caste Determination. PLoS One. 8 (12), e81661 (2013).
- Cristino, A. S., Barchuk, A. R., et al. Neuroligin-associated microRNA-932 targets actin and regulates memory in the honeybee. Nat. Commun. 5, 5529 (2014).
- Vargaftig, B. B., Coignet, J. L., de Vos, C. J., Grijsen, H., Bonta, I. L. Mianserin hydrochloride: Peripheral and central effects in relation to antagonism against 5-hydroxytryptamine and tryptamine. Eur. J. Pharmacol. 16 (3), 336-346 (1971).
- Beggs, K. T., Tyndall, J. D. A., Mercer, A. R. Honey bee dopamine and octopamine receptors linked to intracellular calcium signaling have a close phylogenetic and pharmacological relationship. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J. Neurosci. Methods. 211 (1), 159-167 (2012).
