Summary
この原稿は、自由飛行ミツバチのための単純な非侵襲的方法、ならびに拘束ミツバチの正確な局所治療を可能にする、より侵襲性の変異体を含む、ミツバチへの薬理学的薬剤を投与するためのいくつかのプロトコルについて説明します。
Abstract
ミツバチは、驚異的な学習能力と高度な社会的行動との通信を示しています。また、彼らの脳は、小さな視覚化すると勉強するのは簡単です。したがって、蜂は長い社会的、自然な行動の神経基盤を研究するための神経生物学者とneuroethologistsの間で好まれるモデルとなっています。これは、ハチを研究するために使用される実験技術は挙動が検討されて干渉しないことが重要です。このため、ミツバチの薬理学的操作のための技術の範囲を開発する必要がありました。本稿では、薬理学的物質の広い範囲で拘束またはフリー飛行ミツバチを治療するための方法を実証します。これらは、経口および局所治療だけでなく、全身的または局所的ないずれかの方法で正確な薬物送達を可能にする、より侵襲的な方法として非侵襲的方法の両方を含みます。最後に、私たちは、それぞれの方法の長所と短所を議論し、説明します最善の方法、それらを克服するために、共通のハードルと。私たちは、生物学的な質問ではなく、他の方法で回避に実験方法を適応させることの重要性についての議論と結論付けています。
Introduction
カール・フォン・フリッシュが彼らのダンスの言語1を明らかにしているので、ミツバチは、動物の行動と神経生物学の研究者のための普及研究種残っていました。近年では新しい分野の無数のは、これらの二つのフィールド、およびそれらと並んで生じているいくつかの他の分野（ 例えば、分子生物学、ゲノミクス、およびコンピュータサイエンス）の交差点に浮上しています。これは、神経系内のアクティビティからどのように行動の結果を理解するための新しい理論やモデルの急速な発展につながっています。そのためのユニークなライフスタイル、豊かな行動レパートリー、実験および薬理学的操作の容易さ、ミツバチはこの革命の最前線で推移しています。
ミツバチは、学習と記憶2,3、4意思決定、嗅覚5、または視覚処理6の根底にあるものなど、基本的な神経生物学的な質問を研究するために使用されています。近年では、ほん11、睡眠12、13を老化、または麻酔14のメカニズム- EYの蜂はあっても、そのような依存性薬物7の効果として、一般的に医学研究のために予約トピックを研究するためのモデルとして使用されています。
これは現在、15を変更しているが、古典的な遺伝的モデル生物（ 例えば 、 キイロショウジョウバエ 、 線虫 、M.の筋 ）のためとは異なり、ミツバチに神経機能を操作するために利用可能な非常に少数の遺伝子ツールは、あります。その代わりに、ミツバチの研究は、主に、薬理学的操作に頼ってきました。これは非常に成功しています。しかしながら、ミツバチ研究の多様性は、薬理学的投与のための方法の範囲が必要とされるようなものです。ミツバチでの研究は、異なる分野や背景の研究者によって研究され、非常に多様な質問に対処し、かつ実験的アプローチの様々なを使用しています。多くのRESEアーチの質問は自由に植民地に相互作用し、自由飛行すること、またはその両方のいずれかにミツバチが必要です。これは、困難な個々の実験動物を追跡することを可能にする、および拘束またはカニューレ挿入不可能になることができます。
ミツバチ研究の多様性に対応するために、薬物送達の様々な方法は、薬物動態学的および薬力学的プロファイル、方法の侵襲性、及びその信頼性は、問題のパラダイムに合うようにしながら、堅牢で柔軟な管理を可能にする、必要とされています。そのため、これらの多様なニーズ、ほとんどの研究グループは、独自の薬物投与方法を開発しました。これまでのところ、これは蜂の研究コミュニティの強さとなっています。それは、さまざまな状況における同じ薬剤の投与を可能にする方法のアレイの開発につながりました。ここでの私たちの目標は、蜂の薬理学的操作のための単一の標準化された方法を開発することではなく、そのメソッドを強調することではありません特に成功であることが証明され、研究者がこれらの導入を支援しています。私たちは、基本的な彼らがどのように動作するかの原則、ならびにそれらの利点と欠点について説明します。
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Protocol
活かさミツバチ1.医薬品局（FDA）
- 経口治療
- 水500mlで蔗糖257 gで混合することにより、1.5 Mショ糖溶液を調製し（沸騰水中のスクロースのこの量を溶解することが容易です）。使用するまで4℃で保存スクロース溶液。
注：スクロースソリューションは、ある種の微生物に対して非常に親切な環境を提供し、容易に汚染されたとミツバチにまずいとなります。バルクスクロース溶液を等分し、使用するまで-20℃で保存することができます。 - Aで薬物を希釈し、20μgのを提供するために、 例えば （適切な薬物投与量を決定し（それを達成するためにどのように、以下の議論のセクションで扱われている）、および好適な薬物投与量は20μLのショ糖溶液に溶解されるように溶液を調製1mg / mlの比）。ハーネスミツバチFelsenbergらによると。 （2011）16。 Oミツバチはもはや強調されていないことを確実にするために、少なくとも12時間、薬物治療の前に、この手順を実行します薬液が提示されたときに活用からユタ。
注：より一貫性のある結果を得るために、それはO / N（34℃、湿度70％のインキュベーター中で活かさミツバチを配置することによって）ミツバチを餓死するのが最善です。 - マイクロピペットを用いて、活かさミツバチのアンテナに1.5 Mショ糖水のドロップをタッチします。吻が拡張されると、蜂の口吻に直接薬物を含有する1.5 Mショ糖の20μlの液滴をタッチします。蜂はすべてを消費していることを確認します。車両制御として追加された薬なしで1.5 Mショ糖溶液を使用します。
注：ショ糖溶液の量は、実験計画に基づいて調整する必要があるかもしれません。食欲コンディショニングが意図されている場合は、直前のトレーニングにミツバチを供給すると、ミツバチ '応答性が妨害されます。 - ショ糖のすべてを消費しないミツバチを捨てるか、取っておきます。
注：ミツバチの数が多いショ糖溶液を飲むことができない場合は、給餌スケジュールを調整する必要があります。
- 水500mlで蔗糖257 gで混合することにより、1.5 Mショ糖溶液を調製し（沸騰水中のスクロースのこの量を溶解することが容易です）。使用するまで4℃で保存スクロース溶液。
- 胸部への注射
- 次のようにミツバチリンガー17に薬剤を準備します。
- 7.45グラムのNaCl、0.448グラムのKCl、0.812グラムののMgCl 2、0.735グラムのCaCl 2を、54.72グラムのスクロース、4.95グラムのD-グルコース、および水1000ml中に2.48グラムのHEPESを混合し、オートクレーブ。それは容易に汚染されているようリンガーを保存するときは注意してください。使用するまで-20℃で小分けし、店舗リンガー。
- リンゲル液中に薬物を溶解し、その後、所望の量は5μLで存在するように希釈します。 1μg/μlの最終溶液のためのリンガー1,000：ミツバチ薬物5μgので処理される場合の例として、1 gが最初に1に希釈される前リンガーで1mlに溶解することができます。
注：また、市販のPBS（リン酸緩衝サリン）の代わりにリンゲル液を用いることができます。
- 両刃カミソリの刃の角とを切り離すことにより、microscalpelを作りますブレードホルダー。それは鋭いエンドポイントと素敵なブレードを作るように、ブレードホルダにブレード断片を取り付けます。
- 実体顕微鏡下では、慎重に次のハチの胸郭の後部翼プロセスに、わずか胚盤の上2mmの穴をカットするmicroscalpelを使用しています。これは飛翔筋を傷つける可能性があるため、あまりにも深く切断避け、ウイングヒンジを避けるように注意してください。キューティクルのフラップは、後に損傷部位を閉じるように折り返さすることができるように、理想的には、唯一の、三辺をカット。
- 胸部の穴の上に薬物を含有するマイクロピペット、預金5μlLリンガー（またはPBS）を使用。慎重に全体のドロップが血リンパ中に吸収されていることを確認するために顕微鏡下で監視します。車両制御としてリンガー（またはPBS）を使用します。
- 可能な場合は、穴の上に戻ってキューティクルフラップを動かします。 5-10時間後、それを再接続し、シールします。
注：この技術の代替として、SMAを開いた後、ガラスシリンジを使用して直接胸部に1μLを注入します注射針で小帯（胚盤の後部領域における横ライン）の真ん中にLL穴（直径：0.6ミリメートル、G：23）。これは、最初のメスで胸部を切断し、注射部位が小さいが、この方法は、露出した注射部位を残す必要性を回避します。
- 次のようにミツバチリンガー17に薬剤を準備します。
- 単眼注入
注：これは血リンパに、頭部カプセル全体に分子を送達するのに適した方法です。- 1.2.1のように薬を準備したが、（あまりボリュームが胸郭を通じてより単眼ホールを介して吸収することができる）所望の投与量は、リンガーまたはPBSの1μlの中に含まれるような薬物濃度を調整します。
- 1.2.2のようにmicroscalpelを準備します。実体顕微鏡下では、ワックスで首の隙間を充填することにより所定の位置に活かさ蜂の頭をロックします。 Iであり得る損傷触角嗅覚受容体または他の細胞を避けるために、低温溶融ワックス（ 例えば、歯科用ワックス）を使用し行動（ 例えば、嗅覚学習）を評価するためのmportant。その後、慎重にレンズの下microscalpelの先端を挿入することにより、中央単眼のレンズを取り外し、ゆっくりと頭部カプセルから無料でレンズを破ります。
注：これは、移動を防止するためにアンテナを介して慎重にワックスを配置することも可能です。 - 単眼穴の上に慎重にピペット薬。すべてが頭部カプセル内に取り込まれるまで待ちます。アンテナから歯科用ワックスを削除し、蜂が実験手順を続行する前にしばらく休むことができます。車両制御としてリンガー（またはPBS）を使用します。
- 単眼管への注射
注：単眼管は、中央の脳18のほとんどの地域に接続し、大規模な繊維が含まれています。この治療法は、脳へ化合物を適用することが、脳の特定の部分領域を標的としない可能。- 1.3.2のように蜂を準備します。そしてトンと中央単眼のレンズを削除1.3.3のようにmicroscalpelのIP。
注：これは、注射前に2時間まで行うことができます。私たちの経験に基づいて、供給された蜂が飢餓ミツバチよりも、この手術に対処するより良いことができます - 小さなゲージを装備した10μlのガラスシリンジを記入し（ 例えば、33、直径：210μm）の薬物溶液と針は1.3.1のように調製しました。
- 手動マイクロマニピュレーターを用いて、50μmの深さまで頭部カプセルに単眼網膜を通してシリンジチップを挿入して、溶液の250 NLを注入します。
- 使用後、75％エタノールで3回、次いで蒸留水で注射器を3回リンス。
- 1.3.2のように蜂を準備します。そしてトンと中央単眼のレンズを削除1.3.3のようにmicroscalpelのIP。
- 特定の脳構造へのマイクロインジェクション
注：上記の体系的治療に加えて、それは、特定の脳構造中にマイクロインジェクションを行うことができます。影響を受けない他の人を残し、これは、一つ以上の脳領域の薬理学的操作を可能にします。これは動作します脳の前部脳表面（ 例えば 、触角葉、キノコ体の腎杯または垂直ローブ、または視神経葉）から認識しやすいである領域が、他の地域との最良を標的とされています。オリエンテーション（前方/後方、背/腹）は中枢神経軸19よりも、むしろ、体軸を参照していることに注意してください。- 蛍光（ 例えば、0.5 mg / mlとデキストラン、アレクサ546または568蛍石）または非蛍光色素（ 例えば 、1 mMのメチレンブルー）を追加、1.2.1と同様にリンゲルまたはPBS中に薬剤を準備します。
注：この実験が終わった後に蛍光色素の添加は、（脳解剖以下、共焦点顕微鏡を用いて）噴射位置の検証が可能になり、非蛍光色素は、実験中にダイレクトモニタリングを可能にする一方。 - 注入用ガラスピペットを作るために、標準的なホールド用の電極プラー（1.0ミリメートルのホルダークランプに正しい直径のガラスキャピラリーを挿入ER）材料リストに記載されたマイクロインジェクターのために含まれています。 0.5程度センチチップを製造するために、プルと熱設定を調整します（設定は、同じモデルが使用されている場合でも、すべてのプラーごとに異なります）。
注：理想的には、2つのピペットの両方を使用することができるように、同じ長さ及び形状を有するべきであるつのガラスから引き出さ。 - 実体顕微鏡下では、眼の中に挿入目盛のスケールを使用して、視覚的推定に基づく、約10〜15ミクロンの外径を得るためのヒントを破ります。スケール上の手順は、製造業者によって定義され、使用される倍率補正することができます。
- その後、注入する溶液をガラスピペットを埋めます。フィラメントのガラスキャピラリーを使用する場合、別段microloaderヒントを使用してチップを埋め、薬液に裏面を配置することによって、ピペットを埋めます。
- 手動または電子的MIによって制御されるマイクロインジェクターのキャピラリーホルダ内に充填されたガラスピペットを挿入しますcromanipulator。
- （対象となる脳の構造の大きさに応じて、0.5-2 NL）所望の体積を注入するマイクロインジェクターを調整します。このために、鉱油を含む小さなペトリ皿の中に直接注入し、目盛り付き液滴の直径を測定します。所望の体積に達するまで設定を変更します。
- 、ちょうど中央単眼（腹側）以下の1に1つずつ：3カットで、microscalpelを使用して、頭部カプセルの前部に開口部を切断する前に、1.3.2のようにソフトな歯科用ワックスを使用して活かした蜂の頭を修正しました。アンテナ上記の右または左眼と1の境界線は（背側）茎。場所にオープンしたフラップを保持するために歯科用ワックスの一部を使用します。
- 対象となる脳の構造上記の神経鞘（脳の周りの非常に薄い膜）に小さな破裂を行い、その後、微細な鉗子を使用して、脇脳の上に横たわっている腺と気管を慎重に押し込みます。
注：多くのハチを一度に処置される場合、この手順を早く行うことができます。しかし、自分の脳が乾燥する可能性があるとして、長すぎる（せいぜい30分）この状態で蜂を残さないしないように注意してください。 - 希望の脳領域への先端を挿入し、脳表面に垂直深さを調節（ 例えば、キノコ体の腎杯のために60ミクロン）。プリセットボリュームを注入します。横方向の脳領域については、（ すなわち、各半球に一回の注射を行う）両側性注入。非蛍光染料を使用する場合は、注入しながら観察に右側領域で発生した注射を確保。蛍光色素が使用されている場合、蛍光観察システムと実体顕微鏡を用いた蛍光灯の下で同じことを行います。
- その後、蜂の頭の上に背中オープンフラップを配置します。マイクロはんだごての先端に巻き付け細いワイヤを使用して、直径約1ミリメートルであるエイコサンの結晶を、メルト（溶融温度は、35から37℃である）とカットをシール。これは、大幅に死亡率が減少します。
- リリース例えば、吻の伸展反射（PER）20をテストする -行動分析のためのハーネスからの蜂（ただし、議論を参照）、または拘束ハチ上の実験のためのハーネスに保ちます。
- 蛍光染料を使用した場合、実験は、共焦点レーザー走査顕微鏡（ 図1）を用いて、上で後噴射が関心領域をヒットすることを保証します。
注：（注射段階の間に非蛍光染料を見ることは難しいだろう）より深い脳領域をターゲットとする場合これは特に便利です。
- 蛍光（ 例えば、0.5 mg / mlとデキストラン、アレクサ546または568蛍石）または非蛍光色素（ 例えば 、1 mMのメチレンブルー）を追加、1.2.1と同様にリンゲルまたはPBS中に薬剤を準備します。
フリーフライングミツバチ2.医薬品局（FDA）メソッド
- 経口治療
- 手順と同様に薬剤を準備1.1.1-1.1.2。フィーダに薬液を追加し、保存のために冷蔵庫に置きます。
注：任意のフィーダーは、逆さまボトルキャップやティッシュペーパーに反転瓶のように、行います。 - 1 Mまたは0.5を含む重力フィーダにミツバチを訓練ハイブに近いフィーダを配置することによってMショ糖ソリューション。ミツバチがフィーダーで餌を開始すると、それは（最小5メートル）刺されるのを回避するために快適な距離になるまで、徐々に遠くに移動します。
- 個々のミツバチを追跡するために、ペイントマーク蜂。使用されるすべての色の組み合わせのリストを作成します。フィーダで蜂の土地は、慎重に2色で腹部をマークし、組み合わせが取られているリストにメモしておきます。
- 薬物/スクロース溶液を含むフィーダー用の重力送り装置を交換します。フィーダーを訪れるとマーク蜂に注意してください。ミツバチは多作リクルーターであるため、フィーダーを訪問し、任意のマークのない蜂をキャッチし、薬漬けのフィーダを訪れるミツバチの数は急速にコントロールから抜け出すことができます。ナイーブミツバチがもはやナイーブでないかもしれないのと同じ実験を、連続する日に実行される場合、これは特に問題です。
注：フィーダーに個別のミツバチを訓練する代わりに、以前の著者23 - sが正常に全体ハイブ21に薬物混入ショ糖水を供給しています。
- 手順と同様に薬剤を準備1.1.1-1.1.2。フィーダに薬液を追加し、保存のために冷蔵庫に置きます。
- 局所治療
注：目的は、ワックス状昆虫キューティクルに浸透することができる溶媒中の目的の化合物を溶解することです。異なる溶媒は、この目的のために使用することができます。最も一般的に使用されるアセトン、ジメチルホルムアミド（DMF）およびジメチルスルホキシド（DMSO）が挙げられます。- 手元の化合物に最適な溶媒評価します。強い表現型は過剰摂取（ 例えば、麻痺または死亡）から予想される場合、（ 例えば、20μgのコカイン7）異なる溶媒のそれぞれに溶解し、慎重に麻痺までの時間を監視し、高用量でミツバチ（ステップ2.2.2）の治療または死亡。
- 1μLのマイクロキャピラリー（またはマイクロシリンジ、適切な繰り返しディスペンサーに装着することができる）とマイクロキャピラリーホルダーを使用して、薬物溶液1μl（ 例えば、3を描きます81;グラムのコカイン/μl）をキャピラリーに。ドロップを追放し、慎重にマークされた蜂の胸部にそれをペイントします。蜂はそれをオフにグルーミングする可能性があるとして、溶液で可能な領域のような大きなをカバーするのではなく、固体ドロップを残します。化合物は、ウイングヒンジに連絡することを可能にするために、またはこれは胸部から、それは血リンパに吸収されずに蒸発するの翼に沿ってそれを描くことができないように注意してください。
注：研究の目標に応じて、この方法はまた、ハチの腹部に薬物を投与するために使用することができます。胸部24 .This方法に適用されたときしかし、薬は自由に飛んで蜂のように活かさと同様に動作より迅速かつ大量にCNSに達します。
- 揮発治療
- 薬物を溶解し、100％エタノール（以前は、この方法は、ミツバチ10にコカインを送達するために使用されています）。溶解性を確保するために、塩酸塩または他の塩形態を使用していませんドラッグ可能な場合。量は、蜂に配信されるように希釈して調製する際100μl中に存在します。車両制御として純粋なエタノールを使用してください。
- フィラメントを作成するには、マックラングとハーシュ25と同じ手順を使用します。
- 簡単に説明：しっかりと爪の周りにニクロム線を巻くと、2本の電線（フィラメントの両端に1つずつ）に接続します。爪を外します。残りのニクロムコイルは、フィラメントと呼ばれます。
- 選択された温度に耐性であるべきである50mlの遠心分離管の蓋に慎重に開けた穴を介して2本のワイヤを通します。液状シリコーンのある場所にワイヤーを接着。
注：これは、管の気密を行います。これは、実験者への二次曝露を回避し、ミツバチが適切な用量で処理されることを保証するために不可欠です。
- 電源にフィラメントにつながるワイヤを取り付けます。の温度を測定する熱電対を使用してフィラメント、理想的には、問題の薬剤のための適切な温度プロファイルをもたらすもの、加熱以下の10秒を可能にする1までの異なる電圧/電流の組み合わせで実験。これは非常に重要である、（それは少なくとも200℃に加熱する必要があるが、350℃以上の温度で、それが二次化合物26に分解される揮発させるコカインためには例えば、）関連文献を参照してください。
- 慎重フィラメント上に薬物を含有するエタノール溶液100μlをピペット。これは蒸発効率を増加させるよう、できるだけ多くのフィラメント表面上に液体を広げます。すべてのエタノールが蒸発するまで室温で露出フィラメントを残します。
注：エタノールが十分に蒸発していない場合は、ミツバチが選択薬とエタノールの両方で処理されます。ミツバチは、エタノールに極めて敏感であり、いくつかの薬物は、バイアスの元意志エタノールとの相乗的相互作用を持っていますperimental結果。 - エタノールが完全に（薬物沈殿は通常、顕微鏡下で乾燥したフィラメントで見ることができる）、蒸発させた後、50ミリリットルチューブに自由に飛んで蜂を捕まえます。慎重にフィラメントを含む蓋を閉じます。
- 、10秒間電源をオンにし、電源をオフにし、別の50秒を待つ（揮発化合物が冷却され、それにより凝縮または預託することを可能にします）。蜂を放します。
注：この治療法は、自由飛行ミツバチのため良好に動作している間、それが活かさミツバチと同様に効果的に使用することができます。単純に50ミリリットルのチューブ内活かしたミツバチを添付してください。蜂の間に2.3.4で説明したようにフィラメントをリロードします。より高いスループットのために、いくつかのフィラメントを並列に使用することができます。
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Representative Results
上述した方法のための代表的な結果の選択は、主に方法は、薬剤が脳に到達することを可能にし、ミツバチの挙動に影響を与えることを実証するために示されています。
脳のプロセス上の具体的な効果は簡単に胸部注射後に取得することができます。
薬理学的薬剤が体内に複数のターゲットに作用することができ、脳に到達する前に体内に希釈します胸部を介して注入するので、この技術は、可能な特異性の懸念を提起することができます。それにもかかわらず、主要な二次的な効果をもたらす可能性があり、非常に高用量を使用する必要なしに、認知過程に干渉し、文献に広く用いられています。例えば、転写の遮断薬は、遺伝子を必要とするメモリの位相を識別するために、この技術を用いて投与されています表現。このような分子の胸部注入は、他のターゲットにその潜在的な毒性作用は、限らよく選択された濃度を提供することができることを意味し、数日間27、のための生存と互換性があります。このような条件では、メモリの選択的および時間依存効果は、このように、脳の効率的な標的化（ 図2）を示し得ることができます。
ヘッド体液中への分子の拡散が速い、用量依存的な効果をもたらします。
単眼注入は、彼らは脳内の多くの広範囲の目標を持っている可能性のある場合には特に、体液を介してヘッド全体に目的の分子の迅速な拡散を可能にする方法です。この方法はallatostatins、また神経ホルモン28として機能することができる神経ペプチド）を管理するために使用しました。その結果、性能低下はと一致して、嗅覚学習アッセイで観察されました嗅覚処理に関わる異なる脳領域で受容体をallatostatinと28の学習示唆存在。この効果の用量依存性曲線は平行（ 図3）で実行される独立したグループに、異なる濃度を注入することによって、確立することができます。
異なる投与方法は、脳機能にも同様の効果を得ることができます。
エメチン、タンパク質合成の遮断薬は、典型的には1~2日間コンディショニングした後に発現される初期の嗅覚記憶、長期記憶の形成を損なうために使用されます。ほとんど公表された研究では、胸部29内に注入されています。我々は、同様の効果が単眼管を介して脳に直接投与することにより得ることができることを示した（ 図4）：注入パラメータ（少量、より高い濃度およびより短いの調整を提供しますコンディショニング前に遅延が）、私たちは同じ薬物量（10 nM）を用いて、文献に見られるのと同様の減少（〜20％）を得た- 。ら 、2005年29 Stollhoffに図4との比較。
局部的な注射の効果は時間と空間に閉じ込められています
特定の脳領域にマイクロインジェクションの薬剤の空間的および時間的特性を試験するために、活かさミツバチはコンディショニングパラダイムPER嗅覚で訓練を受け、その後、キノコ体の腎杯または垂直ローブ（740 mMのプロカイン（麻酔薬）の0.5 NLで左右対称に注入しました生理食塩水）を対照として使用しました。ミツバチが順次リコール1、2、および注射後3時間について試験したときに、パフォーマンスが唯一のローブへの二国間の注射（ 図5）とハチに損なわれていました。ローブからではなく、腎杯から無傷の神経出力は、にはよく知られています嗅覚記憶の検索のために必要であるので、これはプロカインは、少なくとも3時間のために注入されていた中で葉にローカライズされたままであったことを示唆しています。また、腎杯に注入された場合プロカインのcalycal注入はローブの遮断に至らなかったので、近くのローブへの拡散は、同じ期間に限定されていたことを示しています。
薬物投与後の行動の表現型は、多くの場合、文脈に依存しています
以前の実験は、コカインミツバチで処理した後、蔗糖液10,30の質を過剰推定することが示されています。この効果は（ここでは、ベースラインのショ糖質）コンテキストに依存していたかどうかを確認するには、自由飛行ミツバチは揮発コカインで処理しました。個別にマークされ、自由飛行ミツバチは1 Mショ糖溶液を含むフィーダーで採餌させました。フィーダでは、ハチを静かに捕獲されました50mLの遠心分離管は、それらがフィーダーから降りるには約でした。ハチは、遊離塩基コカインまたはビヒクル対照（エタノールを蒸発させて）100μgのいずれかで処理しました。処理の後、スクロースフィーダはどちら0.5 M又は2.0 Mスクロースフィーダーによって置き換えられた、レート飼料収穫機は、フィーダに戻しを記録しました。このパラダイムを使用して、コカイン処理されたミツバチはなく、2.0 Mフィーダ（ 図6）で、0.5 Mフィーダーで彼らの採餌努力を増加させました。 2ショ糖濃度で見られる効果の差はうまくハチの行動を研究する際に考慮に入れ、環境手がかりを取ることの重要性を示しています。
図 1：注射部位の共焦点レーザー走査画像 。アレクサ546で標識したデキストランを、薬物溶液（赤）と一緒に注入されます。神経網を特定するにはDAPIでのsaカウンター染色（緑）を加えます。右半球では注射部位は、成功した注射のための例として示され、垂直ローブ（VL）に位置していました。左半球では注射部位は、失敗した注射のための一例として示したリング神経網における垂直葉の背側に位置していました。 =100μmのスケールバーは、MB：キノコ体、AL：触角ローブ、D：背、V：腹、L：左、R：右この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2：長期記憶にアクチノマイシンD（転写ブロッカー）の時間依存効果、胸部に注入食欲の嗅覚のコンディ次異なる遅延で。ニング（6,9または12時間）、アクチノマイシンD 1μL（PBS中の1.5 mM）を胸部に注入しました。長期記憶（LTM）検索は、コンディショニング後（ - 65のn = 25）3日間を評価しました。 PBS処置対照に比べて、メモリの性能は、時間依存的に減少した：注射すぎる（長い遅延にコンディショニング（χ2 = 18.04、P <0.005）の後に6時間置きではなく、場合効果は有意でした9時間：χ2 = 0.95; 12時間：χ2 = 0.47）、LTM形成はコンディショニング後に定義された時間ウィンドウの間に起こる転写の波を必要とすることを示唆しています。エラーバーは標準誤差を表します。データは、以前に27を発表しましたし、許可を得てここに再作成されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図 3：神経ペプチドの単眼注射後の学習パフォーマンスの用量依存的阻害 C allatostatin神経ペプチドは、1時間嗅覚コンディショニング前に、中央単眼を通じて、ヘッド体液（PBS中の200 NL）に注入しました。 （対照またはPBS）の異なる濃度で注射した動物の独立したグループを訓練しました。 U字カーブ（N = 70~78）以下、用量依存的に、最後のコンディショニングにおける馴化応答の割合によって評価しAllatostatin C処理は、学習能力の低下につながりました。この減少は、10 -6 Mでなく、他の濃度で有意でした。エラーバーは標準誤差を表します。データは、以前に28を発表し、許可を得てここに適合されている。 より大きな版を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のシオン。
図 4：1のD AYメモリ の遮断 単眼管を通ってエメチン（翻訳阻害剤）の注入に続いて 、タンパク質合成阻害剤エメチン（PBS中の50mM、200 NL）は、20分前に、単眼管を通って、脳に注入しました嗅覚コンディショニング。メモリは、その後、24時間後に試験しました。 PBS処理対照た（n = 57-70）と比較して、治療著しく損なわ記憶保持（χ2 = 7.03、P <0.01）。エラーバーは標準誤差を表します。 JM Devaud、未発表データ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 5：マイクロインジェクションの解剖学的および時間的特異性食欲の嗅覚コンディショニング後、プロカインは、キノコ体の腎杯または垂直ローブのいずれかに両側性に注入しました。対生理食塩水：χ2 = 10.00、P <0.005;腎杯へのプロカイン対：メモリ検索は、（処理後1時間、注射後1時間を評価し、唯一のローブにプロカイン注射によって影響されたχ2 = 32.92、pは< 0.005）。効果はまだ注射後2時間（χ2 = 6.65、P <0.01）、3（χ2 = 27.22、P <0.005）が見られ、まだ場所固有の（2時間であった可能性：χ2 = 8.60、P < 0.05; 3時間：χ2 = 17.15、P <0.0001）、唯一の注入領域はプロカインの影響を受けたことを示唆しています。割合は、コンディショニングレベルデュに対するものです最後のコンディショニングトライアルを鳴らします。エラーバーは標準誤差（N = 23〜28）を表します。データは、以前に31を発表し、許可を得てここに再作成されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 6：無料フライングミツバチ上のコカインの影響訪問率（試験期間中、すべてのハチのための与えられたハチ/平均訪問の訪問数）は、低品質のソースで揮発コカイン処理後に増加した（0.5M：70トン = 5.0710、P = 0.00003）ではなく、高品質のソースで（2M：トン70 = -0.2087、P = 0.8353）。ボックスは、中央値を示す正中線で1 番目と3 番目の四分位数を表します。ウィスカーは1.5にまで及びます四分位範囲をxは。すべての個々のデータポイントが重畳される外れ値がプロットされていません。データは、以前に10を発表し、許可を得てここに再作成されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 治療 | 自由飛行ミツバチで行うことができますか？ | プロたち | コンズ |
| 経口治療 | はい。 | 簡単、低侵襲性。 | ビー消化は容易ではありません |
| 局所治療 | はい。 | 簡単、低侵襲性、迅速。 | 繰り返しの処理が問題となる可能性があります。 |
| 胸部への注射 | 複雑な、能力を飛んで蜂に影響を与えます | 一貫性と堅牢な。 | やや侵襲。 /ストレス蜂に害を与えるための潜在的な。 |
| 中央単眼への注射 | お勧めできません。 | 多少のローカライズされた、一貫性と堅牢な。 | やや侵襲。 /ストレス蜂に害を与えるための潜在的な。 |
| 単眼管への注射 | お勧めできません。 | 非常にローカライズされました | 非常に侵襲的。 /ストレス蜂に害を与えるための潜在的な。 |
| 脳領域へのマイクロインジェクション | お勧めできません。 | 非常にローカライズされました | 非常に侵襲的な、実行するのは難しいです。 /ストレス蜂に害を与えるための潜在的な。 |
| 揮発薬物送達 | はい。 | 簡単、低侵襲性、迅速。 | すべての薬剤に対しては機能しません。 |
表 1：Compariさまざまな治療方法とそのプロパティの息子。
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Discussion
上記概説した方法は、自由飛行または活かしたミツバチのいずれかの、単純な効果的かつ堅牢な治療を可能にします。これらの方法は、多くの実験パラダイムおよび生物学的質問（ 表1）と互換性があります。自由飛行方法のすべてを容易に活用ハチに適用することができます。逆に、一時的な拘束や侵襲的な治療法は、多くの場合、ミツバチ「飛行能力を損なう可能性があるため、しかし、あまり成功しています。
方法は、脳中心の視点から提示されました。これはむしろので筆者の個人的な興味の、技術の固有の制限によるものではありません。これらの方法は、他の臓器を研究するために使用することができない理由はありません。しかし、小さな変更は、他の器官系への方法をより適切にするために必要とされる場合があります。局所治療が脳に到達することを意図している間、例えば、典型的には胸部に適用され、Th1を適用する方がよいかもしれません腹部への意図されたターゲットが卵巣である場合。同様に、注射が容易に胸部や頭部以外の領域にも適用することができる（ 例えば、腹部臓器、腹部sclerites間に注入することによって標的とすることができます）。
化合物は、ハチに投与することができるという点で、実際には制限はありません。一般的に、人々は、このようなシグナル分子21またはその拮抗薬32、およびカスタムメイドのペプチド28のような薬理学的化合物を投与しています。しかし、このような殺虫剤33と人為的汚染物質34として念頭に適用される質問、とミツバチの化合物を投与するの最近の増加がありました。最近では、投与される化合物は、そのようなdsRNAがあっても、RNA干渉経路35またはマイクロRNA 36とアンタゴ37を活性化させるなど、直接遺伝子発現を妨害するRNA分子を含むように始めています。ていないすべてのメソッドは、すべての化合物についても同様に機能します。これは、おそらく最高したがって、それを消費するからそれらを防ぐ、蜂に砂糖水がまずい作る苦味や酸味化合物によって示されています。揮発手順の間に加熱またはDMFのような過酷な溶媒中に置かれたときなどのRNAまたは特定のポリペプチドのような脆弱な分子は、分解されます。治療手順を存続確保するために投与されているものの化学的性質を理解することが重要です。
蜂に薬剤を得ることは簡単な部分ですが、薬理学的な実験を行う際に軽視すべきではない3大懸念があります。最初は、問題の実験のための良い量を考え出すされています。薬によっては、すでに利用可能な文献が公開される可能性がありますが、ほとんどの部分は、これは、文献検索、情報に当て推量、および用量反応曲線の混合物によって解決されなければなりません。実験プロトコルがどのように複雑に応じて、それが役に立つかもしれません最初に、より精巧なバイオアッセイに試してみる価値用量範囲のより良いアイデアを得るために（全体の動きや生存率を定量化する、など ）簡単なバイオアッセイにおける用量反応曲線を生成します。私たちの研究室では、開始用量は、いずれの蜂の文献にまたはげっ歯類の文献からのデータに基づいてミリグラム/ kgの変換を行うことによって発見されました。開始用量は、1mg、0.01、0.1、10であり、そして場合、この開始点から、ミツバチが開始用量、加えて2または3用量開始用量（10倍の大小で処理され、例えば、100ミリグラムにもなり）を使用し、そしてもちろん、適切な車両制御。
第二の問題は、やや気難しいです：薬剤特異性。ほとんどの薬は心の中で、ミツバチ、または任意の他の昆虫で開発されていませんでした。このため、オフターゲット効果は、一般的な（ 例えば、ミアンセリン、脊椎動物のセロトニン受容体アンタゴニスト38は 、長い昆虫オクトパミン受容体拮抗薬が、最近Fi接続であると考えられていたされています所見は、蜂で）もドーパミン作動性受容体拮抗薬39であることを示しています。この問題に対する一般的な解決策ではなく、共通の関心の対象を有することが知られている薬物のスイートと同じ実験を繰り返し、唯一の薬剤に頼るよりも、あります。基本的には、いくつかの薬物は、異なる薬物は、しばしば、ユニークなオフターゲットプロファイルを有するので、薬物が、期待される効果があることを高い信頼性を与える必要があり、異なる薬物を横切って同様の結果を観察し、特定の標的をブロックすることが知られている場合。
最後の問題は、それが働くことになっている場合に、薬物が作用していることを確実にすることを含みます。この点で、常に特異性および浸潤性の間のトレードオフが存在することになります。系統的な治療方法は、一般に、少なくとも侵襲性であるが、ハチの体内で薬物がその効果を有するされる場合の制御はありません。でも標的組織の薬物のマイクロインジェクションのためのミツバチの体の他の部分に血リンパで移動することができます。この問題は旧姓に対処する方法DSが尋ねた質問で通知します。他人のために、これは重要な唯一の問題であるのに対し、特定の実験のための解剖学的位置は、無関係です。この問題に対処する最善の方法は、全身トリートメントで始まり、徐々にますます特定のメソッドを使用して、解剖学的位置に絞り込むことです。研究されている動作は侵襲的な治療法と特に互換性がない場合、それは非常に特定の薬理学的治療を用いた実験の全シリーズを行う前に、より単純な構成要素にそれを分解しようとしている価値があるかもしれません。
薬物漏出の問題は、さらに薬物が非標的ミツバチに影響を与えることができる自由飛行ミツバチの経口治療をより誇張されています。飼料収穫機ミツバチは自分のコロニーに戻すためにフィールドに蜜を集めます。彼らは返すのではなく、それを吸収する際にハイブでのショ糖液の大部分をオフロードします。ハイブでは、セルに充填脱水し、蜂蜜のように格納されます。のためこれは、薬剤は、潜在的非標的ミツバチに影響を与えることができます。 （例えばマイクロインジェクションなど）のより具体的な方法でこの問題が最小化されます。
これらの注意事項を念頭に置いて、適切に対処して、ミツバチの神経薬理学的操作は非常に強力なツールになります。トランスジェニックツールは、それらの社会的なライフスタイルの、ミツバチ15のために開発されている間、トランスジェニックは、これまでの実験のこれらの種類を行うための簡単かつ信頼性の高い方法であるとは考えにくいです。薬理学が将来的に蜂の研究の重要な要素であり続けることが可能性があります。いくつかのハチの研究者が標準化された実験方法40のコールを作っているが、この場合には、これは間違いです。蜂システムの電力の一部は、常に実験的アプローチの多様性となっている、そしてどのような技術は、心の中で実際の生物学的な質問ではなく、他の方法で回避して開発されてきました。我々が保証することをそれにもかかわらず重要です手元の質問のための最も適切な方法の使用。以前の研究との比較がキーの場合は、標準化されたプロトコルは厳密に従わなければなりません。しかし、標準化された方法を使用してのために確立されたプロトコルを利用して、新しい実験的な可能性を開くことができる新規な方法の開発の道に放置してはいけません。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Any supplier will do |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydrate | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Protection Wax | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Glass capillary | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G NanoFil needle | WPI | NF33BV-2 | |
| Very fine forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| Electrode puller | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| manual micromanipulator | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| electronic micromanipulator | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Junior unit XYZ | |
| stereomicroscope | Leica | M80 | |
| soldering iron | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| small Petri dish | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 50 ml Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| forceps | Australian Entomological Supplies | ||
| Blade holder and breaker | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Feather double edged razor blade | ThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Nichrome wire | Any supplier will do | ||
| Electrical wires | Any supplier will do | ||
| Model paint | Tamiya USA | Depends on colour | |
| Repeating dispenser | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Glass syringe | WPI | NANOFIL | |
| flourescence viewing system | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillary with holder | Drummond | 1-000-0010 | |
| Liquid silicone | Any supplier will do | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
References
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