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Biology

माउस पृथक perfused किडनी तकनीक

doi: 10.3791/54712 Published: November 17, 2016

Summary

माउस पृथक perfused गुर्दा (MIPK) पूर्व vivo की स्थिति भरकर रखा और 1 घंटे के लिए कार्यात्मक के तहत एक माउस गुर्दे रखने के लिए एक तकनीक है। buffers और सर्जिकल तकनीक में विस्तार से बताया गया है।

Abstract

माउस पृथक perfused गुर्दा (MIPK) पूर्व vivo की स्थिति भरकर रखा और 1 घंटे के लिए कार्यात्मक के तहत एक माउस गुर्दे रखने के लिए एक तकनीक है। यह अलग अंग की और कई अभिनव अनुप्रयोगों है कि भविष्य में संभव हो सकता है, या गुर्दे bioengineering के लिए छिड़काव decellularization विरोधी अस्वीकृति या प्रधानमंत्री गुर्दे के लिए उच्च खुराक में जीनोम संपादन दवाओं के प्रशासन सहित, के लिए शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन के लिए एक शर्त है प्रत्यारोपण के लिए। छिड़काव के समय के दौरान, गुर्दे, चालाकी से किया जा सकता है गुर्दे समारोह का आकलन किया जा सकता है, और विभिन्न दवाइयों दिलाई। प्रक्रिया के बाद, गुर्दा प्रत्यारोपित या आणविक जीव विज्ञान, जैव रासायनिक विश्लेषण, या माइक्रोस्कोपी के लिए कार्रवाई की जा सकती।

इस पत्र perfusate और सर्जिकल तकनीक माउस गुर्दे के पूर्व vivo छिड़काव के लिए आवश्यक का वर्णन है। छिड़काव उपकरण का विवरण दिया जाता है और डेटा वी दिखा प्रस्तुत कर रहे हैंगुर्दे की तैयारी की iability: कार्यात्मक, रूपात्मक readouts, और आणविक readout के रूप में विभिन्न क्षेत्रों के नेफ्रॉन परिवहन प्रोटीन के पश्चिमी दाग ​​के रूप में विभिन्न क्षेत्रों के नेफ्रॉन के संचरण इलेक्ट्रॉन micrographs के रूप में गुर्दे रक्त प्रवाह, संवहनी प्रतिरोध, और मूत्र डेटा।

Introduction

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अंगों के अलग छिड़काव कई दशकों के लिए 1 physiologists के बीच चल रहे एक प्रयास का विषय रहा है। तकनीक, अंग के समारोह में सक्षम बनाता है ऐसे रक्तचाप, हार्मोन, या नसों के रूप में प्रणालीगत प्रभाव के बिना, अध्ययन किया जाएगा। कार्ल Eduard Loebell पहले एक अलग गुर्दे का सफल छिड़काव का वर्णन किया है करने के लिए 1849 में 2, माना जाता है। तब से, छिड़काव उपकरण महत्वपूर्ण शोधन आया है। फ्रे और Gruber निरंतर छिड़काव 2 के लिए ऑक्सीजन और गुणवाला पंपों के लिए एक कृत्रिम फेफड़ों की शुरुआत की। जबकि जल्दी शोधकर्ताओं ने मुख्य रूप से बड़े स्तनधारियों-अर्थात्, सूअर 2 और 3 कुत्तों चूहे गुर्दे के उपयोग के -इस पहली रिपोर्ट, वेइस एट अल द्वारा के गुर्दे का अध्ययन किया। , छोटे स्तनपायी-अंग छिड़काव 4 के अध्ययन में एक मील का पत्थर था। Schurek एट अल। perfusate यदि पर्याप्त गुर्दे ट्यूबलर को स्तनधारी एरिथ्रोसाइट्स जोड़ने की आवश्यकता सूचना दीऑक्सीजन प्राप्त किया जा करने के लिए 5 था। लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण एक ही अनुसंधान समूह 6 से बफर के निरंतर डायलिसिस की शुरूआत थी। 2003 में, Schweda एट अल। पहले एक कार्यात्मक माउस पृथक perfused गुर्दा (MIPK) 7, बाद में Rahgozar एट अल द्वारा परिष्कृत रिपोर्ट करने के लिए थे। 18 और Lindell एट अल। 14।

जबकि चूहे भरकर रखा गुर्दे पृथक से तकनीकी रूप से अधिक चुनौतीपूर्ण, MIPK के उपयोग के आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों की एक विस्तृत सरणी का उपयोग को सक्षम करने का लाभ भालू। इस पत्र 1 घंटे के लिए पृथक माउस गुर्दे perfusing के लिए लेखकों को 'विधि का ब्यौरा प्रस्तुत करता है। विधि गुर्दे प्रवाह की दर, संवहनी प्रतिरोध, हार्मोन रिलीज, रक्त गैस विश्लेषण, मूत्र विश्लेषण, और दवाओं के आवेदन के सतत मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। प्रक्रिया के बाद, गुर्दे, आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए कार्रवाई की जा सकती है माइक्रोस्कोपी के लिए तय हो सकता है, या(चित्रा 1) एक प्राप्तकर्ता माउस में प्रत्यारोपित।

आकृति 1
चित्रा 1: संभव इनपुट / आउटपुट, अलग भरकर रखा किडनी के अवलोकन। BGA: रक्त गैस विश्लेषण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस तकनीक की संभावना, 10 के रूप में कई नए अनुप्रयोगों के साथ (या विरोधी अस्वीकृति या जीनोम संपादन दवाओं के आवेदन के बिना) 8, 9 प्रत्यारोपण से पहले लंबे समय तक normothermic गुर्दे छिड़काव की सुबह के साथ विचार-विमर्श किया जा रहा है, आने वाले वर्षों में बढ़ती ध्यान प्राप्त होगा , 11, decellularized scaffolds 12 से पूरे गुर्दे की जैव अभियांत्रिकी और multiphoton इमेजिंग 13 के लिए फ्लोरोसेंट रंगों की उच्च खुराक के आवेदन 14 के दौरान विशिष्ट जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है।

एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल अन्य प्रयोगशालाओं पृथक माउस गुर्दे छिड़काव सफलतापूर्वक प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देने के लिए दिया जाता है। पहला, रचना और बफर की तैयारी निर्दिष्ट किया जाता है। फिर, सर्जरी में विस्तार से वर्णन किया गया है और महत्वपूर्ण कदम दिखाए जाते हैं। तीसरा, डेटा प्रस्तुत किया जाता है कि एक सफल तैयारी के प्रतिनिधि हैं: गुर्दे रक्त प्रवाह, संवहनी प्रतिरोध, glomerular निस्पंदन दर, और आंशिक इलेक्ट्रोलाइट उत्सर्जन सभी भरकर रखा गुर्दे के विभिन्न खंडों नेफ्रॉन की आकृति विज्ञान की व्यवहार्यता और संचरण इलेक्ट्रॉन micrographs के रूप में कार्य माप छिड़काव के 1 घंटे के बाद तय की।

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Protocol

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इस पांडुलिपि में वर्णित सभी जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं स्विस कानून के अनुसार और ज्यूरिख, स्विट्जरलैंड के केंटन के पशु चिकित्सा प्रशासन ने मंजूरी दे दी आयोजित की गई।

1. बफर तैयारी

  1. 4 और antidiuretic हार्मोन (ADH) समाधान (तालिका 1) - समाधान 1 तैयार करें।
  2. डायलिसिस बफर (तालिका 1) तैयार करें।
    नोट: यह छिड़काव के दौरान डायलिसिस बफर के रूप में इस्तेमाल किया बफर है। बाद में, एरिथ्रोसाइट्स अंतिम perfusate के लिए फार्म इस बफर में पतला हो जाएगा।
  3. एरिथ्रोसाइट तैयारी।
    1. मानव एरिथ्रोसाइट ध्यान केंद्रित डायलिसिस बफर के साथ 500 मिलीलीटर (स्थानीय ब्लड बैंक से प्राप्त सामग्री का परीक्षण) के 250 मिलीलीटर पतला। 8 मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र। बफर निकालें, किसी भी एरिथ्रोसाइट्स को दूर करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है। 3x दोहराएँ।
  4. बफर; एल्बुमिन (बीएसए गोजातीय सीरम albumin) तैयार करें।
    1. dialysi की 200 मिलीलीटर मेंबफर, एक हलचल पट्टी का उपयोग बीएसए की 44 ग्राम भंग। फिल्टर पेपर के साथ समाधान फ़िल्टर।
  5. perfusate तैयार करें।
    1. बीएसए बफर में फिल्टर पेपर के माध्यम से कदम 1.3.1 से एरिथ्रोसाइट्स फ़िल्टर। डायलिसिस बफर के साथ 800 मिलीलीटर की कुल मात्रा को भरें।
      नोट: यह अंतिम perfusate है। hematocrit अब 8 और 12% के बीच होना चाहिए। perfusate 12 घंटा के लिए ऊपर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए भंडारित किया जा सकता है।

2. शुरुआत डायलिसिस और oxygenation

  1. बड़ा बफर जलाशय, छोटे बफर जलाशय, और नम कक्ष (एक छोटी सी, डबल घिरी चैम्बर 37 डिग्री सेल्सियस और 100% नमी के लिए लाया बाद में गुर्दे की पकड़ के लिए) 37 डिग्री सेल्सियस के आसपास के पानी से स्नान चालू करें (चित्रा 2)
  2. डायलिसिस बफर के साथ बड़ा बफर जलाशय और perfusate के साथ छोटे जलाशय भरें।
  3. डायलिसिस बफर करने के लिए 5% सीओ को चालू 2/95% 2 हे गैस प्रवाह।
  4. डायलिसिस बफर के खिलाफ perfusate के निरंतर डायलिसिस पर स्विच। कम प्रवाह डायलिसिस ट्यूबिंग का उपयोग करने के लिए ध्यान रखना। 3 कदम आगे बढ़ना।

चित्र 2
चित्रा 2: छिड़काव सर्किट के योजनाबद्ध ड्राइंग। योजना छिड़काव सर्किट के मुख्य घटक और बफर प्रवाह की दिशा दिखाता है। गहरे नीले रंग से घिरे सभी घटकों एक पानी के स्नान / थर्मोस्टेट के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। 1: कम से कम 3 बार छिड़काव बफर की मात्रा का डायलिसिस बफर लगातार 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ bubbled है। 2: डायलिसिस बफर और छिड़काव बफर लगातार एक रोलर पंप से एक डायलिसिस ट्यूब में एक दूसरे के खिलाफ dialyzed रहे हैं। 3: कारण इस डायलिसिस के लिए, छिड़काव बफर 9% ओ के साथ समृद्ध है 2/5% सीओ 2 और इलेक्ट्रोलाइट स्तर रखा जाता निरंतर throughoकेन्द्र शासित प्रदेशों के छिड़काव। 4: एक रोलर पंप गुर्दे की ओर छिड़काव बफर आगे बढाती है। 5: एक windkessel क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला लहरों को निकालता है और एक बुलबुला जाल के रूप में कार्य करता है। 6: दबाव ट्रांसड्यूसर (4 (रोलर पंप जुड़े), जबकि स्वतंत्र रूप से बारी प्रवाह की अनुमति निरंतर दबाव बनाए रखने के लिए)। 7: छिड़काव के दौरान, गुर्दे की 100% हवा में नमी और 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान गुर्दे के लिए एक नम चैम्बर में बनी हुई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. सर्जिकल प्रक्रिया भाग 1 (सभी संयुक्ताक्षर का एक चित्र के लिए, चित्रा 3 देखें)

नोट: 5-0 शल्य धागे का उपयोग सभी संयुक्ताक्षर प्रदर्शन करना।

  1. intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा एक माउस (शरीर के वजन, 20 मिलीग्राम / एमएल ketamine और 1 मिलीग्राम / एमएल xylazine 0.9% सोडियम क्लोराइड में भंग के 10 μl / छ) anesthetize। anesth की पर्याप्त गहराई की पुष्टिरियर पैर सजगता के अभाव के लिए परीक्षण द्वारा Esia।
  2. नम कक्ष में एक लापरवाह स्थिति में माउस को ठीक करें। पशु चिकित्सक मरहम के साथ आंखों की रक्षा। काठ जहाजों तरक्की के लिए रीढ़ की हड्डी के नीचे एक 1 मिलीलीटर सिरिंज रखें।
  3. उरोस्थि उद्घाटन पहले त्वचा है, तो पेट की मांसपेशियों, कैंची के साथ करने के लिए जघन शिखा से एक मंझला laparotomy प्रदर्शन करना।
  4. आंत निकालें और पेट से माउस पार्श्व के बाईं ओर पर जगह है।
  5. संयोजी ऊतक से मूत्राशय को नि: शुल्क और दोनों मूत्रवाहिनी और मूत्रमार्ग का पता लगाएं।
  6. बाएं मूत्रवाहिनी (संयुक्ताक्षर मैं) के चारों ओर एक संयुक्ताक्षर रखें। बंद करो।
  7. मूत्रमार्ग (संयुक्ताक्षर द्वितीय) के चारों ओर एक संयुक्ताक्षर रखें। बंद करो।
  8. एक "कमंद" पूरे मूत्राशय (संयुक्ताक्षर तृतीय) के आसपास संयुक्ताक्षर रखें।
  9. मूत्राशय काटकर अलग कर देना 1 मिमी।
  10. साथ 2 सेमी पीई 50 ट्यूबिंग उद्घाटन Cannulate।
  11. बंद ट्यूबिंग के आसपास संयुक्ताक्षर तृतीय।
  12. संयुक्ताक्षर से छोड़ दिया मूत्रवाहिनी और मूत्रमार्ग बाहर का कट। bladder अब सही मूत्रवाहिनी से जुड़ा हुआ है और केवल स्वतंत्र रूप से घूम रहा है।
  13. संयोजी ऊतक और वसा के उदर महाधमनी साफ़ करें।
  14. एक उदर मध्य महाधमनी संयुक्ताक्षर (संयुक्ताक्षर चतुर्थ) रखें।
  15. बेहतर mesenteric धमनी और सीलिएक ट्रंक (संयुक्ताक्षर वी) के बीच डायाफ्राम के नीचे महाधमनी के चारों ओर एक संयुक्ताक्षर रखें।
  16. बेहतर mesenteric धमनी (संयुक्ताक्षर छठी) के चारों ओर एक संयुक्ताक्षर रखें।
  17. एक महाधमनी संयुक्ताक्षर सीधे ठीक नीचे और बाएं गुर्दे धमनी (संयुक्ताक्षर सप्तम) के ऊपर रखें।
  18. दुम नस पैकेज (कावा) (संयुक्ताक्षर आठवीं) के चारों ओर एक संयुक्ताक्षर रखें। चरण 4 पर आगे बढ़ें।

चित्र तीन
चित्रा 3: सर्जरी के दौरान रखा Ligatures की योजनाबद्ध ड्राइंग। laparotomy के बाद खुला पेट के देखें। आंत बाईं ओर बाहर ले जाया जाता है। एल और आर छोड़ दिया और सही गुर्दे संकेत मिलता है।काले लाइनों संबंधित संयुक्ताक्षर के क्षेत्र दिखा। Ligatures पहले रखा जाता है और फिर बंद कर दिया, पाठ में दिया अनुक्रम में। एक्स महाधमनी केन्युलेशन के लिए चीरा के स्थान के निशान। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. छिड़काव सर्किट की भड़काना

  1. रोटरी पंप शुरू और perfusate साथ ट्यूबिंग भरें। इसमें से सभी हवाई बुलबुले को खाली करने के लिए ध्यान रखना।
  2. perfusate के साथ लगभग मध्य स्तर के लिए windkessel डिवाइस भरें।
  3. 0 मिमी पारा करने के लिए दबाव transducer जांचना जब सभी ट्यूबिंग भर जाता है और प्रवाह 0. इस समय के दौरान गुर्दे स्तर पर छिड़काव सुई रखना है।
  4. एक निरंतर न्यूनतम स्तर (0.6 मिलीग्राम / मिनट) में प्रवाह बनाए रखने और चरण 5 पर आगे बढ़ें।

5. सर्जिकल प्रक्रिया भाग 2

  1. संयुक्ताक्षर चतुर्थ और छोड़ दिया रेना की शाखाओं के बीच एक क्लैंप रखेंएल धमनी।
  2. संयुक्ताक्षर चतुर्थ के महाधमनी दुम में एक छोटा सा चीरा, देखभाल करने के पृष्ठीय दीवार में कटौती नहीं करने के लिए।
  3. एक पोत फैलनेवाली साथ महाधमनी में खोलने चौड़ा करना।
  4. एक सुई के साथ महाधमनी Cannulate (2 सेमी लंबा, पीई 50 खींचा), बस दबाना को टिप धक्का।
  5. दबाना खोलें।
  6. जब तक यह सही गुर्दे धमनी और महाधमनी के जंक्शन तक पहुँचता है सुई की नोक cranially पुश।
  7. बंद संयुक्ताक्षर सातवीं।
  8. बंद संयुक्ताक्षर चतुर्थ।
  9. डायाफ्राम विदारक द्वारा कैंची से छाती खोलें। किसी कट के साथ, महाधमनी, रग कावा, दिल और वनस्पति नसों अलग। इस कदम के साथ, पशु निरंतर गहरी संज्ञाहरण के तहत तेजी से exsanguination के माध्यम से बलिदान है।
  10. छिड़काव पंप के दबाव पर नियंत्रण करना शुरू करें। 80 और 100 एमएमएचजी के बीच का मतलब दबाव बनाए रखें।
  11. बंद संयुक्ताक्षर वी
  12. बंद संयुक्ताक्षर छठी।
  13. बंद संयुक्ताक्षर आठवीं।
  14. फ्री संयोजी Tissu से सही गुर्दाई और कैंची के साथ वसा कैप्सूल में अपनी एम्बेडिंग।
  15. महाधमनी proximally कट वी संयुक्ताक्षर के लिए
  16. बेहतर mesenteric धमनी distally कट छठी संयुक्ताक्षर करने के लिए।
  17. गुर्दे के समर्थन पोत बंडल बाहर कट, देखभाल करने के लिए खुद को वाहिकाओं में कटौती नहीं करने के लिए।
  18. गुर्दे के लिए कनेक्शन पर जिगर में कटौती। गुर्दे को मुक्त करने के लिए ध्यान रखना है, लेकिन यह करने के लिए जिगर पक्षपाती का एक छोटा सा हिस्सा छोड़ देते हैं, तो यह है कि रग कावा यह द्वारा खुला रखा है।
  19. माउस से बाहर गुर्दे बंडल ले लो। नम कक्ष से माउस निकालें।
  20. एक "कमंद" जिगर और गुर्दे (संयुक्ताक्षर IX) के कनेक्शन के आसपास संयुक्ताक्षर रखें।
  21. एक शिरापरक लाइन (2 सेमी पीई 50) के साथ रग कावा Cannulate।
  22. बंद संयुक्ताक्षर नौवीं। शिरापरक लाइन के माध्यम से शिरापरक बहिर्वाह तुरंत शुरू कर देना चाहिए।
  23. नम चैम्बर बंद।

6. डाउनस्ट्रीम विश्लेषण

  1. निम्नलिखित घंटे के दौरान लगातार रक्त प्रवाह और intravascul की निगरानीगिरफ्तारी के दबाव में 15। शिरापरक बहिर्वाह, जिनमें से विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, गुर्दे रेनिन रिहाई 7 लीजिए। इलेक्ट्रोलाइट एकाग्रता और glomerular निस्पंदन दर 14 के विश्लेषण के लिए मूत्र लीजिए। छिड़काव के 1 घंटे के बाद, गुर्दे पश्चिमी सोख्ता के लिए स्नैप-जमे हुए किया जा सकता है या इमेजिंग के लिए तय किया जा 16 दृष्टिकोण।

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Representative Results

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साथ विधि का वर्णन किया, पृथक माउस गुर्दे में कम से कम 1 घंटे के लिए व्यवहार्य रह सकते हैं। हम कार्यात्मक (गुर्दे रक्त प्रवाह और संवहनी प्रतिरोध, शिरापरक बहिर्वाह, glomerular निस्पंदन दर, मूत्र आंशिक ना + और कश्मीर + उत्सर्जन के रक्त गैस विश्लेषण, और मूत्र परासरणीयता) और रूपात्मक (संचरण इलेक्ट्रॉन के साथ निरंतर छिड़काव के 1 घंटे के बाद ऊतक व्यवहार्यता का परीक्षण किया माइक्रोस्कोपी, मंदिर) wildtype C57BL / 6 चूहों के चार गुर्दे में तरीकों। इसके अतिरिक्त, विभिन्न खंडों छोटी नली के शिखर मार्कर प्रोटीन के पश्चिमी blots प्रदर्शन किया गया है, एक ही पशुओं के unperfused गुर्दे के लिए पृथक perfused गुर्दे की तुलना। सभी प्रयोगों में, लगातार दबाव छिड़काव इस्तेमाल किया गया था, 100 एमएमएचजी (चित्रा 4) ~ पर छिड़काव दबाव रखते हुए। उन गुर्दे में, perfusate प्रवाह और संवहनी प्रतिरोध पर 15.6 ± 0.4 मिलीग्राम / मिनट * गुर्दे वजन और 3 जी की 55 मिनट की एक समय पर स्थिर बने रहे5 ± 1.0 एमएमएचजी * न्यूनतम / मिलीलीटर, क्रमशः (चित्रा 4 ए)। perfusate प्रवाह या संवहनी प्रतिरोध में वृद्धि की कमी ऊतक व्यवहार्यता कम और देखभाल के साथ छिड़काव के दौरान निगरानी की जानी चाहिए के संबंध के साथ एक संवेदनशील पैरामीटर है। ब्लड गैस और 100 μl छिड़काव की शुरुआत के बाद 60 मिनट के लिए गए नमूनों में इलेक्ट्रोलाइट विश्लेषण, गुर्दे सीओ 2 उत्पादन और ओ 2 की खपत का पता चला जब धमनी प्रवाह शिरापरक बहिर्वाह (तालिका 2) की तुलना में था। अन्य मानकों धमनी और शिरा (तालिका 2) के बीच अपरिवर्तित रहे। विशेष जोर अनछुए शिरापरक पोटेशियम रिहाई पर रखा जाना चाहिए, के रूप में वृद्धि ऊतकों को नुकसान दौरान हो सकता है। Glomerular निस्पंदन दर, FITC-Inulin क्लीयरेंस 14 के माध्यम से मूल्यांकन, समय के साथ वृद्धि करने के लिए (चित्रा 4 बी) हो जाती थी लेकिन इस प्रवृत्ति को महत्व नहीं पहुँचा। सोडियम और पोटेशियम का आंशिक उत्सर्जन छिड़काव के 55 मिनट के बाद का मूल्यांकनइन विवो स्थिति (चित्रा 4 सी) की तुलना में वृद्धि हुई है। मूत्र परासरणीयता (चित्रा 4 डी) छिड़काव के 55 मिनट के बाद शिरापरक बहिर्वाह की परासरणीयता ऊपर ऊंचा नहीं है।

रूपात्मक अध्ययन के लिए, गुर्दे के रूप में पहले 17 में वर्णित डायलिसिस बफर में 3% paraformaldehyde में छिड़काव और 0.1% glutaraldehyde के बाद तय किया गया। गुर्दे फैटी मंदिर के साथ मूल्यांकन किया गया था। समीपस्थ नलिकाओं के केशिकागुच्छ और एस 1 खंडों छिड़काव (आंकड़े 5 ए और बी) के बाद काफी हद तक अनछुए दिखाई दिया। कुछ है, लेकिन नहीं समीपस्थ नलिकाओं के सभी एस 2 / S3 खंडों और मोटी आरोही अंग कि संवहनी बंडलों को बंद नहीं कर रहे थे अंग क्षति के लक्षण के रूप में चूहे पृथक perfused गुर्दे 5 में पहले से वर्णित दिखा रहे थे (आंकड़े 5 सी और डी)। पास भी निरीक्षण पर, दूरस्थ कुंडलित नलिकाओं और एकत्रित नलिकाओं नेक्रोसिस के स्पष्ट संकेत नहीं दिखा था (आंकड़े 5 ई, एफ और जी)। अंत में, माउस गुर्दे में रूपात्मक निष्कर्षों स्थिति चूहे पृथक perfused गुर्दे 5 में पाया दर्पण।

(छिड़काव की शुरुआत से पहले स्नैप-फ्रोजन) महत्वपूर्ण परिवर्तन का खुलासा नहीं किया पृथक perfused गुर्दे में विभिन्न खंडों नेफ्रॉन के शिखर मार्कर प्रोटीन के पश्चिमी blots ही पशु की unperfused contralateral गुर्दे की तुलना में (छिड़काव के 1 घंटे के बाद स्नैप-फ्रोजन)। हम Näpi-आईआईए (समीपस्थ नलिकाओं में स्थित), NKCC2 (मोटी आरोही अंग), एनसीसी (दूरस्थ कुंडलित नलिकाओं), और ENaC अध्ययन (जोड़ने वाली नलिकाओं / नलिकाओं संग्रह) (आंकड़े 6 ए और बी)।

चित्रा 4
चित्रा 4: 55 मिनट तक भरकर गुर्दे के कार्यात्मक व्यवहार्यता का आकलन। ए) </ Strong> लगातार दबाव छिड़काव, संवहनी प्रतिरोध और perfusate प्रवाह के दौरान 55 मिनट के लिए स्थिर बने रहे। पहले 15 मिनट के उच्च परिवर्तनशीलता हमेशा इस समय के दौरान देखा की वजह से बाहर रखा गया है। बी) Glomerular निस्पंदन दर 25 और 55 मिनट के बाद मूल्यांकन चार गुर्दे की (FITC-Inulin) समय के साथ मामूली नहीं बल्कि उल्लेखनीय वृद्धि का प्रदर्शन किया। सी) सोडियम और पोटेशियम का आंशिक उत्सर्जन छिड़काव के 55 मिनट के बाद आकलन किया। डी) शिरापरक प्लाज्मा और मूत्र छिड़काव के 55 मिनट के बाद परासरणीयता। एन = 4 सभी प्रयोगों में। डेटा प्रस्तुत कर रहे हैं इसका मतलब है के रूप में ± SEM। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। डी के प्रतिनिधि आकृति विज्ञान 1 घंटा की एक अंत बिंदु पर perfused गुर्दे की ifferent नेफ्रॉन खंडों। ए) केशिकागुच्छ बरकरार हैं। एक glomerulus में एक podocyte का विस्तार। एक समीपस्थ छोटी नली के बी) एस 1 खंड। एस 1 खंडों बरकरार हैं। एक समीपस्थ छोटी नली की सी) एस 2 / S3 खंड। कुछ है, लेकिन नहीं समीपस्थ नलिकाओं के सभी एस 2 / S3 खंडों अत्यधिक परिगलित कर रहे हैं। कोशिकाओं में सूजन दिखाई देते हैं और बड़े intracellular नुकसान दिखा। ट्यूबलर रूपरेखा केवल तहखाने झिल्ली द्वारा बनाए रखा है। डी) मोटी आरोही अंग (ताल)। उन TALs कि संवहनी बंडलों से दूर हैं जल का अध: पतन का पहला लक्षण दिखा। Luminal झिल्ली पतला और कमजोर दिखाई देते हैं। ई) दूरस्थ कुंडलित छोटी नली (डीसीटी)। DCTs बरकरार हैं। एफ) एक डीसीटी सेल के basolateral infoldings का विस्तार। गवाक्षित endothelium, तहखाने झिल्ली, basolateral infoldings, और माइटोकॉन्ड्रिया बरकरार हैं। जी) एकत्रित वाहिनी (सीडी)। सीडी बरकरार हैं।e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: पृथक perfused गुर्दे में शिखर मार्कर प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा एक ही जानवरों से Unperfused गुर्दे की तुलना में। ए) गुर्दे की पश्चिमी blots 1 घंटा और unperfused गुर्दे तक भरकर रखा। Näpi-IIa समीपस्थ छोटी नली के लिए प्रतिनिधि है। NKCC2 मोटी आरोही अंग के लिए प्रतिनिधि है। एनसीसी और एनसीसी threonine 53 (pT53 एनसीसी) में phosphorylated विशेष रूप से बाहर का जटिल छोटी नली में पाए जाते हैं। अपनी पूरी लंबाई में ENaC और उनके संबंधित proteolytically cleaved उत्पादों की अल्फा और गामा सब यूनिटों को जोड़ने छोटी नली / संग्रहण नलिका के लिए प्रतिनिधि दिखाए जाते हैं। बी) ए की मात्रा) के बीच गुर्दे भरकर रखा च महत्वपूर्ण अंतर का खुलासा नहीं कियाया 1 घंटा और unperfused गुर्दे। एन = 3 सभी प्रयोगों में। डेटा प्रस्तुत कर रहे हैं ± SEM मतलब है और व्यक्तिगत मूल्यों को दिखाया जाता है के रूप में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: समाधान और डायलिसिस बफर की संरचना है। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सारणी 2
तालिका 2: रक्त गैस और धमनी प्रवाह इलेक्ट्रोलाइट विश्लेषण और छिड़काव के शुरू होने के बाद perfused माउस गुर्दे 60 मिनट की शिरापरक बहिर्वाह (एन = 4)। डेटा प्रस्तुत कर रहे हैं ± मतलब है के रूप मेंSEM।

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Discussion

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माउस भरकर रखा गुर्दे पृथक 1 घंटे के लिए एक नियंत्रित वातावरण पूर्व vivo में गुर्दे समारोह के अध्ययन बरकरार पशुओं में इन विवो प्रयोगों, जो कई प्रणालीगत कारकों के प्रभाव से त्रुटिपूर्ण हो सकता है के बीच अंतर को पूरा करने के लिए एक उपकरण है, और इन विट्रो प्रयोगों में पृथक नेफ्रॉन खंडों या संवर्धित कोशिकाओं है, जो जरूरी समारोह पर बरकरार अंग संरचना का प्रभाव उपेक्षा। वहाँ, 'लेखक ज्ञान के लिए, कोई वैकल्पिक तकनीक के साथ जो इस विशिष्ट कार्य करने के लिए किया जाता है। गुर्दे ऊतक पर जैव रासायनिक अध्ययन, हालांकि, गुर्दे की स्लाइस 17 का उपयोग कर एक बहुत सरल फैशन में किया जा सकता है। जबकि प्रस्तुत तकनीक वर्तमान में ज्यादातर प्रयोग किया जाता है गुर्दे शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन करने के लिए, कई नए अनुप्रयोगों पर चर्चा की जा रही है। उदाहरण के लिए, यह छिड़काव decellularization और Recellularization 12 के दौरान गुर्दे bioengineering के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, पूर्व गुर्दे के लंबे समय तक normothermic छिड़काव tr के लिएansplantation, विरोधी अस्वीकृति या जीनोम संपादन perfusate में दवाओं का अध्ययन किया जा रहा है की उच्च खुराक के प्रशासन के साथ; यहां तक कि नैदानिक सेटिंग 8, 9, 10, 11 में। माउस पृथक perfused गुर्दा एक उत्कृष्ट उपकरण है कि इन अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से पीटकर मॉडल के साथ अलग-अलग जीन की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए है।

तीन चरणों का एक सफल प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस पत्र साधन प्रक्रिया पुन: पेश करने के साथ रुचि रखते प्रयोगशालाओं प्रदान करता है। सबसे पहले, बफर इस तरह है कि गुर्दे की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की शर्तों के तहत लंबे समय तक व्यवहार्यता के लिए आवश्यक पोषक तत्वों की सबसे प्राप्त करने में तैयार होने की जरूरत है। एक संतुलन पूरी तरह से नियंत्रित परिस्थितियों (सिंथेटिक बफर) और एक देशी छिड़काव हालत (पूरे रक्त) के बीच पाया जाना चाहिए। इसलिए, एल्बुमिन और 10% की एक hematocrit को स्तनधारी एरिथ्रोसाइट्स शामिल किया जाना है। इस hematocrit 'लेखक अनुभव में, का प्रतिनिधित्व करता है, पर्याप्त टी के बीच सबसे अच्छा समझौताइस मुद्दे को ऑक्सीजन और कम बफर चिपचिपापन (बढ़ती hematocrit दबाव लगातार छिड़काव के दौरान नाटकीय रूप से प्रवाह कम हो जाती (एरिथ्रोसाइट्स 18 बिना भरकर रखा गुर्दे में मूल्यों के लिए इस अखबार में प्रस्तुत मूल्यों की तुलना))। गुणवत्ता और एरिथ्रोसाइट्स की ताजगी महत्वपूर्ण है। वाशिंग चरणों के दौरान, एरिथ्रोसाइट्स hemolysis को रोकने के लिए सावधानी से नियंत्रित किए जाने की जरूरत है। बफर प्रयोग के दिन पर हौसले से तैयार होने की जरूरत है। दूसरा, सर्जरी कम से कम समय के भीतर एक प्रशिक्षित सर्जन द्वारा किया जाना चाहिए। सर्जन, शरीर के बाकी हिस्सों से जोड़ने वाली मुख्य गुर्दे जहाजों लगभग 6 संयुक्ताक्षर प्रदर्शन करने के लिए, जबकि एक न्यूनतम करने के लिए जानवर के खून की कमी रखने की जरूरत है। इष्टतम परिणामों के लिए, शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप 30 मिनट के भीतर पूरा किया जाना चाहिए। जानवर की मतलब धमनी रक्तचाप, बूँदें संज्ञाहरण के लिए लंबे समय तक सर्जरी के दौरान या कारण हैं, तो 60 एमएमएचजी नीचे, गुर्दे छिड़काव पहले से ही कम हो जाएगा और ऊतकों का खतरा हो जाएगागल जाना है। इस नियम से बाहर करने के लिए, बायां गुर्दा, सर्जरी के बाद लिया जा सकता है जब सही गुर्दे का छिड़काव शुरू हो चुकी है, और एक अनुपचारित नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया। तीसरा, छिड़काव छिड़काव तंत्र के सही कार्य, एक मानक छोटे पशु-छिड़काव सर्किट से मिलकर के समय के दौरान, यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए। कंप्यूटर अपने आप में छिड़काव करता है, वहीं मानव पर्यवेक्षण उदाहरण के छिड़काव सर्किट में बुलबुले के लिए जाँच करने के लिए आवश्यक है।

प्रदान की प्रतिनिधि डेटा पूर्व vivo छिड़काव के 1 घंटा और दृष्टिकोण के साथ साथ वर्णित करने के लिए इस विधि के किसी भी निष्पादन के तकनीकी सफलता की तुलना के बाद गुर्दे की व्यवहार्यता का आकलन के लिए अनुमति देता है। कम से कम 1 घंटा, गुर्दे रक्त प्रवाह, संवहनी प्रतिरोध के दौरान शिरापरक बहिर्वाह और glomerular निस्पंदन दर के रक्त गैसों स्थिर रहना चाहिए।

वहाँ तकनीक, एक मन में रखने के लिए है जो करने के लिए कुछ सीमाएं हैं। यहां तक ​​कि एक Kiसबसे सफल सर्जरी से जारी dney केवल एक सीमित समय के लिए व्यवहार्य रह सकते हैं। लेखकों 1 घंटा पाया, जिस पर छिड़काव को रोकने के लिए सबसे अच्छा समय बिंदु हो सकता है। इसके अतिरिक्त, जबकि पृथक गुर्दे का छिड़काव गहराई में पृथक पूरे अंग के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, यह मुश्किल से एक प्रकार की कोशिका पर विशेष प्रभाव को अलग करने के लिए है। 1 घंटे के बाद तय गुर्दे समीपस्थ नलिकाओं और मोटी आरोही अंग की कोशिकाओं के S3 खंडों में दोष दिखाई दे सकते हैं, जबकि केशिकागुच्छ, एस 1 खंडों, DCTs, और सीडी बरकरार रहना चाहिए। एरिथ्रोसाइट्स की अनिवार्य उपयोग करते हैं, विशेष रूप से मनुष्यों से भी प्रयोगकर्ता के लिए संभावित खतरों (जैसे, संक्रमण) से जुड़ा हुआ है।

सारांश में, माउस पृथक perfused गुर्दे के साथ जो पूरे अंग पूर्व vivo अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है। किसी भी तकनीक की तरह, यह कुछ फायदे और सीमाएं हैं। लेखक का मानना ​​है कि दोनों कई गुना नए अनुप्रयोगों वर्तमान में उत्पन्न होने वाले हैं और इस प्रोटोकॉल sufficien प्रदान कर सकता हैअन्य प्रयोगशालाओं के लिए टी गति इस प्रयास को पुन: पेश।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2901
Cannular with basket and side port Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2947
Thermostat TC120-ST5  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3436
Pressure Transducer APT300  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3862
TAM-D Plugsys Transducer Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-1793
SCP Plugsys servo controller Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2806
Windkessel  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3717
HSE-USB data acquisition Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone B.Braun 7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/8
Name Company Catalog Number Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10% B.Braun 134518064
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt Sigma-Aldrich M1125-25G
Sodium-L-Lactate Sigma-Aldrich L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt Sigma-Aldrich K1875-25G
NaCl Sigma-Aldrich 31434-1KG-R
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761-5KG
KCl Sigma-Aldrich 60130-1KG
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Creatinine Sigma-Aldrich C4255-10G
Ampicillin Roche 10835242001
MgCl2 * 6H2O Sigma-Aldrich M2393-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 * 6H2 Riedel-de-Haën 12074
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-500G
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP Sigma-Aldrich V2013-1MG
FITC-Inulin Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration Macherey-Nagel MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM FEI

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References

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माउस पृथक perfused किडनी तकनीक
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Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).More

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).

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