Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Mus isoleret perfunderet Nyre Teknik

doi: 10.3791/54712 Published: November 17, 2016

Summary

Musen isoleret perfunderede nyre (MIPK) er en teknik til at holde en mus nyre under ex vivo betingelser perfunderes og funktionelle i 1 time. Bufferne og kirurgisk teknik er beskrevet i detaljer.

Abstract

Musen isoleret perfunderede nyre (MIPK) er en teknik til at holde en mus nyre under ex vivo betingelser perfunderes og funktionelle i 1 time. Dette er en forudsætning for at studere fysiologi af den isolerede organ og for mange innovative applikationer, der kan være muligt i fremtiden, herunder perfusion decellularization for nyre bioteknologi eller administration af anti-afvisning eller genom-redigering narkotika i høje doser til prime nyrerne til transplantation. I den tid af perfusionen, kan nyren manipuleres, nyrefunktionen kan vurderes, og forskellige lægemidler administreres. Efter proceduren, kan nyren transplanteres eller behandles med molekylær biologi, biokemisk analyse eller mikroskopi.

Dette papir beskriver perfusatet og den kirurgiske teknik er nødvendig for ex vivo perfusion af mus nyrer. Nærmere oplysninger om perfusionsapparatet er givet, og data er præsenteret som viser viability i nyrerne forberedelse: renal blodgennemstrømning, vaskulær modstand, og urin data som funktionelle, transmission elektronmikrofotografier af forskellige nephron segmenter som morfologiske udlæsninger og western blots af transportproteiner i forskellige nephron segmenter som molekylær udlæsning.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den isolerede perfusion af organer har været genstand for en løbende indsats blandt fysiologer i mange årtier 1. Teknikken muliggør funktionen af ​​organet, uden systemiske påvirkninger, såsom blodtryk, hormoner, eller nerver, der skal undersøges. Carl Eduard Loebell anses for at være den første til at have beskrevet den succesfulde perfusion af en isoleret nyre, i 1849 2. Siden da har perfusionsapparatet undergået betydelig forfinelse. Frey og Gruber indført en kunstig lunge for iltning og pulserende pumper til kontinuerlig perfusion 2. Mens tidlige forskere hovedsageligt undersøgt nyrerne af store pattedyr-nemlig, svin 2 og hunde 3 -den første rapport af brugen af rotte nyrer, ved Weiss et al. , Var en milepæl i studiet af små pattedyr-orgel perfusion 4. Schurek et al. rapporterede nødvendigheden af ​​at tilføre mammale erytrocytter til perfusatet hvis tilstrækkelig renal tubulæriltning skulle opnås 5. Kritisk for langsigtede eksperimenter var indførelsen af kontinuerlig dialyse af bufferen af samme forskergruppe 6. I 2003 Schweda et al. var de første til at rapportere et isoleret funktionel mus perfunderet nyre (MIPK) 7, senere raffineres af Rahgozar et al. 18 og Lindell et al. 14.

Mens teknisk mere udfordrende end rotten isoleret perfunderede nyre, brugen af ​​MIPK bærer den fordel, at anvendelsen af ​​en bred vifte af genetisk ændrede mus. Denne artikel præsenterer detaljerne i forfatternes metode til perfusion isolerede mus nyrer i 1 time. Metoden giver mulighed for løbende vurdering af renal flow, vaskulær modstand, hormon frigivelse, blodgas analyse, urinanalyse, og anvendelsen af ​​lægemidler. Ved at følge fremgangsmåden, kunne nyrer behandles til molekylær og biokemisk analyse, fastsættes for mikroskopi, ellertransplanteres i en recipient mus (figur 1).

figur 1
Figur 1: Oversigt over mulige Input / Output til de isolerede perfunderede nyre. BGA: Blood gasanalyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Denne teknik vil sandsynligvis modtage stigende opmærksomhed i de kommende år, da mange innovative applikationer drøftes med begyndelsen af langvarig normotermisk nyre perfusion før transplantation (med eller uden anvendelse af anti-afvisning eller genom-redigering narkotika) 8, 9, 10 , 11, den bioteknik af hele nyrer fra decellulariserede stilladser 12, og anvendelsen af høje doser af fluorescerende farvestoffer for multifoton billeddannelse 13 14.

En trin-for-trin-protokollen er givet for at tillade andre laboratorier til at udføre isoleret mus nyre perfusion med succes. Først bliver sammensætningen og fremstillingen af ​​bufferen angivet. Derefter kirurgi beskrevet detaljeret og er vist de kritiske trin. For det tredje, data præsenteres som er repræsentative for en vellykket forberedelse: renal blodgennemstrømning, vaskulær modstand, glomerulære filtrationshastighed, og fraktioneret elektrolyt udskillelse-alle som funktionelle målinger af rentabilitet-og transmission elektron mikrografier af morfologi forskellige nephron segmenter af perfunderede nyrer fast efter 1 time af perfusion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle procedurer, der involverer dyr, der er beskrevet i dette manuskript blev gennemført i henhold til schweizisk lovgivning og godkendt af den veterinære administration af kantonen Zürich, Schweiz.

1. Buffer Fremstilling

  1. Fremstille opløsninger 1 - 4 og antidiuretisk hormon (ADH) opløsning (tabel 1).
  2. Forbered dialyse puffer (tabel 1).
    BEMÆRK: Dette er den anvendte buffer som dialysebufferen under perfusion. Senere vil erythrocytterne fortyndes i denne buffer til dannelse af det endelige perfusat.
  3. Erythrocyt forberedelse.
    1. Fortynd 250 ml af human erythrocyt koncentrat (testet materiale opnået fra den lokale blodbank) til 500 ml med dialysepuffer. Centrifuger ved 2.000 xg i 8 min. Fjern buffer, og pas på ikke at fjerne eventuelle erythrocytter. Gentag 3x.
  4. Forbered albumin (bovint serumalbumin; BSA) buffer.
    1. I 200 ml dialysis puffer, opløses 44 g BSA ved anvendelse af en omrører. Opløsningen filtreres med filtrerpapir.
  5. Forbered perfusatet.
    1. Filter erytrocytterne fra trin 1.3.1 gennem filterpapir i BSA-puffer. Fyld op til et samlet volumen på 800 ml med dialysepuffer.
      BEMÆRK: Dette er den sidste perfusatet. Hæmatokritværdien skulle nu være mellem 8 og 12%. Perfusatet kan opbevares i op til 12 timer ved 4 ° C.

2. Start Dialyse og iltning

  1. Tænd vandbadet omgiver større buffer reservoir, mindre buffer reservoir, og den fugtige kammer (en lille, dobbeltvægget kammer bringes til 37 ° C og 100% fugtighed til senere holde nyre) til 37 ° C (figur 2) .
  2. Fyld større buffer reservoir med dialysebufferen og den mindre reservoir med perfusatet.
  3. Tænd CO 5% 2/95% O 2 gas inflow til dialysebufferen.
  4. Tænd kontinuerlig dialyse af perfusatet mod dialysebufferen. Vær omhyggelig med at bruge lav-flux dialyse slangen. Fortsæt til trin 3.

Figur 2
Figur 2: Skematisk tegning af perfusionskredsløbet. Skema viser hovedkomponenterne i perfusionskredsløbet og retningen af ​​buffer flow. Alle komponenter omgivet af mørkeblå holdes ved 37 ° C med et vandbad / termostat. 1: Dialyse buffer på mindst 3 gange volumenet af perfusionsbuffer kontinuerligt gennemboblet med 95% O2 / 5% CO2. 2: Dialyse buffer og perfusionsbuffer løbende dialyseres mod hinanden i et dialyserør med rulle pumpe. 3: På grund af denne dialyse, er perfusionen buffer beriget med 9% O holdes 2/5% CO2 og elektrolyt niveauer konstant throughout perfusion. 4: Rullepumpe fremdriftsmiddel perfusionsbuffer mod nyren. 5: En windkessel fjerner peristaltiske bølger og fungerer som en boble fælde. 6: Trykføler (tilsluttet til 4. (Rullepumpe) for at holde konstant tryk, samtidig med at frit alternerende strømning). 7: I hele perfusion, nyrerne forbliver i et fugtigt kammer i 100% luftfugtighed og 37 ° C nyre temperatur. Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Kirurgisk procedure (1 del til et diagram af alle ligaturer, se figur 3)

Bemærk: Udfør alle ligaturer bruger 5-0 kirurgisk tråd.

  1. Bedøver en mus ved intraperitoneal injektion (10 pl / g legemsvægt, 20 mg / ml ketamin og 1 mg / ml xylazin opløst i 0,9% NaCl). Bekræft tilstrækkelig dybde af AnesthESIA ved at teste for fraværet af bageste-fods reflekser.
  2. Fastgør musen i liggende stilling i den fugtige kammer. Beskyt øjnene med dyrlægen salve. Placer en 1 ml sprøjte under rygsøjlen til at løfte de lumbale fartøjer.
  3. Udfør en median laparotomi fra skambenet kam til brystbenet åbning først huden, så mavemusklerne, med en saks.
  4. Fjern tarmen og placere den på venstre side af musen laterale fra maven.
  5. Frigøre blæren fra bindevæv og udforske begge urinledere og urinrøret.
  6. Placer en ligatur omkring venstre ureter (ligatur I). Luk det.
  7. Placer en ligatur omkring urinrøret (ligatur II). Luk det.
  8. Placer en "lasso" ligatur omkring hele blæren (ligatur III).
  9. Incise blæren 1 mm.
  10. Kanyle åbningen med 2 cm PE 50 rør.
  11. Luk ligatur III omkring slangen.
  12. Skær venstre ureter og urethra distalt fra ligaturer. Det bladder er nu fastgjort til højre ureter kun og frit bevægelige.
  13. Fjern den abdominale aorta af bindevæv og fedt.
  14. Placer en abdominal mid-aorta ligatur (ligatur IV).
  15. Placer en ligatur rundt om aorta under mellemgulvet mellem øvre mesenteriske arterie og cøliaki stammen (ligatur V).
  16. Placer en ligatur omkring den overlegne mesenterialarterie (ligatur VI).
  17. Placer en aorta ligatur direkte under højre og over den venstre renale arterie (ligatur VII).
  18. Placer en ligatur omkring caudale vene pakken (cava) (ligatur VIII). Fortsæt til trin 4.

Figur 3
Figur 3: Skematisk tegning af ligaturer placeret under operationen. Udsigt over det åbne abdomen efter laparotomi. Tarmen flyttes ud til venstre. L og R angiver venstre og højre nyre. Detsorte linjer viser det område af den respektive ligatur. Ligaturer er først placeret og derefter lukket, i den rækkefølge i teksten. X markerer placeringen af snittet for aorta kanyle. Klik her for at se en større version af dette tal.

4. priming af perfusionskredsløbet

  1. Start roterende pumpe og fylde slangen med perfusatet. Vær omhyggelig med at tømme alle luftbobler fra det.
  2. Fyld windkessel enheden til omtrent midt-niveau med perfusatet.
  3. Kalibrere tryktransduceren til 0 mm Hg, når alle rør er fyldt, og strømmen er 0 Hold perfusionen nålen på nyre-niveau i dette tidsrum.
  4. Hold strøm på et konstant minimalt niveau (0,6 ml / min) og gå til trin 5.

5. Kirurgisk Procedure Del 2

  1. Placer en klemme mellem ligatur IV og forgreningen af ​​den venstre renal arterie.
  2. Lav et lille snit i aorta caudale af ligatur IV, idet man ikke skære dorsale væg.
  3. Dilatere åbningen i aorta med et fartøj dilatator.
  4. Kanyle aorta med en nål (2 cm lang, trukket PE 50), skubber spidsen lige til klemmen.
  5. Åbne klemmen.
  6. Skub spidsen af ​​nålen kranialt indtil den når forbindelsen mellem højre nyre arterie og aorta.
  7. Luk ligatur VII.
  8. Luk ligatur IV.
  9. Åbn brystet med en saks ved dissekering mellemgulvet. Med et enkelt snit, adskille aorta, vena cava, hjerte og vegetative nerver. Med dette trin dyret aflives via hurtig forblødning under kontinuerlig dyb anæstesi.
  10. Start trykstyring af perfusion pumpe. Oprethold den gennemsnitlige tryk mellem 80 og 100 mmHg.
  11. Luk ligatur V.
  12. Luk ligatur VI.
  13. Luk ligatur VIII.
  14. Gratis højre nyre fra bindevæv tissue og dets indlejring i adipose kapsel med en saks.
  15. Skær aorta proksimalt til ligatur V.
  16. Skær øvre mesenteriske arterie distalt til ligatur VI.
  17. Skær nyre-støtte fartøj bundle ud, idet man ikke skåret i skibene selv.
  18. Skær leveren ved forbindelsen til nyren. Sørge for at befri nyren, men efterlader en lille del af leveren klæbende til det, så vena cava holdes åben af ​​det.
  19. Tag nyrerne bundt ud af musen. Fjern musen fra fugtigt kammer.
  20. Placer en "lasso" ligatur omkring tilslutning af lever og nyre (ligatur IX).
  21. Kanyle vena cava med en venekateter (2 cm PE 50).
  22. Luk ligatur IX. Venøs udstrømning gennem venekateter bør straks begynde.
  23. Luk fugtigt kammer.

6. Downstream Analyser

  1. Under den efterfølgende time, løbende overvåge blodgennemstrømningen og intravascular pres 15. Indsamle venøs udstrømning, som kan anvendes til analyse af f.eks renal reninfrigivelse 7. Saml urin til analyse af elektrolyt koncentration og glomerulær filtrationshastighed 14. Efter 1 time af perfusion, nyrer kan snap-frosset til western blotting eller fastsættes for billeddannelse nærmer 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med beskrevet fremgangsmåden kan isolerede mus nyrer forblive levedygtige i mindst 1 time. Vi testede væv levedygtigheden efter 1 time med kontinuerlig perfusion med funktionelle (renal blodstrømning og vaskulær modstand, blodgasanalyse for venøs udstrømning, glomerulære filtrationshastighed, urin fraktioneret Na + og K + -udskillelse, og urinosmolalitet) og morfologiske (transmissionselektronmikroskopi mikroskopi, TEM) metoder i fire nyrer af vildtype C57BL / 6 mus. Derudover blev Western blots af apikale markørproteiner af forskellige tubulus segmenter udført, sammenligne isolerede perfunderede nyrer til unperfused nyrerne fra de samme dyr. I alle forsøg blev konstant tryk perfusion anvendes, holde perfusionstryk på ~ 100 mmHg (figur 4). I de nyrer, perfusat flow og vaskulær modstand forblev stabilt over en 55 min ved 15,6 ± 0,4 ml / min * g nyre vægt og 35 ± 1,0 mmHg * min / ml (figur 4 A). Et fald af perfusat flow eller en øget vaskulær resistens er et følsomt parameter med hensyn til faldende vævslevedygtighed og bør overvåges hele perfusion med omhu. Blodgas og elektrolyt analyse i 100 pi prøver udtaget 60 minutter efter påbegyndelsen af perfusion afslørede renal CO 2-produktion og O 2 forbrug, når det arterielle indstrømning blev sammenlignet med den venøse udstrømning (tabel 2). De andre parametre forblev uændret mellem arterie og vene (tabel 2). Der bør lægges særlig vægt på uændret venøs kalium udgivelse, som kan forekomme en stigning i løbet af vævsskader. Glomerulære filtrationshastighed, vurderet via FITC-Inulin feltet 14, havde en tendens til at stige over tid (figur 4 B), men denne tendens nåede ikke signifikans. Fractional udskillelse af natrium og kalium vurderet efter 55 minutters perfusioner steget i forhold til in vivo-situationen (figur 4 C). Urinosmolalitet er ikke hævet over osmolalitet venøs udstrømning efter 55 min perfusion (figur 4 D).

For morfologiske undersøgelser blev nyrer fikseret efter perfusion i 3% paraformaldehyd og 0,1% glutaraldehyd i dialyse buffer som tidligere beskrevet 17. Renal ultrastruktur blev vurderet med TEM. Glomeruli og S1 segmenter af proksimale tubuli optrådte stort set er uændret efter perfusion (figur 5 A og B). Nogle, men ikke alle S2 / S3 segmenter af proksimale tubuli og de tykke opstigende lemmer, der ikke var tæt på vaskulære bundter var viser tegn på organskader, som tidligere beskrevet i rotte isoleret perfunderede nyrer 5 (figur 5 C og D). Selv på tæt inspektion, har distale snoede tubuli og indsamling kanaler ikke viser tydelige tegn på nekrose (Figur 5 E, F og G). Afslutningsvis de morfologiske fund i mus nyrer spejle situation, der konstateredes i rotter isoleret perfunderede nyre fem.

Western blots af apikale markørproteiner for de forskellige nephron segmenter i isolerede perfunderede nyrer (snap-frosset efter 1 time af perfusion) sammenlignet med unperfused kontralaterale nyrer af det samme dyr (snap-frosset før begyndelsen af ​​perfusion) afslørede ikke væsentlige ændringer. Vi studerede NaPi-IIa (placeret i proksimale tubuli), NKCC2 (tykke opadgående lemmer), NCC (distale snoede tubuli), og ENaC (forbindende tubuli / opsamling kanaler) (figur 6 A og B).

Figur 4
Figur 4: Vurdering af Funktionel levedygtighed Nyrer perfunderet for 55 min. A) </ Strong> Under konstant tryk perfusion, vaskulær modstand og perfusat flow forblev stabil i 55 min. De første 15 minutter er udelukket på grund af den høje variabilitet altid set i dette tidsrum. B) glomerulære filtrationshastighed (FITC-inulin) af fire nyrer vurderet efter 25 og 55 min viste svag, men ikke signifikant stigning over tid. C) Fractional udskillelse af natrium og kalium vurderet efter 55 min perfusion. D) Venøs plasma og urin osmolalitet efter 55 min perfusion. n = 4 i alle forsøg. Data er præsenteret som middelværdi ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Transmission Electron Microscopy. Repræsentativ morfologi D ifferent Nephron Segmenter af perfusion Nyrer på et slutpunkt på 1 time. A) glomeruli er intakte. Detalje af en podocyte i en glomerulus. B) S1 segment af en proximal tubulus. S1-segmenter er intakte. C) S2 / S3 segment af en proximal tubulus. Nogle, men ikke alle S2 / S3 segmenter af proksimale tubuli er meget nekrotisk. Celler vises hævede og vise store intracellulære skader. Det rørformede kontur opretholdes kun af basalmembranen. D) tykke opadgående ben (TAL). Disse sygehuse, der er langt fra de vaskulære bundter viser de første tegn på hydropisk degeneration. Luminale membraner synes tyndet og skrøbelig. E) Distal tubulus (DCT). DCT'er er intakte. F) Detalje af de basolaterale infoldings af en DCT celle. Fenestreret endotel, basalmembran, basolaterale infoldings, og mitokondrier er intakte. G) opsamlingskanal (CD). CD'er er intakte.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: Western Blot af AP markørproteiner i isolerede perfunderede Nyrer Sammenlignet med Unperfused Nyrer fra de samme dyr. A) Western blots af nyrer perfunderet i 1 time og unperfused nyrer. NaPi-IIa er repræsentativ for den proksimale tubulus. NKCC2 er repræsentativ for den tykke opadgående del. NCC og NCC phosphoryleret ved threonin 53 (pT53 NCC) udelukkende findes i den distale tubulus contortus. Alpha og gamma subunits af ENaC i deres fulde længde, og deres respektive proteolytisk spaltede produkter er vist repræsentative for tilslutning tubulus / opsamling kanal. B) Kvantificering af A) afslørede ikke signifikante forskelle mellem nyrer perfunderet feller 1 time og unperfused nyrer. n = 3 i alle eksperimenter. Data er præsenteret som middelværdi ± SEM og individuelle værdier er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

tabel 1
Tabel 1: Sammensætning af løsninger og Dialyse Buffer. Klik her for at se en større version af denne tabel.

tabel 2
Tabel 2: Blood Gas og Elektrolyt Analyse af arterielle Nyansatte og Venøs Udstrømning af perfuseret Mouse Nyrer 60 min efter indtræden af Perfusion (n = 4). Data er præsenteret som middelværdi ±SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Musen isoleret perfunderede nyre er et værktøj til at studere nyrefunktion i et kontrolleret miljø ex vivo i 1 time, bygge bro mellem in vivo forsøg i intakte dyr, som kan være mangelfulde med virkningen af talrige systemiske faktorer, og in vitro eksperimenter i isolerede nephron segmenter eller dyrkede celler, som nødvendigvis forsømmer virkningen af ​​intakt organ struktur på funktion. Der er, til forfatternes viden, noget alternativ teknik med til at udføre denne specifikke opgave. Biokemiske undersøgelser af nyrevæv imidlertid kan udføres på en meget enklere måde ved anvendelse nyre skiver 17. Mens teknikken præsenteres i øjeblikket bruges oftest til at studere renal fysiologi, er mange nye applikationer bliver diskuteret. For eksempel kunne det bruges til nyre bioteknik under perfusion decellularization og recellularization 12. Desuden langvarig normotermisk perfusion af nyrer kendte transplantation, med administration af høje doser af anti-afvisning eller genom-redigering lægemidler i perfusatet, bliver undersøgt; selv i kliniske omgivelser 8, 9, 10, 11. Musen isoleret perfunderede nyre er et fremragende værktøj, der kan anvendes til disse applikationer, især at belyse den rolle, som individuelle gener med knockout-modeller.

Tre trin er afgørende for en vellykket eksperiment. Dette papir giver interesserede laboratorier med midlerne til at gengive proceduren. Først skal forberedes på en sådan måde, at nyren får de fleste af de næringsstoffer, der er nødvendige for langvarig levedygtighed under reproducerbare betingelser bufferen. En balance skal findes mellem fuldt kontrollerede forhold (syntetisk buffer) og en indfødt perfusion tilstand (fuldblod). Derfor albumin og mammale erytrocytter til en hæmatokrit på 10% har skal medtages. Denne hæmatokrit repræsenterer, i forfatternes erfaring, det bedste kompromis mellem tilstrækkelig tproblem iltning og lav buffer viskositet (stigende hæmatokrit falder flyde dramatisk i tryk-konstant perfusion (sammenligne værdier præsenteret i dette papir til værdier i nyrer perfunderet uden erytrocytter 18)). Den kvalitet og friskhed af erytrocytter er kritisk. Under vasketrinene, skal håndteres med forsigtighed for at undgå hæmolyse erytrocytter. Bufferen skal fremstilles frisk på dagen for forsøget. For det andet, skal udføres af en uddannet kirurg inden for den kortest mulige tid operationen. Kirurgen skal udføre 6 ligaturer omkring den vigtigste fartøjer forbinder nyren til resten af ​​kroppen, og samtidig holde blodtab dyrets til et minimum. For at opnå optimale resultater, bør de kirurgiske indgreb udføres inden for 30 minutter. Hvis gennemsnitlige arterielle blodtryk af dyret falder, ved langvarig kirurgi eller på grund af anæstesi, under 60 mmHg, renal perfusion vil allerede være minimal, og vævet vil være tilbøjeligetil nekrose. At udelukke dette, kan den venstre nyre tages efter operationen, når perfusion af højre nyre allerede er begyndt, og anvendt som en ubehandlet kontrol. Tredje, i den tid af perfusionen den korrekte funktion perfusionsapparatet, der består af en standard lille dyr-perfusionskredsløb, skal sikres. Mens computeren udfører perfusionen af ​​sig selv, menneskelig overvågning er nødvendig, for eksempel for at kontrollere for bobler i perfusionskredsløbet.

De repræsentative data muliggør vurderingen af nyre levedygtigheden efter 1 time af ex vivo perfusion og sammenligningen af den tekniske succes for enhver udførelse af denne fremgangsmåde til den fremgangsmåde, der er beskrevet heri. Under mindst 1 time, renal blodgennemstrømning, vaskulær modstand, blodgasser af venøs udstrømning og glomerulær filtrationshastighed bør forblive stabile.

Der er visse begrænsninger for den teknik, som man har at holde sig for øje. Selv en kidney udstedelse fra de mest vellykket operation kan kun forbliver levedygtige i et begrænset tidsrum. Forfatterne fandt 1 hr at være det bedste tidspunkt tidspunkt at stoppe perfusion. Og mens perfusion af det isolerede nyre muliggør studiet af det isolerede helorgan i dybden, er det vanskeligt at skelne specifikke virkninger på en celletype. Nyrer fast efter 1 time kan vise fejl i S3 segmenter af proksimale tubuli og tykke opadgående del celler, mens glomeruli, S1-segmenter, DCT'er, og cd'er bør forblive intakt. Den obligatoriske anvendelse af erythrocytter, især fra mennesker, er også knyttet til potentielle risici (f.eks infektioner) til forsøgslederen.

Sammenfattende musen isoleret perfuseret nyre er en nyttig teknik med at studere hele organ ex vivo. Som enhver teknik, det har visse fordele og begrænsninger. Forfatterne mener, at både de mangfoldige nye applikationer i øjeblikket opstår, og denne protokol kunne give sufficient momentum for andre laboratorier til at reproducere denne indsats.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2901
Cannular with basket and side port Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2947
Thermostat TC120-ST5  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3436
Pressure Transducer APT300  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3862
TAM-D Plugsys Transducer Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-1793
SCP Plugsys servo controller Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2806
Windkessel  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3717
HSE-USB data acquisition Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone B.Braun 7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/8
Name Company Catalog Number Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10% B.Braun 134518064
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt Sigma-Aldrich M1125-25G
Sodium-L-Lactate Sigma-Aldrich L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt Sigma-Aldrich K1875-25G
NaCl Sigma-Aldrich 31434-1KG-R
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761-5KG
KCl Sigma-Aldrich 60130-1KG
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Creatinine Sigma-Aldrich C4255-10G
Ampicillin Roche 10835242001
MgCl2 * 6H2O Sigma-Aldrich M2393-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 * 6H2 Riedel-de-Haën 12074
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-500G
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP Sigma-Aldrich V2013-1MG
FITC-Inulin Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration Macherey-Nagel MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM FEI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81, (2112), 621-623 (1935).
  2. Skutul, K. Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv. 123, (4-6), 249-273 (1908).
  3. Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7, (1), 1-11 (1975).
  4. Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196, (5), 1115-1118 (1959).
  5. Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53, (2), 145-155 (1985).
  6. Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16, (3), 377-384 (1979).
  7. Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284, (4), F770-F777 (2003).
  8. Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360, (1), 7-19 (2009).
  9. Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13, (5), 1246-1252 (2013).
  10. Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38, (4), 352-361 (2014).
  11. Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
  12. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19, (5), 646-651 (2013).
  13. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22, (7), 1297-1304 (2011).
  14. Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
  15. Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100, (4), 556-563 (2007).
  16. Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger's Archiv. (2016).
  17. Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8, (10), 1227-1236 (2015).
  18. Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9, (5), 288-296 (2004).
Mus isoleret perfunderet Nyre Teknik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).More

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter