Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Musen isolerte perfuserte Nyre Technique

doi: 10.3791/54712 Published: November 17, 2016

Summary

Musen isolert perfusert nyre (MIPK) er en teknikk for å holde en mus nyre i henhold til ex vivo betingelser perfuserte og funksjonelle i 1 time. De buffere og kirurgisk teknikk som er beskrevet i detalj.

Abstract

Musen isolert perfusert nyre (MIPK) er en teknikk for å holde en mus nyre i henhold til ex vivo betingelser perfuserte og funksjonelle i 1 time. Dette er en forutsetning for å studere fysiologi av isolerte organ og for mange innovative applikasjoner som kan være mulig i fremtiden, inkludert perfusjon decellularization for nyre bioteknologi eller administrasjon av anti-avvisning eller genom-redigering narkotika i høye doser til prime nyrene for transplantasjon. I løpet av tiden for perfusjon, kan nyren manipuleres, nyrefunksjonen kan bli vurdert, og forskjellige legemidler administreres. Etter prosedyren kan bli transplantert nyre eller behandles for molekylær biologi, biokjemiske analyser, eller mikroskopi.

Dette notatet beskriver perfusatet og den kirurgiske teknikken som trengs for ex vivo perfusjon av mus nyrer. Detaljer av perfusjon anordningen har fått, og data er presentert som viser viability av nyre forberedelse: renal blodgjennomstrømning, vaskulær motstand, og urin data som funksjonelle, transmisjons- elektronmikroskopi forskjellige nevronet segmenter som morfologiske avlesninger, og vestlige blotter av transportproteiner i forskjellige nevronet segmenter som molekylær avlesning.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den isolerte perfusjon av organer har vært gjenstand for et pågående arbeid blant fysiologer i mange tiår 1. Teknikken muliggjør funksjon av organet, uten systemiske påvirkning, slik som blodtrykk, hormoner, eller nerver, for å bli undersøkt. Carl Eduard Loebell er ansett for å være de første som har beskrives den vellykkede perfusjon av en isolert nyre, i 1849 2. Siden den gang har perfusjon apparat gjennomgått en betydelig forbedring. Frey og Gruber innført en kunstig lunge for oksygene og pulsatile pumper for kontinuerlig perfusjon to. Mens tidlige forskere hovedsakelig studert nyrene av store pattedyr-nemlig griser 2 og hunder 3 -den første rapport om bruk av rotte nyrer, etter Weiss et al. , Var en milepæl i studiet av små pattedyr-organ perfusjon 4. Schurek et al. rapportert nødvendigheten av å legge pattedyr erytrocytter til perfusatet hvis tilstrekkelig renal tubulæroksygene skulle oppnås 5. Kritisk for langvarige forsøk var innføringen av kontinuerlig dialyse av bufferen ved den samme forskningsgruppe 6. I 2003 Schweda et al. var den første til å rapportere en funksjonell mus isolert dynket nyre (MIPK) 7, senere videreutviklet av Rahgozar et al. 18 og Lindell et al. 14.

Selv om det teknisk mer utfordrende enn det isolerte perfuserte rottenyre, bruken av MIPK bærer fordelen av å muliggjøre bruk av et bredt spekter av genetisk forandret mus. Dette notatet presenterer detaljene forfatternes metode for perfusert isolerte mus nyrer for en time. Metoden gjør det mulig for en kontinuerlig vurdering av nyrestrømningshastighet, vaskulær motstand, hormon utgivelse, blodgassanalyse, urin analyse, og bruk av narkotika. Ved å følge fremgangsmåten, kan nyrer bli behandlet for molekylære og biokjemiske analyser, bli løst for mikroskopi, ellertransplantert inn i en mottaker mus (figur 1).

Figur 1
Figur 1: Oversikt over Mulig Input / Output til isolerte perfuserte Nyre. BGA: Blod gass analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Denne teknikken sannsynlig vil få økt oppmerksomhet i årene som kommer, så mange innovative applikasjoner blir diskutert med begynnelsen av langvarig normotermisk nyre perfusjon før transplantasjonen (med eller uten bruk av anti-avvisning eller genom-redigering narkotika) 8, 9, 10 , 11, bioteknologi av hele nyrer fra decellularized stillaser 12, og bruk av høye doser av fluorescerende fargestoffer for multiphoton bildebehandling 13 14.

En trinn-for-trinn-protokoll er gitt for å tillate andre laboratorier for å utføre isolerte mus nyre perfusjon med hell. Først blir sammensetningen og fremstillingen av bufferen angitt. Deretter blir den operasjon som er beskrevet i detalj, og de kritiske trinn er vist. For det tredje, data blir presentert som er representative for en vellykket fremstilling: renal blodstrøm, vaskulær motstand, glomerulær filtreringshastighet, og fraksjonelle elektrolyttutskillelse-alle som funksjonelle målinger av levedyktighet-og transmisjonselektronmikroskopibilder av morfologien av forskjellige nevronet segmenter av perfuserte nyrer fast etter en time av perfusjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle prosedyrer som involverer dyr som er beskrevet i dette manuskriptet ble utført i henhold til sveitsisk lov og godkjent av veterinær administrasjon av kantonen Zürich, Sveits.

1. Buffer Klargjøring

  1. Forbered løsninger 1 - 4 og antidiuretisk hormon (ADH) løsning (tabell 1).
  2. Forbered dialyse buffer (tabell 1).
    MERK: Dette er den anvendte buffer som dialysebuffer under perfusjon. Senere vil erytrocyttene være fortynnet i denne buffer for å danne det endelige perfusatet.
  3. Erytrocytt forberedelse.
    1. Fortynn 250 ml human erytrocytt-konsentrat (testet materiale oppnådd fra den lokale blodbank) til 500 ml med dialysebuffer. Sentrifuger ved 2000 x g i 8 min. Fjern buffer, være forsiktig med å fjerne eventuelle erytrocytter. Gjenta 3x.
  4. Klargjør albumin (bovin serum albumin, BSA) buffer.
    1. I 200 ml dialysis buffer, oppløse 44 g av BSA ved å bruke en rørestav. Filtrer løsningen med filterpapir.
  5. Forbered perfusatet.
    1. Filter erytrocytter fra trinn 1.3.1 gjennom filter papir i BSA buffer. Fyll opp til et totalt volum på 800 ml med dialysebuffer.
      MERK: Dette er det siste perfusate. Hematokrit skal nå være mellom 8 og 12%. Perfusatet kan lagres i opp til 12 timer ved 4 ° C.

2. Starte Dialyse og Oxygenation

  1. Skru på vannbadet som omgir større bufferreservoaret, mindre bufferreservoaret, og det fuktige kammer (en liten, dobbeltvegget kammer bringes til 37 ° C og 100% fuktighet for senere å holde nyre) til 37 ° C (figur 2) .
  2. Fyll større bufferreservoaret med dialysebuffer og jo mindre reservoar med perfusatet.
  3. Slå på 5% CO 2/95% O 2 gass tilsig til dialyse buffer.
  4. Slå på kontinuerlig dialyse av perfusatet mot dialysebuffer. Pass på å bruke lav-flux dialyse tubing. Gå til trinn 3.

Figur 2
Figur 2: Skjematisk tegning av perfusjon Circuit. Reaksjonsskjema viser hovedkomponentene i perfusjon kretsen og retningen av bufferstrømmen. Alle komponenter som er omgitt av mørkeblå holdes ved 37 ° C med et vannbad / termostat. 1: Dialyse buffer på minst 3 ganger volumet av perfusjonen bufferen blir kontinuerlig gjennomboblet med 95% O2 / 5% CO2. 2: Dialyse buffer og perfusjon bufferen blir kontinuerlig dialysert mot hverandre i en dialyseslange med en rullepumpe. 3: På grunn av dette dialyse, er perfusjon buffer beriket med 9% O 2/5% CO 2 og elektrolyttnivået holdes konstant throughout perfusjon. 4: En valse pumpe driver perfusjon buffer mot nyre. 5: En windkessel fjerner peristaltiske bølger og fungerer som en boble felle. 6: Trykk sensorer (koblet til 4. (roller pumpe) for å holde kontinuerlig press, samtidig som fritt vekslende flyt). 7: Gjennom perfusjon, forblir nyre i et fuktig kammer for 100% luftfuktighet og 37 ° C nyre temperatur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. Kirurgisk prosedyre Del 1 (for et diagram av alle ligaturer, se Figur 3)

Merk: Utfør alle ligaturer som bruker 5-0 kirurgisk tråd.

  1. Bedøve en mus ved intraperitoneal injeksjon (10 ul / g kroppsvekt, 20 mg / ml ketamin og 1 mg / ml xylazin oppløst i 0,9% NaCl). Bekreft tilstrekkelig dybde på AnesthESIA ved å teste for fraværet av bakre fot på ballen.
  2. Fest mus i en liggende stilling i fuktig kammeret. Beskytt øynene med veterinær salve. Plasser en 1 ml sprøyte under ryggrad til å heve lumbale fartøy.
  3. Utfør en median laparotomi fra kjønnshår crest til sternum åpningen først huden, da magemusklene, med saks.
  4. Fjern tarmen og legg den på venstre side av musen lateral fra magen.
  5. Frigjør blæren fra bindevev og utforske begge urinlederne og urinrøret.
  6. Plasser en ligatur rundt venstre ureter (ligatur I). Lukk den.
  7. Plasser en ligatur rundt urinrøret (ligatur II). Lukk den.
  8. Plasser en "lasso" ligatur rundt hele blæren (ligatur III).
  9. Langsgående snitt i blære 1 mm.
  10. Cannulate åpningen med 2 cm PE 50 rør.
  11. Lukk ligatur III rundt slangen.
  12. Skjær venstre ureter og urinrør distal fra ligaturer. den bladder er nå festet til den høyre ureter eneste og fritt bevegelige.
  13. Tøm hovedpulsåren av bindevev og fett.
  14. Plasser en abdominal mid-aorta ligatur (ligatur IV).
  15. Plasser en ligatur rundt aorta under mellomgulvet mellom den overlegne mesenteric arterien og cøliaki bagasjerommet (ligatur V).
  16. Plasser en ligatur rundt den overlegne mesenteric arterie (ligatur VI).
  17. Plasser en aortic ligatur rett under høyre og over venstre nyrearterien (ligatur VII).
  18. Plasser en ligatur rundt halevenen pakken (cava) (ligatur VIII). Gå til trinn 4.

Figur 3
Figur 3: Skjematisk tegning av Liga plassert under operasjonen. Utsikt over den åpne magen etter laparotomi. Tarmen er flyttet ut til venstre. L og R angir venstre og høyre nyre. Desvarte linjer viser området av den respektive ligatur. Ligaturer blir først plassert og deretter lukket, i den rekkefølge som er gitt i teksten. X angir beliggenheten til snittet for aorta kanylering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

4. Grunning av Perfusjons Circuit

  1. Start roterende pumpe og fyll slangen med perfusate. Pass på å tømme alle luftbobler fra det.
  2. Fyll windkessel enheten til ca midten nivå med perfusate.
  3. Kalibrere trykkgiveren til 0 mm Hg når alle rør er fylt og flyt er 0. Hold perfusjon nålen på nyre nivå i løpet av denne tiden.
  4. Hold flyt på et konstant minimalt nivå (0,6 ml / min) og gå videre til trinn 5.

5. Kirurgisk prosedyre del 2

  1. Plasser en klemme mellom ligatur IV og forgrening av venstre renal arterie.
  2. Lag et lite snitt i aorta hale av ligaturen IV, ta vare å ikke kutte rygg veggen.
  3. Utvide åpningen i aorta med et fartøy dilator.
  4. Cannulate aorta med en nål (2 cm lang, trukket PE 50), presser spissen bare for å klemmen.
  5. Åpne klemmen.
  6. Presse tuppen av nålen kranialt til den når forbindelsen mellom høyre nyre arterien og aorta.
  7. Lukk ligatur VII.
  8. Lukk ligatur IV.
  9. Åpne brystet med saks ved dissekere mellomgulvet. Med et enkelt kutt, skiller aorta, vena cava, hjerte og vegetative nervene. Med dette trinn blir dyrene ofret via rask blodtapping under kontinuerlig dyp anestesi.
  10. Starttrykk kontroll av perfusjon pumpen. Opprettholde den midlere trykk mellom 80 og 100 mmHg.
  11. Lukk ligatur V.
  12. Lukk ligatur VI.
  13. Lukk ligatur VIII.
  14. Gratis høyre nyre fra binde tissue og dens forankring i det adipose kapsel med saks.
  15. Kutt aorta proksimalt til ligatur V.
  16. Skjær den overlegne mesenteric arterien distalt til ligatur VI.
  17. Kutt nyre bærende fartøy bundle ut, ta vare å ikke kutte i fartøyene selv.
  18. Kutt leveren ved tilkoblingen til nyrene. Vær nøye med å frigjøre nyrene, men la en liten del av leveren tilhenger til det, slik at vena cava holdes åpen av det.
  19. Ta nyre bunt ut av musen. Fjern musen fra fuktig kammer.
  20. Plasser en "Lasso« ligatur rundt tilkobling av lever og nyre (ligatur IX).
  21. Cannulate vena cava med et venekateter (2 cm PE 50).
  22. Lukk ligatur IX. Venøs utstrømning gjennom venekateter bør umiddelbart starte.
  23. Lukk fuktig kammeret.

6. Nedstrøms Analyser

  1. I løpet av neste time, kontinuerlig overvåke blodstrøm og intravascular press 15. Samle venøs utstrømning, som kan anvendes for analyse av, for eksempel, renal reninfrisetting 7. Samle urin for analyse av elektrolyttkonsentrasjon og glomerulær filtrasjonshastighet 14. Etter en time av perfusjon, nyrer kan snap-frosset for western blotting eller festes for bildebehandling nærmer 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med den fremgangsmåte som er beskrevet, kan isolerte mus nyrer forblir levedyktige i minst 1 time. Vi testet vev levedyktighet etter 1 time kontinuerlig perfusjon med funksjonell (renal blodstrøm og vaskulær motstand, blodgassanalyse av venøs utstrømming, glomerulusfiltrasjon, urin brøk Na + og K + utskillelse, og urin osmolalitet) og morfologiske (transmisjonselektron mikroskopi, TEM) metoder i fire nyrer av villtype C57BL / 6 mus. I tillegg ble western blot av apikale markørproteiner med forskjellige tubulære segmenter utført, sammenligner isolerte perfuserte nyrer til unperfused nyrene i de samme dyrene. I alle eksperimenter ble konstant trykk-perfusjon anvendes, holde perfusjonstrykk på ~ 100 mmHg (figur 4). I disse nyrer, perfusatet strømnings og vaskulær motstand holdt seg stabil over et tidsrom på 55 minutter ved 15,6 ± 0,4 ml / min * g nyrevekt og 35 ± 1,0 mmHg * min / ml, henholdsvis (figur 4 A). En reduksjon av perfusatet strømning eller en økning i vaskulær resistens er en følsom parameter med hensyn til avtagende vev levedyktighet og bør overvåkes gjennom hele perfusjon med forsiktighet. Blod gass og elektrolytt-analyse i 100 ul prøver tatt 60 minutter etter start av perfusjonen viste nedsatt CO 2-produksjon og O 2 forbruk, da den arterielle innstrømningen ble sammenlignet med venøs utstrømning (tabell 2). De andre parametre er uforandret mellom arterie og vene (tabell 2). Det bør legges spesiell vekt på uendret venøs kalium utgivelsen, som er en økning kan oppstå under vevsskade. Glomerulusfiltrasjon, vurderes via FITC-Inulin clearance 14, hadde en tendens til å øke over tid (figur 4 B), men denne trenden nådde ikke signifikans. Delvis utskillelsen av natrium og kalium vurderes etter 55 minutter av perfusjoner økt i forhold til in vivo-situasjonen (figur 4 C). Urin osmolalitet er ikke hevet over osmolaliteten i venøs utstrømning etter 55 min perfusjon med (figur 4 D).

For morfologiske studier ble nyrer fast etter perfusjon i 3% paraformaldehyd og 0,1% glutaraldehyd i dialysebuffer som tidligere beskrevet 17. Nedsatt ultrastructure ble vurdert med TEM. Glomeruli og S1 segmenter av proksimale tubuli dukket opp i stor grad uendret etter perfusjon (figur 5 A og B). Noen, men ikke alle S2 / S3 segmenter av proksimale tubuli og de tykke stigende lemmer som ikke var i nærheten av vaskulære bunter ble vist tegn til organskade, som tidligere beskrevet i rotte isolert perfuserte nyrer 5 (figur 5 C og D). Selv på nært inspeksjon, gjorde distale convoluted tubuli og samle kanaler ikke viser tydelige tegn på nekrose (Figurene 5 E, F og G). Som konklusjon, morfologiske funn hos mus nyrer speile den situasjon finnes i den isolerte perfuserte rottenyre 5.

Western blot av apikale markørproteiner i de forskjellige nevronet segmenter i isolerte perfuserte nyrer (snap-frosset etter en time av perfusjon) sammenlignet med unperfused kontralaterale nyre av samme dyr (snap-frosset før utbruddet av perfusjon) avdekket ikke vesentlige endringer. Vi studerte NaPi-IIa (ligger i proksimale tubuli), NKCC2 (tykke stigende lemmer), NCC (distale convoluted tubuli), og ENaC (kobler tubuli / oppsamling kanaler) (figur 6 A og B).

Figur 4
Figur 4: Vurdering av Funksjonell levedyktighet Nyrer dynket i 55 min. A) </ Strong> Under konstant press perfusjon, vaskulær motstand og perfusate flyt holdt seg stabil i 55 min. De første 15 minutter er utelukket på grunn av den høye variasjon alltid sett i løpet av denne tiden. B) glomerulusfiltrasjon (FITC-Inulin) av fire nyrer utlignet etter 25 og 55 min vises svak, men ikke signifikant økning over tid. C) Delvis utskillelsen av natrium og kalium vurderes etter 55 min av perfusjon. D) venøs plasma og urin osmolalitet etter 55 minutter av perfusjon. n = 4 i alle forsøk. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: transmisjonselektronmikroskopi. Representant Morfologi av D ifferent nevronet segmenter av perfused Nyrer på et sluttpunkt på en time. A) glomeruli er intakte. Detalj av en podocyte i en glomerulus. B) S1 segment av en proksimale tubuli. S1 segmenter er intakte. C) S2 / S3 segment av en proksimale tubuli. Noen, men ikke alle S2 / S3 segmenter av proksimale tubuli er meget nekrotisk. Celler vises hovne og viser stor intracellulær skade. Den rørformede omriss opprettholdes bare av basalmembranen. D) Tykk stigende lem (TAL). De tals som er langt fra de vaskulære bunter viser de første tegn på hydropic degenerasjon. Luminal membraner vises tynnet og skjør. E) distale del av nyretubuli (DCT). DCTs er intakte. F) Detalj av de basolaterale infoldings av en DCT celle. Fenestrert endotelet, basalmembran, basolaterale infoldings, og mitokondrier er intakte. G) Samle duct (CD). CDer er intakt.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Western Blot av apikal markørproteiner i isolerte perfuserte Nyrer Sammenlignet Unperfused Nyrer fra de samme dyrene. A) Western blot av nyrer dynket i 1 time og unperfused nyrer. NaPi-IIa er representativ for den proksimale tubuli. NKCC2 er representative for den tykke stigende lem. NCC og NCC fosforylert ved treonin 53 (pT53 NCC) er utelukkende funnet i distale del av nyretubuli. Alfa- og gammaunderenhetene av ENaC i sin fulle lengde, og deres respektive proteolytisk spaltede produkter er vist representant for forbindelses tubuli / samlekanal. B) Kvantifisering av A) viste ikke signifikante forskjeller mellom nyrer dynket feller 1 time og unperfused nyrer. n = 3 i alle forsøk. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM og individuelle verdier er vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1: Sammensetning av løsninger og Dialyse buffer. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.

Tabell 2
Tabell 2: Blood Gass og elektrolytt Analyse av arteriell Tilsig og venøs utstrømning av dynket Mouse Nyrer 60 min etter utbruddet av perfusjon (n = 4). Data er presentert som gjennomsnitt ±SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Musen isolert perfundert nyre er et verktøy for å studere nyrefunksjonen i et kontrollert miljø ex vivo i 1 time, bygge bro over gapet mellom in vivo eksperimenter i intakte dyr, som kan være feil ved virkningen av en rekke systemiske faktorer, og in vitro-eksperimenter isolerte nevronet segmenter eller dyrkede celler, som nødvendigvis overse betydningen av intakt organ struktur på funksjon. Det er, for å forfatternes kunnskap, ikke noe alternativ teknikk som brukes til å utføre denne oppgaven. Biokjemiske studier på nyrevev, men kan utføres på en mye enklere måte ved hjelp av nyre skiver 17. Mens teknikken presenteres i dag brukes for det meste til å studere renal fysiologi, er mange nye søknader blir diskutert. For eksempel kan det brukes til nyre bioteknologi under perfusjon decellularization og recellularization 12. I tillegg til langvarig normotermisk perfusjon av nyrer tidligere transplantation, med administrering av høye doser av anti-avvisning eller genom-redigering av medikamenter i perfusatet, blir studert; selv i kliniske omgivelser 8, 9, 10, 11. Musen isolert perfusert nyre er et utmerket verktøy som kan brukes for disse anvendelser, spesielt for å klargjøre rollen av enkeltgener med knockout-modeller.

Tre trinn er kritisk for en vellykket eksperiment. Dette papiret gir interesserte laboratorier med midler til å reprodusere prosedyren. Først må buffer for å fremstilles på en slik måte at nyrene får de fleste av de næringsstoffer som er nødvendige for forlenget levedyktighet etter reproduserbare betingelser. En balanse må finnes mellom helt kontrollerte forhold (syntetisk buffer) og en innfødt perfusjon tilstand (fullblod). Derfor albumin og pattedyr erytrocytter til en hematokrit på 10% har for å bli inkludert. Dette hematokritt representerer, i forfatternes erfaring, det beste kompromisset mellom tilstrekkelig tproblemet oksygenering og lav buffer viskositet (økende hematokrit avtar flyte dramatisk under press-konstant perfusjon (sammenligne verdier presenteres i denne artikkelen til verdier i nyrene perfuserte uten erytrocytter 18)). Kvaliteten og helse på erytrocytter er kritisk. I løpet av vasketrinnene, erytrocytter må håndteres med forsiktighet for å hindre hemolyse. Bufferen må forberedes ferskt på dagen for eksperimentet. For det andre, må operasjonen utføres av et trenet kirurg i løpet av kortest mulig tid. Kirurgen må utføre 6 ligaturer rundt de største skipene som forbinder nyrene til resten av kroppen, samtidig som dyrets blodtapet til et minimum. For optimale resultater, bør kirurgiske inngrep utføres innen 30 minutter. Dersom det midlere arterielle blodtrykket til dyret faller, under langvarig operasjon eller som følge av anestesi, under 60 mmHg, nyreperfusjon vil allerede være minimal og vevet vil bli utsatttil nekrose. For å utelukke dette, kan den venstre nyre tas etter operasjonen, når perfusjon av den høyre nyren har allerede begynt, og anvendt som en ubehandlet kontroll. For det tredje, i den tiden av perfusjonen den korrekte funksjon av perfusjon apparat, bestående av en standard liten-dyr-perfusjon krets, må sikres. Mens maskinen utfører perfusjonen av seg selv, er menneskelig tilsyn nødvendig, for eksempel for å se etter bobler i perfusjon kretsen.

De representative data gitt muliggjør vurdering av nyre levedyktighet etter en time av ex vivo perfusjon og sammenligning av teknisk suksess for en hvilken som helst utførelse av denne fremgangsmåten til den metode som er beskrevet heri. Under minst en time, nedsatt blodstrøm, vaskulær motstand, blodgasser av venøs utstrømning og glomerulusfiltrasjon bør forbli stabil.

Det er visse begrensninger i teknikken, som man må huske på. Selv en kidney utstede fra den mest vellykkede operasjonen kan bare være levedyktig i en begrenset periode. Forfatterne fant en time for å være den beste tiden punktet der å stoppe perfusjon. I tillegg, mens perfusjon av isolerte nyre tillater studiet av det isolerte hele organet i dybden, er det vanskelig å skille spesifikke effekter på én celletype. Nyrer fast etter en time kan vise feil i S3 segmenter av proksimale tubuli og tykke stigende lem celler, mens glomeruli, S1 segmenter, DCTs og CDer bør forbli intakt. Obligatorisk bruk av erytrocytter, spesielt fra mennesker, er også knyttet til potensiell risiko (f.eks infeksjoner) for eksperimentator.

Oppsummert er musen isolert dynket nyre en nyttig teknikk som brukes til å studere hele orgelet ex vivo. Som enhver teknikk, har det visse fordeler og begrensninger. Forfatterne mener at både de mange nye programmer som oppstår og denne protokollen kan gi sufficient momentum for andre laboratorier for å reprodusere dette arbeidet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2901
Cannular with basket and side port Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2947
Thermostat TC120-ST5  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3436
Pressure Transducer APT300  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3862
TAM-D Plugsys Transducer Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-1793
SCP Plugsys servo controller Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2806
Windkessel  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3717
HSE-USB data acquisition Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone B.Braun 7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/8
Name Company Catalog Number Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10% B.Braun 134518064
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt Sigma-Aldrich M1125-25G
Sodium-L-Lactate Sigma-Aldrich L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt Sigma-Aldrich K1875-25G
NaCl Sigma-Aldrich 31434-1KG-R
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761-5KG
KCl Sigma-Aldrich 60130-1KG
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Creatinine Sigma-Aldrich C4255-10G
Ampicillin Roche 10835242001
MgCl2 * 6H2O Sigma-Aldrich M2393-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 * 6H2 Riedel-de-Haën 12074
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-500G
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP Sigma-Aldrich V2013-1MG
FITC-Inulin Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration Macherey-Nagel MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM FEI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81, (2112), 621-623 (1935).
  2. Skutul, K. Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv. 123, (4-6), 249-273 (1908).
  3. Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7, (1), 1-11 (1975).
  4. Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196, (5), 1115-1118 (1959).
  5. Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53, (2), 145-155 (1985).
  6. Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16, (3), 377-384 (1979).
  7. Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284, (4), F770-F777 (2003).
  8. Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360, (1), 7-19 (2009).
  9. Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13, (5), 1246-1252 (2013).
  10. Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38, (4), 352-361 (2014).
  11. Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
  12. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19, (5), 646-651 (2013).
  13. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22, (7), 1297-1304 (2011).
  14. Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
  15. Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100, (4), 556-563 (2007).
  16. Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger's Archiv. (2016).
  17. Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8, (10), 1227-1236 (2015).
  18. Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9, (5), 288-296 (2004).
Musen isolerte perfuserte Nyre Technique
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).More

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter