Summary
Questo manoscritto descrive diversi protocolli per la somministrazione di agenti farmacologici alle api, tra cui semplici metodi non invasivi per le api in volo libero, così come le varianti più invasive che consentono preciso trattamento localizzato delle api trattenuti.
Abstract
Le api da miele dimostrano capacità di apprendimento sorprendenti e il comportamento sociale avanzata e la comunicazione. Inoltre, il loro cervello è piccolo, facile da visualizzare e studiare. Pertanto, le api sono stati a lungo un modello preferito tra i neurobiologi e neuroethologists per studiare le basi neurali del comportamento sociale e naturale. È importante, tuttavia, che le tecniche sperimentali utilizzate per studiare le api non interferiscono con i comportamenti oggetto di studio. Per questo motivo, è stato necessario sviluppare una gamma di tecniche per la manipolazione farmacologica di api. In questo lavoro abbiamo dimostrato metodi per il trattamento api mellifere trattenuto o volo libero con una vasta gamma di agenti farmacologici. Questi includono entrambi i metodi non invasivi come trattamenti per via orale e topica, nonché metodi più invasivi che consentono precisa somministrazione di farmaci sia in modo sistemico o localizzato. Infine, si discute i vantaggi e gli svantaggi di ciascun metodo e descriviamoostacoli comuni e come superare meglio di loro. Concludiamo con una discussione sull'importanza di adattare il metodo sperimentale per le questioni biologiche, piuttosto che il contrario.
Introduction
Dal momento che Karl von Frisch chiarito il loro linguaggio della danza 1, le api sono rimasti una specie di studio richiesti per i ricercatori in comportamento animale e neurobiologia. Negli ultimi anni una miriade di nuove discipline sono emerse nel punto di intersezione di questi due campi, e diverse altre discipline (ad esempio, la biologia molecolare, la genomica e informatica) sono sorti al loro fianco. Questo ha portato a un rapido sviluppo di nuove teorie e modelli per comprendere come il comportamento deriva da attività nei sistemi nervosi. A causa dello stile di vita unico, ricco repertorio comportamentale, e la facilità di manipolazione sperimentale e farmacologica, le api sono rimasti in prima linea in questa rivoluzione.
Le api da miele sono stati utilizzati per studiare domande neurobiologici di base come quelli alla base dell'apprendimento e della memoria 2,3, il processo decisionale 4, 5 olfattiva, o elaborazione visiva 6. Negli ultimi anni, la honey ape è stato anche utilizzato come modello per lo studio di argomenti generalmente riservati per la ricerca medica, come ad esempio gli effetti di sostanze stupefacenti 7 - 11, 12 sonno, invecchiamento 13, oppure i meccanismi alla base di anestesia 14.
A differenza dei classici organismi modello genetico (per esempio, D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), ci sono pochissimi strumenti genetici disponibili per la manipolazione di funzioni neurali di api mellifere, anche se questo è attualmente cambiando 15. Invece, gli studi api sono principalmente affidamento su manipolazioni farmacologiche. Questo è stato un grande successo; tuttavia, la diversità della ricerca ape è tale che sono necessari una serie di metodi per la somministrazione farmacologica. La ricerca con le api affronta questioni molto diverse, è studiata da ricercatori provenienti da diverse discipline e contesti, e utilizza una varietà di approcci sperimentali. molti RESEdomande arco richiedono api per essere o volo libero, liberamente interagire nella loro colonia, o entrambi. Questo può rendere difficile tenere traccia dei singoli animali da esperimento, e rende moderazione o incannulamento irrealizzabile.
Per accogliere la diversità delle ricerche miele d'api, sono necessari una varietà di metodi di somministrazione dei farmaci, consentendo per la somministrazione robusto e flessibile, garantendo nel contempo che i profili farmacocinetici e farmacodinamica, invasività del metodo, e la sua affidabilità, soddisfare il paradigma in questione. A causa di queste diverse esigenze, la maggior parte dei gruppi di ricerca hanno sviluppato i propri metodi di gestione della droga unici. Finora, questo è stato un punto di forza della comunità di ricerca delle api; ha portato allo sviluppo di array di metodi che consentono la somministrazione del farmaco stesso in circostanze diverse. Il nostro obiettivo non è quello di sviluppare un unico metodo standardizzato per manipolazioni farmacologiche di api, ma piuttosto mettere in evidenza i metodi chehanno dimostrato di essere particolarmente efficace, e aiutare i ricercatori adottano questi. Discutiamo i principi di base di come funzionano, così come i loro vantaggi e svantaggi.
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Protocol
1. Drug Administration per le api da tiro
- trattamento orale
- Preparare la soluzione 1,5 M di saccarosio mescolando 257 g di saccarosio con 500 ml di acqua (è più facile per sciogliere questa quantità di saccarosio in acqua bollente). Conservare soluzione di saccarosio a 4 ° C fino all'utilizzo.
Nota: La soluzione saccarosio fornisce un ambiente molto ospitale per alcuni microrganismi, e quindi diventa facilmente contaminato e sgradevole per le api. soluzione di saccarosio Bulk può essere aliquotati e conservati a -20 ° C fino al momento dell'uso. - Stabilire una dose farmacologica appropriata (come realizzarla, è rivolta nella sezione discussione sotto), e preparare una soluzione tale che la dose farmaco preferito viene sciolto in 20 microlitri soluzione di saccarosio (ad esempio, per fornire 20 mg, diluire farmaco alla rapporto di 1 mg / ml). api cablaggio secondo il Felsenberg et al. (2011) 16. Fare questo passo, almeno 12 ore prima del trattamento farmacologico per garantire che le api sono stressati o non è piùUT da sfruttare quando la soluzione farmaco viene presentato.
NOTA: per risultati più coerenti, è meglio morire di fame api (mettendo api sfruttata in un incubatore a 34 ° C e 70% di umidità) O / N. - Usando una micropipetta, toccare una goccia di 1,5 M saccarosio dell'acqua all'antenna di un ape sfruttato. Quando la proboscide è esteso, toccare una goccia 20 ml di 1,5 M di saccarosio contenente il farmaco direttamente alla proboscide delle api. Assicurarsi che l'ape consuma tutto. Come utilizzare il controllo del veicolo da 1,5 M soluzione di saccarosio senza farmaci aggiunti.
NOTA: potrebbe essere necessario un aggiustamento sulla base di piani sperimentali La quantità di soluzione di saccarosio. Se appetitive condizionata è destinato, alimentando le api appena prima della formazione possa interferire con la reattività api. - Eliminare o mettere da parte le api che non consumano tutto il saccarosio.
NOTA: Se un gran numero di api non riescono a bere la soluzione di saccarosio, potrebbe essere necessario un aggiustamento del programma di alimentazione.
- Preparare la soluzione 1,5 M di saccarosio mescolando 257 g di saccarosio con 500 ml di acqua (è più facile per sciogliere questa quantità di saccarosio in acqua bollente). Conservare soluzione di saccarosio a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Iniezione nel torace
- Preparare droga nel miele delle api Ringer 17 come segue:
- Mescolare e autoclave 7,45 g di NaCl, 0.448 g KCl, 0,812 g MgCl 2, 0,735 g CaCl 2, 54.72 g di saccarosio, 4,95 g D-glucosio e 2,48 g HEPES a 1.000 ml di acqua. Fare attenzione quando si ripone suoneria in quanto è facilmente contaminato. Aliquotare e conservare Ringer a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Sciogliere il farmaco in soluzione di Ringer e poi diluire in modo che la quantità desiderata è presente in 5 microlitri. Ad esempio, se le api devono essere trattati con 5 mg di un farmaco, 1 g può inizialmente essere sciolto in 1 ml di Ringer, prima di essere diluito 1: 1000 in Ringer per una soluzione finale di 1 mg / mL.
NOTA: In alternativa, disponibile in commercio PBS (Phosphate-buffered Salin) può essere usato al posto di soluzione di Ringer.
- Fare un microscalpel rompendo l'angolo di una lama a doppio taglio rasoio con offun portalama. Fissare il frammento di lama per un porta lama in modo che si fa un bel lama con un punto finale tagliente.
- Sotto uno stereomicroscopio, usare con cautela il microscalpel per tagliare un foro di 2 millimetri appena sopra il scutello, accanto al processo dell'ala posteriore del torace di un ape. Evitare di tagliare troppo in profondità in quanto ciò potrebbe danneggiare muscoli del volo, e fare attenzione ad evitare le cerniere ala. Idealmente, tagliare solo tre lati, in modo che il lembo di cuticole può essere successivamente ripiegato per chiudere il sito di lesione.
- Usando una micropipetta, deposito 5 μlL Ringer (o PBS) contenente il farmaco sulla parte superiore del foro nel torace. Monitorare attentamente al microscopio per assicurare l'intera goccia è assorbito nel emolinfa. Utilizzare Ringer (o PBS) come un controllo del veicolo.
- Se possibile, spostare il lembo cuticola posteriore sopra il foro. Dopo 5-10 ore, sarà ricollegare e sigillare.
NOTA: In alternativa a questa tecnica, iniettare 1 ml direttamente nel torace usando una siringa di vetro, dopo aver aperto un smabuco ll nel mezzo del frenulo (linea trasversale nella regione posteriore della scutello) con una siringa (diametro: 0,6 mm G: 23). Questo aggira la necessità di tagliare prima il torace con un bisturi e il sito di iniezione è più piccolo, ma questo metodo lascerà il sito di iniezione esposto.
- Preparare droga nel miele delle api Ringer 17 come segue:
- iniezione ocellus
NOTA: Questo è un metodo adatto per la distribuzione di molecole in tutta la capsula testa, nella emolinfa.- Preparare farmaci come in 1.2.1, ma regolare concentrazioni di farmaco in modo tale che la dose desiderata sarà contenuto in 1 ml di Ringer o PBS (meno volume può essere assorbito attraverso il foro ocellus che attraverso il torace).
- Preparare una microscalpel come in 1.2.2. Sotto uno stereomicroscopio, bloccare la testa di un ape sfruttato in posizione riempiendo la fessura collo con cera. Utilizzare fusione della cera a bassa temperatura (ad esempio, cera dentale) per evitare recettori olfattivi antennali danneggiare o altre cellule che possono essere importante per valutare il comportamento (ad esempio, l'apprendimento olfattivo). Poi rimuovere con attenzione la lente della ocellus mediana inserendo la punta del microscalpel sotto la lente e rompere delicatamente la lente libera dalla capsula testa.
NOTA: È anche possibile posizionare accuratamente cera sopra le antenne per impedire il movimento. - pipetta con cura droga sul foro ocellus. Attendere fino a quando tutto è preso nella capsula testa. Rimuovere impronte dentarie dalle antenne e consentire l'ape a riposo per un po 'prima di continuare la procedura sperimentale. Utilizzare Ringer (o PBS) come un controllo del veicolo.
- Iniezione nel tratto ocellare
NOTA: Il tratto ocellare contiene grandi fibre, che collega alla maggior parte delle regioni del cervello centrale 18. Questo metodo di trattamento abilita l'applicazione composti solo il cervello, ma non mira sottoregioni specifiche del cervello.- Preparare api come a 1.3.2. e rimuovere il cristallino ocellus mediana con il tip di un microscalpel come in 1.3.3.
NOTA: Questo può essere fatto fino a 2 ore prima dell'iniezione. Sulla base della nostra esperienza, le api Fed sono meglio in grado di far fronte a questo tipo di chirurgia dalle api Starved - Riempire una siringa di vetro 10 ml dotato di un piccolo calibro (ad esempio, 33, diametro: 210 micron) ago con soluzione di droga preparata come a 1.3.1.
- Utilizzando un micromanipolatore manuale, inserire la punta della siringa attraverso la retina ocellare nella capsula testa ad una profondità di 50 micron e iniettare 250 nl di soluzione.
- Dopo l'uso, lavare la siringa 3 volte con acqua distillata, quindi 3 volte con etanolo al 75%.
- Preparare api come a 1.3.2. e rimuovere il cristallino ocellus mediana con il tip di un microscalpel come in 1.3.3.
- Microiniezione in particolari strutture cerebrali
NOTA: Oltre ai trattamenti sistematici di cui sopra, è possibile eseguire microiniezioni in particolari strutture cerebrali. Questo permette la manipolazione farmacologica di una o più regioni cerebrali, lasciando inalterati gli altri. Questo funzionameglio con le regioni del cervello che sono facili da riconoscere dalla superficie del cervello anteriore (ad esempio, lobi antennali, calici di funghi corpo o lobi verticali, o lobi ottici), ma in altre regioni sono stati presi di mira. Si prega di notare che l'orientamento (anteriore / posteriore, dorsale / ventrale) si riferisce alle all'asse del corpo, piuttosto, che al nevrasse 19.- Preparare il farmaco in Ringer o PBS nello stesso modo come in 1.2.1, aggiungendo un fluorescente (ad esempio, 0,5 mg / ml destrano, Alexa 546 o 568 fluoro) o colorante nonfluorescent (ad esempio, 1 mM blu di metilene).
NOTA: L'aggiunta di un colorante fluorescente consentirà la verifica della posizione di iniezione dopo l'esperimento è finito (utilizzando la microscopia confocale, seguendo dissezione cerebrale), considerando coloranti nonfluorescent consentono il monitoraggio diretto durante l'esperimento. - Per rendere pipette di vetro per l'iniezione, inserire capillari di vetro del diametro corretto in morsetti titolare di un estrattore elettrodi (1,0 mm per la tenuta di serieER incluso per microinjector menzionata nella lista dei materiali). Regolare le impostazioni di trazione e di calore per la produzione di un lungo circa 0,5 cm punta (impostazioni sarà diverso per ogni estrattore, anche se lo stesso modello è utilizzato).
NOTA: Idealmente, i due pipette tirato da un bicchiere dovrebbero avere la stessa lunghezza e forma, in modo che entrambi possono essere usati. - Sotto uno stereomicroscopio, rompere le punte avere un diametro esterno di circa 10-15 micron, basato sulla stima visiva utilizzando una scala su un reticolo inserito nel oculare. I livelli sulla scala sono definiti dal produttore e possono essere corrette per l'ingrandimento utilizzato.
- Poi, riempire le pipette di vetro con la soluzione da iniettare. Se si usano capillari di vetro con filamenti, riempire la pipetta mettendo la parte posteriore nella soluzione di droga, altrimenti riempire punta con punte microloader.
- Inserire la pipetta di vetro riempito nel supporto capillare di un microinjector, che è controllato da un mi manuale o elettronicocromanipulator.
- Calibrare il microinjector per iniettare il volume desiderato (0,5-2 nl, a seconda delle dimensioni della struttura cerebrale mirato). Per questo, iniettare direttamente in una piccola capsula di Petri contenenti olio minerale e misurare il diametro della goccia con il reticolo. Modificare le impostazioni fino a raggiungere il volume desiderato.
- Fissare la testa di un ape sfruttato con cera dentale morbido come in 1.3.2, prima di tagliare un'apertura nella parte anteriore della capsula testa, utilizzando un microscalpel, con tre tagli: uno appena sotto il ocellus mediana (ventrale), uno alla il bordo di destra o occhio sinistro e uno sopra l'antenna steli (dorsale). Usare un pezzo di cera dentale per tenere il lembo aperto nel posto.
- Spingere con cautela ghiandole e trachea si trova in cima del cervello da parte utilizzando una pinza sottile, poi fare una piccola rottura nella neurolemma (membrana molto sottile intorno al cervello) al di sopra della struttura del cervello mirati.
NOTA: Se molti api sono da trattare in una sola volta, questa procedurapuò essere eseguito in precedenza; tuttavia, fare attenzione a non lasciare le api in questo stato troppo a lungo (non più di 30 minuti), in quanto il loro cervello potrebbero essiccare. - Inserire la punta nella regione del cervello desiderato e regolare la profondità perpendicolarmente alla superficie del cervello (ad esempio, 60 micron per calici corpo di funghi). Iniettare il volume preimpostato. Per le regioni del cervello laterali, iniettare bilaterale (cioè fare una iniezione per ogni emisfero). Se viene utilizzato un colorante nonfluorescent, garantire l'iniezione avvenuta nella regione di destra sull'osservazione durante l'iniezione. Se viene utilizzato un colorante fluorescente fare lo stesso sotto luce fluorescente utilizzando uno stereomicroscopio con un sistema di visualizzazione a fluorescenza.
- Successivamente, posizionare il lembo aperto indietro sopra la testa del ape. Sciogliere un cristallo di eicosano, che è di circa 1 mm di diametro, con un sottile filo avvolto attorno alla punta di un saldatore micro (temperatura di fusione è 35-37 ° C) e sigillare i tagli. Questo ridurrà di molto la mortalità.
- Rilasciare ilape dal cablaggio per l'analisi comportamentale (ma si veda la discussione), o tenere nel cablaggio per esperimenti sulle api trattenuti - per esempio, l'estensione proboscide reflex (PER) test 20.
- Se è stato utilizzato un colorante fluorescente, affinché l'iniezione colpito la zona di interesse dopo l'esperimento è finito utilizzando un confocale a scansione laser microscopio (fig. 1).
NOTA: Questo è particolarmente utile quando si mira aree cerebrali profonde (in cui sarebbe difficile vedere colorante nonfluorescent durante la fase di iniezione).
- Preparare il farmaco in Ringer o PBS nello stesso modo come in 1.2.1, aggiungendo un fluorescente (ad esempio, 0,5 mg / ml destrano, Alexa 546 o 568 fluoro) o colorante nonfluorescent (ad esempio, 1 mM blu di metilene).
2. Metodi Drug Administration per le api in volo libero
- trattamento orale
- Preparare farmaco nello stesso modo come in passaggi 1.1.1-1.1.2. Aggiungere la soluzione farmaco per un alimentatore e posto in frigorifero per lo stoccaggio.
NOTA: Ogni alimentatore farà, come un tappo di bottiglia capovolta o un vaso rovesciato su carta velina. - Addestrare le api ad un alimentatore gravità contenente 1 M o 0,5M soluzione di saccarosio, ponendo un alimentatore vicino al alveare. Una volta api iniziano foraggiamento al alimentatore, gradualmente allontanarlo finché è a una distanza confortevole per evitare essere punti (minimo 5 m).
- api Paint-marchio al fine di tenere traccia delle singole api mellifere. Fate una lista di tutte le combinazioni di colori che verranno utilizzati. Quando un ape atterra l'alimentatore, segnano con cura il suo addome con due colori, e fare una nota della lista che la combinazione è preso.
- Scambiare l'alimentatore a gravità per un alimentatore contenente la soluzione medicinale / saccarosio. Prendete nota delle api marcate che visitano l'alimentatore. Cattura ogni ape non marcato visita l'alimentatore come le api sono reclutatori prolifici, e il numero di api che visitano l'alimentatore drogato può ottenere rapidamente fuori controllo. Questo è particolarmente problematico se lo stesso esperimento deve essere eseguita in giorni successivi, come api naive potrebbero non essere più naive.
NOTA: In alternativa alla formazione singole api ad un alimentatore, autore precedentes hanno alimentato con successo l'acqua saccarosio farmaco-cucita ad un intero alveare 21 - 23.
- Preparare farmaco nello stesso modo come in passaggi 1.1.1-1.1.2. Aggiungere la soluzione farmaco per un alimentatore e posto in frigorifero per lo stoccaggio.
- Il trattamento topico
NOTA: L'obiettivo è di sciogliere il composto di interesse in un solvente che può penetrare l'insetto cuticola cerosa. Diversi solventi possono essere utilizzati per questo scopo. Il più comunemente usato includono acetone, dimetilformammide (DMF) e dimetilsolfossido (DMSO).- Valutare quale solvente funziona meglio per il composto a portata di mano. Se un forte fenotipo è prevista da un sovradosaggio (ad esempio, paralisi o morte), api ossequio (fase 2.2.2) con una dose elevata (ad esempio, 20 mg di cocaina 7) sciolti in ciascuno dei diversi solventi e monitorare attentamente tempo fino paralisi o la morte.
- Utilizzando un microcapillare 1 ml (o una microsiringa, che può essere montato su un dispensatore a ripetizione appropriato) e porta microcapillari, disegnare 1 ml di soluzione di farmaco (ad esempio, 381; g / ml di cocaina) nel capillare. Espellere la goccia, e con attenzione dipingere sul torace di un'ape marcata. Coprire più grande di una zona una possibile con la soluzione, piuttosto che lasciare un solido goccia, come l'ape è quindi probabile sposo fuori. Fare attenzione a non permettere al prodotto di contattare l'ala cerniere, o questo può trarre fuori il torace e lungo le ali dove evaporerà senza essere assorbiti nel emolinfa.
NOTA: A seconda del obiettivo di ricerca, questo metodo può essere utilizzato anche per somministrare farmaci per l'addome dell'ape. Tuttavia, i farmaci raggiungono il sistema nervoso centrale più veloce e in grandi quantità quando applicato al torace metodo di 24 .Questo funziona altrettanto bene con sfruttato come con le api volo libero.
- trattamento volatilizzato
- Sciogliere la droga (in precedenza questo metodo è stato utilizzato per fornire la cocaina alle api 10) su 100% di etanolo. Per garantire la solubilità, non utilizzare un cloridrato o altre forme di sale didi droga, se possibile. Quando si effettua una diluizione prepararlo in modo che l'importo da erogare un ape è presente in 100 microlitri. Utilizzare etanolo puro come un controllo del veicolo.
- Per creare un filamento, utilizzare la stessa procedura McClung e Hirsh 25.
- Brevemente ha spiegato: finire filo nichelcromo strettamente intorno un chiodo e collegare a due fili elettrici (uno per ogni estremità del filamento). Rimuovere il chiodo. La bobina nichelcromo rimanente viene indicato come il filamento.
- Infilare i due fili attraverso fori praticati con attenzione nel coperchio di un 50 ml provetta da centrifuga, che dovrebbe essere resistente alla temperatura prescelta. Incollare i cavi in posizione con silicone liquido.
NOTA: Questo renderà la tenuta d'aria tubo. Ciò è essenziale per evitare l'esposizione secondaria allo sperimentatore ed assicurare che le api sono trattati con la dose appropriata.
- Collegare i fili che portano al filamento di una fonte di alimentazione. Utilizzo di una termocoppia per misurare la temperatura diil filamento, esperimento con tensione diversa / combinazioni correnti fino uno che si traduce in un profilo di temperatura appropriata per il farmaco in questione, idealmente, quella che consente per 10 sec di riscaldamento o meno. Questo è molto importante, fare riferimento alla letteratura rilevante (ad esempio, in modo che la cocaina volatilizzare deve essere riscaldato ad almeno 200 ° C, ma a temperature oltre 350 ° C viene suddiviso in composti secondari 26).
- pipetta con cautela 100 ml di farmaco contenente soluzione di etanolo sul filamento. Distribuire il liquido sulla superficie del filamento per quanto possibile in quanto ciò aumenterà l'efficienza evaporazione. Lasciare il filamento esposto a temperatura ambiente fino a quando tutto l'etanolo evaporato.
NOTA: Se l'etanolo non è sufficientemente evaporato, api saranno trattati sia con il farmaco di scelta ed etanolo. Le api sono estremamente sensibili a etanolo, e alcuni farmaci avere interazioni sinergiche con l'etanolo, che sarà pregiudizi exrisultati sperimentali. - Una volta che l'etanolo sia completamente evaporata (farmaco precipitato di solito può essere visto sul filamento secca al microscopio), prendere un ape in volo libero in un tubo da 50 ml. chiudere con cautela il coperchio contenente il filamento.
- Accendere l'alimentazione per 10 secondi, spegnere il dispositivo e attendere altri 50 secondi (per consentire il composto volatilizzato raffreddare e quindi condensare o un deposito). Rilasciare l'ape.
NOTA: Anche se questo metodo di trattamento funziona in modo eccellente per le api in volo libero, può essere utilizzato in modo altrettanto efficace con le api bardati. È sufficiente collegare l'ape imbrigliato all'interno di un tubo da 50 ml. Ricaricare il filamento come descritto in 2.3.4 tra le api. Per maggiore produttività, più filamenti possono essere utilizzati in parallelo.
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Representative Results
Una selezione di risultati rappresentativi per i metodi di cui sopra sono riportati, in primo luogo per dimostrare che i metodi consentono agenti farmacologici per raggiungere il cervello e influenzano il comportamento delle api il miele.
Effetti specifici sui processi cerebrali possono essere facilmente ottenuti dopo l'iniezione del torace.
Poiché gli agenti farmacologici iniettati attraverso il torace può agire su più bersagli nel corpo, e ottenere diluito nel corpo prima di raggiungere il cervello, questa tecnica può sollevare eventuali preoccupazioni specificità. Tuttavia, è stato ampiamente utilizzato in letteratura per interferire con i processi cognitivi, senza la necessità di utilizzare dosi molto elevate che potrebbero produrranno importanti effetti secondari. Ad esempio, bloccanti di trascrizione sono state somministrate con questa tecnica, al fine di individuare le fasi di memoria che richiedono geneespressione. Iniezione Thorax di tali molecole è compatibile con la sopravvivenza per diversi giorni 27, il che significa che il loro potenziale azione tossica su altri obiettivi può essere limitata, a condizione che la concentrazione è ben scelto. In tali condizioni, effetti selettivi e dipendenti dal tempo in memoria possono essere ottenuti, mostrando quindi efficiente il targeting del cervello (Figura. 2).
Diffusione delle molecole nel emolinfa testa porta ad effetti rapidi dose-dipendente.
iniezione ocellus è un modo per consentire un breve diffusione delle molecole di interesse in tutta la testa attraverso la emolinfa, soprattutto se essi possono avere molti obiettivi diffuse nel cervello. Questo metodo è stato utilizzato per amministrare allatostatins, neuropeptidi che può anche agire come neuro-ormoni 28). Di conseguenza, una riduzione delle prestazioni è stata osservata in un test di apprendimento olfattivo, coerente conla presenza suggerito di allatostatin recettori in diverse regioni cerebrali coinvolte nella elaborazione olfattiva e di apprendimento 28. Una curva dose-dipendente per questo effetto potrebbe essere stabilito, iniettando diverse concentrazioni di gruppi indipendenti posti in parallelo (fig. 3).
Diversi modi di somministrazione può produrre effetti simili sulla funzione del cervello.
Emetine, un bloccante di sintesi proteica, è utilizzato per alterare la formazione della memoria olfattiva memoria inizi a lungo termine, che è tipicamente espresso 1-2 giorni dopo il condizionamento. In studi pubblicati è stato iniettato nel torace 29. Abbiamo dimostrato che effetti simili potrebbero essere ottenuti somministrando direttamente al cervello attraverso il tratto ocellare (Figura 4).: Fornire una regolazione dei parametri di iniezione (volume più piccolo, maggiore concentrazione e più breveritardo prima di condizionamento), abbiamo ottenuto una diminuzione (~ 20%) simile a quello trovato nella letteratura utilizzando la stessa quantità di droga (10 NM) - confronto con la Figura 4 in Stollhoff et al, 2005 29..
Gli effetti delle iniezioni localizzate sono confinati nel tempo e nello spazio
Per testare le proprietà spaziali e temporali dei farmaci microiniettati in regioni specifiche del cervello, le api bardati sono stati addestrati in un olfattiva PER condizionata paradigma, e poi iniettato bilateralmente con 0,5 nl di 740 mm procaina (un anestetico) nei calici del corpo di funghi o lobi verticali ( soluzione salina è stata usata come controllo). Quando api sono stati successivamente testati per richiamo 1, 2, e 3 ore dopo l'iniezione, la prestazione è stata compromessa solo in api con iniezioni bilaterali nelle lobi (Figura. 5). uscita intatta neurale dai lobi, ma non dai calici, è noto peressere necessarie per il recupero della memoria olfattiva, quindi questo suggerisce che procaina rimasto localizzato al lobo in cui era stata iniettata per almeno 3 ore. Essa mostra anche che, quando iniettato nei calici, la diffusione nei lobi vicine è stato limitato nello stesso periodo, dal momento che una iniezione calycal di procaina non ha portato a blocco dei lobi.
Fenotipi comportamentali in seguito alla somministrazione di droga sono spesso dipendenti dal contesto
Esperimenti precedenti hanno dimostrato che dopo trattamento con api cocaina over-stimare la qualità di una soluzione di saccarosio 10,30. Per vedere se questo effetto era dipendente dal contesto (qui, linea di base di qualità saccarosio), volo libero api da miele sono stati trattati con la cocaina volatilizzato. Individualmente le api in volo libero segnalati sono stati autorizzati a foraggio ad un alimentatore contenente 1 M soluzione di saccarosio. Al alimentatore, le api sono state gentilmente acquisite inun tubo da centrifuga da 50 ml mentre stavano per scendere dall'alimentatore. Le api sono stati trattati con 100 mg di cocaina freebase o controllo del veicolo (etanolo evaporato). Dopo il trattamento, l'alimentatore saccarosio veniva sia sostituito da un 0,5 M oppure un alimentatore di 2.0 M saccarosio ed i raccoglitori tasso restituito stato registrato l'alimentatore. Utilizzando questo paradigma, api cocaina trattati aumentato i loro sforzi foraggiamento presso l'alimentatore 0,5 M, ma non a 2,0 M di alimentazione (Figura 6). La differenza in effetti visto con le due concentrazioni di saccarosio che dimostra l'importanza di prendere stimoli ambientali in considerazione quando si studia il comportamento delle api.
Figura 1: confocale a scansione laser Immagine del sito di iniezione. destrano Alexa 546-marcato viene iniettato assieme alla soluzione medicinale (rosso). Per identificare il neuropilsi aggiunge sa contro-colorazione con DAPI (verde). Nel emisfero destro del sito di iniezione è stato situato nel lobo verticale (VL), indicato come un esempio per una iniezione di successo. Nell'emisfero sinistro del sito di iniezione è stato situato dorsale del lobo verticale nel neuropil anello, indicato come esempio per una iniezione senza successo. Barra di scala = 100 micron, MB: Corpi funghi, AL: antennali lobi, d: dorsale, v: ventrale, L: Sinistra, R: Sì. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetto tempo-dipendente di actinomicina D (Trascrizione Blocker) sulla memoria a lungo termine, una volta iniettato nel torace A diversi ritardi a seguito appetitiva Condi olfattiva. zionamento (6, 9 o 12 h), 1 ml actinomicina D (1,5 mM in PBS) è stato iniettato nel torace. A lungo termine di memoria (LTM) il recupero è stato valutato 3 d dopo il condizionamento (n = 25-65). Le prestazioni della memoria è stata ridotta in modo dipendente dal tempo, rispetto a quella dei controlli PBS-trattati: l'effetto era significativo quando iniezione troppo posizionare 6 h dopo condizionamento (χ 2 = 18.04, p <0.005), ma non a ritardi più lunghi ( 9 h: × 2 = 0.95; 12 h: χ 2 = 0,47), suggerendo che la formazione richiede LTM un'ondata di trascrizione che si svolge durante un intervallo di tempo definito dopo il condizionamento. barre di errore rappresentano gli errori standard. I dati sono stati precedentemente pubblicato con il 27 e viene ricreato qui con il permesso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3:. Inibizione dose-dipendente di apprendimento delle prestazioni dopo iniezione ocellare di un neuropeptide Il neuropeptide allatostatin C è stata iniettata nella emolinfa testa (200 nl in PBS), attraverso la ocellus mediana, 1 ora prima del condizionamento olfattivo. gruppi indipendenti di animali iniettati con diverse concentrazioni (o PBS per controlli) sono stati formati. trattamento Allatostatin C ha portato ad una diminuzione della capacità di apprendimento, come valutato dalla percentuale di risposte condizionate in ultima condizionata, in modo dose-dipendente che segue una curva a forma di U (n = 70-78). Questa diminuzione è significativa al 10 -6 M, ma non in altri concentrazioni. barre di errore rappresentano gli errori standard. I dati sono stati precedentemente pubblicato con il 28, ed è adattato qui con il permesso. Clicca qui per visualizzare un grande versione di questa figura.
Figura 4:. Il blocco del 1 D ay memoria dopo l'iniezione di Emetine (Traduzione Inhibitor) attraverso il ocellare Tract Il emetine inibitore della sintesi proteica (50 mm in PBS, 200 nl) è stato iniettato nel cervello, attraverso il tratto ocellare, 20 minuti prima condizionata olfattiva. Memoria è stato poi testato 24 ore più tardi. La ritenzione trattamento significativamente ridotta memoria (χ 2 = 7.03, p <0.01) rispetto ai controlli PBS-trattati (n = 57-70). barre di errore rappresentano gli errori standard. JM Devaud, dati non pubblicati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Anatomica e temporale Specificità del Microiniezioni seguito condizionata olfattiva appetitiva, procaina è stato iniettato bilateralmente in entrambi i calici del corpo di funghi o lobi verticali. Recupero della memoria è stato valutato 1 ora dopo l'iniezione ed è stato influenzato solo da iniezioni di procaina nei lobi (1 ora dopo il trattamento: vs salina: χ 2 = 10,00, p <0,005; vs. procaina a calici: χ 2 = 32.92, p < 0.005). L'effetto potrebbe ancora essere visto 2 ore (χ 2 = 6.65, p <0.01) e 3 (χ 2 = 27.22, p <0.005) dopo l'iniezione, ed era ancora luogo-specifica (2 ore: χ 2 = 8.60, p < 0,05; 3 ore: χ 2 = 17.15, p <0,0001), suggerendo che solo l'area iniettata è stata colpita da procaina. Le proporzioni sono relative al livello di condizionamento dusuonare l'ultima prova di condizionamento. barre di errore rappresentano gli errori standard (n = 23-28). I dati sono stati precedentemente pubblicato con il 31, e viene ricreato qui con il permesso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6:. Effetti della cocaina sulle api in volo libero tasso Visitazione (numero di visite da una data / visite medie api per tutte le api durante il periodo di prova) è aumentata in seguito al trattamento di cocaina volatilizzato ad una sorgente di bassa qualità (0.5M: t 70 = 5,0710, p = 0,00003), ma non a una fonte di alta qualità (2M: t 70 = -0,2087, p = 0,8353). Le caselle rappresentano 1 ° e 3 ° quartili con la linea mediana che mostra la mediana. I baffi si estendono a 1,5x l'intervallo interquartile. I valori anomali non sono tracciate come tutti i singoli punti di dati si sovrappongono. I dati sono stati precedentemente pubblicato con il 10, e viene ricreato qui con il permesso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Trattamento | Può essere fatto con le api volanti di libero? | Professionisti | Contro |
| trattamento orale | Sì. | Facile, minimamente invasiva. | Bee digestione non è semplice |
| Il trattamento topico | Sì. | Facile, minimamente invasiva, rapida. | trattamenti ripetuti possono essere problematico. |
| Iniezione nel torace | Complicato,colpisce le api abilità di volo | Coerente e robusto. | Un po 'invasiva. Potenziale di danno / lo stress delle api. |
| Iniezione nel ocellus mediana | Non consigliato. | Coerente e robusto, un po 'localizzato. | Un po 'invasiva. Potenziale di danno / lo stress delle api. |
| Iniezione nel tratto ocellare | Non consigliato. | molto localizzato | Molto invasivo. Potenziale di danno / lo stress delle api. |
| Micro-iniezione in regioni del cervello | Non consigliato. | molto localizzato | Molto invasivo, difficile da eseguire. Potenziale di danno / lo stress delle api. |
| somministrazione di farmaci volatilizzato | Sì. | Facile, minimamente invasiva, rapida. | Non funziona per tutti i farmaci. |
Tabella 1: Comparifiglio dei diversi metodi di trattamento e le loro proprietà.
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Discussion
I metodi di cui sopra consentono un trattamento semplice, efficace e robusto sia priva di volare o api mellifere bardati. Questi metodi sono compatibili con molti paradigmi sperimentali e questioni biologiche (Tabella 1). Tutti i metodi in volo libero può essere facilmente applicato per le api bardati. Il contrario è meno successo, tuttavia, dal momento moderazione temporanea e metodi di trattamento invasivo spesso possono compromettere la capacità volare api.
I metodi sono stati presentati da un punto di vista cerebrale-centric. Ciò non è dovuto a limiti intrinseci delle tecniche, ma piuttosto a causa di interessi personali degli autori. Non vi è alcun motivo per cui questi metodi non possono essere utilizzati per studiare altri organi. Tuttavia, potrebbero essere necessari piccole modifiche per rendere il metodo più adatto da altri organi. Ad esempio, mentre il trattamento topico destinato a raggiungere il cervello è tipicamente applicata al torace, potrebbe essere meglio applicare this all'addome se il bersaglio designato è ovaie. Allo stesso modo, le iniezioni possono essere facilmente applicate a settori diversi del torace o della testa (ad esempio, organi addominali possono essere mirati iniettando tra le scleriti addominali).
Dal punto di vista dei quali composti possono essere somministrati per le api, ci sono davvero limiti. In genere, le persone hanno somministrato composti farmacologici come molecole segnale 21 o dei loro antagonisti, 32 e peptidi su misura 28. Tuttavia, vi è stato un recente aumento di somministrazione di composti api con le domande applicate in mente, come pesticidi e contaminanti di origine antropica 33 34. Recentemente, composti somministrati hanno iniziato a includere molecole di RNA che interferiscono con l'espressione genica direttamente, come ad esempio l'attivazione dsRNA l'interferenza dell'RNA percorso 35 o anche microRNA 36 e 37 antagomirs. Non tutti i metodi funzionano ugualmente bene per tutti i composti.Questo è forse meglio illustrato da composti amari o aspri che rendono l'acqua di zucchero sgradevole per le api, impedendo loro di consumarlo. molecole fragili, come RNA o certe polipeptidi, sono ripartiti quando riscaldato nel corso di una procedura di volatilizzazione o collocato in un solvente dura come DMF. È quindi importante capire la chimica di ciò che viene somministrato per assicurare che sopravvive alla procedura di trattamento.
Ottenere un agente farmacologico in un ape è la parte facile, ma ci sono tre grandi preoccupazioni che non dovrebbe mai essere presa alla leggera durante l'esecuzione di esperimenti farmacologici. Il primo è capire una buona dose per l'esperimento in questione. A seconda del farmaco, ci potrebbe essere già pubblicato letteratura disponibile, ma per la maggior parte, questo dovrà essere risolto da una miscela di ricerche di letteratura, congetture informato, e le curve dose-risposta. A seconda di come complicato il protocollo sperimentale è, potrebbe essere utileprima generare una curva dose-risposta in un saggio biologico più semplice (ad esempio, quantificare movimento complessivo o la sopravvivenza) per avere una migliore idea di una dose-range da provare in un saggio biologico più elaborato. Nel nostro laboratorio, una dose iniziale si sia trovato nella letteratura ape o facendo un mg / kg di conversione in base ai dati della letteratura roditore. Da questo punto di partenza, api vengono trattati con la dose iniziale, più 2 o 3 dosi 10 volte più grande e più piccola della dose iniziale (ad esempio, se la dose iniziale è di 1 mg, 0,01, 0,1, 10 e 100 mg sarebbe anche usato), e naturalmente un controllo veicolo appropriato.
Il secondo problema è leggermente più schizzinoso: specificità di droga. La maggior parte dei farmaci non sono stati sviluppati con le api, o qualsiasi altro insetto, in mente. A causa di questo, gli effetti off-obiettivo sono comuni (ad esempio, mianserin, un vertebrato serotonina antagonista del recettore 38, è stato a lungo pensato per essere un insetto octopaminergic antagonista del recettore, ma recenti fireperti mostrano che le api è anche un antagonista del recettore dopaminergico 39). Una soluzione a questo problema è, piuttosto che basarsi su un solo farmaco, per ripetere lo stesso esperimento con una serie di farmaci noti per avere l'obiettivo di interesse comune. In sostanza, se diversi farmaci sono noti per bloccare un certo target, osservando risultati simili tra i diversi farmaci dovrebbe dare maggiore fiducia che il farmaco ha l'effetto previsto, dal momento che diversi farmaci spesso hanno profili fuori bersaglio unici.
L'ultima questione riguarda garantire che il farmaco sta agendo dove si suppone di agire. A questo proposito, ci sarà sempre un compromesso tra specificità e invasività. Metodi di trattamento sistematici sono generalmente meno invasivo, ma non vi è alcun controllo di dove nel corpo ape il farmaco sta avendo il suo effetto. Anche per microiniezione di tessuti bersaglio farmaci possono viaggiare con emolinfa ad altre parti del corpo ape. Come questo problema è stato risolto needs per essere informati via le domande poste. Per alcuni esperimenti posizione anatomica è irrilevante, mentre per altri questo è l'unico problema di importanza. Il modo migliore per affrontare questo è di iniziare con trattamenti sistemici e gradualmente restringere ad una posizione anatomica utilizzando metodi sempre più specifici. Se il comportamento in fase di studio è particolarmente incompatibile con metodi di trattamento invasive, potrebbe essere utile cercare di scomporla in componenti più semplici prima di fare una serie di esperimenti con molto specifici trattamenti farmacologici.
Questo problema di perdita della droga è ancora più esagerato con il trattamento orale di api in volo libero, in cui i farmaci possono influenzare le api non bersaglio. Falciatrici le api raccolgono il nettare nel campo per riportare alla loro colonia. Saranno scaricare la maggior parte della loro soluzione di saccarosio nell'alveare al ritorno piuttosto che assorbirla. Nel alveare, viene compresso nelle cellule, disidratato, e conservato come il miele. A causa diquesto, farmaci potenzialmente in grado di influenzare le api non bersaglio. Con metodi più specifici (come microiniezioni) questo problema è minimizzato.
Con questi caveat in mente, e adeguatamente affrontati, manipolazione neurofarmacologico delle api può essere uno strumento molto potente. Mentre gli strumenti transgenici sono stati sviluppati per le api 15, a causa del loro stile di vita sociale, è improbabile che transgenici saranno mai essere un modo semplice e affidabile per condurre questo tipo di esperimenti. È quindi probabile che la farmacologia continuerà ad essere un elemento importante della ricerca ape in futuro. Mentre alcuni ricercatori api hanno fatto richieste di metodi sperimentali standardizzati 40, in questo caso, questo sarebbe un errore. Parte della potenza del sistema ape è sempre stata la diversità di approcci sperimentali, e come le tecniche sono state sviluppate con questioni biologiche reali in mente piuttosto che il contrario. E 'tuttavia importante che ci assicuriamoutilizzo del metodo più appropriato per la domanda in questione. Se confronti con studi precedenti sono fondamentali, protocolli standardizzati devono essere strettamente osservate. Tuttavia, utilizzando il protocollo stabilito per il bene di utilizzare metodi standardizzati non deve essere permesso di ostacolare lo sviluppo di nuovi metodi che possono aprire nuove possibilità sperimentali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Any supplier will do |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydrate | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Protection Wax | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Glass capillary | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G NanoFil needle | WPI | NF33BV-2 | |
| Very fine forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| Electrode puller | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| manual micromanipulator | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| electronic micromanipulator | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Junior unit XYZ | |
| stereomicroscope | Leica | M80 | |
| soldering iron | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| small Petri dish | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 50 ml Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| forceps | Australian Entomological Supplies | ||
| Blade holder and breaker | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Feather double edged razor blade | ThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Nichrome wire | Any supplier will do | ||
| Electrical wires | Any supplier will do | ||
| Model paint | Tamiya USA | Depends on colour | |
| Repeating dispenser | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Glass syringe | WPI | NANOFIL | |
| flourescence viewing system | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillary with holder | Drummond | 1-000-0010 | |
| Liquid silicone | Any supplier will do | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
References
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