Summary

Musen isolerte perfuserte Nyre Technique

Published: November 17, 2016
doi:

Summary

Musen isolert perfusert nyre (MIPK) er en teknikk for å holde en mus nyre i henhold til ex vivo betingelser perfuserte og funksjonelle i 1 time. De buffere og kirurgisk teknikk som er beskrevet i detalj.

Abstract

Musen isolert perfusert nyre (MIPK) er en teknikk for å holde en mus nyre i henhold til ex vivo betingelser perfuserte og funksjonelle i 1 time. Dette er en forutsetning for å studere fysiologi av isolerte organ og for mange innovative applikasjoner som kan være mulig i fremtiden, inkludert perfusjon decellularization for nyre bioteknologi eller administrasjon av anti-avvisning eller genom-redigering narkotika i høye doser til prime nyrene for transplantasjon. I løpet av tiden for perfusjon, kan nyren manipuleres, nyrefunksjonen kan bli vurdert, og forskjellige legemidler administreres. Etter prosedyren kan bli transplantert nyre eller behandles for molekylær biologi, biokjemiske analyser, eller mikroskopi.

Dette notatet beskriver perfusatet og den kirurgiske teknikken som trengs for ex vivo perfusjon av mus nyrer. Detaljer av perfusjon anordningen har fått, og data er presentert som viser viability av nyre forberedelse: renal blodgjennomstrømning, vaskulær motstand, og urin data som funksjonelle, transmisjons- elektronmikroskopi forskjellige nevronet segmenter som morfologiske avlesninger, og vestlige blotter av transportproteiner i forskjellige nevronet segmenter som molekylær avlesning.

Introduction

Den isolerte perfusjon av organer har vært gjenstand for et pågående arbeid blant fysiologer i mange tiår 1. Teknikken muliggjør funksjon av organet, uten systemiske påvirkning, slik som blodtrykk, hormoner, eller nerver, for å bli undersøkt. Carl Eduard Loebell er ansett for å være de første som har beskrives den vellykkede perfusjon av en isolert nyre, i 1849 2. Siden den gang har perfusjon apparat gjennomgått en betydelig forbedring. Frey og Gruber innført en kunstig lunge for oksygene og pulsatile pumper for kontinuerlig perfusjon to. Mens tidlige forskere hovedsakelig studert nyrene av store pattedyr-nemlig griser 2 og hunder 3 -den første rapport om bruk av rotte nyrer, etter Weiss et al. , Var en milepæl i studiet av små pattedyr-organ perfusjon 4. Schurek et al. rapportert nødvendigheten av å legge pattedyr erytrocytter til perfusatet hvis tilstrekkelig renal tubulæroksygene skulle oppnås 5. Kritisk for langvarige forsøk var innføringen av kontinuerlig dialyse av bufferen ved den samme forskningsgruppe 6. I 2003 Schweda et al. var den første til å rapportere en funksjonell mus isolert dynket nyre (MIPK) 7, senere videreutviklet av Rahgozar et al. 18 og Lindell et al. 14.

Selv om det teknisk mer utfordrende enn det isolerte perfuserte rottenyre, bruken av MIPK bærer fordelen av å muliggjøre bruk av et bredt spekter av genetisk forandret mus. Dette notatet presenterer detaljene forfatternes metode for perfusert isolerte mus nyrer for en time. Metoden gjør det mulig for en kontinuerlig vurdering av nyrestrømningshastighet, vaskulær motstand, hormon utgivelse, blodgassanalyse, urin analyse, og bruk av narkotika. Ved å følge fremgangsmåten, kan nyrer bli behandlet for molekylære og biokjemiske analyser, bli løst for mikroskopi, ellertransplantert inn i en mottaker mus (figur 1).

Figur 1
Figur 1: Oversikt over Mulig Input / Output til isolerte perfuserte Nyre. BGA: Blod gass analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Denne teknikken sannsynlig vil få økt oppmerksomhet i årene som kommer, så mange innovative applikasjoner blir diskutert med begynnelsen av langvarig normotermisk nyre perfusjon før transplantasjonen (med eller uten bruk av anti-avvisning eller genom-redigering narkotika) 8, 9, 10 , 11, bioteknologi av hele nyrer fra decellularized stillaser 12, og bruk av høye doser av fluorescerende fargestoffer for multiphoton bildebehandling 13 </sup>. Det er også en ideell modell som å studere rollen av spesifikke gener under akutt nyreskade 14.

En trinn-for-trinn-protokoll er gitt for å tillate andre laboratorier for å utføre isolerte mus nyre perfusjon med hell. Først blir sammensetningen og fremstillingen av bufferen angitt. Deretter blir den operasjon som er beskrevet i detalj, og de kritiske trinn er vist. For det tredje, data blir presentert som er representative for en vellykket fremstilling: renal blodstrøm, vaskulær motstand, glomerulær filtreringshastighet, og fraksjonelle elektrolyttutskillelse-alle som funksjonelle målinger av levedyktighet-og transmisjonselektronmikroskopibilder av morfologien av forskjellige nevronet segmenter av perfuserte nyrer fast etter en time av perfusjon.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyr som er beskrevet i dette manuskriptet ble utført i henhold til sveitsisk lov og godkjent av veterinær administrasjon av kantonen Zürich, Sveits. 1. Buffer Klargjøring Forbered løsninger 1 – 4 og antidiuretisk hormon (ADH) løsning (tabell 1). Forbered dialyse buffer (tabell 1). MERK: Dette er den anvendte buffer som dialysebuffer under perfusjon. Senere vil erytrocyttene være fortynnet i de…

Representative Results

Med den fremgangsmåte som er beskrevet, kan isolerte mus nyrer forblir levedyktige i minst 1 time. Vi testet vev levedyktighet etter 1 time kontinuerlig perfusjon med funksjonell (renal blodstrøm og vaskulær motstand, blodgassanalyse av venøs utstrømming, glomerulusfiltrasjon, urin brøk Na + og K + utskillelse, og urin osmolalitet) og morfologiske (transmisjonselektron mikroskopi, TEM) metoder i fire nyrer av villtype C57BL / 6 mus. I tillegg ble western blot …

Discussion

Musen isolert perfundert nyre er et verktøy for å studere nyrefunksjonen i et kontrollert miljø ex vivo i 1 time, bygge bro over gapet mellom in vivo eksperimenter i intakte dyr, som kan være feil ved virkningen av en rekke systemiske faktorer, og in vitro-eksperimenter isolerte nevronet segmenter eller dyrkede celler, som nødvendigvis overse betydningen av intakt organ struktur på funksjon. Det er, for å forfatternes kunnskap, ikke noe alternativ teknikk som brukes til å utføre denne…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Michèle Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and Jürg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research “Kidney.CH” and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.

Materials

Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2901
Cannular with basket and side port Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2947
Thermostat TC120-ST5  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3436
Pressure Transducer APT300  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3862
TAM-D Plugsys Transducer Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-1793
SCP Plugsys servo controller Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2806
Windkessel  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3717
HSE-USB data acquisition Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone B.Braun 7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D. Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/8
Name Company Catalog Number Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10% B.Braun 134518064
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt Sigma-Aldrich M1125-25G
Sodium-L-Lactate Sigma-Aldrich L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt Sigma-Aldrich K1875-25G
NaCl Sigma-Aldrich 31434-1KG-R
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761-5KG
KCl Sigma-Aldrich 60130-1KG
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Creatinine Sigma-Aldrich C4255-10G
Ampicillin Roche 10835242001
MgCl2 * 6H2O Sigma-Aldrich M2393-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 * 6H2 Riedel-de-Haën 12074
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-500G
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP Sigma-Aldrich V2013-1MG
FITC-Inulin Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration Macherey-Nagel MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM FEI

References

  1. Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81 (2112), 621-623 (1935).
  2. Skutul, K. . Über Durchströmungsapparate Pflüger’s Archiv. 123 (4-6), 249-273 (1908).
  3. Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).
  4. Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).
  5. Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).
  6. Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).
  7. Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).
  8. Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).
  9. Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).
  10. Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).
  11. Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
  12. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19 (5), 646-651 (2013).
  13. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).
  14. Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
  15. Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).
  16. Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger’s Archiv. , (2016).
  17. Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).
  18. Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).

Play Video

Cite This Article
Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).

View Video