Summary
توضح هذه المخطوطة عدة بروتوكولات لإدارة وكلاء الدوائية للنحل العسل، بما في ذلك أساليب موسع بسيطة للنحل تحلق الحرة، فضلا عن المتغيرات أكثر الغازية التي تسمح العلاج الموضعي دقيقة من النحل ضبط النفس.
Abstract
عسل النحل تظهر قدرات التعلم مذهلة والسلوك الاجتماعي المتقدمة والاتصالات. وبالإضافة إلى ذلك، الدماغ هو صغير، وسهلة لتصور ودراسة. لذلك، كانت النحل فترة طويلة نموذجا مفضلا بين بيولوجيا عصبية وneuroethologists لدراسة الأساس العصبي للسلوك الاجتماعي والطبيعي. من المهم، مع ذلك، أن التقنيات التجريبية المستخدمة لدراسة النحل لا تتداخل مع السلوكيات التي تجري دراستها. وبسبب هذا، فقد كان من الضروري لتطوير مجموعة من التقنيات لمعالجة الدوائية للعسل النحل. في هذه الورقة ونحن لشرح الطرق لعلاج النحل العسل ضبط النفس أو ترفع الحرة مع مجموعة واسعة من وكلاء الدوائية. وتشمل هذه الطريقتين موسع مثل العلاجات الفموية والموضعية، فضلا عن أساليب أكثر الغازية التي تسمح لتسليم المخدرات الدقيق في أي من الأزياء النظامية أو المترجمة. وأخيرا، ونحن نناقش مزايا وعيوب كل طريقة ووصفالعقبات المشتركة وكيفية التغلب عليها أفضل. ونختتم مناقشة حول أهمية تطويع المنهج التجريبي على الأسئلة البيولوجية بدلا من العكس.
Introduction
منذ كارل فون فريش توضيح لغة الرقص من 1، ظلت نحل العسل نوع الدراسة شعبية للباحثين في سلوك الحيوان وعلم الأعصاب. في السنوات الأخيرة، ظهر عدد لا يحصى من التخصصات الجديدة عند تقاطع هذين المجالين، والعديد من التخصصات الأخرى (على سبيل المثال، علم الأحياء الجزيئي، وعلم الجينوم وعلم الحاسوب) نشأت معهم. وقد أدى ذلك إلى التطور السريع للنظريات ونماذج جديدة لفهم كيفية النتائج السلوك من النشاط في الجهاز العصبي. بسبب نمط الحياة فريدة من نوعها، مرجع السلوكي الغنية، وسهولة التلاعب التجريبية والدوائية، ظلت النحل في طليعة هذه الثورة.
ويجري استخدام عسل النحل لدراسة المسائل العصبية الحيوية الأساسية مثل تلك الكامنة وراء التعلم والذاكرة 2،3، صنع القرار 4، حاسة الشم 5، أو المعالجة البصرية 6. في السنوات الأخيرة، وهونوقد تم حتى تستخدم إرنست و يونغ النحل كنموذج لدراسة الموضوعات عموما محفوظة للبحوث الطبية، مثل آثار إدمان المخدرات 7-11، والنوم 12، والشيخوخة 13، أو الآليات الكامنة التخدير 14.
وخلافا للكائنات النموذج الجيني الكلاسيكية (على سبيل المثال، D. البطن، C. ايليجانس، M. العضلة)، وهناك عدد قليل جدا من الأدوات الجينية المتاحة لمعالجة الوظائف العصبية في نحل العسل، على الرغم من أن هذا الوضع يتغير حاليا 15. بدلا من ذلك، وقد اعتمدت الدراسات نحل العسل في المقام الأول على التلاعب الدوائية. وقد كان هذا نجاحا كبيرا. ومع ذلك، فإن تنوع البحوث النحل هو من هذا القبيل أن هناك حاجة إلى مجموعة من الأساليب لإدارة الدوائية. بحث مع عسل النحل يتناول مسائل متنوعة للغاية، ودرس باحثون من تخصصات وخلفيات مختلفة، ويستخدم مجموعة متنوعة من الأساليب التجريبية. العديد من عزاءالأسئلة اللدودين تتطلب النحل إما أن تكون تحلق الحرة، والتفاعل بحرية في مستعمرتهم، أو كليهما. وهذا يمكن أن تجعل من الصعب تتبع حيوانات التجارب الفردية، ويجعل من ضبط النفس أو إقناء؛ إدخال القنية غير مجد.
لاستيعاب تنوع البحوث عسل النحل، وهناك حاجة إلى مجموعة متنوعة من أساليب تسليم المخدرات، مما يسمح للإدارة قوية ومرنة مع ضمان أن الدوائية وملامح الدوائية، غزو من طريقة، وموثوقيتها، تتناسب مع النموذج في السؤال. وبسبب هذه الاحتياجات المتنوعة، وضعت معظم المجموعات البحثية أساليب إدارة المخدرات فريدة خاصة بهم. حتى الآن، كان هذا مصدر قوة للمجتمع أبحاث النحل. وقد أدى ذلك إلى تطوير صفائف من أساليب السماح لإدارة الدواء نفسه في ظروف مختلفة. هدفنا هنا ليس لتطوير طريقة موحدة واحد للتلاعب الدوائية من النحل، وإنما لتسليط الضوء على الطرق التيأثبتت نجاحها بشكل خاص، ومساعدة الباحثين تعتمد هذه. نحن مناقشة المبادئ الأساسية لكيفية عملها، فضلا عن مزاياها وعيوبها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الدواء لالنحل تسخيرها
- العلاج عن طريق الفم
- يعد حل 1.5 M السكروز عن طريق خلط 257 غرام من السكروز مع 500 مل من الماء (أنه من الأسهل أن حل هذا المبلغ من السكروز في الماء المغلي). تخزين محلول السكروز عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: يوفر حل السكروز بيئة مضيافة جدا لبعض الكائنات الحية الدقيقة، وبالتالي بسهولة يصبح ملوثا وغير مستساغ للنحل. محلول السكروز السائبة يمكن aliquoted وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. - تقرر على جرعة الدواء المناسبة (كيفية تحقيق ذلك، تم تناولها في قسم المناقشة أدناه)، ويعد حل مثل أن جرعة العقار المفضل يذوب في 20 ميكرولتر محلول السكروز (على سبيل المثال، لتقديم 20 ميكروغرام، وتمييع المخدرات في نسبة 1 ملغ / مل). النحل تسخير وفقا لFelsenberg وآخرون. (2011) 16. هل هذه الخطوة لا يقل عن 12 ساعة قبل العلاج من تعاطي المخدرات لضمان أن النحل لم تعد أكد سحزب التحرير من تسخير عند تقديم حل المخدرات.
ملاحظة: للحصول على نتائج أكثر اتساقا، فمن الأفضل أن يموت جوعا النحل (عن طريق وضع النحل تسخيرها في حاضنة عند 34 درجة مئوية والرطوبة 70٪) O / N. - باستخدام micropipette، المس قطرة من 1.5 M المياه السكروز إلى هوائي نحلة تسخيرها. عندما يتم توسيع خرطوم، المس قطرات 20 ميكرولتر من 1.5 M السكروز التي تحتوي على الدواء مباشرة إلى خرطوم للنحل. تأكد من أن النحل يستهلك كل شيء. كما السيطرة على السيارة استخدام 1.5 M حل السكروز بدون استخدام العقاقير المضافة.
ملاحظة: قد تحتاج كمية من محلول السكروز إلى تعديلها على أساس الخطط التجريبية. إذا كان المقصود تكييف الشهية، وتغذية النحل فقط قبل التدريب سوف تتداخل مع الاستجابة النحل. - تجاهل أو جانبا النحل التي لا تستهلك كل من السكروز.
ملاحظة: إذا كان هناك عدد كبير من النحل تفشل في شرب محلول السكروز، قد تحتاج الجدول الزمني للتغذية إلى تعديل.
- يعد حل 1.5 M السكروز عن طريق خلط 257 غرام من السكروز مع 500 مل من الماء (أنه من الأسهل أن حل هذا المبلغ من السكروز في الماء المغلي). تخزين محلول السكروز عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- الحقن في الصدر
- تحضير المخدرات في عسل النحل قارع الأجراس 17 على النحو التالي:
- مزيج الأوتوكلاف 7.45 غرام كلوريد الصوديوم، 0.448 غرام بوكل، 0.812 غرام MgCl 2، 0.735 غرام CaCl 2، 54.72 غرام السكروز، 4.95 ز مد الجلوكوز، و2.48 HEPES ز في 1000 مل من الماء. كن حذرا عند تخزين قارع الأجراس كما هو ملوثة بسهولة. قسامة ومخزن قارع الأجراس في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- حل المخدرات في حل قارع الأجراس ثم يخفف ذلك أن المبلغ المطلوب موجود في 5 ميكرولتر. على سبيل المثال، إذا النحل هي أن يعامل مع 5 ميكروغرام من المخدرات، 1 غرام يمكن في البداية أن يذوب في 1 مل في قارع الأجراس، قبل أن يتم المخفف 1: 1000 في قارع الأجراس للتوصل إلى حل نهائي من 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يتوفر تجاريا برنامج تلفزيوني (فوسفات مخزنة سالين) يمكن استخدامها بدلا من حل قارع الأجراس.
- جعل microscalpel عن طريق كسر قبالة زاوية ذو حدين شفرة حلاقة معحامل شفرة. نعلق جزء شفرة لحامل شفرة بحيث يجعل شفرة لطيف مع نقطة نهاية حادة.
- تحت مجهر تشريحي، استخدم بعناية microscalpel لقطع حفرة 2 ملم فقط فوق scutellum، إلى جانب عملية الجناح الخلفي من القفص الصدري والنحل. تجنب قطع عميق جدا لأن ذلك قد تصيب عضلات الطيران، وتوخي الحذر لتجنب يتوقف الجناح. من الناحية المثالية، وقطع فقط ثلاثة جوانب، بحيث رفرف من بشرة وقت لاحق يمكن طيها إلى إغلاق موقع الإصابة.
- باستخدام micropipette، إيداع 5 μlL قارع الأجراس (أو PBS) التي تحتوي على المخدرات على رأس ثقب في الصدر. مراقبة بعناية تحت المجهر لضمان استيعاب الانخفاض بأكمله في الدملمف. استخدام الرنين (أو PBS) بمثابة السيطرة على السيارة.
- إذا كان ذلك ممكنا، نقل رفرف بشرة إلى أكثر من الحفرة. بعد 5-10 ساعة، وسوف أعد وختم.
ملاحظة: كبديل لهذه التقنية، حقن 1 ميكرولتر مباشرة في الصدر باستخدام حقنة زجاجية، بعد فتح سعد محمدحفرة ليرة لبنانية في منتصف جام (الخط العرضي في المنطقة الخلفية لscutellum) مع إبرة حقنة (قطر: 0.6 مم، G: 23). هذا تلتف على الحاجة لخفض أولا الصدر مع مشرط وموقع الحقن هو أصغر، ولكن هذه الطريقة سوف يغادر موقع الحقن عرضة للخطر.
- تحضير المخدرات في عسل النحل قارع الأجراس 17 على النحو التالي:
- حقن Ocellus
ملاحظة: هذا هو الأسلوب المناسب لتقديم الجزيئات في جميع أنحاء كبسولة الرأس، في الدملمف.- تحضير المخدرات كما هو الحال في 1.2.1، ولكن ضبط تركيز الدواء بحيث سيتم الواردة الجرعة المطلوبة في 1 ميكرولتر من قارع الأجراس أو برنامج تلفزيوني (أقل حجم يمكن استيعابها من خلال ثقب ocellus من خلال القفص الصدري).
- إعداد microscalpel كما هو الحال في 1.2.2. تحت مجهر تشريحي، وقفل رئيس نحلة تسخيرها في مكان عن طريق ملء شق الرقبة مع الشمع. استخدام درجات الحرارة المنخفضة ذوبان الشمع (على سبيل المثال، الشمع الأسنان) من أجل تجنب إلحاق أضرار مستقبلات الشم antennal أو غيرها من الخلايا التي قد تكون طmportant لتقييم السلوك (على سبيل المثال، تعلم حاسة الشم). ثم إزالة بعناية عدسة ocellus متوسط عن طريق إدراج غيض من microscalpel تحت عدسة وكسر بلطف العدسة خالية من الكبسولة الرأس.
ملاحظة: من الممكن أيضا لوضع الشمع بعناية على مدى قرون الاستشعار لمنع الحركة. - ماصة بعناية المخدرات على حفرة ocellus. انتظر حتى يتم اتخاذ جميع في كبسولة الرأس. إزالة الشمع الأسنان من الهوائيات والسماح للنحل للراحة لفترة من الوقت قبل مواصلة إجراء التجارب. استخدام الرنين (أو PBS) بمثابة السيطرة على السيارة.
- الحقن في المسالك ocellar
ملاحظة: إن الجهاز ocellar يحتوي على ألياف كبيرة، لربط معظم مناطق الدماغ المركزي 18. إن أسلوب العلاج تمكن تطبق المركبات إلى الدماغ فقط، ولكن لا تستهدف مناطق فرعية محددة من الدماغ.- إعداد النحل كما هو الحال في 1.3.2. وإزالة عدسة ocellus متوسط مع رالملكية الفكرية من microscalpel كما هو الحال في 1.3.3.
ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك لتصل إلى 2 ساعة قبل الحقن. بناء على خبرتنا، النحل تتغذى أكثر قدرة على التعامل مع هذه الجراحة من النحل جوعا - حقنة ملء كوب 10 ميكرولتر مجهزة مقياس صغير (على سبيل المثال، 33، قطر: 210 ميكرون) إبرة مع حل المخدرات أعدت كما هو الحال في 1.3.1.
- باستخدام micromanipulator اليدوي، إدراج طرف الحقنة من خلال شبكية العين ocellar في كبسولة الرأس إلى عمق 50 ميكرون وحقن 250 NL من الحل.
- بعد الاستخدام، شطف حقنة 3 مرات بالماء المقطر، ثم 3 مرات مع 75٪ من الإيثانول.
- إعداد النحل كما هو الحال في 1.3.2. وإزالة عدسة ocellus متوسط مع رالملكية الفكرية من microscalpel كما هو الحال في 1.3.3.
- حقن مكروي في هياكل الدماغ معينة
ملاحظة: بالإضافة إلى العلاجات المنهجية المذكورة أعلاه، فإنه من الممكن أن تؤدي إبر دقيقة جدا في هياكل الدماغ معينة. وهذا يسمح للتلاعب الدوائية من مناطق الدماغ واحدة أو أكثر، في حين ترك الآخرين تتأثر. هذا يعملأفضل مع مناطق الدماغ التي يسهل التعرف عليها من سطح الدماغ الأمامي (على سبيل المثال، فصوص antennal، كؤوس زهرية الفطر الجسم أو الفصوص الرأسية، أو الفصوص البصرية)، ولكن المناطق الأخرى تم استهدافها. يرجى ملاحظة أن التوجه (الأمامي / الخلفي، الظهرية / بطني) يشير إلى محور الجسم، بدلا من ذلك، من على الجهاز العصبي المركزي (19).- تحضير المخدرات في قارع الأجراس أو برنامج تلفزيوني بنفس الطريقة كما هو الحال في 1.2.1، إضافة فلوري (على سبيل المثال، 0.5 ملغ / مل ديكستران، اليكسا 546 أو 568 فلور) أو صبغ nonfluorescent (على سبيل المثال، 1 ملم الميثيلين الأزرق).
ملاحظة: سيتم إضافة صبغة الفلورسنت تسمح بالتحقق من مكان الحقن بعد التجربة انتهت (باستخدام متحد البؤر المجهري، بعد تشريح الدماغ)، في حين الأصباغ nonfluorescent تسمح الرصد المباشر أثناء التجربة. - لجعل الماصات الزجاجية للحقن، تضاف الشعرية كوب من القطر الصحيح في المشابك صاحب مجتذب الكهربائي (1.0 ملم لعقد قياسيإيه شملت لmicroinjector المذكورة في قائمة المواد). ضبط سحب والحرارة إعدادات لإنتاج غيض حوالي 0.5 سم (إعدادات ستكون مختلفة عن كل مجتذب، حتى إذا تم استخدام نفس النموذج).
ملاحظة: من الناحية المثالية، وانسحبت ماصات اثنين من كوب واحد يجب أن يكون نفس الطول والشكل، بحيث يمكن استخدامها على حد سواء. - تحت مجهر تشريحي، كسر نصائح للحصول على القطر الخارجي من حوالي 10-15 ميكرومتر، بناء على تقدير البصرية باستخدام مقياس على graticule إدراجها في بصري. يتم تعريف الخطوات على مقياس من قبل الشركة المصنعة، ويمكن تصحيح للتضخم المستخدمة.
- ثم، وملء الماصات الزجاجية مع الحل لحقن. إذا تم استخدام الزجاج الشعيرات الدموية مع خيوط، وملء ماصة عن طريق وضع الجانب الخلفي في حل المخدرات، وإلا ملء طرف باستخدام نصائح microloader.
- إدراج ماصة زجاجية مملوءة إلى صاحب الشعرية من microinjector، التي تسيطر عليها مي اليدوي أو الإلكترونيcromanipulator.
- معايرة microinjector لحقن حجم المطلوب (0.5-2 NL، اعتمادا على حجم بنية الدماغ المستهدفة). لهذا، حقن مباشرة في طبق بتري صغيرة تحتوي على الزيوت المعدنية وقياس قطر الحبرية مع graticule. تغيير الإعدادات حتى يتم الوصول إلى حجم المطلوب.
- إصلاح رأس النحل تسخيرها باستخدام الشمع الأسنان الناعمة كما هو الحال في 1.3.2، قبل قطع فتحة في الجزء الأمامي من كبسولة الرأس، وذلك باستخدام microscalpel، مع ثلاث قطع: واحد فقط دون ocellus المتوسطة (البطني)، واحدة في حدود الحق أو العين اليسرى واحدة فوق هوائي ينبع (الظهرية). استخدام قطعة من الشمع الأسنان لعقد رفرف جاء في المركز.
- دفع بعناية الغدد والقصبة الهوائية ملقاة على أعلى الدماغ جانبا باستخدام ملقط غرامة، ثم جعل تمزق صغير في غمد الليف العصبي (غشاء رقيق جدا حول الدماغ) فوق بنية الدماغ المستهدفة.
ملاحظة: في حالة أن يعامل العديد من النحل في آن واحد، وهذا الإجراءلا يمكن أن يؤديها في وقت سابق. ومع ذلك، يجب الحرص على أن لا يترك النحل في هذه الدولة طويلة جدا (لا يزيد عن 30 دقيقة)، وأدمغتهم قد يجفف. - إدراج معلومات سرية إلى منطقة الدماغ المطلوبة، وضبط عمق عمودي على سطح الدماغ (على سبيل المثال، 60 ميكرون لكؤوس زهرية الجسم الفطر). حقن حجم معين. لمناطق الدماغ الجانبية، وضخ على المستوى الثنائي (أي قيام حقنة واحدة كل نصف الكرة الأرضية). إذا تم استخدام صبغة nonfluorescent، وضمان حقن وقعت في المنطقة اليمنى علي الملاحظة في حين حقن. إذا تم استخدام صبغة الفلورسنت تفعل الشيء نفسه تحت ضوء الفلورسنت باستخدام مجهر تشريحي مع نظام العرض مضان.
- بعد ذلك، ضع رفرف مفتوحة إلى أكثر من رأس النحلة. تذوب بلورة eicosane، وهو ما يقرب من 1 ملم في القطر، وذلك باستخدام أسلاك رقيقة ملفوفة حول غيض من حام الحديد الصغيرة (درجة حرارة انصهار هو 35-37 درجة مئوية) وختم التخفيضات. وهذا سوف يقلل بشكل كبير معدل الوفيات.
- أطلق الالنحل من تسخير التحليل السلوكي (ولكن انظر المناقشة)، أو الاحتفاظ بها في تسخير للتجارب على النحل ضبط النفس - على سبيل المثال، تمديد خرطوم المنعكس (PER) اختبار 20.
- إذا تم استخدام صبغة الفلورسنت، تأكد من أن حقن ضرب منطقة ذات أهمية بعد هذه التجربة قد انتهت باستخدام متحد البؤر المسح بالليزر المجهر (الشكل 1).
ملاحظة: هذا هو مفيدة بشكل خاص عند استهداف مناطق الدماغ أكثر عمقا (حيث أنه سيكون من الصعب أن نرى صبغ nonfluorescent خلال مرحلة الحقن).
- تحضير المخدرات في قارع الأجراس أو برنامج تلفزيوني بنفس الطريقة كما هو الحال في 1.2.1، إضافة فلوري (على سبيل المثال، 0.5 ملغ / مل ديكستران، اليكسا 546 أو 568 فلور) أو صبغ nonfluorescent (على سبيل المثال، 1 ملم الميثيلين الأزرق).
2. طرق الدواء لالنحل تحلق خالية من
- العلاج عن طريق الفم
- إعداد الدواء في نفس الطريقة كما في الخطوات 1.1.1-1.1.2. إضافة حل المخدرات لتغذية ووضع في الثلاجة لمدة التخزين.
ملاحظة: أي تغذية القيام به، مثل غطاء زجاجة رأسا على عقب أو جرة مقلوبة على المناديل الورقية. - تدريب النحل لتغذية الجاذبية التي تحتوي على 1 م أو 0.5M محلول السكروز عن طريق وضع التغذية على مقربة من خلية. وبمجرد أن تبدأ النحل تستخدم علفا في وحدة التغذية، والانتقال تدريجيا بعيدا حتى يصبح على مسافة مريحة لتجنب لسع (الحد الأدنى 5 م).
- النحل الطلاء علامة من أجل تتبع نحل العسل الفردية. تقديم قائمة من جميع تركيبات الألوان التي سيتم استخدامها. عندما يسقط النحل في وحدة التغذية، علامة بعناية البطن مع اثنين من الألوان، وتقديم مذكرة في القائمة التي يتم اتخاذها الجمع.
- مبادلة وحدة تغذية الجاذبية لتغذية تحتوي على محلول الدواء / السكروز. يحيط علما النحل ملحوظ أن زيارة وحدة التغذية. التقاط أي النحل لا تحمل علامات زيارة المغذية مثل النحل التوظيف وافرة، وأعداد النحل زيارة المغذية تخديرهم يمكن الحصول بسرعة تخرج عن نطاق السيطرة. وهذه مشكلة كبيرة وخاصة إذا كان نفس التجربة التي يتعين القيام بها في أيام متتالية، والنحل ساذجة قد لم يعد ساذجا.
ملاحظة: كبديل لتدريب النحل الفردية للتغذية، مؤلف السابقالصورة أسهمت بنجاح الماء السكروز الذي تغلب عليه اسهم المخدرات إلى الخلية بأكملها 21-23.
- إعداد الدواء في نفس الطريقة كما في الخطوات 1.1.1-1.1.2. إضافة حل المخدرات لتغذية ووضع في الثلاجة لمدة التخزين.
- العلاج الموضعي
ملاحظة: الهدف هو حل مجمع الفائدة في المذيبات التي يمكن أن تخترق بشرة الحشرات الشمعية. مذيبات مختلفة يمكن استخدامها لهذا الغرض. الأكثر شيوعا تشمل الأسيتون، ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF) وdimethylsulphoxide ([دمس]).- تقييم الذي يعمل كمذيب أفضل للمجمع في متناول اليد. إذا كان من المتوقع النمط الظاهري قوي من جرعة زائدة (على سبيل المثال، والشلل أو الموت)، النحل في علاج (الخطوة 2.2.2) مع جرعة عالية (على سبيل المثال، 20 ميكروغرام الكوكايين 7) الذائب في كل من المذيبات المختلفة وبعناية مراقبة الوقت حتى الشلل أو الموت.
- باستخدام microcapillary 1 ميكرولتر (أو محقنة مكروية، التي يمكن تركيبها على موزع التكرار المناسب) وحامل microcapillary، رسم 1 ميكرولتر من محلول الدواء (على سبيل المثال، 381؛ ز / ميكرولتر من الكوكايين) في شعري. طرد هذا التراجع، وبعناية رسمه على القفص الصدري من نحلة ملحوظ. تغطية كبيرة اعتبارا من مساحة لالممكنة مع الحل، بدلا من ترك قطرة الصلبة، كما النحلة من المرجح أن العريس تشغيله ثم. يجب الحرص على عدم السماح للمركب للاتصال يتوقف الجناح، أو يمكن استدراجه بعيدا عن الصدر وطول الأجنحة حيث سوف تتبخر دون أن يمتصها الدملمف.
ملاحظة: اعتمادا على هدف البحث، ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لإدارة المخدرات إلى بطن النحلة. ومع ذلك، والمخدرات تصل إلى الجهاز العصبي المركزي بشكل أسرع وبكميات أكبر عند تطبيقه على الصدر 24 .هذا الأسلوب يعمل ايضا على قدم المساواة مع تسخيرها كما هو الحال مع النحل تحلق الحرة.
- العلاج تتطاير
- حل المخدرات (سابقا وقد استخدم هذا الأسلوب لتقديم الكوكايين على نحل العسل 10) في الإيثانول بنسبة 100٪. لضمان الذوبان، لا تستخدم هيدروكلوريد أو غيرها من أشكال ملحالمخدرات إذا كان ذلك ممكنا. عند اتخاذ قرار تخفيف إعداده بحيث مبلغ ليتم تسليمها إلى النحل موجود في 100 ميكرولتر. استخدام الإيثانول النقي باعتباره السيطرة على السيارة.
- لخلق خيوط، استخدم نفس الإجراء McClung وهيرش 25.
- وأوضح لفترة وجيزة: يختتم الأسلاك نيتشروم بإحكام حول الأظافر ونعلق على اثنين من الأسلاك الكهربائية (واحد في نهاية كل من خيوط). إزالة الظفر. يشار إلى فائف نيتشروم المتبقية على أنها خيوط.
- كاتب الموضوع السلكين من خلال حفر ثقوب بعناية في غطاء أنبوب الطرد المركزي 50 مل، التي ينبغي أن تكون مقاومة لدرجات الحرارة الذي تم اختياره. الغراء الأسلاك في مكانها مع السيليكون السائل.
ملاحظة: هذا سيجعل محكم أنبوب. وهذا أمر ضروري لتجنب التعرض الثانوي للاختبارات وضمان أن يتم التعامل مع النحل مع الجرعة المناسبة.
- نعلق الأسلاك المؤدية إلى خيوط بمصدر طاقة. باستخدام الحرارية لقياس درجة حرارةخيوط، تجربة مع الجهد مختلفة / مجموعات الحالية حتى واحد أن يؤدي إلى ملف تعريف درجة الحرارة المناسبة للدواء في السؤال، من الناحية المثالية، واحد الذي يسمح لمدة 10 ثانية من التسخين أو أقل. وهذا أمر مهم جدا، يرجى الرجوع إلى الأدبيات ذات الصلة (على سبيل المثال، من أجل الكوكايين لتطيير فإنه يحتاج إلى أن يكون ساخنا على 200 درجة مئوية على الأقل، ولكن في درجات حرارة أكثر من 350 درجة مئوية يتم تقسيمها إلى مركبات ثانوية 26).
- بعناية ماصة 100 ميكرولتر من المخدرات التي تحتوي على محلول الإيثانول على خيوط. نشر السائل على أكبر قدر من سطح خيوط ممكن حيث سيؤدي ذلك إلى زيادة كفاءة التبخر. ترك خيوط يتعرض في درجة حرارة الغرفة حتى تبخرت كل الايثانول.
ملاحظة: إذا لم يتم يتبخر الإيثانول بما فيه الكفاية، سيتم التعامل مع كل من النحل الدواء المفضل والايثانول. النحل حساسة للغاية للإيثانول، وبعض الأدوية لها تفاعلات تعاونية مع الإيثانول، والتي سوف التحيز السابقالنتائج perimental. - وبمجرد أن الإيثانول قد تبخرت تماما (يمكن عادة أن ينظر راسب المخدرات على خيوط جافة تحت المجهر)، قبض على النحل تحلق خالية في أنبوب 50 مل. بعناية إغلاق الغطاء التي تحتوي على خيوط.
- بدوره على السلطة لمدة 10 ثانية، وتحويل خارج السلطة والانتظار 50 ثانية أخرى (للسماح مجمع المتطاير لتبرد وتتكثف أو إيداع بذلك). الافراج عن النحل.
ملاحظة: رغم أن هذا الأسلوب العلاج يعمل بشكل ممتاز للنحل تحلق الحرة، يمكن استخدامه فقط على نحو فعال مع النحل تسخيرها. نعلق ببساطة النحل تسخيرها داخل أنبوب 50 مل. تحديث خيوط كما هو موضح في 2.3.4 بين النحل. لأعلى إنتاجية، عدة خيوط يمكن استخدامها في وقت واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر مجموعة مختارة من نتائج ممثل عن الأساليب المذكورة أعلاه، في المقام الأول لإثبات أن وسائل تسمح كلاء الدوائية للوصول إلى الدماغ وتؤثر على سلوك نحل العسل.
آثار محددة على عمليات الدماغ يمكن الحصول عليها بسهولة بعد الحقن القفص الصدري.
لأن وكلاء الدوائية حقن من خلال القفص الصدري قد تعمل على أهداف متعددة في الجسم، والحصول على المخفف في الجسم قبل أن يصل إلى الدماغ، هذه التقنية قد تثير مخاوف الخصوصية المحتملة. ومع ذلك، فقد تم استخدامه على نطاق واسع في الأدب التدخل في العمليات المعرفية، دون الحاجة لاستخدام جرعات عالية جدا قد ينتج عنه آثار جانبية كبيرة. على سبيل المثال، تم إعطاء حاصرات النسخ باستخدام هذه التقنية، من أجل تحديد مراحل الذاكرة التي تتطلب الجيناتالتعبير. حقن الصدر من هذه الجزيئات متوافق مع بقاء لعدة أيام 27، مما يعني أن عمل السامة المحتملة على أهداف أخرى يمكن أن تكون محدودة، شريطة أن تركيز وحسن اختيار. في مثل هذه الظروف، والآثار الانتقائية والتي تعتمد على الوقت على الذاكرة يمكن الحصول عليها، مما يدل على استهداف كفاءة الدماغ (الشكل 2).
نشر جزيئات في الدملمف رئيس يؤدي إلى آثار سريعة، تعتمد على الجرعة.
حقن Ocellus هو وسيلة لتمكين انتشار سريع للجزيئات من الفائدة في الرأس كله من خلال الدملمف، خصوصا إذا كانوا قد يكون العديد من الأهداف على نطاق واسع في الدماغ. وقد استخدمت هذه الطريقة لادارة allatostatins، نيوروببتيد التي قد تعمل أيضا هرمونات عصبية 28). ونتيجة لذلك، لوحظ وجود انخفاض الأداء في مقايسة التعلم حاسة الشم، بما يتفق معوجود المقترح allatostatin المستقبلات في مناطق الدماغ المختلفة المشاركة في معالجة حاسة الشم والتعلم 28. ويمكن إنشاء منحنى تعتمد على الجرعة عن هذا التأثير، عن طريق حقن تركيزات مختلفة لمجموعات مستقلة بالتوازي (الشكل 3).
طرق مختلفة لإدارة يمكن أن تذعن للآثار مماثلة على وظيفة المخ.
إيميتين، مانع من تخليق البروتين، ويستخدم لتنال من تشكيل مبكرة ذاكرة الشم الذاكرة طويلة المدى، وهو ما يعبر عنه عادة بعد 1-2 أيام تكييف. في معظم الدراسات المنشورة تم حقنه في الصدر 29. أظهرنا أن آثار مماثلة يمكن الحصول عليها من قبل إدارة مباشرة إلى المخ عن طريق الجهاز ocellar (الشكل 4): توفير تعديل المعلمات حقن (حجم أصغر، وتركيز أعلى وأقصرتأخير قبل تكييف)، حصلنا على انخفاض (~ 20٪) مماثلة لتلك التي وجدت في الأدب باستخدام نفس كمية المخدرات (10 نانومتر) - مقارنة مع الشكل 4 في Stollhoff وآخرون، 2005 29.
تقتصر آثار الحقن الموضعية في الزمان والمكان
لاختبار الخصائص المكانية والزمانية المخدرات microinjected إلى مناطق محددة في الدماغ، وقد تم تدريب النحل تسخيرها في حاسة الشم لكل نموذج تكييف، ومن ثم حقن ثنائي مع 0.5 NL 740 ملي البروكين (مخدر) في كؤوس زهرية هيئة فطر أو الفصوص الرأسية ( تم استخدام المياه المالحة كعنصر تحكم). عندما تم اختبار النحل على التوالي لاستدعاء 1 و 2 و 3 ساعات بعد الحقن، وضعف الأداء فقط في النحل مع حقن الثنائية في فصوص (الشكل 5). ومن المعروف الانتاج على حالها العصبي من الفصوص، ولكن ليس من الكؤوس، لتكون ضرورية لاسترجاع الذاكرة الشمية، لذلك هذا يشير إلى أن البروكين بقي المترجمة إلى الفص الذي تم حقنه لا يقل عن 3 ساعة. لكنه يظهر أيضا أنه عندما يحقن في الكؤوس، ونشرها في فصوص القريبة كانت محدودة خلال الفترة نفسها، لأن حقن calycal من البروكين لم تؤد إلى الحصار المفروض على الفصوص.
الظواهر السلوكية التالية الدواء غالبا ما تكون التي تعتمد على السياق
وقد أظهرت التجارب السابقة أنه بعد العلاج مع النحل الكوكايين الإفراط في تقدير نوعية محلول السكروز 10،30. لمعرفة ما إذا كان هذا التأثير يعتمد على السياق (هنا، جودة السكروز الأساسية)، تم علاج تحلق حرة عسل النحل مع الكوكايين المتطاير. سمح تميز عسل النحل تحلق حرة بشكل فردي لالعلف في تغذية تحتوي على 1 M حل السكروز. في وحدة التغذية، تم القبض على النحل بلطف فيأنبوب الطرد المركزي 50 مل كما كانت على وشك النزول من وحدة التغذية. وعولج النحل مع أي 100 ميكروغرام من الكوكايين Freebase باستخدام أو السيطرة على السيارة (الإيثانول تبخرت). بعد العلاج، تم استبدال وحدة التغذية السكروز إما عن طريق 0.5 M أو تغذية 2.0 M السكروز، وعاد علافات معدل لوسجلت وحدة التغذية. استخدام هذا النموذج، زادت النحل المعالجة الكوكايين جهد البحث عن الطعام الخاصة بهم في وحدة التغذية 0.5 M، ولكن ليس على 2.0 M المغذية (الشكل 6). الفرق في التأثير رأت مع اثنين من تركيزات السكروز يوضح لطيف على أهمية اتخاذ العظة البيئية في الحسبان عند دراسة سلوك النحل.
الشكل 1: متحد البؤر ليزر المسح صورة لحقن الموقع. يتم حقن ديكستران اليكسا 546 المسمى جنبا إلى جنب مع محلول الدواء (الحمراء). للتعرف على neuropilيضاف سا مكافحة تلطيخ مع دابي (الخضراء). في النصف الأيمن كانت موجودة في موقع الحقن في الفص العمودي (فل)، كما هو موضح مثال لنجاح الحقن. في نصف الكرة المخية الأيسر كان يقع في موقع الحقن الظهرية من الفص العمودي في neuropil حلقة، كما هو موضح في المثال لحقن ناجحة. شريط مقياس = 100 ميكرون، MB: مسطحات الفطر، AL: Antennal فصوص، د: الظهري، والخامس: بطني، ل: اليسار، ص: الحق الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تأثير الوقت التي تعتمد من الاكيتنوميسين د (النسخ مانع) على الذاكرة على المدى الطويل، عندما المصبوبة في الصدر في تأخير المختلفة التالية كوندي حاسة الشم مشهي. تم حقن tioning (6، 9 أو 12 ساعة)، 1 ميكرولتر أكتينوميسين D (1.5 ملي في برنامج تلفزيوني) في الصدر. وجرى تقييم الذاكرة (LTM) استرجاع المدى الطويل 3 د بعد تكييف (ن = 25-65). وانخفض أداء الذاكرة بطريقة تعتمد على الوقت، بالمقارنة مع تلك الضوابط تعامل PBS: كان تأثير كبير عندما حقن وضع أيضا 6 ساعات بعد تكييف (χ 2 = 18.04، ف <0.005)، ولكن ليس في تأخير أطول ( 9 ساعة: χ 2 = 0.95؛ 12 ساعة: χ 2 = 0.47)، مما يشير إلى أن تشكيل LTM يتطلب موجة من النسخ التي تحدث خلال نافذة زمنية محددة بعد تكييف. أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعيارية. والبيانات المنشورة سابقا 27 ويتم إنشائها هنا بإذن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4695 / 54695fig3.jpg "/>
الرقم 3: تثبيط الجرعة التي تعتمد على الأداء التعليمي وبعد حقن Ocellar من نيوروبيبتيدي تم حقن نيوروبيبتيدي allatostatin C في الدملمف الرأس (200 نيكولا لانغ في برنامج تلفزيوني)، من خلال ocellus متوسط، 1 ساعة قبل تكييف حاسة الشم. تم تدريب مجموعة مستقلة من الحيوانات المحقونة مع تركيزات مختلفة (أو برنامج تلفزيوني للضوابط). أدت المعاملة Allatostatin C إلى انخفاض في الأداء التعلم، وفقا لتقييم النسبة المئوية للاستجابات مشروطة في تكييف الماضي، بطريقة تعتمد على الجرعة التالية منحنى U- شكل (ن = 70-78). وكان هذا الانخفاض الكبير في 10 -6 M ولكن ليس في تركيزات أخرى. أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعيارية. والبيانات المنشورة من قبل 28 عاما، ويتم تكييف هنا بإذن. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر الاصدارسيون من هذا الرقم.
تم حقن الحصار من 1 D المنعم يوسف الذاكرة بعد حقن إيميتين (ترجمة المانع) من خلال Ocellar المسالك وإيميتين تخليق البروتين المانع (50 ملم في برنامج تلفزيوني، 200 نيكولا لانغ) في الدماغ، من خلال الجهاز ocellar، 20 دقيقة قبل: الرقم 4. تكييف حاسة الشم. ثم تم اختبار الذاكرة بعد 24 ساعة. علاج ضعف بشكل كبير الاحتفاظ الذاكرة (χ 2 = 7.03، ف <0.01) بالمقارنة مع الضوابط تعامل PBS (ن = 57-70). أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعيارية. JM ديفو، بيانات غير منشورة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: تشريحية والزمانية خصوصية إبر دقيقة جدا بعد تكييف حاسة الشم مشهي، تم حقن البروكين ثنائيا إما إلى كؤوس زهرية هيئة فطر أو الفصوص الرأسية. تم تقييم استرجاع الذاكرة 1 ساعة بعد الحقن وتأثر فقط عن طريق الحقن البروكين في فصوص (1 ساعة بعد العلاج: مقابل المالحة: χ 2 = 10.00، ف <0.005، مقابل البروكين لالكؤوس: χ 2 = 32.92، ص < 0.005). لا يزال من الممكن النظر إلى تأثير الموارد البشرية 2 (χ 2 = 6.65، ف <0.01) و 3 (χ 2 = 27.22، ف <0.005) بعد الحقن، وكان لا يزال موقع محددة (2 ساعة: χ 2 = 8.60، ف < 0.05، 3 ساعة: χ 2 = 17.15، ف <0.0001)، مما يشير إلى أن المنطقة المحقونة فقط تأثر البروكين. نسب قريبة إلى مستوى تكييف دودق مشاركة محاكمة تكييف. أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعيارية (ن = 23-28). والبيانات التي تم نشرها مسبقا 31، ويتم إنشائها هنا بإذن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6: آثار الكوكايين على النحل تحلق خالية من معدل الزيارة تم زيادة (عدد الزيارات التي يقوم بها معين النحل متوسط الزيارات / لجميع النحل أثناء فترة الاختبار) بعد العلاج الكوكايين المتطاير في مصدر جودة منخفضة (0.5M: ر 70 = 5،0710، ص = 0.00003)، ولكن ليس على مصدر جودة عالية (2M: ر 70 = -0.2087، ع = 0.8353). تمثل صناديق شارع 1 و 3 الثالثة الربعية مع خط الوسط تبين المتوسط. شعيرات تمتد إلى 1.5س مجموعة الشرائح الربعية. لا يتم رسم القيم المتطرفة كما يتم فرضه جميع نقاط البيانات الفردية. ونشرت بيانات في وقت سابق 10، ويتم إنشائها هنا بإذن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| علاج | يمكن القيام به مع النحل الطيران احلرية؟ | الايجابيات | سلبيات |
| العلاج عن طريق الفم | نعم فعلا. | من السهل، الغازية الحد الأدنى. | النحل الهضم ليست واضحة |
| العلاج الموضعي | نعم فعلا. | من السهل، مينيملي وسريعة. | العلاجات المتكررة يمكن أن يكون مشكلة. |
| الحقن في الصدر | معقد،يؤثر النحل تحلق القدرات | متسقة وقوية. | الغازية إلى حد ما. يمكن أن يضر / الإجهاد النحل. |
| الحقن في ocellus متوسط | لا ينصح. | متسقة وقوية، المترجمة إلى حد ما. | الغازية إلى حد ما. يمكن أن يضر / الإجهاد النحل. |
| الحقن في المسالك ocellar | لا ينصح. | محلي جدا | الغازية للغاية. يمكن أن يضر / الإجهاد النحل. |
| الصغير الحقن في مناطق الدماغ | لا ينصح. | محلي جدا | الغازية جدا، من الصعب القيام بها. يمكن أن يضر / الإجهاد النحل. |
| تسليم المخدرات المتطاير | نعم فعلا. | من السهل، مينيملي وسريعة. | لا يعمل لجميع الأدوية. |
الجدول 1: Compariابن طرق العلاج المختلفة وخصائصها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأساليب المذكورة أعلاه تسمح علاج بسيط وفعال وقوي إما خالية من الطيران أو نحل العسل تسخيرها. هذه الأساليب متوافقة مع العديد من النماذج التجريبية والأسئلة البيولوجية (الجدول 1). كل الطرق خالية من الطيران يمكن بسهولة أن تطبق على النحل تسخيرها. العكس هو أقل نجاحا، ولكن بما ضبط النفس المؤقت وطرق العلاج الغازية يمكن في كثير من الأحيان بخرق القدرة تحلق النحل.
تم عرض الطرق من منظور تتمحور في الدماغ. هذا لا يعود إلى القيود المتأصلة في التقنيات، بل بسبب المصالح الشخصية للمؤلفين. لا يوجد أي سبب لماذا هذه الأساليب لا يمكن استخدامها لدراسة الأجهزة الأخرى. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة إلى إجراء تعديلات صغيرة لجعل طريقة أكثر ملاءمة لأجهزة الجسم الأخرى. على سبيل المثال، في حين أن العلاج الموضعي تهدف للوصول إلى الدماغ عادة ما يطبق على الصدر، قد يكون من الأفضل لتطبيق ثيالصورة في البطن إذا كان الهدف المقصود هو المبيض. وبالمثل، يمكن بسهولة تطبيق الحقن إلى مناطق أخرى من الصدر أو الرأس (على سبيل المثال، أعضاء البطن يمكن أن تكون مستهدفة من قبل عن طريق الحقن بين sclerites البطن).
من حيث والمركبات يمكن أن تدار على النحل، وهناك حقا لا حدود لها. عادة، وتدار الناس المركبات الدوائية مثل جزيئات إشارة 21 أو خصومهم 32، والببتيدات حسب الطلب 28. ومع ذلك، فقد كانت هناك زيادة الأخيرة في إدارة لمركبات النحل مع الأسئلة المطبقة في الاعتبار، مثل المبيدات الحشرية والملوثات 33 البشرية 34. مؤخرا، بدأت مركبات تدار لتشمل جزيئات الحمض النووي الريبي التي تتداخل مع التعبير الجيني مباشرة، مثل الرنا المزدوج الجديلة تفعيل الحمض النووي الريبي التدخل مسار 35 أو حتى الرنا الميكروية 36 و 37 antagomiRs. ليس كل أساليب عمل جيد على قدم المساواة لجميع المركبات.ولعل أفضل طريقة لتوضيح ذلك من خلال مركبات مريرة أو تعكر التي تجعل من الماء والسكر غير مستساغ للنحل، وبالتالي منعهم من استهلاكه. جزيئات الهشة، مثل الرنا أو بعض البروتينية، وموزعة عند تسخينها أثناء إجراء التطاير أو وضعها في المذيبات قاسية مثل DMF. ولذلك فمن المهم أن نفهم الكيمياء ما تدار لضمان انه يبقى إجراء العلاج.
الحصول على وكيل الدوائي إلى نحلة هو الجزء السهل، لكن هناك ثلاثة اهتمامات الكبيرة التي لا ينبغي أبدا أن يؤخذ على محمل الجد عند إجراء التجارب الدوائية. الأول هو معرفة جرعة جيدة للتجربة في السؤال. اعتمادا على المخدرات، وهناك قد يكون بالفعل نشرت الأدب المتاحة، ولكن بالنسبة للجزء الأكبر، وهذا سوف يتعين حلها من خلال مزيج من عمليات البحث الأدب والتخمين علم، ومنحنيات الاستجابة للجرعة. اعتمادا على مدى تعقيد البروتوكول التجريبي، قد يكون من المفيد لأولا إنشاء منحنى الاستجابة للجرعة في الأحيائي بساطة (على سبيل المثال، قياس حركة الشاملة أو البقاء على قيد الحياة) للحصول على فكرة أفضل من جرعة المدى يستحق المحاولة في الأحيائي أكثر تفصيلا. في المختبر لدينا، وإما وجدت جرعة البداية في الأدب النحل أو عن طريق القيام ملغم / كغم من تحويل استنادا إلى بيانات من الأدب القوارض. من هذا المنطلق، تعامل النحل مع جرعة البداية، بالإضافة إلى 2 أو 3 جرعات 10 مرات أكبر وأصغر من جرعة البداية (على سبيل المثال، إذا كان جرعة البداية هي 1 ملغ، 0.01، 0.1، 10، و 100 ملغ سيكون أيضا المستخدمة)، وبالطبع على السيطرة على السيارة المناسبة.
والمشكلة الثانية هي أكثر قليلا صعب: خصوصية المخدرات. لم تتطور معظم الأدوية مع عسل النحل، أو أي حشرة أخرى، في الاعتبار. وبسبب هذا، والآثار بعيدا عن الهدف شائعة (على سبيل المثال، ميانسيرين، من الفقاريات السيروتونين مستقبلات 38، وكان يعتقد منذ فترة طويلة أن تكون حشرة octopaminergic مستقبلات، ولكن في الآونة الأخيرة فايوتشير الاكتشافات التي في النحل وإنما هو أيضا خصم الدوبامين مستقبلات 39). وثمة حل مشترك لهذه المشكلة هو، بدلا من الاعتماد على دواء واحد فقط، لتكرار نفس التجربة مع مجموعة من العقاقير تعرف أن الهدف من مصلحة مشتركة. في الأساس، إذا عرفت العديد من الأدوية لمنع هدف معين، ومراقبة نتائج مماثلة في جميع أنحاء الأدوية المختلفة ينبغي أن يعطي ثقة أكبر بأن الدواء له تأثير متوقع، لأن الأدوية المختلفة في كثير من الأحيان فريدة الشخصية بعيدا عن الهدف.
أما القضية الأخيرة التأكد من أن الدواء يتصرف حيث أنه من المفترض أن يكون التمثيل. وفي هذا الصدد، سيكون هناك دائما مفاضلة بين خصوصية والغازية. طرق العلاج المنتظم عادة ما تكون أقل الغازية، ولكن ليست هناك سيطرة من مكان في الجسم النحل الدواء هو وجود تأثير لها. حتى ل microinjection من الأنسجة المستهدفة الأدوية قد يسافر مع الدملمف إلى أجزاء أخرى من الجسم النحل. كيف يتم معالجة هذه المسألة نيس ليكون على علم بها الأسئلة. بالنسبة لبعض التجارب موقع تشريحي غير ذي صلة، بينما يرى آخرون أن هذا هو السؤال الوحيد من أهمية. أفضل طريقة لمعالجة هذا هي أن تبدأ مع العلاجات النظامية وتدريجيا تضييق إلى موقع تشريحي باستخدام أساليب أكثر تحديدا على نحو متزايد. إذا كان سلوك قيد الدراسة غير متوافق بشكل خاص مع طرق العلاج الغازية، قد يكون من المفيد محاولة لتفكيك ذلك إلى مكونات أبسط قبل القيام بسلسلة من التجارب مع العلاجات الدوائية محددة للغاية.
هذه المشكلة من تسرب المخدرات هو أكثر مبالغ فيها مع العلاج عن طريق الفم من النحل تحلق الحرة، حيث من الأدوية يمكن أن تؤثر على النحل غير المستهدفة. المؤن عسل النحل بجمع الرحيق في هذا المجال لتحقيق العودة إلى مستعمرتهم. وسوف افراغ غالبية محلول السكروز في الخلية عند عودته بدلا من استيعابه. في الخلية هي معبأة في الخلايا، المجففة، وتخزينها كالعسل. بسببهذا، ويمكن أن تؤثر الأدوية النحل غير المستهدفة. مع أساليب أكثر تحديدا (مثل إبر دقيقة جدا) يتم التقليل من هذه المشكلة.
مع هذه المحاذير في الاعتبار، ومعالجتها بشكل صحيح، والتلاعب neuropharmacological من عسل النحل يمكن أن تكون أداة قوية جدا. في حين يجري تطوير أدوات المعدلة وراثيا للنحل العسل 15، بسبب نمط الحياة الاجتماعية فإنه من غير المحتمل أن الجينات سوف يكون من أي وقت مضى وسيلة سهلة وموثوقة لإجراء هذا النوع من التجارب. ولذلك فمن المرجح أن علم الصيدلة ستظل عنصرا هاما من أبحاث النحل في المستقبل. في حين أن بعض الباحثين النحل وإجراء مكالمات لأساليب تجريبية موحدة 40، في هذه الحالة هذا سيكون خطأ. وكان جزء من قوة النظام النحل دائما تنوع المقاربات التجريبية، والطريقة التي تطورت التقنيات مع الأسئلة البيولوجية الحقيقية في العقل وليس العكس. ومع ذلك، فمن المهم أن نضمناستخدام أنسب طريقة للمسألة في متناول اليد. إذا مقارنات لدراسات سابقة هي المفتاح، يجب أن يتبع بروتوكولات موحدة بدقة. ومع ذلك، باستخدام بروتوكول المعمول به من أجل استخدام أساليب موحدة يجب ألا يسمح للوقوف في طريق تطوير أساليب جديدة يمكن أن تفتح الاحتمالات التجريبية الجديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Any supplier will do |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydrate | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Protection Wax | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Glass capillary | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G NanoFil needle | WPI | NF33BV-2 | |
| Very fine forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| Electrode puller | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| manual micromanipulator | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| electronic micromanipulator | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Junior unit XYZ | |
| stereomicroscope | Leica | M80 | |
| soldering iron | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| small Petri dish | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 50 ml Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| forceps | Australian Entomological Supplies | ||
| Blade holder and breaker | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Feather double edged razor blade | ThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Nichrome wire | Any supplier will do | ||
| Electrical wires | Any supplier will do | ||
| Model paint | Tamiya USA | Depends on colour | |
| Repeating dispenser | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Glass syringe | WPI | NANOFIL | |
| flourescence viewing system | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillary with holder | Drummond | 1-000-0010 | |
| Liquid silicone | Any supplier will do | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
References
- Frisch, K. . von B. ees Their Vision, Chemical Senses, and Language. , Cornell University Press. Itacha, NY. (1971).
- Giurfa, M. The amazing mini-brain: lessons from a honey bee. Bee World. 84 (1), 5-18 (2003).
- Giurfa, M. Behavioral and neural analysis of associative learning in the honeybee: a taste from the magic well. J. Comp. Physiol. 193 (8), 801-824 (2007).
- Perry, C. J., Barron, A. B. Honey bees selectively avoid difficult choices. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (47), 19155-19159 (2013).
- Giurfa, M., Sandoz, J. -C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn. Mem. 19 (2), 54-66 (2012).
- Srinivasan, M. V. Honey bees as a model for vision, perception, and cognition. Annu. Rev. Entomol. 55, 267-284 (2010).
- Søvik, E., Cornish, J. L., Barron, A. B.
- Søvik, E., Barron, A. B.
- Søvik, E. Reward processing and responses to drugs of abuse in the honey bee, Apis mellifera. , Macquarie University. Australia. November (2013).
- Søvik, E., Even, N., Radford, C. W., Barron, A. B. Cocaine affects foraging behaviour and biogenic amine modulated behavioural reflexes in honey bees. Peer J. 2, e662 (2014).
- Abramson, C. I., Stone, S. M., et al. The development of an ethanol model using social insects I: behavior studies of the honey bee (Apis mellifera L.). Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 1153-1166 (2000).
- Sauer, S., Kinkelin, M., Herrmann, E., Kaiser, W. The dynamics of sleep-like behaviour in honey bees. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 189 (8), 599-607 (2003).
- Münch, D., Kreibich, C. D., Amdam, G. V. Aging and its modulation in a long-lived worker caste of the honey bee. J. Exp. Biol. 216 (Pt 9), 1638-1649 (2013).
- Cheeseman, J. F., Winnebeck, E. C., et al. General anesthesia alters time perception by phase shifting the circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. , (2012).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (47), e2282 (2011).
- Burger, H., Ayasse, M., Dötterl, S., Kreissl, S., Galizia, C. G. Perception of floral volatiles involved in host-plant finding behaviour: Comparison of a bee specialist and generalist. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 199 (9), 751-761 (2013).
- Pan, K. C., Goodman, L. J. Ocellar projections within the central nervous system of the worker honey bee, Apis mellifera. Cell Tissue Res. 176 (4), 505-527 (1977).
- Ito, K., Shinomiya, K., et al. A systematic nomenclature for the insect brain. Neuron. 81, 755-765 (2014).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97 (2), 107-119 (1983).
- Barron, A. B., Robinson, G. E. Selective modulation of task performance by octopamine in honey bee (Apis mellifera) division of labour. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 191 (7), 659-668 (2005).
- Schulz, D. J., Sullivan, J. P., Robinson, G. E. Juvenile Hormone and Octopamine in the Regulation of Division of Labor in Honey Bee Colonies. Horm. Behav. 42 (2), 222-231 (2002).
- Schulz, D. J., Elekonich, M. M., Robinson, G. E. Biogenic amines in the antennal lobes and the initiation and maintenance of foraging behavior in honey bees. J. Neurobiol. 54 (2), 406-416 (2003).
- Barron, A. B., Vander Meer, R. K., Maleszka, J., Robinson, G. E., Maleszka, R. Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybees with octopamine. J. Insect Physiol. 53 (2), 187-194 (2007).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr. Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Martin, B. R., Lue, L. P., Boni, J. P.
- Lefer, D., Perisse, E., Hourcade, B., Sandoz, J. -C., Devaud, J. -M. Two waves of transcription are required for long-term memory in the honeybee. Learn. Mem. 20 (1), 29-33 (2012).
- Urlacher, E., Soustelle, L., et al. Honey Bee Allatostatins Target Galanin/Somatostatin-Like Receptors and Modulate Learning: A Conserved Function? PLoS One. 11 (1), e0146248 (2016).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera). J. Neurosci. 25 (18), 4485-4492 (2005).
- Barron, A. B., Maleszka, R., Helliwell, P. G., Robinson, G. E. Effects of cocaine on honey bee dance behaviour. J. Exp. Biol. 212 (2), 163-168 (2009).
- Devaud, J. -M., Papouin, T., Carcaud, J., Sandoz, J. -C., Grünewald, B., Giurfa, M. Neural substrate for higher-order learning in an insect: Mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proc. Natl. Acad. Sci. , 1-9 (2015).
- Vergoz, V., Roussel, E., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Aversive learning in honeybees revealed by the olfactory conditioning of the sting extension reflex. PLoS One. 2 (3), e288 (2007).
- Henry, M., Béguin, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
- Søvik, E., Perry, C. J., LaMora, A., Barron, A. B., Ben-Shahar, Y. Negative impact of manganese on honeybee foraging. Biol. Lett. 11 (3), 20140989 (2015).
- Farooqui, T., Vaessin, H., Smith, B. H. Octopamine receptors in the honeybee (Apis mellifera) brain and their disruption by RNA-mediated interference. J. Insect Physiol. 50 (8), 701-713 (2004).
- Guo, X., Su, S., et al. Recipe for a Busy Bee: MicroRNAs in Honey Bee Caste Determination. PLoS One. 8 (12), e81661 (2013).
- Cristino, A. S., Barchuk, A. R., et al. Neuroligin-associated microRNA-932 targets actin and regulates memory in the honeybee. Nat. Commun. 5, 5529 (2014).
- Vargaftig, B. B., Coignet, J. L., de Vos, C. J., Grijsen, H., Bonta, I. L. Mianserin hydrochloride: Peripheral and central effects in relation to antagonism against 5-hydroxytryptamine and tryptamine. Eur. J. Pharmacol. 16 (3), 336-346 (1971).
- Beggs, K. T., Tyndall, J. D. A., Mercer, A. R. Honey bee dopamine and octopamine receptors linked to intracellular calcium signaling have a close phylogenetic and pharmacological relationship. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J. Neurosci. Methods. 211 (1), 159-167 (2012).
