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Biology

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

doi: 10.3791/54712 Published: November 17, 2016

Summary

Die Maus isoliert perfundierten Nieren (MIPK) ist eine Technik zum Halten einer Mausniere unter ex vivo - Bedingungen durchbluteten und funktionell für 1 Std. Die Puffer und die chirurgische Technik werden ausführlich beschrieben.

Abstract

Die Maus isoliert perfundierten Nieren (MIPK) ist eine Technik zum Halten einer Mausniere unter ex vivo - Bedingungen durchbluteten und funktionell für 1 Std. Dies ist eine Voraussetzung für die Physiologie des isolierten Organs zu studieren und für viele innovative Anwendungen, die in der Zukunft möglich sein, einschließlich Perfusion Dezellularisierung für Nieren Biotechnik oder die Verabreichung von anti-Ablehnung oder Genom-Bearbeitung Medikamente in hohen Dosen zu grundieren der Niere für die Transplantation. Während der Zeit der Perfusion kann die Niere manipuliert werden, kann die Nierenfunktion bewertet werden, und verschiedene Arzneimittel verabreicht. Nach dem Verfahren kann die Niere für die Molekularbiologie, biochemische Analyse oder Mikroskopie transplantierten oder verarbeitet werden.

Dieses Papier beschreibt die Perfusat und die chirurgische Technik für die ex vivo Perfusion von Mausnieren benötigt. Einzelheiten der Perfusionsgerät gegeben und Daten vorgestellt, die v zeigtAFTUNG der Zubereitung der Niere: Nierendurchblutung, Gefäßwiderstand und Urin Daten als funktionelle, Transmissionselektronenmikrographien verschiedener nephron Segmente als morphologische Ablesungen und Western-Blots von Transportproteinen verschiedener nephron Segmente als molekulare Anzeige.

Introduction

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Die isolierte Perfusion von Organen hat unter Physiologen seit vielen Jahrzehnten ein Gegenstand einer laufenden Bemühungen gewesen. Die Technik ermöglicht es, die Funktion des Organs, ohne systemische Einflüsse wie Blutdruck, Hormone oder Nerven, untersucht werden. Carl Eduard Loebell gilt als der erste sein , um die erfolgreiche Perfusion eines isolierten Niere beschrieben haben, im Jahr 1849 2. Seitdem hat sich die Perfusionsgerät erhebliche Verfeinerung erfahren. Frey und Gruber führte eine künstliche Lunge für die Sauerstoffversorgung und pulsatile Pumpen für kontinuierliche Perfusion 2. Während frühe Forscher vor allem die Nieren von großen Säugetieren nämlich sucht, Schweine und Hunde 2 3 -der erste Bericht über die Verwendung von Rattennieren, die von Weiss et al. , War in der Studie der kleinen Säuger-Organperfusion 4 ein Meilenstein. Schurek et al. die Notwendigkeit der Zugabe von Säugetieren Erythrozyten zu dem Perfusat, wenn eine ausreichende renale tubuläre berichtetOxygenierung wurde auf 5 erreicht werden. Kritisch für Langzeitversuchen war die Einführung der kontinuierlichen Dialyse des Puffers von der gleichen Arbeitsgruppe 6. Im Jahr 2003 Schweda et al. waren die ersten , eine funktionelle Maus isoliert perfundierten Niere (MIPK) 7, verfeinert später von Rahgozar et al berichten. 18 und Lindell et al. 14.

Während technisch schwieriger als die Ratte perfundierten Nieren isoliert, trägt die Verwendung des MIPK den Vorteil, die Verwendung einer Vielzahl von genetisch veränderten Mäusen ermöglichen. Dieses Papier stellt die Einzelheiten des Verfahrens der Autoren für die Perfusion von isolierten Maus-Nieren für 1 Stunde. Das Verfahren ermöglicht die kontinuierliche Messung der Nierendurchflussrate, Gefäßwiderstand, Hormonfreisetzung, Blutgasanalyse, Urinanalyse und die Anwendung von Medikamenten. Nach dem Verfahren könnte Nieren für molekulare und biochemische Analyse verarbeitet werden, für die Mikroskopie festgelegt werden, odertransplantierten in eine Empfängermaus (Abbildung 1).

Abbildung 1
Abbildung 1: Übersicht über die möglichen Input / Output an den isolierten perfundierten Nieren. BGA: Blutgasanalyse. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diese Technik wird wahrscheinlich erhalten Aufmerksamkeit in den kommenden Jahren zu erhöhen, da viele innovative Anwendungen sind mit dem Beginn der verlängerten normothermic Nierenperfusion vor der Transplantation diskutiert (mit oder ohne die Anwendung von Anti-Ablehnung oder Genom-Bearbeitung Drogen) 8, 9, 10 , 11, die Bioengineering von ganzen Nieren von dezellularisierten Gerüste 12 und die Anwendung von hohen Dosen von fluoreszierenden Farbstoffen für Mehrphotonenabbildungs 13 14 die Rolle spezifischer Gene während der akuten Nierenschädigung zu untersuchen.

Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll gegeben anderen Labors zu ermöglichen isolierten Maus Nierenperfusion erfolgreich durchzuführen. Zuerst wird die Zusammensetzung und die Herstellung des Puffers spezifiziert. Dann wird die Operation im Detail beschrieben und die kritischen Schritte gezeigt. Drittens werden Daten vorgestellt, die repräsentativ für eine erfolgreiche Vorbereitung: Nierendurchblutung, Gefäßwiderstand, glomeruläre Filtrationsrate und fraktionierte Elektrolytausscheidung-alle als funktionelle Messungen der Lebensfähigkeit-und transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen der Morphologie verschiedener nephron Segmente perfundiert Nieren nach 1 Stunde der Perfusion fixiert.

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Protocol

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Alle Verfahren mit Tieren in diesem Manuskript beschrieben, wurden auf Schweizer Recht durchgeführt nach und von der Veterinärverwaltung des Kantons Zürich, Schweiz genehmigt.

1. Puffer Vorbereitung

  1. Herstellung von Lösungen von 1 bis 4 und der ADH (ADH) -Lösung (Tabelle 1).
  2. Bereiten Sie die Dialysepuffer (Tabelle 1).
    Hinweis: Dies ist der Puffer als Dialysepuffer während der Perfusion verwendet. Später werden die Erythrozyten in diesem Puffer verdünnt, um die endgültige Perfusat zu bilden.
  3. Erythrozyt Vorbereitung.
    1. Verdünnte 250 ml menschlicher Erythrozyten-Konzentrat (geprüfte Material aus der lokalen Blutbank erhalten wird) auf 500 ml mit Dialysepuffer. Zentrifuge bei 2000 × g für 8 min. Entfernen Sie den Puffer, wobei keine Erythrozyten zu entfernen. 3x wiederholen.
  4. Bereiten Sie das Albumin (Rinderserumalbumin, BSA) Puffer.
    1. In 200 ml dialysis Puffer, lösen sich 44 g BSA einen Rührstab verwenden. Filtern Sie die Lösung mit Filterpapier.
  5. Bereiten Sie die Perfusat.
    1. Filtern Sie die Erythrozyten aus Schritt 1.3.1 durch Filterpapier in den BSA-Puffer. Füllen Sie auf ein Gesamtvolumen von 800 ml mit Dialysepuffer auf.
      HINWEIS: Dies ist die letzte Perfusat. Der Hämatokrit sollten nun zwischen 8 und 12% liegen. Das Perfusat kann bei 4 ° C bis zu 12 Stunden gelagert werden.

2. Initiieren Dialyse und Oxygenation

  1. Schalten Sie das Wasserbad rund um den größeren Pufferbehälter, kleiner Pufferspeicher, und die feuchte Kammer (eine kleine, doppelwandige Kammer gebracht auf 37 ° C und 100% Luftfeuchtigkeit später die Nieren halten) bis 37 ° C (Abbildung 2) .
  2. Füllen Sie den größeren Pufferspeicher mit dem Dialysepuffer und den kleineren Behälter mit dem Perfusat.
  3. Schalten Sie die 5% CO 2/95% O 2 Gaszufluss zu dem Dialysepuffer.
  4. Schalten Sie kontinuierliche Dialyse des Perfusat gegen den Dialysepuffer. Achten Sie darauf, Low-Flux-Dialyseschlauch zu verwenden. Gehen Sie zu Schritt 3.

Figur 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Perfusionskreislaufes. Schema zeigt die Hauptkomponenten des Perfusionskreislaufs und die Richtung des Pufferflusses. Alle Komponenten von dunkelblau umgeben sind bei 37 ° C mit einem Wasserbad / Thermostat gehalten. 1: Dialysepuffer von mindestens 3 - fache des Volumens des Puffers Perfusion mit 95% O 2/5% CO 2 kontinuierlich geperlt. 2: Dialysepuffer und Perfusionspuffer werden gegeneinander in einen Dialyseschlauch mit einer Rollenpumpe kontinuierlich dialysiert. 3: Durch diese Dialyse, die Perfusionspuffer mit 9% O 2/5% CO 2 und der Elektrolytspiegel konstant gehalten werden througho angereichertut Perfusion. 4: Eine Rollenpumpe treibt den Perfusionspuffer in Richtung auf die Niere. 5: Ein Windkessel entfernt peristaltischen Wellen und wirkt als Blasenfalle. 6: Druckwandler (verbunden mit 4. (Rollenpumpe) Dauerdruck zu halten , während frei abwechselnd Strömung erlaubt). 7: Während der Perfusion, bleibt die Niere in einer feuchten Kammer für 100% Luftfeuchtigkeit und 37 ° C Nierentemperatur. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Chirurgische Verfahren Teil 1 (für ein Diagramm aller Ligaturen, siehe Abbildung 3)

Hinweis: Führen Sie alle Ligatur mit 5-0 chirurgischen Faden.

  1. Anästhesieren einer Maus durch intraperitoneale Injektion (10 ul / g Körpergewicht, 20 mg / ml Ketamin und 1 mg / ml Xylazin in 0,9% NaCl gelöst). Bestätigen Sie eine ausreichende Tiefe von AnesthESIA durch die Prüfung für das Fehlen von hinteren Fuß Reflexe.
  2. Befestigen Sie die Maus in Rückenlage in der feuchten Kammer. Schützen Sie die Augen mit vet Salbe. Legen Sie eine 1-ml-Spritze unterhalb der Wirbelsäule, die Lendengefäße zu erhöhen.
  3. Führen Sie eine mittlere Laparotomie vom Schamkamm bis zum Brustbein Öffnung zuerst die Haut, dann die Bauchmuskeln, mit einer Schere.
  4. Entfernen Sie den Darm und legen Sie sie auf der linken Seite der Maus seitlich aus dem Bauch.
  5. Befreien Sie die Blase aus Bindegewebe und erforschen beide Harnleiter und die Harnröhre.
  6. Legen Sie eine Ligatur um die linke Harnleiter (Ligatur I). Schließen Sie es.
  7. Legen Sie eine Ligatur um die Harnröhre (Ligatur II). Schließen Sie es.
  8. Setzen Sie ein "Lasso" Ligatur um die ganze Blase (Ligatur III).
  9. Inzision der Blase 1 mm.
  10. Kanülieren die Öffnung mit 2 cm PE 50 Schläuchen.
  11. Schließen Ligatur III um das Rohr.
  12. Schneiden Sie die linke Harnleiter und Harnröhre entfernt von der Ligatur. Die bladder wird jetzt nur auf der rechten Seite Harnleiter befestigt und frei bewegen.
  13. Deaktivieren Sie die Bauchaorta von Bindegewebe und Fett.
  14. Legen Sie eine Bauch Mitte Aorta Ligatur (Ligatur IV).
  15. Legen Sie eine Ligatur um die Aorta unterhalb der Membran zwischen der A. mesenterica superior und der Zöliakie-Stamm (Ligatur V).
  16. Legen Sie eine Ligatur um die A. mesenterica superior (Ligatur VI).
  17. Legen Sie eine Aorten-Ligatur direkt unter dem rechten und über dem linken Nierenarterie (Ligatur VII).
  18. Legen Sie eine Ligatur um die Schwanzvene Paket (Cava) (Ligatur VIII). Gehen Sie zu Schritt 4.

Figur 3
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Ligatures während der Operation gegeben. Mit Blick auf das offene Bauch nach der Laparotomie. Der Darm wird nach links ausgezogen. L und R zeigen die linke und die rechte Niere. Dasschwarze Linien zeigen den Bereich der jeweiligen Ligatur. Ligatures werden immer zuerst gesetzt und dann geschlossen, in der im Text angegebenen Reihenfolge. X markiert die Lage des Einschnitts für Aorta Kanülierung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Priming des Perfusionskreislaufes

  1. Starten Sie die Kreiselpumpe und füllen Sie den Schlauch mit Perfusat. Achten Sie darauf, alle Luftblasen aus sie zu leeren.
  2. Füllen Sie das Windkessel Gerät etwa der mittleren Ebene mit Perfusat.
  3. Kalibrieren Sie den Druckwandler auf 0 mm Hg, wenn alle Rohre gefüllt und Strömung ist 0. während dieser Zeit die Perfusion Nadel bei Nieren Niveau zu halten.
  4. Halten Sie Fluss auf einem konstanten minimalen Niveau (0,6 ml / min) und gehen Sie zu Schritt 5.

5. Chirurgisches Verfahren Teil 2

  1. Legen Sie eine Klammer zwischen Ligatur IV und der Verzweigung des linken renal Arterie.
  2. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Aorta Schwanz- der Ligatur IV, dabei nicht die Rückwand zu schneiden.
  3. Dilatieren die Öffnung in der Aorta mit einem Gefäß Dilatator.
  4. nur an der Klemme kanülieren die Aorta mit einer Nadel (2 cm lang, zog 50 PE), die Spitze schieben.
  5. Öffnen Sie die Klemme.
  6. Schieben Sie die Spitze der Nadel kranial, bis sie die Kreuzung der rechten Nierenarterie und der Aorta erreicht.
  7. Schließen Ligatur VII.
  8. Schließen Ligatur IV.
  9. Öffnen Sie die Brust mit einer Schere durch die Membran zu sezieren. Mit einem einzigen Schnitt, trennen Sie die Aorta, Hohlvene, Herz und vegetative Nerven. Mit diesem Schritt wird das Tier über eine schnelle Ausbluten unter kontinuierlicher tiefer Narkose getötet.
  10. Starten Drucksteuerung der Perfusionspumpe. Pflegen Sie den mittleren Druck zwischen 80 und 100 mmHg.
  11. Schließen Ligatur V.
  12. Schließen Ligatur VI.
  13. Schließen Ligatur VIII.
  14. Freie die rechte Niere von Binde- tissue und seine Einbettung in die adipösen Kapsel mit einer Schere.
  15. Schneiden proximal die Aorta V. Ligatur
  16. Schneiden Sie die A. mesenterica superior distal VI Ligatur.
  17. Schneiden Sie die Niere tragende Gefäßbündel aus, dabei nicht in die Gefäße selbst zu schneiden.
  18. Schneiden die Leber an der Verbindung mit der Niere. Achten Sie darauf, die Niere zu befreien, aber ein kleiner Teil der Leber verwachsen sie verlassen, so dass die Hohlvene wird durch sie offen gehalten.
  19. Nehmen Sie die Niere Bündel aus der Maus. Entfernen Sie die Maus aus der feuchten Kammer.
  20. Setzen Sie ein "Lasso" Ligatur um die Verbindung von Leber und Niere (Ligatur IX).
  21. Kanülieren die Hohlvene mit einer venösen Leitung (2 cm PE 50).
  22. Schließen Ligatur IX. Venöse Abfluss durch die venöse Leitung sollte sofort beginnen.
  23. Schließen Sie die feuchte Kammer.

6. Downstream-Analysen

  1. Während der folgenden Stunde, überwachen kontinuierlich den Blutfluss und intravascular Druck 15. Sammeln Sie venösen Abfluss, die 7 für die Analyse von zum Beispiel Nierenreninfreisetzung verwendet werden kann. Sammeln Sie Urin für die Analyse der Elektrolytkonzentration und der glomerulären Filtrationsrate 14. Nach 1 Stunde Perfusion kann Nieren für Western - Blot werden schockgefroren oder für die Bildgebung Ansätze 16 festgelegt werden.

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Representative Results

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Mit dem Verfahren isolierten Maus-Nieren beschrieben, kann für mindestens 1 h lebensfähig bleiben. Wir testeten die Gewebelebensfähigkeit nach 1 Stunde der kontinuierlichen Perfusion mit funktionellen (Nierendurchblutung und Gefäßwiderstand, Blutgasanalyse von venösen Abflusses, der glomerulären Filtrationsrate, Harn- fraktionierte Na + und K + -Ausscheidung und Urinosmolalität) und morphologischen (Transmissionselektronenmikroskop Mikroskopie TEM) Methods in vier Nieren von Wildtyp C57BL / 6-Mäusen. Zusätzlich Western - Blots von apikal Markerproteine verschiedener Röhrchens Segmente wurden durchgeführt, isoliert perfundierten Nieren zu unperfused Nieren von den gleichen Tieren zu vergleichen. In allen Experimenten wurde konstanten Perfusionsdruck, halten die Perfusionsdruck bei ~ 100 mmHg (Abbildung 4) verwendet. In diesen Nieren blieb Perfusat Strömungs- und Gefäßwiderstand stabil über eine Zeit von 55 min bei 15,6 ± 0,4 ml / min * g Nierengewicht und 35 ± 1,0 mmHg * min / ml, bzw. (Figur 4 A). Eine Abnahme von Perfusat Strömung oder eine Erhöhung der Gefäßwiderstand ist ein sensibler Parameter in Bezug auf die Lebensfähigkeit des Gewebes zu verringern und sollte während der Perfusion mit Sorgfalt kontrolliert werden. Blutgasanalyse und Elektrolyt in 100 ul - Proben 60 min nach dem Beginn der Perfusion ergaben , renal CO 2 -Produktion und O 2 -Verbrauch, wenn der arterielle Zufluss zum venösen Abflusses (Tabelle 2) verglichen. Die anderen Parameter blieben unverändert zwischen Arterie und Vene (Tabelle 2). Besonderes Augenmerk sollte auf unverändert venösen Kalium Freisetzung platziert werden, da ein Anstieg bei der Gewebeschäden auftreten können. Die glomeruläre Filtrationsrate, bewertet über FITC-Inulin - Clearance 14 tendierten im Laufe der Zeit (Abbildung 4 B) zu erhöhen , aber dieser Trend Bedeutung nicht erreichen. Fraktionierte Ausscheidung von Natrium und Kalium in der 55. Minute der Perfusion beurteilterhöht wird , verglichen mit der in vivo Situation (Figur 4 C). Urinosmolalität oberhalb der Osmolalität des venösen Abflusses nach 55 min Perfusion (4 D) nicht erhöht.

Für morphologische Studien wurden Nieren nach Perfusion in 3% Paraformaldehyd und 0,1% Glutaraldehyd in Dialysepuffer fixiert , wie zuvor beschrieben 17. Renal Ultra wurde mit TEM beurteilt. Glomeruli und S1 Segmente der proximalen Tubuli erschien weitgehend unverändert nach Perfusion (Figuren 5 A und B). Einige, aber nicht alle S2 / S3 Segmente proximalen Tubuli und die dicken aufsteigenden Gliedmaßen , die nicht zu Leitbündel schließen wurden Anzeichen von Organschäden zeigt, wie zuvor in der Ratte isoliert perfundierten Nieren 5 beschrieben (Abbildungen 5 C und D). Selbst bei genauer Betrachtung, distalen Tubuli und Sammelkanäle zeigten keine offensichtlichen Anzeichen von Nekrose (Figuren 5 E, F und G). Abschließend spiegeln die morphologischen Befunde bei den Nieren einer Maus , die Situation in der Ratte isoliert perfundierten Niere 5 gefunden.

Western-Blots von apikal Markerproteine ​​der verschiedenen nephron Segmente in isolierten perfundierten Nieren (schockgefroren nach 1 Stunde der Perfusion) im Vergleich zu unperfused kontralateralen Nieren des gleichen Tieres (schockgefroren vor dem Beginn der Perfusion) zeigte keine signifikanten Veränderungen. Wir studierten NaPi-IIa (im proximalen Tubuli), NKCC2 (dicke aufsteigende Gliedmaßen), NCC (distalen Tubuli) und ENaC (Anschluss Tubuli / Sammelkanäle) (Figuren 6 A und B).

Abbildung 4
Abbildung 4: Beurteilung der Funktionsfähigkeit der Nieren für 55 min perfundiert. A) </ Strong> Während konstantem Druck Perfusion blieb Gefäßwiderstand und Perfusat Fluss für 55 min stabil. Die ersten 15 min werden aufgrund der hohen Variabilität ausgeschlossen immer während dieser Zeit gesehen. B) Die glomeruläre Filtrationsrate (FITC-Inulin) von vier Nieren bewertet nach 25 und 55 min dargestellt leichte , aber nicht signifikanten Anstieg über die Zeit. C) Fraktionierte Ausscheidung von Natrium und Kalium , nach 55 min Perfusion beurteilt. D) Venöse Plasma und Urin - Osmolalität nach 55 min der Perfusion. n = 4 in allen Experimenten. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Transmissionselektronenmikroskopie. Repräsentative Morphologie von D ifferent Nephron Segmente perfundierter Kidneys an einem Endpunkt von 1 Stunde. A) Glomeruli sind intakt. Detail eines podocyte in einem Glomerulus. B) S1 - Segment des proximalen Tubulus. S1 Segmente sind intakt. C) S2 / S3 - Segment des proximalen Tubulus. Einige, aber nicht alle S2 / S3 Segmente der proximalen Tubuli sind hoch nekrotisch. Die Zellen erscheinen geschwollen und zeigen große intrazelluläre Schäden. Der rohrförmige Umriß ist nur durch die Basalmembran beibehalten. D) Dicke aufsteigende Schenkel (TAL). Diese TALs, die weit von den Gefäßbündeln zeigen die ersten Anzeichen von hydropic Degeneration sind. Luminal Membranen erscheinen verdünnt und zerbrechlich. E) Distal Tubulus (DCT). DKGs sind intakt. F) Detail der basolateralen Einstülpungen einer DCT - Zelle. Fenestrated Endothel, Basalmembran, basolateralen Einstülpungen und Mitochondrien sind intakt. G) Sammelkanal (CD). CDs sind intakt.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6: Western Blot von Apical Markerproteinen in isolierten perfundierten Nieren Im Vergleich zu Unperfused Kidneys aus der gleichen Tiere. A) Western - Blots von Nieren durchbluteten für 1 Stunde und unperfused Nieren. NaPi-IIa ist repräsentativ für den proximalen Tubuli. NKCC2 ist repräsentativ für den dicken aufsteigenden Ast. NCC und NCC phosphoryliert an Threonin 53 (PT53 NCC) im distalen Konvolut ausschließlich gefunden. Alpha und Gamma-Untereinheiten von ENaC in ihrer vollen Länge und ihre jeweiligen proteolytisch gespalten Produkte repräsentativ gezeigt für den Anschlussröhrchens / Sammelkanal. B) Quantifizierung von A) zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Nieren durchbluteten foder 1 Stunde und unperfused Nieren. n = 3 in allen Experimenten. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM und Einzelwerte dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1
Tabelle 1: Zusammensetzung der Lösungen und Dialysepuffer. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

Tabelle 2
Tabelle 2: Blut - Gas und Elektrolyt Analyse von arteriellen Zustroms und eines venösen Abflusses von perfundierten Nieren einer Maus 60 min nach dem Beginn der Perfusion (n = 4). Daten sind als Mittelwerte ±SEM.

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Discussion

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Die Maus perfundierte Niere isoliert ist ein Werkzeug für die Untersuchung der Nierenfunktion in einer kontrollierten Umgebung ex vivo für 1 h, die Lücke zwischen den in vivo Experimenten in intakten Tieren, die durch die Wirkung zahlreicher systemischer Faktoren fehlerhaft sein kann, und in vitro - Experimenten in isoliert nephron Segmente oder kultivierten Zellen, die notwendigerweise die Auswirkungen der intakten Organstruktur auf Funktion vernachlässigen. Es ist, nach Kenntnis der Autoren, keine Alternative Technik, mit der diese spezifische Aufgabe auszuführen. Biochemische Untersuchungen an Nierengewebe kann jedoch auf viel einfachere Art und Weise durchgeführt werden unter Verwendung von Nierenscheiben 17. Während die präsentierte Technik zur Zeit hauptsächlich verwendet wird, Nierenphysiologie, viele neue Anwendungen werden diskutiert zu studieren. Zum Beispiel könnte es für Nieren Bioengineering während der Perfusion Dezellularisierung und Rezellularisierung 12 verwendet werden. Darüber hinaus verlängerte Normothermie Perfusion der Nieren vor transplantation, die mit der Verabreichung von hohen Dosen von anti-Abstoßung oder Genom-Bearbeitung Medikamente in das Perfusat, untersucht wird; auch in klinischen Umgebungen 8, 9, 10, 11. Die Maus isoliert perfundierten Niere ist ein ausgezeichnetes Werkzeug, das für diese Anwendungen verwendet werden könnten, vor allem die Rolle einzelner Gene mit Knockout-Modelle zu erläutern.

Drei Schritte sind entscheidend für ein erfolgreiches Experiment. Dieses Papier bietet interessierten Labors mit den Mitteln, das Verfahren zu reproduzieren. Erstens muss der Puffer in der Weise hergestellt werden, dass die Niere die meisten Nährstoffe, die für längere Lebensfähigkeit unter reproduzierbaren Bedingungen erhält. Es muss ein Gleichgewicht zwischen vollständig kontrollierten Bedingungen (synthetische Puffer) und einer nativen Perfusions-Zustand (Vollblut) zu finden. Daher wurden an Albumin und Säuger Erythrozyten zu einem Hämatokrit von 10% enthalten sein. Dieser Hämatokrit repräsentiert, in der Erfahrung der Autoren, den besten Kompromiss zwischen ausreichend tAusgabe Sauerstoffversorgung und geringer Puffer Viskosität (Erhöhung der Hämatokrit während druckkonstante Perfusion dramatisch verringert Flusswerte (vgl in diesem Papier auf Werte in den Nieren ohne Erythrozyten 18) durchbluteten vorgelegt). Die Qualität und Frische der Erythrozyten ist kritisch. Während der Waschschritte müssen Erythrozyten vorsichtig behandelt werden, um Hämolyse zu verhindern. Der Puffer muss frisch des Experiments am Tag hergestellt werden. Zweitens muss die Operation durch einen geschulten Arzt innerhalb der kürzest möglichen Zeit durchgeführt werden. Der Chirurg muss 6 Ligaturen durchzuführen um die Hauptgefäße der Niere mit dem Rest des Körpers verbinden, während der Blutverlust auf ein Minimum des Tieres zu halten. Für optimale Ergebnisse sollten die chirurgischen Eingriffen innerhalb von 30 Minuten erreicht werden. Wenn der mittlere arterielle Blutdruck des Tieres fällt, während einer längeren Operation oder durch Anästhesie unter 60 mmHg, wird Nierenperfusion bereits minimal sein und das Gewebe anfälligNekrose. Um dies auszuschließen, kann die linke Niere nach der Operation entnommen werden, wenn die Perfusion der rechten Niere hat bereits begonnen, und als unbehandelte Kontrolle eingesetzt. Drittens muss während der Zeit der Perfusion die korrekte Funktion der Perfusionsapparatur, bestehend aus einem Standard-Kleintier-Perfusionskreislauf, sichergestellt werden. Während der Computer die Perfusion von selbst durchführt, ist die menschliche Überwachung notwendig, beispielsweise für Blasen im Perfusionskreislauf zu überprüfen.

Die repräsentativen Daten vorgesehen ermöglicht die Beurteilung von Nieren Lebensfähigkeit nach 1 Stunde von ex vivo Perfusion und dem Vergleich der technischen Erfolg jeder Ausführung dieses Verfahrens auf die hierin beschriebenen Ansatz. Während mindestens 1 Stunde, Nierendurchblutung, Gefäßwiderstand, Blutgase des venösen Abflusses und der glomerulären Filtrationsrate sollte stabil bleiben.

Es gibt bestimmte Beschränkungen in Bezug auf die Technik, die man im Auge behalten muss. Selbst ein kidney von der erfolgreichsten Chirurgie Ausgabe kann bleiben nur für eine begrenzte Zeit lebensfähig. Die Autoren fanden, 1 h die beste Zeitpunkt, zu dem sein Perfusion zu stoppen. Darüber hinaus, während Perfusion des isolierten Niere für die Untersuchung des isolierten ganzen Organs in der Tiefe ermöglicht, ist es schwierig, bestimmte Auswirkungen auf einen Zelltyp zu differenzieren. Kidneys nach 1 Stunde fixiert könnten Defekte in S3 Segmenten proximalen Tubuli und dicken aufsteigenden Ast Zellen zeigen, während Glomeruli, S1 Segmente, DKG und CDs sollte intakt bleiben. Die obligatorische Verwendung von Erythrozyten, insbesondere von Menschen, ist auch mit potentiellen Risiken verbunden (zB Infektionen) für den Experimentator.

Zusammenfassend ist die Maus isoliert perfundierten Nieren eine nützliche Technik , mit der das ganze Organ zu studieren ex vivo. Wie jede Technik, hat es gewisse Vorteile und Einschränkungen. Die Autoren glauben, dass die beiden vielfältige neue Anwendungen, die derzeit entstehen, und dieses Protokoll könnte sufficien liefernt Impulse für andere Labore, diese Bemühungen zu reproduzieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2901
Cannular with basket and side port Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2947
Thermostat TC120-ST5  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3436
Pressure Transducer APT300  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3862
TAM-D Plugsys Transducer Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-1793
SCP Plugsys servo controller Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2806
Windkessel  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3717
HSE-USB data acquisition Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone B.Braun 7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/8
Name Company Catalog Number Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10% B.Braun 134518064
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt Sigma-Aldrich M1125-25G
Sodium-L-Lactate Sigma-Aldrich L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt Sigma-Aldrich K1875-25G
NaCl Sigma-Aldrich 31434-1KG-R
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761-5KG
KCl Sigma-Aldrich 60130-1KG
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Creatinine Sigma-Aldrich C4255-10G
Ampicillin Roche 10835242001
MgCl2 * 6H2O Sigma-Aldrich M2393-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 * 6H2 Riedel-de-Haën 12074
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-500G
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP Sigma-Aldrich V2013-1MG
FITC-Inulin Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration Macherey-Nagel MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM FEI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik
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Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).More

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).

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