Summary
Musen isolert perfusert nyre (MIPK) er en teknikk for å holde en mus nyre i henhold til ex vivo betingelser perfuserte og funksjonelle i 1 time. De buffere og kirurgisk teknikk som er beskrevet i detalj.
Abstract
Musen isolert perfusert nyre (MIPK) er en teknikk for å holde en mus nyre i henhold til ex vivo betingelser perfuserte og funksjonelle i 1 time. Dette er en forutsetning for å studere fysiologi av isolerte organ og for mange innovative applikasjoner som kan være mulig i fremtiden, inkludert perfusjon decellularization for nyre bioteknologi eller administrasjon av anti-avvisning eller genom-redigering narkotika i høye doser til prime nyrene for transplantasjon. I løpet av tiden for perfusjon, kan nyren manipuleres, nyrefunksjonen kan bli vurdert, og forskjellige legemidler administreres. Etter prosedyren kan bli transplantert nyre eller behandles for molekylær biologi, biokjemiske analyser, eller mikroskopi.
Dette notatet beskriver perfusatet og den kirurgiske teknikken som trengs for ex vivo perfusjon av mus nyrer. Detaljer av perfusjon anordningen har fått, og data er presentert som viser viability av nyre forberedelse: renal blodgjennomstrømning, vaskulær motstand, og urin data som funksjonelle, transmisjons- elektronmikroskopi forskjellige nevronet segmenter som morfologiske avlesninger, og vestlige blotter av transportproteiner i forskjellige nevronet segmenter som molekylær avlesning.
Introduction
Den isolerte perfusjon av organer har vært gjenstand for et pågående arbeid blant fysiologer i mange tiår 1. Teknikken muliggjør funksjon av organet, uten systemiske påvirkning, slik som blodtrykk, hormoner, eller nerver, for å bli undersøkt. Carl Eduard Loebell er ansett for å være de første som har beskrives den vellykkede perfusjon av en isolert nyre, i 1849 2. Siden den gang har perfusjon apparat gjennomgått en betydelig forbedring. Frey og Gruber innført en kunstig lunge for oksygene og pulsatile pumper for kontinuerlig perfusjon to. Mens tidlige forskere hovedsakelig studert nyrene av store pattedyr-nemlig griser 2 og hunder 3 -den første rapport om bruk av rotte nyrer, etter Weiss et al. , Var en milepæl i studiet av små pattedyr-organ perfusjon 4. Schurek et al. rapportert nødvendigheten av å legge pattedyr erytrocytter til perfusatet hvis tilstrekkelig renal tubulæroksygene skulle oppnås 5. Kritisk for langvarige forsøk var innføringen av kontinuerlig dialyse av bufferen ved den samme forskningsgruppe 6. I 2003 Schweda et al. var den første til å rapportere en funksjonell mus isolert dynket nyre (MIPK) 7, senere videreutviklet av Rahgozar et al. 18 og Lindell et al. 14.
Selv om det teknisk mer utfordrende enn det isolerte perfuserte rottenyre, bruken av MIPK bærer fordelen av å muliggjøre bruk av et bredt spekter av genetisk forandret mus. Dette notatet presenterer detaljene forfatternes metode for perfusert isolerte mus nyrer for en time. Metoden gjør det mulig for en kontinuerlig vurdering av nyrestrømningshastighet, vaskulær motstand, hormon utgivelse, blodgassanalyse, urin analyse, og bruk av narkotika. Ved å følge fremgangsmåten, kan nyrer bli behandlet for molekylære og biokjemiske analyser, bli løst for mikroskopi, ellertransplantert inn i en mottaker mus (figur 1).
Figur 1: Oversikt over Mulig Input / Output til isolerte perfuserte Nyre. BGA: Blod gass analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Denne teknikken sannsynlig vil få økt oppmerksomhet i årene som kommer, så mange innovative applikasjoner blir diskutert med begynnelsen av langvarig normotermisk nyre perfusjon før transplantasjonen (med eller uten bruk av anti-avvisning eller genom-redigering narkotika) 8, 9, 10 , 11, bioteknologi av hele nyrer fra decellularized stillaser 12, og bruk av høye doser av fluorescerende fargestoffer for multiphoton bildebehandling 13 </sup>. Det er også en ideell modell som å studere rollen av spesifikke gener under akutt nyreskade 14.
En trinn-for-trinn-protokoll er gitt for å tillate andre laboratorier for å utføre isolerte mus nyre perfusjon med hell. Først blir sammensetningen og fremstillingen av bufferen angitt. Deretter blir den operasjon som er beskrevet i detalj, og de kritiske trinn er vist. For det tredje, data blir presentert som er representative for en vellykket fremstilling: renal blodstrøm, vaskulær motstand, glomerulær filtreringshastighet, og fraksjonelle elektrolyttutskillelse-alle som funksjonelle målinger av levedyktighet-og transmisjonselektronmikroskopibilder av morfologien av forskjellige nevronet segmenter av perfuserte nyrer fast etter en time av perfusjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Musen isolert perfundert nyre er et verktøy for å studere nyrefunksjonen i et kontrollert miljø ex vivo i 1 time, bygge bro over gapet mellom in vivo eksperimenter i intakte dyr, som kan være feil ved virkningen av en rekke systemiske faktorer, og in vitro-eksperimenter isolerte nevronet segmenter eller dyrkede celler, som nødvendigvis overse betydningen av intakt organ struktur på funksjon. Det er, for å forfatternes kunnskap, ikke noe alternativ teknikk som brukes til å utføre denne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Michèle Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and Jürg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research “Kidney.CH” and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.
Materials
| Perfusion Circuit: | |||
| Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
| Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
| Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
| ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 1L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 0.5L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
| Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
| TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
| SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
| Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
| HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
| Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
| PE-Tubing for aorta cannulation 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer reagents: | |||
| Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
| L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
| Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
| alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
| Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
| MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
| Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
| FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
| Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
| BGA Analysis: | |||
| ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
| Electron Microscope: | |||
| Philips CM100 TEM | FEI |
References
- Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81 (2112), 621-623 (1935).
- Skutul, K. . Über Durchströmungsapparate Pflüger’s Archiv. 123 (4-6), 249-273 (1908).
- Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).
- Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).
- Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).
- Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).
- Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).
- Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).
- Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).
- Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).
- Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19 (5), 646-651 (2013).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
- Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).
- Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger’s Archiv. , (2016).
- Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).
- Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).
