Summary
Dieses Manuskript beschreibt mehrere Protokolle für pharmakologische Mittel zur Verabreichung von Honigbienen, einschließlich einfacher nicht-invasive Methoden zur freifliegenden Bienen, sowie mehr invasive Varianten, die eine präzise lokalisierte Behandlung von zurückhaltender Bienen ermöglichen.
Abstract
Honigbienen zeigen erstaunliche Lernfähigkeiten und fortschrittliche Sozialverhalten und Kommunikation. Außerdem ihr Gehirn ist klein, leicht zu visualisieren und zu untersuchen. Aus diesem Grund haben die Bienen schon lange ein beliebtes Modell unter Neurobiologie und Neuroethologen für die neuronalen Grundlagen der sozialen und natürlichen Verhalten zu studieren. Es ist jedoch wichtig, dass die experimentellen Techniken Bienen zu studieren interferieren nicht mit dem Verhalten untersucht. Aus diesem Grund war es notwendig, eine Reihe von Techniken für die pharmakologische Manipulation von Honigbienen zu entwickeln. In diesem Beitrag zeigen wir Methoden zur Behandlung von zurückhaltender oder frei fliegenden Honigbienen mit einem breiten Spektrum von pharmakologischen Wirkstoffen. Dazu gehören sowohl nicht-invasive Methoden wie orale und topische Behandlungen, sowie mehr invasive Methoden, die entweder systemisch oder lokalisierte Art und Weise für präzise Medikamentenabgabe zu ermöglichen. Schließlich diskutieren wir die Vor- und Nachteile der einzelnen Methoden und beschreibengemeinsame Hürden und wie man sie am besten überwinden. Wir schließen mit einer Diskussion über die Bedeutung der experimentellen Methode auf die biologischen Fragen der Anpassung und nicht umgekehrt.
Introduction
Seit Karl von Frisch ihre Tanzsprache aufgeklärt 1, Honigbienen sind eine populäre Studie Arten für die Forscher das Verhalten der Tiere und der Neurobiologie geblieben. In den letzten Jahren an der Schnittstelle zwischen diesen beiden Bereichen und mehreren anderen Disziplinen (zB Molekularbiologie, Genomik und Informatik) haben neben ihnen entstanden entstanden eine Vielzahl von neuen Disziplinen. Dies hat zu einer raschen Entwicklung neuer Theorien und Modelle für das Verständnis, wie das Verhalten von Aktivität führt innerhalb des Nervensystems. Aufgrund der einzigartigen Lebensstil, reiche Verhaltensrepertoire und Leichtigkeit der experimentellen und pharmakologische Manipulation, Bienen haben an der Spitze dieser Revolution blieb.
Honigbienen werden verwendet neurobiologischen Grund Fragen zu untersuchen, wie die zugrunde liegenden Lernen und Gedächtnis 2,3, Entscheidung 4 zu machen, Riech 5 oder visuelle Verarbeitung 6. In den letzten Jahren die hon11, schlafen 12, Alterung 13 oder die zugrunde liegenden Mechanismen der Anästhesie 14 - ey Biene hat für die medizinische Forschung, wie die Auswirkungen von Suchtmitteln im Allgemeinen reserviert sogar bereits 7 für das Studium Themen als Modell verwendet.
Im Gegensatz zu den klassischen genetischen Modellorganismen (zB D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), gibt es nur sehr wenige genetische Werkzeuge zur Verfügung , für die Manipulation von neuronalen Funktionen in Honigbienen, obwohl dies derzeit 15 ändern. Stattdessen haben Studien Honigbiene in erster Linie auf pharmakologische Manipulationen verlassen. Dies war sehr erfolgreich; jedoch ist die Vielfalt der Bienenforschung, so dass eine Reihe von Methoden für die pharmakologische Verabreichung benötigt werden. Forschung mit Honigbienen befasst sich sehr unterschiedliche Fragen, wird von Forschern aus verschiedenen Disziplinen und Hintergründe untersucht und verwendet eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen. Viele ReseBogen Fragen erfordern Bienen entweder frei fliegenden sein, frei in ihrer Kolonie interagieren, oder beides. Dies kann es den Überblick über einzelne Versuchstiere machen schwer zu halten und macht Zurückhaltung oder Kanülierung nicht machbar.
Um die Vielfalt von Bienenforschung aufzunehmen, eine Vielzahl von Drug-Delivery-Methoden benötigt werden, so dass für eine robuste und flexible Verwaltung, während sichergestellt wird, dass die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Profile, Invasivität des Verfahrens und seine Zuverlässigkeit, das Paradigma in Frage entsprechen. Aufgrund dieser unterschiedlichen Bedürfnisse haben die meisten Forschungsgruppen ihre eigenen einzigartigen Wirkstoffverabreichung Methoden entwickelt. Bisher hat dies eine Stärke der Bienenforschungsgemeinschaft gewesen; für die Verabreichung desselben Arzneimittels in verschiedenen Umständen es ermöglicht die Entwicklung von Anordnungen von Methoden geführt. Unser Ziel ist es nicht ein einziges standardisiertes Verfahren für die pharmakologische Manipulationen von Bienen zu entwickeln, sondern Methoden zu betonen, dasshaben sich als besonders erfolgreich zu sein, und helfen den Forschern übernehmen diese. Wir diskutieren die grundlegenden Prinzipien, wie sie arbeiten, sowie ihre Vor- und Nachteile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drug Administration für Harnessed Bees
- orale Behandlung
- Bereiten 1,5 M Sucrose-Lösung durch Mischen von 257 g Saccharose mit 500 ml Wasser (es ist leichter, diese Menge an Sucrose aufzulösen in siedendem Wasser). Speichern von Saccharoselösung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
HINWEIS: Saccharose-Lösung bietet eine sehr gastfreundliche Umgebung für bestimmte Mikroorganismen und somit wird leicht kontaminiert und ungenießbar für Bienen. Bulk Saccharoselösung kann bei -20 ° C bis zur Verwendung in Aliquots aufgeteilt und gespeichert werden. - Entscheiden Sie sich für eine angemessene Medikamentendosis (wie es zu erreichen, in der Diskussion Abschnitt weiter unten gerichtet ist), und bereiten eine Lösung , so dass die bevorzugte Arzneimitteldosis in 20 & mgr; l Saccharose - Lösung aufgelöst wird (zB zu liefern 20 ug, verdünnte Arzneimittel bei einem Verhältnis von 1 mg / ml). Harness Bienen nach Felsenberg et al. (2011) 16. Führen Sie diesen Schritt mindestens 12 Stunden vor der medikamentösen Behandlung, um sicherzustellen, dass die Bienen nicht mehr gestresst out aus nutzbar zu machen, wenn die Arzneimittellösung präsentiert wird.
HINWEIS: Weitere konsistente Ergebnisse, ist es am besten Bienen verhungern (von spannte Bienen bei 34 ° C in einem Inkubator platziert und 70% Luftfeuchtigkeit) O / N. - Mit Hilfe einer Mikropipette, berühren Sie einen Tropfen 1,5 M Saccharose Wasser auf die Antenne eines spannte Biene. Wenn der Rüssel verlängert wird, berühren Sie einen 20 & mgr; l Tröpfchen von 1,5 M Saccharose das Medikament direkt an den Rüssel der Biene enthält. Stellen Sie sicher, dass die Biene alles verbraucht. Als Kontrolle Fahrzeug 1,5 M Saccharose-Lösung ohne Zusatz von Drogen.
HINWEIS: Die Menge an Saccharose-Lösung müssen möglicherweise basierend auf experimentellen Pläne angepasst werden. Wenn appetitive Anlage bestimmt ist, werden die Bienen Fütterung kurz vor dem Training mit Bienen Ansprechbarkeit stören. - Entsorgen oder beiseite Bienen, die nicht alle der Saccharose verbrauchen.
HINWEIS: Wenn eine große Anzahl von Bienen nicht die Saccharoselösung zu trinken, kann die Fütterung Zeitplan angepasst werden müssen.
- Bereiten 1,5 M Sucrose-Lösung durch Mischen von 257 g Saccharose mit 500 ml Wasser (es ist leichter, diese Menge an Sucrose aufzulösen in siedendem Wasser). Speichern von Saccharoselösung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Injektion in den Thorax
- Bereiten Sie Droge in Honigbiene 17 Ringer wie folgt:
- Mischen und Autoklaven 7,45 g NaCl, 0,448 g KCl, 0,812 g MgCl 2, 0,735 g CaCl 2, 54,72 g Saccharose, 4,95 g D-Glucose und 2,48 g HEPES in 1000 ml Wasser. Seien Sie vorsichtig, wenn Ringer Lagerung, da es leicht kontaminiert ist. Aliquotieren und lagern Ringer bei -20 ° C bis zur Verwendung.
- Man löst den Wirkstoff in Ringer-Lösung und dann verdünnt, so daß die gewünschte Menge in 5 & mgr; l vorhanden ist. Als ein Beispiel, wenn Bienen mit 5 ug eines Arzneimittels behandelt werden sollen, 1 g kann zunächst in 1 ml in Ringer gelöst werden, bevor 1 verdünnt wird: für eine endgültige Lösung von 1 ug / ul 1,000 in Ringer.
HINWEIS: Alternativ können kommerziell erhältliche PBS (Phosphat-gepufferte Salin) kann anstelle von Ringer-Lösung verwendet werden.
- Machen Sie eine microscalpel durch die Ecke eines zweischneidigen Rasierklinge abbrach miteinen Klingenhalter. Bringen Sie das Messer Fragment an einem Messerhalter so, dass es eine schöne Klinge mit einem scharfen Endpunkt macht.
- knapp über dem Scutellum, neben dem hinteren Flügel Prozess eines Bienen Thorax unter einem Stereomikroskop, verwenden Sie sorgfältig die microscalpel ein Loch von 2 mm zu schneiden. Vermeiden Sie zu tief schneiden, da dies Flugmuskeln verletzen, und achten Sie darauf, die Flügel Scharniere zu vermeiden. Idealerweise schneiden nur drei Seiten, so dass die Klappe der Kutikula später gefaltet werden, um die Stelle der Verletzung zu schließen zurück.
- Mit Hilfe einer Mikropipette, Kaution 5 μlL Ringer (oder PBS), um das Medikament auf dem Loch im Brustkorb enthält. Sorgfältig unter dem Mikroskop überwachen die gesamte Tropfen in der Hämolymphe absorbiert wird, um sicherzustellen. Verwenden Ringer (oder PBS) als Fahrzeugsteuerung.
- Wenn möglich, bewegen Sie die Kutikula Klappe wieder über das Loch. Nach 5-10 Stunden wird wieder anbringen und abdichten.
HINWEIS: Als Alternative zu dieser Technik injizieren 1 & mgr; l direkt in den Brustkorb mit einer Glasspritze, nach einem Öffnen small Loch in der Mitte der frenum (Querlinie im hinteren Bereich des Scutellum) mit einer Injektionsnadel (Durchmesser: 0,6 mm, G: 23). Dies umgeht die Notwendigkeit, zuerst den Thorax mit einem Skalpell und der Injektionsstelle geschnitten ist kleiner, aber dieses Verfahren wird verlassen ausgesetzt, um die Injektionsstelle.
- Bereiten Sie Droge in Honigbiene 17 Ringer wie folgt:
- Ocellus Injektion
Hinweis: Dies ist ein Verfahren, geeignet für Moleküle über die Kopfkapsel, in die Hämolymphe zu liefern.- Vorbereitung Medikamente wie in 1.2.1, aber justieren Arzneimittelkonzentrationen so dass die gewünschte Dosis wird in 1 ul Ringer oder PBS enthalten sein (weniger Volumen kann durch die ocellus Loch absorbiert werden, als durch den Thorax).
- Bereiten Sie eine microscalpel wie in 1.2.2. Unter einem Stereomikroskop, sperren Sie den Kopf eines spannte Biene an Ort und Stelle durch den Hals Spalt mit Wachs gefüllt wird. Verwenden Sie bei niedriger Temperatur schmelzendes Wachs (zB Dentalwachs), um schädliche antennal Geruchsrezeptoren oder andere Zellen zu vermeiden , dass ich sein kannmportant Verhalten für die Bewertung (zB olfaktorischen Lernen). Dann vorsichtig die Linse des Median ocellus entfernen, indem die Spitze des microscalpel unter der Linse einsetzen und vorsichtig die Linse frei von der Kopfkapsel brechen.
HINWEIS: Es ist auch möglich, Wachs vorsichtig über die Antennen zu platzieren Bewegung zu verhindern. - Sorgfältig pipettieren Droge auf die ocellus Loch. Warten Sie, bis alle in die Kopfkapsel genommen wird. Entfernen Zahn Wachs von den Antennen und lassen Sie die Biene für eine Weile ruhen, bevor Sie das experimentelle Verfahren fortgesetzt wird. Verwenden Ringer (oder PBS) als Fahrzeugsteuerung.
- Die Injektion in den ocellar - Darm - Trakt
HINWEIS: Die ocellar - Darm - Trakt große Fasern enthält, zu den meisten Regionen des zentralen Gehirns verbindet 18. Diese Behandlungsmethode ermöglicht nur Verbindungen an das Gehirn Anwendung, aber nicht spezifische Teilbereiche des Gehirns Targeting.- Bereiten Sie Biene wie in 1.3.2. und entfernen Sie die Linse des Median ocellus mit dem tip eines microscalpel wie in 1.3.3.
ANMERKUNG: Dies kann bis zu 2 Stunden vor der Injektion durchgeführt werden. Basierend auf unserer Erfahrung sind gefüttert Bienen besser in der Lage mit dieser Operation als verhungert Bienen zu bewältigen - Füllen Sie eine 10 & mgr; l - Glasspritze mit einem kleinen Messgerät ausgestattet (zB 33, Durchmesser: 210 & mgr; m) Nadel mit Wirkstofflösung wie in 1.3.1 bereit.
- Mit Hilfe eines manuellen Mikromanipulator, legen Sie die Spritzenspitze durch die ocellar Retina in die Kopfkapsel bis zu einer Tiefe von 50 & mgr; m und 250 nl der Lösung zu injizieren.
- Nach dem Gebrauch der Spritze spülen 3 mal mit destilliertem Wasser, dann 3-mal mit 75% Ethanol.
- Bereiten Sie Biene wie in 1.3.2. und entfernen Sie die Linse des Median ocellus mit dem tip eines microscalpel wie in 1.3.3.
- Mikroinjektion in bestimmten Gehirnstrukturen
HINWEIS: Zusätzlich zu den systematischen Behandlungen oben erwähnt, ist es möglich, Mikroinjektionen in bestimmten Hirnstrukturen durchzuführen. Dies ermöglicht eine pharmakologische Manipulation von einem oder mehreren Hirnregionen, während andere unbeeinflußt bleibt. Das funktioniertam besten mit Hirnregionen, die leicht von der vorderen Hirnoberfläche zu erkennen (zB Antennalloben, Pilzkörper Kelche oder vertikale Lappen oder den optischen Loben), aber auch andere Regionen gezielt worden. Bitte beachten Sie, dass die Orientierung (anterior / posterior, dorsal / ventral) bezieht sich auf die Körperachse, sondern als auf die neuraxis 19.- Bereiten Sie die Droge in Ringer oder PBS in der gleichen Weise wie in 1.2.1, Zugabe eines fluoreszierend (beispielsweise 0,5 mg / ml Dextran, Alexa 546 oder 568 fluor) oder nichtfluoreszierenden Farbstoff (beispielsweise 1 mM Methylenblau).
HINWEIS: Die Zugabe eines Fluoreszenzfarbstoffs Überprüfung der Injektionsstelle ermöglichen wird, nachdem das Experiment vorbei ist (konfokale Mikroskopie, nach Gehirnsezierung), während nicht-fluoreszierende Farbstoffe während des Experiments die direkte Überwachung ermöglichen. - Um Glaspipetten zur Injektion machen, Glas Kapillaren des richtigen Durchmesser in den Halter Klammern einer Elektrode Abzieher (1,0 mm für die Standard-Halteeinsatzer eingeschlossen für die Mikroinjektors in der Materialliste erwähnt). Stellen Sie Zug- und Heizstufen eine ca. 0,5 cm lange Spitze, um (Einstellungen werden für jeden Abzieher unterschiedlich sein, auch wenn das gleiche Modell verwendet wird).
HINWEIS: Im Idealfall sind die beiden Pipetten gezogen von einem Glas sollte die gleiche Länge und Form aufweisen, so dass beide verwendet werden können. - Unter einem Stereomikroskop, brechen die Spitzen einen Außendurchmesser von etwa 10 bis 15 & mgr; m, basierend auf der visuellen Abschätzung zu erhalten, unter Verwendung einer Skala auf einem Raster in das Okular eingefügt. Die Schritte auf der Skala werden vom Hersteller festgelegt und kann für das verwendete Vergrßerung korrigiert werden.
- Dann füllen die Glaspipetten mit der Lösung zu injizieren. Wenn Glaskapillaren mit Fäden verwendet werden, füllen Sie die Pipette durch die Rückseite in die Wirkstofflösung platzieren, sonst Spitze Micro Tipps mit zu füllen.
- Legen Sie die gefüllte Glaspipette in die Kapillare Inhaber eines Mikroinjektors, die durch eine manuelle oder elektronische mi gesteuert wirdcromanipulator.
- Kalibrieren Sie den Mikroinjektors das gewünschte Volumen zu injizieren (0,5-2 nl, abhängig von der Größe der Struktur des Gehirns gezielt). Hierzu injizieren direkt in eine kleine Petrischale Mineralöl enthält, und den Durchmesser des Tröpfchens mit dem graticule messen. Ändern Sie Einstellungen, bis die gewünschte Lautstärke erreicht ist.
- Befestigen Sie den Kopf eines spannte Biene mit weichen Dentalwachs wie in 1.3.2, bevor eine Öffnung in den vorderen Teil der Kopfkapsel eingeschnitten, sondern microscalpel verwenden, mit drei Schnitte: ein knapp unter dem Median ocellus (ventralen), eine an die Grenze des rechten oder linken Auge und eine über der Antenne stammt (dorsale). Verwenden Sie ein Stück Dentalwachs die geöffnete Klappe in Position zu halten.
- (Sehr dünne Membran um das Gehirn) über die gezielte Gehirnstruktur vorsichtig schieben Drüsen und der Trachea auf der Oberseite des Gehirns liegen beiseite feinen Pinzette, dann einen kleinen Bruch in die Neurilemm machen.
HINWEIS: Wenn viele Bienen auf einmal behandelt werden, dieses Verfahrenkann früher durchgeführt werden; aber darauf achten, nicht die Bienen in diesem Zustand zu lange verlassen (nicht mehr als 30 min), als ihr Gehirn desiccate könnten. - Legen Sie die Spitze in die Hirnregion gewünscht wird , und passen Tiefe senkrecht zur Hirnoberfläche (zB 60 & mgr; m für die Pilzkörper Kelche). Injizieren Sie die voreingestellte Lautstärke. Zur seitlichen Gehirnregionen, injizieren bilateral (dh tun eine Injektion zu jeder Hemisphäre). Wenn ein nicht-fluoreszierenden Farbstoff verwendet wird, stellen die aufgetreten Injektion im rechten Bereich auf Beobachtung, während die Injektion. Wenn ein fluoreszierender Farbstoff verwendet wird, das gleiche tun unter Fluoreszenzlicht ein Stereomikroskop mit einem Fluoreszenz-Beobachtungssystem verwendet wird.
- Danach legen Sie die offene Klappe wieder über den Kopf des Biene. Schmelzen eines Kristalls aus Eicosan, die etwa 1 mm im Durchmesser ist, einen dünnen Draht um die Spitze einer Mikro Lötkolben gewickelt unter Verwendung von (Schmelztemperatur ist 35-37 ° C) und die Schnitte abzudichten. Dies wird erheblich Sterblichkeit verringern.
- Befreit dasBiene aus dem Gurtzeug für Verhaltensanalyse (aber Diskussion sehen), oder für Experimente an zurückhaltender Bienen im Gurtzeug halten - zB Rüssel - Streckreflex (PER) Prüfung 20.
- Wenn ein fluoreszierender Farbstoff verwendet wurde, sicherzustellen , dass die Injektion den Bereich von Interesse getroffen , nachdem das Experiment vorbei ist ein konfokales Laser - Scanning - Mikroskop (Abbildung. 1).
Hinweis: Dies ist besonders nützlich, wenn tiefere Hirnarealen Targeting (wo es schwierig wäre, nicht fluoreszierenden Farbstoff während der Injektionsphase zu sehen).
- Bereiten Sie die Droge in Ringer oder PBS in der gleichen Weise wie in 1.2.1, Zugabe eines fluoreszierend (beispielsweise 0,5 mg / ml Dextran, Alexa 546 oder 568 fluor) oder nichtfluoreszierenden Farbstoff (beispielsweise 1 mM Methylenblau).
2. Drug Administration Methoden frei fliegende Bienen
- orale Behandlung
- Vorbereitung Medikament in der gleichen Weise wie in den Schritten 1.1.1-1.1.2. In Arzneimittellösung zu einem Zubringer und in den Kühlschrank für die Lagerung.
Hinweis: Jeder Feeder tun wird, wie ein auf dem Kopf nach unten Flaschendeckel oder einem Glas auf Tissue-Papier invertiert. - Zug Bienen zu einer Schwerkraftzuführung, die 1 M oder 0,5M Saccharoselösung durch eine Zuführung der Nähe des Bienenstocks platzieren. Sobald Sie anfangen Bienen am Anleger Nahrungssuche, sie nach und nach weiter weg bewegen, bis sie in einem komfortablen Abstand ist (mindestens 5 m), die gestochen zu vermeiden.
- Lackzeichen Bienen, um den Überblick einzelner Honigbienen zu halten. Machen Sie eine Liste aller Farbkombinationen, die verwendet werden. Wenn eine Biene landet am Anleger, markieren Sie sorgfältig seinen Bauch mit zwei Farben und eine Note auf der Liste zu machen, dass die Kombination genommen wird.
- Tauschen Sie die Schwerkraftzuführung für einen Zubringer mit dem Arzneimittel / Saccharose-Lösung. Beachten Sie die gekennzeichneten Bienen, die den Einzug besuchen. Fangen Sie nicht markierte Biene Besuch der Feeder als Bienen produktivsten Werber sind, und die Zahl der Bienen die unter Drogen Feeder besuchen kann schnell außer Kontrolle geraten. Dies ist besonders problematisch, wenn das gleiche Experiment an aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt werden, wie naive Bienen nicht mehr naiv sein könnten.
HINWEIS: Als Alternative zur Ausbildung von einzelnen Bienen zu einem Zubringer, frühere Autor23 - s erfolgreich Arzneimittel-geschnürt Saccharose Wasser auf einen ganzen Bienenstock 21 eingespeist.
- Vorbereitung Medikament in der gleichen Weise wie in den Schritten 1.1.1-1.1.2. In Arzneimittellösung zu einem Zubringer und in den Kühlschrank für die Lagerung.
- Die topische Behandlung
HINWEIS: Das Ziel ist es, die Verbindung von Interesse in einem Lösungsmittel zu lösen, die die wächserne Insekt Kutikula eindringen kann. Verschiedene Lösungsmittel können für diesen Zweck verwendet werden. Die am häufigsten verwendet werden, umfassen Aceton, Dimethylformamid (DMF) und Dimethylsulfoxid (DMSO).- Beurteilen Sie die Lösungsmittel am besten für die Verbindung zur Hand arbeitet. Wenn eine starke Phänotyp aus einer Überdosis zu erwarten ist (beispielsweise Lähmung oder Tod), treat Bienen (Schritt 2.2.2) mit einer hohen Dosis (beispielsweise 20 & mgr; g Kokain 7) in jeder der verschiedenen Lösungsmitteln gelöst und vorsichtig Zeit bis Paralyse überwachen oder Tod.
- Mit einem 1 ul Mikrokapillare (oder einer Mikro, die auf einem geeigneten Dispensers angebracht werden kann) und Mikrokapillare Halter, ziehe 1 ul der Wirkstofflösung (zB 381; g / & mgr; l Kokain) in die Kapillare. Vertreibt den Abfall, und es sorgfältig malen auf den Thorax eines markierten Biene. Decken so groß eines Bereichs a mit der Lösung möglich, anstatt eines festen Tropfen verlassen, da die Biene dann wahrscheinlich ist es, zu pflegen ab. Achten Sie darauf, nicht die Verbindung zu ermöglichen, die Flügel zu kontaktieren Scharniere, oder das sie aus den Flügeln des Thorax und entlang ziehen kann, wo sie ohne absorbiert in die Hämolymphe verdampfen.
HINWEIS: Je nach Forschungsziel, dieses Verfahren auch verwendet werden können, Drogen Bauch auf die Biene zu verabreichen. Allerdings erreichen Drogen das ZNS schneller und in größeren Mengen , wenn auf den Thorax 24 .Diese Methode angewandt funktioniert genauso gut mit spannte wie mit frei fliegenden Bienen.
- verflüchtigten Behandlung
- Löse Drogen (früher diese Methode verwendet wurde Kokain zu Honigbienen 10 zu liefern) in 100% igem Ethanol. Um sicherzustellen, dass die Löslichkeit, nicht um ein Hydrochlorid oder andere Salzformen des Einsatzeswenn möglich Droge. Wenn eine Verdünnung macht es so vorbereiten, dass die Menge an einer Biene geliefert werden soll, in 100 & mgr; l vorhanden. Verwenden Sie reines Ethanol als Fahrzeugkontrolle.
- So erstellen Sie einen Faden, verwenden Sie das gleiche Verfahren wie McClung und Hirsh 25.
- Kurz erklärt: wind up Nichromdrahtes eng um einen Nagel und heften sich an zwei elektrischen Leitungen (eine an jedem Ende des Filaments). Entfernen Sie den Nagel. Die verbleibende Nichrom Spule wird als Filament bezeichnet.
- Fädeln der zwei Drähte durch sorgfältig Bohrungen im Deckel einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen, die zu der gewählten Temperatur beständig sein sollte. Kleben Sie die Drähte an Ort und Stelle mit flüssigem Silikon.
HINWEIS: Dadurch wird das Rohr luftdicht zu machen. Dies ist wichtig, sekundäre Exposition gegenüber dem Experimentator zu vermeiden und sicherzustellen, dass die Bienen mit der entsprechenden Dosis behandelt werden.
- Befestigen Sie die Drähte an dem Faden an eine Stromquelle führt. die Temperatur mit einem Thermoelement zu messen,das Filament, experimentieren mit unterschiedlichen Spannungs- / Strom-Kombinationen, bis eine, die für das betreffende Medikament in einem geeigneten Temperaturprofil ergibt sich idealerweise eine, die für 10 Sekunden von Heizung oder weniger erlaubt. Dies ist sehr wichtig, siehe einschlägige Literatur ( zum Beispiel , um es zu verflüchtigen Kokain muss mindestens 200 ° C erhitzt werden, aber bei Temperaturen über 350 ° C wird aufgeteilt in Nebenverbindungen 26).
- Pipette vorsichtig 100 ul Arzneimittel Ethanol-Lösung auf das Filament. Verbreiten Sie die Flüssigkeit über so viel Faden Oberfläche wie möglich, da dies Verdampfungseffizienz erhöhen. Lassen Sie den Faden bei Raumtemperatur ausgesetzt, bis das gesamte Ethanol verdampft ist.
HINWEIS: Wenn das Ethanol nicht ausreichend verdampft wird, werden Bienen sowohl mit dem Medikament der Wahl und Ethanol behandelt werden. Bienen sind extrem empfindlich gegenüber Ethanol, und einige Medikamente haben synergistische Interaktionen mit Ethanol, das wird Bias extellen Ergebnisse. - Sobald das Ethanol vollständig verdampft ist (drug Niederschlag kann in der Regel auf dem trockenen Filaments unter einem Mikroskop zu sehen ist), fangen sie eine frei fliegende Biene in einem 50-ml-Tube. Schließen Sie vorsichtig den Deckel des Filaments enthält.
- Schalten Sie das Gerät für 10 Sekunden, schalten Sie das Gerät aus und warten Sie weitere 50 Sekunden (damit die verflüchtigte Verbindung zu kühlen und dadurch kondensieren oder Kaution). Lassen Sie die Biene.
HINWEIS: Während diese Behandlungsmethode hervorragend für freifliegenden Bienen arbeitet, kann es genauso effektiv mit spannte Bienen verwendet werden. Bringen Sie einfach in einem 50-ml-Tube, die genutzt Biene. Laden Sie den Faden wie in 2.3.4 zwischen Bienen beschrieben. Für einen höheren Durchsatz können mehrere Filamente parallel verwendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eine Auswahl von repräsentativen Ergebnissen für die oben beschriebenen Verfahren gezeigt sind, in erster Linie zu zeigen, dass die Verfahren pharmakologische Mittel erlauben das Gehirn und beeinflussen honey bee Verhalten zu erreichen.
Spezifische Auswirkungen auf die Gehirnprozesse können leicht folgende Thorax Injektion erhalten werden.
Da pharmakologische Wirkstoffe durch den Thorax injiziert kann im Körper auf mehrere Ziele wirken, und sich in den Körper verdünnt, bevor sie das Gehirn erreicht, kann diese Technik möglich Spezifität Bedenken aufwerfen. Dennoch wurde es in der Literatur vielfach verwendet, um mit kognitiven Prozesse zu stören, ohne die Notwendigkeit, sehr hohen Dosen zu verwenden, die wichtigsten Nebenwirkungen ergeben könnten. Zum Beispiel Blocker der Transkription wurden mit dieser Technik, verabreicht, um Phasen des Speichers zu identifizieren, die Gen erfordernAusdruck. Thorax Injektion solcher Moleküle ist kompatibel mit dem Überleben für mehrere Tage 27, was bedeutet , dass ihre möglichen toxischen Wirkung auf andere Ziele begrenzt werden kann, vorausgesetzt , die Konzentration ist gut gewählt. In solchen Bedingungen selektiv und zeitabhängige Wirkungen auf Speicher erhalten werden, wodurch eine effiziente Ausrichtung des Gehirns zeigt (Fig. 2).
Diffusion von Molekülen in den Kopf Hämolymphe führt zu schnellen, dosisabhängige Effekte.
Ocellus Injektion ist ein Weg, um eine schnelle Diffusion von Molekülen von Interesse in den ganzen Kopf durch die Hämolymphe zu ermöglichen, vor allem, wenn sie viele weit verbreitete Ziele im Gehirn haben können. Diese Methode wurde verwendet , allatostatins zu administrieren, Neuropeptide , die auch als Neurohormone 28 handeln kann). Als Folge in einem olfaktorischen Lernen Test konsistent beobachtet, die mit einer reduzierten Leistung wurdedie vorgeschlagene Anwesenheit in olfaktorischen Verarbeitung und Lernen 28 beteiligten Rezeptoren in verschiedenen Hirnregionen allatostatin. Eine dosisabhängige Kurve für diesen Effekt konnte festgestellt werden, die von verschiedenen Konzentrationen an unabhängige Gruppen laufen parallel Injektion (Bild. 3).
Verschiedene Arten der Verabreichung können ähnliche Effekte auf die Gehirnfunktion ergeben.
Emetin, ein Blocker der Proteinsynthese wird verwendet, um die Bildung von frühen olfaktorischen Speicher Langzeitgedächtnis zu beeinträchtigen, die in der Regel 1-2 Tage nach der Konditionierung ausgedrückt. In den meisten veröffentlichten Studien hat es in den Thorax 29 injiziert worden. Wir zeigten , dass ähnliche Wirkungen durch Verabreichung direkt an das Gehirn durch den ocellar Trakts erhalten werden konnte (Abb . 4): eine Anpassung der Einspritzparameter Providing (kleineres Volumen, eine höhere Konzentration und kürzerVergleichen mit Figur 4 in Stollhoff et al, 2005 , 29 -. Verzögerung vor der Konditionierung), haben wir eine Abnahme (~ 20%) ähnlich wie in der Literatur unter Verwendung der gleichen Arzneimittelmenge (10 nM) gefunden erhalten.
Die Wirkungen von lokalisierten Injektionen werden in Zeit und Raum beschränkt
Um die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften von Drogen testen mikroinjiziert in spezifischen Hirnregionen, spannte Bienen wurden in einem olfaktorischen PRO Konditionierung ausgebildet und dann injiziert bilateral mit 0,5 nl von 740 mM Procain (ein Anästhetikum) in den Pilzkörper Kelche oder vertikale Lappen ( Kochsalzlösung wurde als Kontrolle verwendet). Wenn Bienen nacheinander für Rückruf getestet wurden 1, 2 und 3 Stunden nach der Injektion wurde die Leistung nur in Bienen mit bilateralen Injektionen in den Lappen (Abb. 5) beeinträchtigt. Intact neuralen Ausgang von den Lappen, aber nicht von den Kelchen ist, bekannt istfür olfaktorische Speicherabruf erforderlich sein, so ist dies legt nahe, dass Procain zur Lappens lokalisierte blieb in dem sie für mindestens 3 h eingespritzt worden war. Es zeigt auch, dass, wenn sie in die Kelche injiziert, Diffusion in die Nähe Lappen wurde mit der gleichen Periode beschränkt auf, da eine calycal Injektion von Procain nicht Blockade der Lappen führte.
Behavioral Phänotypen Arzneimittelverabreichung folgenden sind oft kontextabhängig
Frühere Experimente haben , dass mit Kokain Bienen nach der Behandlung gezeigt überschätzen die Qualität einer Saccharoselösung 10,30. Um zu sehen, ob dieser Effekt auf kontextabhängig war (hier Basis Saccharose-Qualität), wurden freifliegenden Honigbienen mit verflüchtigten Kokain behandelt. mit 1 M Saccharose-Lösung individuell gekennzeichnet waren frei fliegenden Honigbienen erlaubt bei einer Zuführung nach Futter zu suchen. Am Zubringer wurden Bienen sanft gefangen inein 50 ml-Zentrifugenröhrchen, wie sie waren etwa steigen von der Beschickungsvorrichtung zu. Bienen wurden entweder mit Kontroll 100 ug Freebase Kokain oder Vehikel behandelt (verdampfte Ethanol). Nach der Behandlung wurde die Saccharose feeder entweder durch eine 0,5 M oder 2,0 M Sucrose feeder ersetzt, und die Rate foragers wieder in den feeder aufgezeichnet wurde. Mit diesem Paradigma, Kokain behandelten Bienen erhöht ihre Nahrungssuche Aufwand bei der 0,5 M Feeder, aber nicht an der 2,0 M Zuführung (Abbildung 6). Der Unterschied in der Wirkung mit den Sucrosekonzentrationen gesehen zwei demonstriert schön wichtig es ist, Umweltreize zu berücksichtigen, wenn Biene Verhalten zu studieren.
Abbildung 1: Die konfokale Laserscanning Bild von der Injektionsstelle. Alexa 546-markiertes Dextran injiziert wird zusammen mit der Arzneimittellösung (rot). Zur Identifizierung der neuropilsa Gegenfärbung mit DAPI hinzugefügt wird (grün). In der rechten Hemisphäre wurde die Injektionsstelle in der vertikalen Lappen (VL) angeordnet ist, als ein Beispiel für eine erfolgreiche Injektion gezeigt. In der linken Hemisphäre wurde die Injektionsstelle dorsal des Vertikalkeule in dem Ring Neuropil befindet, als ein Beispiel für eine nicht erfolgreiche Injektion gezeigt. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m, MB: Pilzkörper, AL: Antennalloben, d: dorsale, v: ventralen, l: links, r. Rechts Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Zeitabhängige Wirkung von Actinomycin D (Transkription Blocker) auf das Langzeitgedächtnis, wenn es in den Thorax injizierte Zu verschiedenen Verzögerungen folgende appetitive olfaktorischen Bedin. tionierung (6, 9 oder 12 h), 1 & mgr; l Actinomycin D (1,5 mM in PBS) wurde in den Brustkorb injiziert. Langzeitgedächtnis (LTM) Retrieval wurde 3 d nach der Konditionierung bewertet (n = 25-65). Gedächtnisleistung wurde in einer zeitabhängigen Art und Weise verringert wird , im Vergleich zu der von PBS-behandelten Kontrollen: Der Effekt signifikant war , wenn zu Einspritzung 6 h nach der Konditionierung (χ 2 = 18.04, p <0,005), aber nicht auf längere Verzögerungen ( 9 h: χ 2 = 0,95; 12 h: χ 2 = 0,47), was darauf hindeutet , dass LTM Bildung eine Welle der Transkription erfordert, die während eines definierten Zeitfensters nach der Konditionierung stattfindet. Fehlerbalken stellen die Standardfehler. Die Daten wurden zuvor 27 veröffentlicht und wird hier mit Genehmigung neu erstellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4695 / 54695fig3.jpg "/>
Fig . 3: Dosisabhängige Inhibierung der Lernleistung Ocellar Nach Injektion eines Neuropeptid Das Neuropeptid allatostatin C wurde in den Kopf Hämolymphe (200 nl in PBS) injiziert, die durch die Mittel ocellus, 1 h vor olfaktorischen Konditionierung. Unabhängige Gruppen von mit unterschiedlichen Konzentrationen injizierten Tieren (oder PBS für Kontrollen) wurden ausgebildet. Allatostatin C-Behandlung führte zu einer Abnahme der Lernleistung, wie durch den Prozentsatz der konditionierten Reaktionen in der letzten Anlage bewertet, in einer dosisabhängigen Weise nach einer U-förmigen Kurve (n = 70-78). Dieser Rückgang war signifikant bei 10 -6 M , aber nicht in anderen Konzentrationen. Fehlerbalken stellen die Standardfehler. Die Daten wurden bisher 28 veröffentlicht wurde , und wird hier mit Genehmigung angepasst. Bitte klicken Sie hier um ein , um zu vergrößern version von dieser Figur.
Abb . 4: Blockade von 1 D ay Speicher nach der Injektion von Emetin (Translation Inhibitor) durch das Ocellar Tract Der Proteinsyntheseinhibitor Emetin (50 mM in PBS, 200 nl) wurde in das Gehirn injiziert wird , durch die ocellar Trakts, 20 min vor Riechanlage. Speicher wurde dann 24 h später getestet. Die Behandlung signifikant beeinträchtigt Einprägungsgrad (χ 2 = 7,03, p <0,01) im Vergleich zu PBS-behandelten Kontrollen (n = 57-70). Fehlerbalken stellen die Standardfehler. JM Devaud, nicht veröffentlichte Daten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:. Anatomische und Temporal Spezifität von Mikroinjektionen Nach appetitive olfaktorischen Konditionierung wurde in bilateral injiziert Procain entweder den Pilzkörper Kelche oder vertikale Lappen. Gedächtnisabruf wurde 1 Stunde nach der Injektion beurteilt und wurde nur von Procain - Injektionen in den Lappen (1 Stunde nach der Behandlung betroffen: vs. Kochsalzlösung: χ 2 = 10.00, p <0,005; gegen Procain zu Kelche: χ 2 = 32.92, p < 0,005). Der Effekt kann noch 2 h zu sehen (χ 2 = 6,65, p <0,01) und 3 (χ 2 = 27.22, p <0,005) nach der Injektion, und war noch ortsspezifische (2 hr: χ 2 = 8,60, p < 0,05; 3 Std: χ 2 = 17.15, p <0,0001), was darauf hindeutet , daß nur der Injektionsstelle von Procain betroffen war. Proportions bezüglich zu Anlage Ebene duRing der letzten Anlage Studie. Fehlerbalken stellen die Standardfehler (n = 23-28). Die Daten wurden zuvor 31 veröffentlicht wurde , und wird hier mit Genehmigung neu erstellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6:. Auswirkungen von Kokain auf Free-fliegenden Bienen Visitation Rate (Anzahl der Besuche von einem bestimmten Biene / durchschnittliche Anzahl der Besuche für alle Bienen während des Testzeitraums) wurde bei einer niedrigen Qualität Quelle folgende verflüchtigt Kokain Behandlung erhöht (0,5 M: t 70 = 5,0710, p = 0,00003), aber nicht mit einer hohen Qualität Quelle (2M: t 70 = -0,2087, p = 0,8353). Die Boxen repräsentieren 1. und 3. Quartile mit der Mittellinie den Median zeigt. Die Whisker verlängern bis 1,5x die Quartilsabstand. Ausreißer werden nicht wie alle einzelnen Datenpunkte aufgetragen überlagert werden. Die Daten wurden zuvor 10 veröffentlicht wurde , und wird hier mit Genehmigung neu erstellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Behandlung | Kann mit frei fliegenden Bienen zu tun? | Pros | Cons |
| orale Behandlung | Ja. | Einfach, minimal-invasive. | Bee Verdauung ist nicht einfach |
| Die topische Behandlung | Ja. | Einfach, minimal-invasive, schnell. | Wiederholte Behandlungen kann problematisch sein. |
| Injektion in den Thorax | Kompliziert,wirkt sich die Bienen fliegen Fähigkeiten | Konsistente und robust. | Etwas invasiv. Mögliche zu schaden / Stress Biene. |
| Die Injektion in den Median ocellus | Nicht empfohlen. | Konsistente und robust, etwas lokalisiert. | Etwas invasiv. Mögliche zu schaden / Stress Biene. |
| Die Injektion in den ocellar-Darm-Trakt | Nicht empfohlen. | Sehr lokalisiert | Sehr invasiv. Mögliche zu schaden / Stress Biene. |
| Mikroinjektion in Hirnregionen | Nicht empfohlen. | Sehr lokalisiert | Sehr invasive, schwer durchzuführen. Mögliche zu schaden / Stress Biene. |
| Verflüchtigten Arzneimittelabgabe | Ja. | Einfach, minimal-invasive, schnell. | Nicht für alle Medikamente wirken. |
Tabelle 1: CompariSohn der verschiedenen Behandlungsmethoden und deren Eigenschaften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Methoden oben skizzierten ermöglichen eine einfache, effektive und robuste Behandlung von entweder freifliegenden oder spannte Honigbienen. Diese Verfahren sind kompatibel mit vielen experimentellen Paradigmen und biologischen Fragen (Tabelle 1). Alle der freifliegenden Methoden leicht nutzbar Bienen angewendet werden kann. Das Gegenteil ist weniger erfolgreich, da jedoch vorübergehende Zurückhaltung und invasive Behandlungsmethoden oft Bienenflugfähigkeit beeinträchtigen können.
Die Verfahren wurden von einem Gehirn-zentrierte Perspektive dargestellt. Dies ist nicht aufgrund der inhärenten Beschränkungen der Techniken, sondern vielmehr wegen der persönlichen Interessen der Autoren. Es gibt keinen Grund, warum diese Methoden nicht für die Untersuchung anderer Organe verwendet werden. Allerdings könnten kleine Änderungen benötigt die Methode besser geeignet, um andere Organsysteme zu machen. Zum Beispiel, während die topische Behandlung das Gehirn zu erreichen bestimmt wird typischerweise auf den Thorax angelegt, könnte es besser sein thi anzuwendens auf den Bauch, wenn das beabsichtigte Ziel ist die Ovarien. In ähnlicher Weise können Injektionen leicht auf andere Bereiche angewendet werden , als der Thorax oder den Kopf (zB kann Bauchorgane durch Einspritzen zwischen den Bauch Sklerite gezielt werden).
In Bezug auf denen Verbindungen zu den Bienen verabreicht werden, gibt es wirklich keine Grenzen gesetzt. Typischerweise haben die Menschen pharmakologische Verbindungen verabreicht wie Signalmoleküle 21 oder deren Antagonisten 32 und maßgeschneiderten Peptide 28. Allerdings gab es 34 eine jüngste Anstieg auf Bienen Verbindungen mit aufgesetzten Fragen im Kopf, wie Pestizide 33 und anthropogenen Schadstoffen in die Verwaltung. Vor kurzem verabreichten Verbindungen haben damit begonnen , RNA - Moleküle enthalten , die direkt mit der Genexpression stören, wie dsRNA die RNA - Interferenz - Bahn 35 oder sogar microRNAs 36 und Antagomirs 37 aktiviert wird . Nicht alle Methoden gleich gut arbeiten für alle Verbindungen.Dies wird vielleicht am besten dargestellt durch bitter oder sauer Verbindungen, die Zuckerwasser ungenießbar Bienen machen, so dass sie aus dem Konsum es zu verhindern. Fragile Moleküle, wie RNAs oder bestimmte Polypeptide, abgebaut werden, wenn sie in einem harten Lösungsmittel wie DMF während einer Verflüchtigung Verfahren oder in Verkehr gebracht erhitzt. Es ist daher wichtig, die Chemie des zu verstehen, was verabreicht wird, um sicherzustellen, dass sie den Behandlungsverfahren überlebt.
Erste ein pharmakologisches Mittel in eine Biene ist der einfache Teil, aber es gibt drei große Bedenken, dass nie die leichte Schulter genommen werden sollte, wenn pharmakologische Experimente durchführen. Die erste ist eine gute Dosis für das Experiment in Frage herauszufinden. In Abhängigkeit von der Droge, könnte es bereits Literatur veröffentlicht werden, aber zum größten Teil geschieht, wird dies durch eine Mischung aus Literaturrecherchen, informiert Mutmaßungen gelöst werden, und die Dosis-Wirkungs-Kurven. Je nachdem, wie kompliziert die experimentelle Protokoll ist, kann es sinnvoll sein,erzeugen zuerst eine Dosis-Wirkungs-Kurve in einer einfacheren Bioassay (zB Gesamtbewegung oder das Überleben zu quantifizieren) , um eine bessere Vorstellung von einer Dosis-Bereich zu bekommen Wert in einem aufwendigeren Bioassay versuchen. In unserem Labor wird eine Anfangsdosis entweder in der Bienen Literatur oder durch eine mg / kg Umwandlung basierend auf Daten von der Nagetier Literatur zu tun. Von diesem Ausgangspunkt sind Bienen mit der Anfangsdosis behandelt, plus 2 oder 3 Dosen 10 mal größer und kleiner als die Anfangsdosis (beispielsweise wenn die Anfangsdosis 1 mg, 0,01, 0,1, 10 und 100 mg wäre auch ) und natürlich eine geeignete Fahrzeugsteuerung verwendet.
Das zweite Problem ist etwas heikel: drug Spezifität. Die meisten Medikamente wurden nicht mit Honigbienen oder ein anderes Insekt, im Verstand entwickelt. Aus diesem Grund , sind Nebeneffekte häufig (zB Mianserin, ein wirbel Serotonin - Rezeptor - Antagonist 38, galt lange Zeit als ein Insekt oktopaminergen - Rezeptor - Antagonisten zu sein, aber die jüngsten fiBefunde zeigen , dass bei den Bienen es ist auch ein dopaminerge Rezeptor - Antagonist 39). Eine übliche Lösung für dieses Problem ist, anstatt sich auf nur ein Medikament angewiesen, das gleiche Experiment mit einer Reihe von Medikamenten, die Ziel von Interesse gemeinsam zu haben bekannt zu wiederholen. Grundsätzlich, wenn mehrere Medikamente sind bekannt, ein bestimmtes Ziel zu blockieren, ähnliche Ergebnisse in den verschiedenen Medikamenten beobachtet sollte mehr Vertrauen geben, dass das Medikament die erwartete Wirkung hat, da unterschiedliche Medikamente haben oft einzigartige off-Zielprofilen.
Die letzte Ausgabe wird darauf geachtet, dass das Medikament wirkt, wo es soll handeln werden. In dieser Hinsicht wird es immer einen Kompromiss zwischen Genauigkeit und Invasivität sein. Systematische Behandlungsmethoden sind in der Regel die am wenigsten invasive, aber es gibt keine Kontrolle, wo in den Bienenkörper das Medikament seine Wirkung zeigt. Auch für die Mikroinjektion von gezielten Gewebe Medikamente mit der Hämolymphe auf andere Teile des Bienenkörpers bewegen kann. Wie dieses Problem wird behoben needs durch die gestellten Fragen zu informieren. Für bestimmte Experimente anatomische Lage ist irrelevant, während für andere dies die einzige Frage von Bedeutung ist. Der beste Weg, dies zu adressieren ist mit systemischen Behandlungen zu beginnen und allmählich verengen an einer anatomischen Lage durch zunehmend spezifischere Methoden. Wenn das Verhalten mit invasiven Behandlungsmethoden ist insbesondere unvereinbar untersucht, könnte es einen Versuch wert, es in einfachere Komponenten zu zerlegen, bevor sie eine ganze Reihe von Experimenten mit sehr spezifischen pharmakologischen Behandlungen zu tun.
Dieses Problem der Drogen Leckage ist noch übertrieben mit oralen Behandlung von freifliegenden Bienen, wo Drogen nicht zu den Ziel Bienen beeinflussen können. Forager Honigbienen sammeln Nektar auf dem Gebiet zu ihrer Kolonie zu bringen. Sie werden den größten Teil ihrer Zuckerlösung in den Bienenstock-Offload bei der Rückkehr nicht absorbieren. Im Bienenstock wird in Zellen gepackt, entwässert und als Honig gespeichert. Durchdiese können Arzneimittel potenziell Nicht-Ziel Bienen beeinflussen. Mit spezifischere Methoden (wie Mikroinjektionen) wurde dieses Problem minimiert wird.
Trotz dieser Vorbehalte im Auge, und richtig adressiert, neuropharmakologische Manipulation von Honigbienen kann ein sehr mächtiges Werkzeug sein. Während transgene Werkzeuge für Honigbienen werden entwickelt 15, die aufgrund ihrer sozialen Lebensweise ist es unwahrscheinlich , dass transgenics jemals eine einfache und zuverlässige Art und Weise sein , diese Art von Experimenten durchzuführen. Es ist daher wahrscheinlich, dass die Pharmakologie ein wichtiges Element der Bienenforschung in der Zukunft sein wird. Während einige Bienenforscher fordert standardisierte experimentelle Methoden gemacht haben , 40, in diesem Fall wäre dies ein Fehler sein. Ein Teil der Kraft des Bienen System hat die Vielfalt experimenteller Ansätze immer, und wie Techniken wurden mit realen biologischen Fragen im Kopf entwickelt und nicht umgekehrt. Es ist jedoch wichtig, dass wir sicherstellen,Verwendung der am besten geeignete Methode für die Frage auf der Hand. Wenn Vergleiche zu früheren Studien Schlüssel sind, müssen standardisierte Protokolle strikt befolgt werden. Allerdings etablierte Protokoll der Verwendung von standardisierten Methoden zum Zwecke nutzen darf nicht in der Art und Weise der Entwicklung neuer Methoden stehen gelassen werden, die neue experimentelle Möglichkeiten eröffnen können.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Any supplier will do |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydrate | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Protection Wax | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95% Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Glass capillary | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G NanoFil needle | WPI | NF33BV-2 | |
| Very fine forsceps | Dumont | 0208-55-PO | |
| Electrode puller | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| manual micromanipulator | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| electronic micromanipulator | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Junior unit XYZ | |
| stereomicroscope | Leica | M80 | |
| soldering iron | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| small Petri dish | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| 50 ml Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| forceps | Australian Entomological Supplies | ||
| Blade holder and breaker | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Feather double edged razor blade | ThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Nichrome wire | Any supplier will do | ||
| Electrical wires | Any supplier will do | ||
| Model paint | Tamiya USA | Depends on colour | |
| Repeating dispenser | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Glass syringe | WPI | NANOFIL | |
| flourescence viewing system | Nightsea | SFR-GR | |
| graticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillary with holder | Drummond | 1-000-0010 | |
| Liquid silicone | Any supplier will do | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
References
- Frisch, K. . von B. ees Their Vision, Chemical Senses, and Language. , Cornell University Press. Itacha, NY. (1971).
- Giurfa, M. The amazing mini-brain: lessons from a honey bee. Bee World. 84 (1), 5-18 (2003).
- Giurfa, M. Behavioral and neural analysis of associative learning in the honeybee: a taste from the magic well. J. Comp. Physiol. 193 (8), 801-824 (2007).
- Perry, C. J., Barron, A. B. Honey bees selectively avoid difficult choices. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (47), 19155-19159 (2013).
- Giurfa, M., Sandoz, J. -C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn. Mem. 19 (2), 54-66 (2012).
- Srinivasan, M. V. Honey bees as a model for vision, perception, and cognition. Annu. Rev. Entomol. 55, 267-284 (2010).
- Søvik, E., Cornish, J. L., Barron, A. B. Cocaine tolerance in honey bees. PLoS One. 8 (5), e64920 (2013).
- Søvik, E., Barron, A. B. Invertebrate models in addiction research. Brain. Behav. Evol. 82 (3), 153-165 (2013).
- Søvik, E. Reward processing and responses to drugs of abuse in the honey bee, Apis mellifera. , Macquarie University. Australia. November (2013).
- Søvik, E., Even, N., Radford, C. W., Barron, A. B. Cocaine affects foraging behaviour and biogenic amine modulated behavioural reflexes in honey bees. Peer J. 2, e662 (2014).
- Abramson, C. I., Stone, S. M., et al. The development of an ethanol model using social insects I: behavior studies of the honey bee (Apis mellifera L.). Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 1153-1166 (2000).
- Sauer, S., Kinkelin, M., Herrmann, E., Kaiser, W. The dynamics of sleep-like behaviour in honey bees. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 189 (8), 599-607 (2003).
- Münch, D., Kreibich, C. D., Amdam, G. V. Aging and its modulation in a long-lived worker caste of the honey bee. J. Exp. Biol. 216 (Pt 9), 1638-1649 (2013).
- Cheeseman, J. F., Winnebeck, E. C., et al. General anesthesia alters time perception by phase shifting the circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. , (2012).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (47), e2282 (2011).
- Burger, H., Ayasse, M., Dötterl, S., Kreissl, S., Galizia, C. G. Perception of floral volatiles involved in host-plant finding behaviour: Comparison of a bee specialist and generalist. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 199 (9), 751-761 (2013).
- Pan, K. C., Goodman, L. J. Ocellar projections within the central nervous system of the worker honey bee, Apis mellifera. Cell Tissue Res. 176 (4), 505-527 (1977).
- Ito, K., Shinomiya, K., et al. A systematic nomenclature for the insect brain. Neuron. 81, 755-765 (2014).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97 (2), 107-119 (1983).
- Barron, A. B., Robinson, G. E. Selective modulation of task performance by octopamine in honey bee (Apis mellifera) division of labour. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 191 (7), 659-668 (2005).
- Schulz, D. J., Sullivan, J. P., Robinson, G. E. Juvenile Hormone and Octopamine in the Regulation of Division of Labor in Honey Bee Colonies. Horm. Behav. 42 (2), 222-231 (2002).
- Schulz, D. J., Elekonich, M. M., Robinson, G. E. Biogenic amines in the antennal lobes and the initiation and maintenance of foraging behavior in honey bees. J. Neurobiol. 54 (2), 406-416 (2003).
- Barron, A. B., Vander Meer, R. K., Maleszka, J., Robinson, G. E., Maleszka, R. Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybees with octopamine. J. Insect Physiol. 53 (2), 187-194 (2007).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr. Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Martin, B. R., Lue, L. P., Boni, J. P. Pyrolysis and volatilization of cocaine. J. Anal. Toxicol. 13 (3), 158-162 (1989).
- Lefer, D., Perisse, E., Hourcade, B., Sandoz, J. -C., Devaud, J. -M. Two waves of transcription are required for long-term memory in the honeybee. Learn. Mem. 20 (1), 29-33 (2012).
- Urlacher, E., Soustelle, L., et al. Honey Bee Allatostatins Target Galanin/Somatostatin-Like Receptors and Modulate Learning: A Conserved Function? PLoS One. 11 (1), e0146248 (2016).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera). J. Neurosci. 25 (18), 4485-4492 (2005).
- Barron, A. B., Maleszka, R., Helliwell, P. G., Robinson, G. E. Effects of cocaine on honey bee dance behaviour. J. Exp. Biol. 212 (2), 163-168 (2009).
- Devaud, J. -M., Papouin, T., Carcaud, J., Sandoz, J. -C., Grünewald, B., Giurfa, M. Neural substrate for higher-order learning in an insect: Mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proc. Natl. Acad. Sci. , 1-9 (2015).
- Vergoz, V., Roussel, E., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Aversive learning in honeybees revealed by the olfactory conditioning of the sting extension reflex. PLoS One. 2 (3), e288 (2007).
- Henry, M., Béguin, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
- Søvik, E., Perry, C. J., LaMora, A., Barron, A. B., Ben-Shahar, Y. Negative impact of manganese on honeybee foraging. Biol. Lett. 11 (3), 20140989 (2015).
- Farooqui, T., Vaessin, H., Smith, B. H. Octopamine receptors in the honeybee (Apis mellifera) brain and their disruption by RNA-mediated interference. J. Insect Physiol. 50 (8), 701-713 (2004).
- Guo, X., Su, S., et al. Recipe for a Busy Bee: MicroRNAs in Honey Bee Caste Determination. PLoS One. 8 (12), e81661 (2013).
- Cristino, A. S., Barchuk, A. R., et al. Neuroligin-associated microRNA-932 targets actin and regulates memory in the honeybee. Nat. Commun. 5, 5529 (2014).
- Vargaftig, B. B., Coignet, J. L., de Vos, C. J., Grijsen, H., Bonta, I. L. Mianserin hydrochloride: Peripheral and central effects in relation to antagonism against 5-hydroxytryptamine and tryptamine. Eur. J. Pharmacol. 16 (3), 336-346 (1971).
- Beggs, K. T., Tyndall, J. D. A., Mercer, A. R. Honey bee dopamine and octopamine receptors linked to intracellular calcium signaling have a close phylogenetic and pharmacological relationship. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J. Neurosci. Methods. 211 (1), 159-167 (2012).
