Summary
oclusão cirúrgica de um ramo distal da artéria cerebral média (MCAo) é um modelo usado com freqüência em pesquisa acidente vascular cerebral experimental. Este manuscrito descreve a técnica básica de MCAo permanente, combinada com a inserção de uma janela craniana lateral, que oferece a oportunidade para microscopia intravital longitudinal em ratinhos.
Abstract
Isquemia cerebral focal (ou seja, acidente vascular cerebral isquémico) pode causar lesão cerebral principal, que conduz a uma perda grave da função neuronal e, consequentemente, a um hospedeiro de motor e deficiências cognitivas. Sua alta prevalência coloca um problema de saúde grave, como acidente vascular cerebral é uma das principais causas de incapacidade a longo prazo e de morte em todo o mundo 1. A recuperação da função neuronal é, na maioria dos casos, apenas parcial. Até agora, as opções de tratamento são muito limitadas, em particular devido à janela de tempo estreita para trombólise 2,3. Que determina os métodos para acelerar a recuperação de acidente vascular cerebral continua a ser um objectivo médico prime; No entanto, isto tem sido dificultado pela insuficiência de conhecimentos mecanísticos para o processo de recuperação. pesquisadores tempos experimentais frequentemente empregam modelos de roedores de isquémia cerebral focal. Para além da fase aguda, a investigação acidente vascular cerebral é cada vez mais centrada na fase sub-aguda e crónica após isquemia cerebral. A maioria dos pesquisadores AVC aplicar permanente ou tranSIENT oclusão da MCA em ratinhos ou ratos. Em pacientes, oclusões do MCA estão entre as causas mais frequentes de acidente vascular cerebral isquêmico 4. Além de oclusão proximal da MCA utilizando o modelo de filamento, oclusão cirúrgica do MCA distal é provavelmente o modelo mais utilizado na pesquisa acidente vascular cerebral experimental 5. Oclusão de um distal (à ramificação das artérias lenticulo-estriadas) MCA ramo normalmente poupa o estriado e afeta principalmente o neocórtex. oclusão do vaso pode ser permanente ou transitória. Alta reprodutibilidade do volume de lesão e as taxas de mortalidade muito baixas em relação ao resultado a longo prazo são as principais vantagens deste modelo. Aqui, demonstramos como realizar uma janela craniana (CW) preparação crônica lateral ao seio sagital e, posteriormente, como na cirurgia de induzir um acidente vascular cerebral distal debaixo da janela usando uma abordagem craniotomia. Esta abordagem pode ser aplicada para imagiologia sequencial de alterações agudas e crónicas após isquemia atravésepi-iluminação, confocal de varredura a laser, e de dois fótons de microscopia intravital.
Protocol
ÉTICA DECLARAÇÃO: Experimentos envolvendo indivíduos animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlim, Alemanha (G0298 / 13) e os critérios de chegar, conforme aplicável. Para este estudo, 10 a 12 do sexo masculino semanas de idade C57BL / 6J foram usadas.
1. Lateral Crônica Cranial Preparação Janela
- Realizar a anestesia com uma injecção subcutânea de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Teste para sedação adequada com um estímulo doloroso.
- Esterilizar os instrumentos cirúrgicos e campo cirúrgico com 70% de etanol.
- Remova o cabelo do couro cabeludo desde o pescoço até os olhos usando uma máquina de barbear roedor.
- Fixar a cabeça em um quadro estereotáxico.
- Use dexpantenol pomada olho em ambos os olhos para evitar a desidratação.
- Limpar a área cirúrgica para remover todos os pêlos e esterilizá-lo com 3 camadas de 74,1% de etanol e 10% de 2-propanolol.
- Executar uma linha médiaincisão do pescoço para os olhos usando um bisturi.
- Abrangem o retalho de pele com 4 suturas tenting.
- Remover cuidadosamente o periósteo no hemisfério esquerdo raspando-o com um bisturi para o ponto onde começa o músculo temporal.
NOTA: Esta preparação também serve para criar uma boa área de adesão para a cola dental, que fixa a tampa de vidro. - Realizar uma craniotomia fronto-parietal com um diâmetro de 4 mm diluindo o crânio na borda do retalho ósseo usando um microdrill. Aplicar soro fisiológico durante a perfuração para evitar lesões de calor.
- Elevar o retalho ósseo com cânulas e removê-lo usando micropinças.
- Lavar cuidadosamente e extensivamente com solução salina.
- Misture a cola dentária até que tenha a consistência apropriada e não é fluido (isto é, a cola não deve produzir fios mais). Coloque-o sobre o osso ao redor da craniotomia.
- Coloque uma tampa de vidro com um 6 mm de diâmetro na cola preparada e corrigi-lo com the resto da cola dentária. Certifique-se de que é estanque. Aguarde até que a cola é seco e duro, testando-a com uma pinça.
NOTA: Uma irrigação adicional acelera o processo de cura. - Retirar as suturas tenting e fechar a ferida com suturas de pele.
- Puxe a pele do flanco do mouse. Inserir uma agulha subcutânea e gentilmente substituir 0,5 ml de solução salina estéril por via subcutânea para o equilíbrio de fluidos.
- Após a cirurgia, manter os animais na gaiola recuperação aquecida durante 90 min. Espere até que os animais são completamente acordado antes de deixá-los sozinhos. Espere até que os animais são completamente recuperado antes de devolvê-los a uma gaiola com outros animais.
- Repetir a substituição do volume de solução salina por via subcutânea, após cerca de 12 horas, tal como descrito no passo 1.16.
- Sempre aplicar analgesia através de sonda gástrica ou directamente para dentro da cavidade oral após a cirurgia (por exemplo, paracetamol (10 mg / ml) ou outros fármacos anti-inflamatórios não esteróides).
- Verifica a condição dos animais todos os dias após a cirurgia, e sempre fornecem purê de alimentos de origem animal no chão, em uma placa de petri para tornar a alimentação simples e para evitar a perda de peso crítico após a cirurgia.
NOTA: microscopia intravital pode ser realizada no primeiro dia após a preparação janela craniana. - Aplicar anestesia isoflurano e corrigir o animal em um suporte de cabeça. Abra a sutura da pele e limpar a janela com cotonetes e solução salina estéril. Após 24 h, a janela craniana deve ser preenchido com fluido cerebrospinal por esse ponto de tempo, que permite a criação de imagens. Realizar imagem usando protocolos de microscopia estabelecidos 18.
2. Distal MCAo
NOTA: O procedimento MCAo deve ser realizada cerca de 5 d após a preparação CW. Isto minimiza a interferência a partir da reacção imune causada pela preparação CW com a reacção imune induzida por acidente vascular cerebral.
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Figura 1. Visão Geral do Distal MCAo. A. Esta é uma boa visão geral sobre os vasos antes do op. B. Os vasos após o primeiro contato bipolar. C. Os vasos após segundo contato bipolar. D. A visão geral sobre os vasos, que são completamente fechados agora. E. visão geral final com menor ampliação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Anestesiar os ratos usando uma máscara de anestesia e um regime anestésico adequado, em consulta com o pessoal veterinário (por exemplo, indução com 1,5-2% isoflurano e manutenção com 1,0-1,5% de isoflurano em 2/3 N 2 O e 1/3 O2 via um vaporizador).
- Raspar e remover o cabelo e desinfectar a pele e pele circundante com um agente apropriado (por exemplo, álcool etílico a 70%), e secá-lo depois.
- Manter a temperatura do corpo dos ratos a 36,5 ° C ± 0,5 ° C durante a cirurgia. Uma realimentação controlada almofada de aquecimento, aquecido de acordo com a temperatura rectal do rato, é altamente recomendável.
- Coloque o animal na posição lateral. Corrigir o nariz na máscara de anestesia e ajustar a concentração de isoflurano para 1,0-1,5%.
- Aplicar pomada molhado (dexpantenol) para ambos os olhos.
- Use a incisão na pele feita para a preparação CW.
- Suavemente separar a pele e o músculo temporal identificar por baixo.
- Ajustar a energia do gerador de alta frequência (5-7 W) e utilizar o modo bipolar.
- Use a pinça eletrocoagulação e remova cuidadosamente o músculo temporal do crânio, criando um retalho do músculo, sem remover totalmente o músculo.
- Identificar o MCA abaixo do crânio transparente na parte rostral da área temporal, dorsal à retro-orbital sinusal. Se a bifurcação MCA não pode ser identificado, tentar identificar o recipiente mais rostral.
- Diluir o crânio acima do ramo MCA com uma microdrill enquanto continuamente irrigação para evitar danos causados pelo calor.
- Levante o osso com cânulas e removê-lo com micropinças.
- Diminuir a energia do gerador de alta frequência para 3-5 W.
- Aproxime-se da artéria de cima e suavemente tocá-lo com as pinças bipolares de ambos os lados, sem levantar a embarcação.
- Coagular a artéria proximal e distal à bifurcação navio.
- Espere por 30 segundos e, em seguida, toque a artéria com cuidado para garantir que o fluxo de sangue é permanentemente interrompida. Repita o eletrocoagulação se um recanalização é observado.
- Corrigir o músculo temporal com 1 ou 2 pontos na parte de inserção do músculo para cobrir o defeito ósseo, se possível.
- Suturar a ferida e colocar o animal na caixa de recuperação do aquecida. Em geral, os animais recuperação rapidamente após anest volátilhesia.
- Para a substituição de volume, aplicam-se por via subcutânea 0,5 ml de solução salina estéril, tal como descrito no passo 1.16.
- Após a cirurgia, que os animais possam ficar na gaiola de recuperação aquecida por 90 min. Espere até que os animais são conscientes antes de deixá-los sozinhos. Apenas devolvê-los para uma gaiola com outros animais quando eles são totalmente recuperado.
- Repetir a substituição de volume, tal como explicado no passo 1.16, depois 12 h.
- Aplicar analgesia pós-operatória através da água de beber (por exemplo, paracetamol (10 mg / ml) ou outros fármacos anti-inflamatórios não esteróides).
- Verifique a condição médica dos animais todos os dias após a cirurgia. Fornecer alimentos de origem animal purê em uma placa de petri no chão para simplificar a comer e para minimizar a perda de peso pós-operatória.
3. Sham Tratamento
- Efectuar todos os procedimentos de forma idêntica às etapas 1 e 2, descritos acima, incluindo CW preparação, exceto não coagular o ar cerebral média expostatery.
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Representative Results
A linha do tempo e os resultados representativos são mostrados nas Figuras 2 e 3. A preparação janela do crânio, com uma pequena janela lateral do crânio para o seio sagital superior (Figura 2 B, C, D) resulta em uma taxa de mortalidade e morbidade muito baixa quando realizada por um cirurgião experiente. Todos os 10 animais sobreviveram, e todos CW crónica pode ser usado para geração de imagens de alta qualidade, mesmo 28 dias após a cirurgia. Não havia nenhum problema com infecções de feridas ou outras complicações.
Devido à curta exposição a anestesia volátil e único dano cerebral menor, cerca de 10 - 15 min após MCAo distal e transferência para a gaiola de recuperação aquecida, todos os animais estavam acordados, movendo-se livremente na gaiola de recuperação, e interagindo com ninhada. Em geral, a mortalidade do modelo MCAo distai é menor do que 5% e ocorre principalmente como resultado de i vascularnjury e subsequente hemorragia durante a cirurgia MCAo. A mortalidade durante o período de observação de 28 dias seguinte MCAo distal ocorre muito raramente. Morfologicamente, a lesão pode ser avaliada utilizando histologia ou MRI (Figura 3 A, B). Além disso, as medições de MRI oferecem a oportunidade de avaliar o volume da lesão e progressão de uma forma longitudinal. Um MRI realizada 24 horas após a isquemia descreve claramente a lesão isquémica localizado por baixo da CW crónica, enquanto que após a cirurgia sham, não tecido cortical foi encontrado lesionado (Figura 3A). Os resultados de MRI mostram claramente a limitação estrita da lesão para o córtex, poupando, assim, o corpo estriado, em contraste com o modelo MCAo filamentosos (Figura 3B). A preparação CW crónica lateral, permite a visualização de longo prazo da vasculatura e da microcirculação cortical por microscopia de epi-fluorescência (Figura 3C, parte superior) e de áreas sub-corticais por microscopia de dois fotões (Figure 3C, parte inferior). Além disso, é possível vias moleculares de imagem e as interacções célula-para-célula, com as células marcadas por fluorescência ou medições autofluorescência, tais como imagens de fluorescência vida. Tal como mostrado na Figura 3D, o modelo MCAo distai provoca lesões isquémicas altamente reprodutíveis. Em relação ao volume de infarto, esperamos um desvio padrão abaixo de 15% em um único conjunto de cirurgias. Como mencionado acima, em contraste com os modelos de MCAo proximal, as taxas de mortalidade são bastante baixo para o modelo distai 5. Usando ressonância magnética sequencial, lesão, volume, e progressão edema após isquemia cerebral focal pode ser avaliado. A MRI às 24 horas e 96 horas após a MCAo distal permanente não mostrou progressão significativa de T2 hyperintensities.
Figura 2: Chronic Preparação janela do crânio. (A) cronograma Representante. <forte> (B) para marcar a área onde a craniotomia ocorre, lateral ao músculo temporal, medial para o seio sagital superior, e dorsal em relação ao bregma. (C) a superfície do cérebro após uma craniotomia, com uma camada dura intacta e a tampa de vidro no lugar; o círculo mostra a localização da área isquêmica após MCAo distal. (D) com acabamento janela do crânio crônica com tampa de vidro fixas, pronto para a imagem latente repetitivo durante várias semanas (b = bregma, TM = músculo temporal, SSS = seio sagital superior, ai = área de isquemia). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Combinação do lateral crônica CW e Distal MCAo ou Sham Cirurgia. (A) A RM realizada 24 horas após a SHcirurgia am não mostra qualquer tecido cortical lesado. (B) A RM realizada 24 horas após a isquemia descreve claramente a lesão isquémica (*) localizado por baixo da CW crónica. Imaging (C) Intravital epi-fluorescência (parte superior) e de imagem de dois fótons (parte inferior) da vasculatura cortical. O volume (D) infarto avaliado através de ressonância magnética em 24 horas e 96 horas após a isquemia mostra um volume médio de lesão de 13.16 2,3 milímetros 3 às 24 horas e 12,2 1,9 milímetros 3 às 96 h. Cada ponto representa um animal individual (n = 10 animais por grupo, média ± SEM). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
AVC é uma das principais causas de incapacidade a longo prazo e de morte em todo o mundo 1. Além do tratamento agudo, investigando novas abordagens e mecanismos para acelerar e melhorar a recuperação após acidente vascular cerebral continua a ser um objectivo primordial médica 7. pesquisadores tempos experimentais frequentemente empregam modelos de roedores de isquémia cerebral focal. De facto, os modelos indutores transiente ou permanente MCAo imitar um dos tipos mais comuns de isquemia cerebral focal em pacientes 4. Além de oclusão proximal da MCA, o modelo de filamentos para a oclusão cirúrgica do MCAo distal é provavelmente o modelo mais utilizado em 5,19 pesquisas acidente vascular cerebral experimental. Aqui, nós descrevemos a técnica básica de MCAo permanente distal combinado com um CW lateral, oferecendo a oportunidade para microscopia intravital longitudinal em ratinhos. Alta reprodutibilidade do volume da lesão, bem como as taxas de mortalidade muito baixas, em particular no que diz respeito ao estudo resultados a longo prazo, arPT As principais vantagens desse modelo murino. Neste modelo acidente vascular cerebral cortical, vasos sanguíneos na área do acidente vascular cerebral e região peri-enfarte pode ser visualizada através do CW crônica. Utilizando um sistema de epifluorescência videomicroscópicos multi-fluorescência, a dinâmica do fluxo de sangue e o recrutamento de células circulantes dinâmico pode ser visualizado. Os vasos sanguíneos são visualizados através da utilização de macromoléculas marcadas com fluorescência, como dextranos ou albumina. As células podem ser rotulados ou por corantes fluorescentes ou por modelos genéticos, como quimeras de medula óssea com animais GFP positivas. Além disso, para estudar as interacções célula-célula e a dinâmica das células extravasculares, um de dois fotões microscópio confocal de varrimento laser pode ser aplicado. Imagiologia até 250 um abaixo da superfície cortical pode ser realizada. Mais uma vez, vasos sanguíneos são coradas usando macromoléculas marcadas fluorescentemente, e as células são marcadas geneticamente (p.ex., usando o ratinho transgénico GFP-nestina).
A janela cranianacirurgia é realizada através de uma craniotomia sem abrir a dura. Uma grande armadilha é para ferir acidentalmente a camada dural e do córtex baixo ao abrir o crânio com a microdrill. Portanto, esta técnica requer alguma habilidade técnica, a fim de evitar danos para a dura e o córtex, o que induz a uma reacção e microscopia influências imunes resultados. Alternativamente, um potencial modelo crânio-diluídos é limitada pela qualidade microscopia menos fiável por causa do crânio restante, especialmente a longo prazo. Frequentemente, repetitivo afinamento crânio é necessário, enquanto que no modelo CW, a qualidade janela dura vários meses, até rebrota crânio ou influências espessamento dural imagem de qualidade 14,20. Uma modulação deste modelo com uma preparação de crânio diluído seria possível. A camada dura-máter deve ser deixado no cérebro para evitar qualquer lesão ou de excitação do córtex. Somente se uma aplicação directa na área isquêmica é desejada em um modelo experimental pode a dura-máter ser remudou-se, com cuidado e sem prejudicar quaisquer veias ponte.
Em contraste com modelos que combinam um CW e induzindo a oclusão do vaso alvo através de irradiação de fotossensibilizadores em circulação, conduzindo a lesões isquémicas só é muito pequeno, o distais MCAO modelo imita a maioria dos acidentes vasculares cerebrais humanos que estão localizados na cortical território da ACM 13. Para evitar a interferência com uma reação inflamatória transitória devido à preparação CW, a janela deve estar preparado vários dias antes da cirurgia MCAo distal.
Uma série de exames para avaliar aspectos funcionais, bem como comportamentais em roedores estão disponíveis (por exemplo, análise da marcha, teste de rotarod, teste de pólo, teste de remoção de adesivo, teste de escada, teste de campo aberto e labirinto aquático de Morris) 21. Em todos estes ensaios, os ratos submetidos a MCAo executar menos êxito do que os animais de controlo no que diz respeito a resultados a curto prazo e longo prazo intermediário. No entanto, relativamente à avaliação dasresultados a longo prazo, deve-se reconhecer que a sensibilidade do teste funcional é muito limitada em termos de MCAo distal, bem como leve proximal MCAo 19,21-23.
Distal MCAo, realizada por cirurgiões bem treinados, podem ser induzidos em menos de 20 minutos e pode produzir lesões isquêmicas altamente reprodutíveis. No entanto, a reprodutibilidade requer um minucioso controle de fatores de confusão. As diferenças na técnica cirúrgica pode conduzir a diferenças no tamanho do infarto 24. cepas diferentes do mouse pode mostrar um resultado curso diferente devido a variações na anatomia vascular cerebral entre as linhagens. Além disso, como a temperatura do corpo afecta danos neuronais e a susceptibilidade a isquemia, com hipotermia conduzindo a lesões menores e hipertermia para défices mais graves 25,26, controle de temperatura e de manutenção são altamente relevante neste modelo, bem como em outros modelos de isquemia 27. Em geral, os parâmetros fisiológicos, tais como pressu sanguere e sangue gases, são fatores de confusão importantes do resultado e deve ser controlada para 28. Além disso, a escolha do anestésico é altamente importante, já que alguns agentes podem exercer efeitos neuroprotectores directos ou actuam indirectamente através de propriedades vasoactivas 29. Portanto, a exposição à anestesia deve ser padronizado e mantido tão curto quanto possível. Finalmente, as condições de habitação, como o uso de enriquecimento, podendo afetar a evolução do curso, bem como, e, portanto, devem ser padronizados e descritos em relatórios de pesquisa 30. Para produzir resultados pré-clínicos relevantes para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas, padronização, controle de qualidade e relatórios são de extrema importância 31.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Heating pad with rectal probe | FST | 21061-10 | |
| Stereotactic frame | Kopf | Model 930 | |
| Anaethesia system for isoflurane | Draeger | ||
| Isoflurane | Abott | ||
| Dumont forceps #5 | FST | 11251-10 | |
| Dumont forceps #7 | FST | 11271-30 | |
| Bipolar Forceps | Erbe | 20195-501 | |
| Bipolar Forceps | Erbe 20195-022 | ||
| Microdrill | FST 18000-17 | ||
| Needle holder | FST | 12010-14 | |
| 5-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | ||
| 7-0 silk suture | Feuerstein,Suprama | ||
| 8-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | ||
| Veterinary Recovery Chamber | Peco Services | V1200 |
References
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