Summary
Erfelijke hartritmestoornissen worden vaak veroorzaakt door mutaties die de oppervlakte levering van één of meer ionkanalen wijzigen. Hier passen we flowcytometrie assays een kwantificering van de relatieve totale en celoppervlak-eiwit expressie van recombinant ionenkanalen tot expressie gebracht in TSA-201 cellen.
Introduction
Dit artikel geeft een betrouwbare test om de relatieve expressie van celoppervlak membraaneiwitten zoals ionenkanalen tot expressie gebracht in recombinante cellen met de aanwezige flowcytometrie techniek melden. Ionenkanalen porie-vormende membraaneiwitten die verantwoordelijk zijn voor het regelen van elektrische signalen door het poorten van de stroming van ionen door de celmembraan. Zij worden ingedeeld door de activatie mechanisme, natuur, en de selectiviteit van de ion soorten op doorreis in de poriën waar ze worden gelokaliseerd. Op cellulair en weefsel niveaus, de macroscopische ion fluxen door middel van ion kanalen zijn het product van biofysische (gating en permeatie), biochemische (fosforylering), en biogenese (synthese, glycosylering, mensenhandel en afbraak) eigenschappen 1. Elk van deze processen is uniek voor elk type ionenkanalen en is geoptimaliseerd om de fysiologische rol van het ionkanaal voldoen. Derhalve veranderingen in elk van deze verfijnde 'via deerfelijke of door genetische modificatie, vaak aangeduid als "channelopathy", kan schadelijk celhomeostase zijn. Het is belangrijk te benadrukken dat het leveren van de "juiste" hoeveelheid ionenkanalen aan het celoppervlak is essentieel voor celhomeostase. Zelfs kleine stijgingen (gain-of-functie) en kleine dalingen (verlies-van-functie) in ionkanaal activiteit hebben de potentie om een ernstige pathologie over een leven leiden. Defecten in het celoppervlak levering van rijpe ionkanalen is een belangrijke determinant in talrijke kanalopathieën, zoals cystische fibrose (CFTR ionkanaal) 2 en hartritmestoornissen van het lange QT syndroom vorm (cardiale kaliumkanalen) 3.
Kanalopathieën worden geassocieerd met cardiale plotselinge dood 4. De huidige wereldwijde prevalentie van alle cardiale kanalopathieën wordt gedacht dat minstens 1 te zijn: 2,000-1: 3000 per persoon 5 en zijn verantwoordelijk voor ongeveer de helft van een plotselinge aritmische hartdood cases 6. Disfunctie bij cardiale spanningsafhankelijke natrium-, kalium-, calcium- en selectieve ionenkanalen zijn bekend een belangrijke rol spelen in dit proces. De L-type Ca V 1.2-voltage-gated calcium kanaal is vereist om gesynchroniseerd hartspier contractie te starten. De cardiale L-type Ca 1,2 V kanaal is een multi-subeenheid proteïne complex samengesteld uit het porievormende Ca V α1 subeenheid en Ca Vss en Ca V α2δ1 aanvullende subeenheden 7-12. Merk op dat de volledige set van hulp- subeenheden vereist om functionele Ca V 1,2 kanalen in het plasmamembraan en dynamische interacties veroorzaken tussen deze subeenheden zijn essentieel voor de normale elektrische functie van het hart 13 te ondersteunen. Ca V ß bevordert het celoppervlak expressie van ca 1,2 V kanalen via een niet-covalente hydrofobe interactie nanomolair 14. Co-expressie van de Ca V α2δ1 subunit with Ca V ß-gebonden Ca V α1 stimuleert piekstroom uitdrukking (5 tot 10-voudig) en bevordert kanaal activering op meer negatieve spanningen. Gain-of-function mutaties van het porievormende subeenheid Ca V 1,2 zijn geassocieerd met een vorm van ventriculaire aritmieën genoemd het lange QT syndroom 15 dat samen met puntmutaties in de drie subeenheden die het L-type Ca V 1,2 kanaal geïdentificeerd in individuen die lijden aan aritmieën van de korte QT syndroom vorm 16,17. Ion kanalen zijn membraaneiwitten die kunnen worden onderzocht vanuit een biochemisch perspectief (eiwit chemie) of met behulp van elektrofysiologische instrumenten (huidige genererende machines) en vaak met behulp van deze complementaire aanpak. Elektrofysiologie, met name whole-cell patch-klemming, is een geschikte benadering voor de functie van ionkanalen 15 verhelderen maar kan niet wijzigingen in proteïne transport lossen van veranderingen in hun biofysischeeigenschappen. Eiwitchemie is echter vaak beperkt gebruik door de relatief lage expressie van grote membraaneiwitten opzichte van kleinere oplosbare eiwitten. Robuuste high-throughput methoden met behulp van fluorescentie uitlezing moeten worden ontwikkeld om specifiek ingegaan op gebreken in eiwitten biogenese veroorzaken van veranderingen in het celoppervlak expressie van ionkanalen.
Flowcytometrie is een biofysische technologie gebruikt in cel tellen, sorteren, biomarker opsporing en protein engineering 18. Wanneer een monsteroplossing van levende cellen of deeltjes cytometer in een stroom wordt geïnjecteerd, worden de cellen gerangschikt in een enkele stroom die kan worden gesondeerd door de machine detectiesysteem (figuur 1). De eerste stromingscytometer akte in 1956 19 gedetecteerd slechts één parameter maar modern flowcytometers meerdere lasers en fluorescentiedetectoren dat de detectie van meer dan 30 fluorescerende 20,21 parameters mogelijk.Filters en spiegels (emissie optiek) richt de lichtverstrooiing of TL-licht van cellen aan een elektronisch netwerk (fotodiode en detectoren), die het licht proportioneel om te zetten in de intensiteit ervan. Digitale gegevens worden geanalyseerd met gespecialiseerde software en de eerste uitgang wordt weergegeven als puntenplot 21.
Figuur 1:. Biofysische principes flowcytometrie sorteren Single cellen worden geduwd door een sproeier onder hoge druk in een stroom omhullingfluïdum die hen beweegt op een of meerdere laser afvraagpunten. De lichtbundel wordt afgebogen door de passerende cellen en verzameld in de voorwaartse richting (Forward Scatter, FCS) licht naar een fotodiode die het licht omzet in een signaal evenredig aan de grootte van de cel. Het licht wordt ook verzameld op een 90 ° hoek met de laser pad en naar detectors (ook wel fotomultipliers (PMT)).Dit licht wordt via dichroïsche spiegels die de detectie van het signaal zijwaartse verstrooiing (SSC), die de korreligheid in de cellen weerspiegelt mogelijk, en de fluorescente emissie als opgewonden fluorochromen in de cel aanwezig zijn. Drie detectoren (groen, geel en rood) worden weergegeven met verschillende golflengte banddoorlaatfilters, waardoor de gelijktijdige detectie van verschillende fluorochromen. De verschillende signalen worden gedigitaliseerd door een externe computer en omgezet in gegevens die worden geanalyseerd om de eigenschappen van de cellen te kwantificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
De high-throughput capaciteit van flowcytometers werd benut om de relatieve membraan expressie van recombinant wild-type en de handel-deficiënte voltage-gated L-type Ca V 1.2 kanalen en bijbehorende subeenheden in levende cellen te kwantificeren. cDNA constructen coding voor de eiwitten werden dubbel gelabeld om gelijktijdig een extracellulair niet fluorescerende epitoop die door een ondoordringbare fluorescerend geconjugeerd antilichaam en een intracellulair fluorofoor die constitutief fluorescerende kan worden gedetecteerd. Zowel de extracellulaire epitoop, een extracellulaire lus van het eiwit geplaatst, en de intracellulaire fluorofoor, ingevoegd na de C-terminus, worden omgezet met het eiwit. In deze reeks experimenten werd het Ca V α2δ1 eiwit ontworpen om een extracellulaire hemagglutinine (HA) epitoop (YPYDVPDYA) gedetecteerd door een ondoordringbare FITC (fluoresceïne isothiocyanaat) expressie geconjugeerd anti-HA en mCherry de intrinsieke intracellulaire fluorofoor. De relatieve celoppervlak expressie van het mCherry-Ca V α2δ1 HA-gemerkt eiwit te bepalen, werden recombinante cellen die het fusie-eiwit na transfectie geoogst en gekleurd met FITC-geconjugeerd monoklonaal anti-HA-epitooplabel Antibody (figuur 2). FITC is een organische fluorescente verbinding die aanzienlijk kleiner is dan enzym verslaggevers en dus niet zoveel kans om te interfereren met de biologische functie. mCherry- Ca V α2δ1 HA-overexpressie in TSA-201cells, levert aanzienlijk 3-log toename van de FITC fluorescentie en fluorescentie mCherry twee-dimensionale plots 22. Aangezien de HA epitoop in het extracellulaire deel van het eiwit, de fluorescentie-intensiteit van FITC verkregen in aanwezigheid van intacte cellen weerspiegelen de relatieve index van het celoppervlak expressie van HA-gemerkt eiwit. De toegankelijkheid van de HA epitoop in de constructen systematisch gevalideerd door het FITC signaal nadat cel permeabilisatie. Deze maatregel dient ook om de genormaliseerde totale eiwitexpressie bevestigen aangezien de relatieve fluorescentie intensiteiten voor FITC in gepermeabiliseerde cellen geschat zijn kwalitatief vergelijkbaar met de relatieve fluorescentiewaarden for mCherry gemeten onder permeabel en non-gepermeabiliseerde voorwaarden 22,23. Het is belangrijk op te merken dat de intrinsieke fluorescentie spectrum wordt verschoven naar hogere waarden na permeabilisatie maar dat de enige waarde wordt gerapporteerd is de verandering in fluorescentie-intensiteit in vergelijking met de controle construct. Relatieve veranderingen in de fluorescentie-intensiteit voor de test constructen worden geschat aan de hand van de ΔMean Fluorescence Intensity (ΔMFI) waarden voor elke fluorofoor (mCherry of FITC). Experimenten zijn ontworpen om de fluorescentie-intensiteit van de testconstruct opzichte van de fluorescentie-intensiteit van de controle construct tot expressie gebracht onder dezelfde omstandigheden gemeten experimentele variaties beperken de intrinsieke fluorescentie van het fluorofoor-geconjugeerde antilichaam. Twee membraaneiwitten met succes onderzocht met behulp van deze test: de porie vormende subeenheid van het L-type spanningsafhankelijke Ca calciumkanaal V 1,2 14,22 en een andere reeksexperimenten, de extracellulaire extra Ca V α2δ1 subunit 22,23. Het volgende protocol werd toegepast om de celoppervlak expressie van het Ca V α2δ1 subunit van het cardiale L-type Ca 1,2 V kanaal onder controle omstandigheden en na mutaties die de posttranslationele modificatie van het ionkanaal te bepalen. Onder gestandaardiseerde experimentele omstandigheden het celoppervlak fluorescentie van FITC verhoogt quasi-lineair met de expressie van cDNA dat codeert voor mCherry-Ca V α2δ1 HA-eiwitten (figuur 5 van referentie 22).
Figuur 2:. Schematische weergave van de totale en het membraan etikettering in de flowcytometrie experimentele protocol De regeling schetst enkele van de belangrijkste stappen die nodig zijn om de relatieve totale en celoppervlak expressie van recombinante ionkanalen door fl kwantificerenow cytometrie. Cellen worden getransfecteerd met de twee merktekens constructie mCherry-Ca V α2δ1-HA in TSA-201 cellen (1) en gekleurd voor of na permeabilisatie (2). Multiparameter gegevens worden verkregen in een flowcytometer (3) voor multivariate analyse (4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dubbel Tagged DNA-constructen
- Plaats het HA-epitoop (YPYDVPDYA) in de linker van extracellulair Ca V α2δ1 tussen D676 en R677 door plaatsgerichte mutagenese (figuur 3B) 20. Gebruik Forward primer gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC en Reverse primer acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC.
- Subkloneren van het cDNA-sequentie van het gelabelde HA Ca V α2δ1 in het zoogdier pmCherry N1-expressievector ontworpen om het eiwit gefuseerd aan de N-terminus van mCherry tussen de SacI en SalI plaatsen (Figuur 3B) 20 tot expressie.
LET OP: Passende kanaal functie moet worden getest met de controle construct met behulp van standaard elektrofysiologische methoden 24.
2.-liposoom-gemedieerde transiënte transfectie (30 min, Alle stappen worden uitgevoerd onder laminaire stroming kap)
- Dag 1: Plate een half miljoen van de TSA-201 cellen (of HEKT) in35 mm kweekschalen met 2 ml Dulbecco's hoog glucosegehalte minimaal essentieel medium (DMEM-HG) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (PS) kweekmedium. Aantal cellen met een standaard hemacytometer. Beoordelen cellevensvatbaarheid uit een fractie van het celmonster met behulp trypan blauw. Plaat genoeg cellen tot 90% confluentie bereiken op het moment van transfectie.
- Dag 2: Change kweekmedium met 2 ml verse voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium zonder PS.
- Voor elke transfectie monster, twee 1,5 ml buizen. In buis 1 verdunnen 4 ug DNA in 250 ui gereduceerd serum medium. In buis 2, meng 10 pl van het liposoom-gemedieerde transfectie reagens met 250 pl serum-gereduceerde kweekmedium. Meng voorzichtig de transfectiereagens voor gebruik.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Combineer de inhoud van de buis 1 en de buis 2, meng voorzichtig en incubeer ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg de liposomen / DNEen complexen aan de gekweekte cellen en schud de cultuur schotel te mengen.
- Incubeer bij 37 ° C onder 5% CO2 atmosfeer gedurende 24 uur.
3. kleuring van cellen voor flowcytometrie (3 uur)
- Het voorbereiden van de Cel Samples
- Dag 3: Verwijder medium uit de kweekschaal voorzichtig en was de cellen met 400 ul voorverwarmde (37 ° C) 0,05% trypsine-EDTA 1x (ethyleendiaminetetra-azijnzuur).
- Voeg 400 ul trypsine-EDTA en incubeer de schaal bij 37 ° C onder 5% CO2 atmosfeer gedurende 5 minuten om cellen los te maken van de schaal.
- Stop de enzymdigestie door het toevoegen van 1 ml koud kweekmedium zonder PS en was alles uit de cellen van het oppervlak door pipetteren voorzichtig 4-5 keer. Vermijd over-spijsvertering en over-pipetteren om celdood te verminderen.
- Verzamel cellen in 1,5 ml buizen en plaats onmiddellijk op ijs. Gebruik ijskoude oplossingen en houd de cellen bij 4 ° C om de internalisatie voorkomenvan oppervlakte-antigenen. Verlaag verlichting fotobleken van het fluorescentiesignaal beperken.
- Centrifugebuizen bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zorgvuldig aspireren en gooi de supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing 1x (PBS) om een enkele celsuspensie te bereiden.
- Kort vortex de buizen heel voorzichtig en herhaal de stappen 3.1.5 en 3.1.6 aan kweekmedium volledig te verwijderen.
- Resuspendeer de pellet in 600 pi 1X PBS en stel de celconcentratie een minimum van 3 x 10 6 cellen / ml.
- Verdeel de cellen in twee nieuwe 1,5 ml buizen voor extracellulaire en intracellulaire kleuring. Onder meer passende controles om specifieke kleuring van niet-specifieke kleuring discrimineren.
NB: De isotypecontroleantilichaam helpt bij de beoordeling van het niveau van de achtergrond kleuring en idealiter overeenkomen met elke primaire antilichaam de talrijke soorten, isotype en fluorofoor. Met isotype controle en geconjugeerd antilichaam tegelijkertijdeiwitconcentratie.
Tabel 1: Flow-cytometrie experimenten controlemonsters voor niet-gepermeabiliseerde en gepermeabiliseerde cellen Elk experiment moet de volgende negatieve controles omvatten:. (1) niet-getransfecteerde cellen (zonder antilichaam met de isotype of het geconjugeerde antilichaam). (2) Getransfecteerde cellen met het eiwit van belang gesubkloneerd in een plasmide zonder constitutieve intracellulaire fluorescente fluorochroom (pCMV- Ca V α2δ1-HA) of met dubbel gelabelde constructie (pmCherry-Ca V α2δ1 en geïncubeerd zonder antilichaam met de isotype of het geconjugeerde antilichaam). Enkele kleur controles worden gebruikt voor de vergoeding van fluorochroom emissie overlap. Dezelfde controles worden uitgevoerd voor niet-gepermeabiliseerde en gepermeabiliseerd omstandigheden in elke reeks experimenten.
- Celoppervlak kleuring van Intactlevende cellen
- Aliquot 1 x 10 6 cellen / 100 ul in 1,5 ml buizen.
- Voeg de FITC-geconjugeerd monoklonaal anti-HA antilichaam bij 5 ug / ml en vortex vóór incuberen van de cellen op een rocker platform (200 rpm) in het donker bij 4 ° C gedurende 45 minuten.
OPMERKING: De optimale antilichaamconcentratie werd bepaald voorafgaande titratie-experimenten (Figuur 4). - Verwijder de cellen van het donker en voeg 900 pl 1x PBS / buis. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml 1x PBS, vortex en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Herhaal de wasbeurt (stap 3.2.4) twee keer om eventuele niet-gebonden antilichaam te verwijderen. Als een niet-geconjugeerd primair antilichaam gebruikt, geïncubeerd met het geschikte secundaire antilichaam.
- Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de cellen in 500 pi 1X PBS en breng de enkele celsuspensie in 5 ml flowcytometrie buizen. Houd de cels in het donker bij 4 ° C totdat het monster loopt.
- Run de monsters op een flowcytometer. Voor het beste resultaat, het analyseren van de cellen op de flowcytometer zo spoedig mogelijk en uiterlijk 24 uur na.
- Intracellulaire kleuring: Fixatie, Permeabilisatie en kleuring
- Aliquot 1 x 10 6 cellen / 100 ul in 1,5 ml en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Gooi supernatant en resuspendeer cellen in 100 ul van fixatie-permeabilisatie oplossing direct uit voorraad leverbaar.
- Incubeer in het donker bij 4 ° C gedurende 20 min.
- Voeg 100 ul van vers bereide 1x permeabilisatie-wasbuffer (10x verdunnen permeabilisatie-wasbuffer in gedestilleerd H 2 O). Vortex en sediment cellen met een tafel centrifuge bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Zuig en gooi de supernatant.
- Herhaal stap 3.3.4 en 3.3.5.
- Add FITC-geconjugeerd monoklonaal anti-HA antilichaam bij 5gg / ml in 100 gl van 1x permeabilisatie-wasbuffer en, vortex voor cellen te incuberen in het donker bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
OPMERKING: De intracellulaire kleuring wordt uitgevoerd volgens dezelfde procedure als die welke voor het celoppervlak kleuring. Saponine-gemedieerde permeabilisatie is echter een snel reversibel proces, dus is het belangrijk om 1x PBS vervangen 1x Perm / Wash buffer om de cellen in de voortdurende aanwezigheid van saponine tijdens intracellulaire kleuring houden. - Verwijder de cellen van het donker en voeg 100 ul permeabilisatie-wasbuffer. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de pellet in 100 pl permeabilisatie-wasbuffer, vortex en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Herhaal de wasbeurt (stap 3.3.9) nog een keer om eventuele niet-gebonden antilichaam te verwijderen.
- Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de cellen in 500 pi 1X PBS en breng de zondegle celsuspensie tot 5 ml flowcytometrie buizen. Houd de cellen in het donker bij 4 ° C totdat het injecteren van het monster in de flowcytometer.
- Run de monsters op een flowcytometer. Voer de vaste monsters op de cytometer zo spoedig mogelijk, doch uiterlijk binnen 1 week na de kleuring. Run de niet- gepermeabiliseerde en gepermeabiliseerde cellen op dezelfde dag.
4. Flowcytometrie
- Flowcytometer Cell Sorter Daily Setup
- Schakel de flowcytometrie software. Voorafgaand aan het experimenteren, kalibreren en het instellen van de flowcytometer cel sorter om optimale prestaties te garanderen instrument (dwz laser en optica presteren op specificatie, de laser en de stroom cel goed zijn uitgelijnd) met behulp van instrument setup kralen.
- Gebruik de 100 micrometer mondstuk met 20 psi schede druk.
Opmerking: Het mondstuk hoeft niet te worden gewijzigd op een bank flowcytometer. - Stel de cytometer debiet volgens de fabrikantener specificatie. Buitengewoon hoge stroomsnelheden zullen gevoeligheid bij de detectie van veranderingen in fluorescentie verlagen.
- Selecteer blauw (488 nm te prikkelen fluoresceïne Isothiocayanate of FITC) en geel-groen (561 nm tot mCherry prikkelen) lasers. Verzamel FITC en mCherry fluorescentie niveaus met een 530/30 nm en met een 610/20 nm banddoorlaatfilter respectievelijk.
- Verwerven van de voorwaartse verstrooiing (FCS) versus zijwaartse verstrooiing (SSC) dot plot voor ongekleurde cellen met behulp van lineaire schaal. Pas versterking elke detector om cellen te visualiseren in de linker kwadrant van de dot plot.
- Monster lezen van Intact Non-gepermeabiliseerde cellen
- Stel de P1gate voor levende niet-gepermeabiliseerde cellen door het afbakenen van een vrije vorm rond de cellen te analyseren uitzondering celafval en celaggregaten, aldus vermindert het fluorescentiesignaal op intacte cellen.
LET OP: Leef / dead uitsluiting kleurstoffen kunnen worden gebruikt om de poort plaatsing op levende cellen te vergemakkelijken. Stel 10.000 events op te nemenin het stoppen poort P1. Zet dit op een hoger aantal events als dat nodig is. - Verwerven mCherry versus FITC twee-parameter contour plot met de uitgangswaarde autofluorescentie van ongekleurde cellen op te sporen. Gebruik bi-logaritmische schaal om negatieve waarden tonen en het verbeteren van de resolutie tussen populaties 25. Stel voltage elke detector om de ongekleurde negatieve cellen te midden van het onderste gedeelte van de eerste tien eenheden van de log fluorescentie-intensiteit plots.
- Acquire alle intact niet-gepermeabiliseerde monsters met behulp van in 4.1.5 en 4.1.6 gevestigde instellingen en het verzamelen van FSC, SSC en signalen in de fluorescentie detectoren.
- Exporteren en opslaan * .fcs bestanden te gebruiken voor analyse met flowcytometrie analyse software.
- Stel de P1gate voor levende niet-gepermeabiliseerde cellen door het afbakenen van een vrije vorm rond de cellen te analyseren uitzondering celafval en celaggregaten, aldus vermindert het fluorescentiesignaal op intacte cellen.
- Monster lezen van gepermeabiliseerde cellen
- Beweeg de P1 poort naar levende cellen in de gepermeabiliseerde monsters te selecteren en aan te passen FSC en SSC spanning als aangegeven in 4.1.5 en 4.1.6.
- Acquire alle gepermeabiliseerd monsters en het verzamelen van FSC, SSC eennd signalen in de fluorescentie detectors.
- Exporteren en opslaan * .fcs bestanden te gebruiken voor analyse met flowcytometrie analyse software.
- Gegevensanalyse
- Start de flowcytometrie analyse software en importeren * .fcs bestanden die zijn opgeslagen in 4.2.4 en 4.3.3.
- Klik op het eerste monster in de werkruimte venster weergegeven. Een nieuw venster vernoemd naar de buis ID-nummer wordt automatisch geopend. Start het gating proces in de plot van SSC versus FSC. Teken een poort (P1) met behulp van het pictogram Ellipse rond levende cellen en elimineren van alle vuil, dode cellen, of aggregaten die verschillende voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing dan levende cellen hebben
- Om de twee-parameter contour plot van de mCherry (y-as) versus FITC (x-as) fluorescentie-intensiteit van de levende cellen te tekenen, klikt u eerst op de x-as en kies de FITC-A kanaal en klik dan op de y -as en kies de PE-mCherry-A-kanaal. Klik op het icoon "Quad" om het kwadrant markering te plaatsen aan de rand van eenutofluorescent cellen in elk kanaal fluorescentie.
LET OP: De rondom het FITC en mCherry positieve cellen poort is de P2 poort. De fluorescentie negatieve celpopulatie wordt aangeduid als de P3 gate. Zie figuur 5 voor de representatieve gating methode die wordt gebruikt in dit artikel. - Selecteer P2 en P3 poorten en klik op het icoontje "Statistieken Add" in de oorspronkelijke workspace venster. Klik op "Count" (aantal positieve cellen) en klik op "Mean" (gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elke fluorochroom) of "Median" (mediaan fluorescentie-intensiteit van elk fluorochroom) statistieken in de lijst met opties. Klik op het icoon "Statistieken toevoegen" weer. Al deze waarden worden automatisch overgezet naar de oorspronkelijke workspace venster.
LET OP: De "Mean" wordt alleen gebruikt als de fluorescentie-intensiteit volgt een normale verdeling. In alle andere gevallen, klikt u op het tabblad "Median". MFI dus kan verwijzen naar gemiddelde fluorescentie Intensity of Median Fluorescence Intensity.
OPMERKING: De volgende stap is om parameters en statistieken de poorten 'voor alle monsters gesondeerd door cytometer. - In de werkruimte venster met de muis te slepen en neerzetten van de poorten en statistieken parameters op de lijn gemarkeerd alle monsters.
- Genereer een batchrapport tweedimensionale contour plots (mCherry vs FITC) en histogrammen (celtelling versus fluorescentie-intensiteit) voor niet-gepermeabiliseerde en gepermeabiliseerde cellen (Figuren 6A - B).
- Uit de gegenereerde in stap 4.4.4 statistieken, berekent het gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) voor elke fluorochroom voor de gekleurde cellen. Uit deze waarde af te trekken van de MFI-waarde bij ongekleurde cellen aan het oppervlak en de totale expressie van het eiwit van belang te kwantificeren.
- Rapporteer de ΔMFI waarden voor elke fluorofoor (mCherry en FITC) (Figuur 6C - D). Normaliseren van de ΔMFI gemeten voor de Ca
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit artikel beschrijft een betrouwbaar protocol totale en celoppervlak van recombinant ionenkanalen tot expressie gebracht in TSA-201cells kwantificeren door een tweekleurige flowcytometrie-assay. Als voorbeeld, de relatieve celoppervlak totale eiwitexpressie werd berekend om Ca V α2δ1subunit. Om de tweekleurige flowcytometrie analyse uit te voeren, werd Ca V α2δ1 dubbel gelabeld aan een extracellulaire niet-fluorescerende HA epitoop dat door een anti-HA FITC-geconjugeerd antilichaam en een constitutieve intracellulaire fluorescente mCherry fluorofoor kan worden gedetecteerd uitdrukken. De excitatie en emissiespectra voor FITC en mCherry laten zien dat FITC is enthousiast met 88% rendement door de 488 nm laser, maar de efficiëntie daalt tot 0% met de 561 nm laser. De mCherry toont 63,9% van de maximale fluorescentie bij excitatie met 561 nm laser, maar slechts 7,6% van de 488 nm laser (figuur 3). De excitatie en emissie spectra voor zowel fluoroforen vertonen een optimale lichtproductie en minimale overlap met de verschillende lasers en filters geselecteerd. Flowcytometrie assays kan kwantitatieve informatie over de relatieve expressie van membraaneiwitten bieden tegen een grote celpopulatie zolang de MFI voor de gegeven fluorochroom is recht evenredig met de eiwitexpressie van Ca V α2δ1 op elke cel in plaats van het aantal fluorescerende cellen. Dit omvat het gebruik van een concentratie van fluorescentie-geconjugeerd antilichaam na verzadiging. De titratie curve voor de anti-HA FITC-geconjugeerd antilichaam bindt aan Ca V α2δ1 (Figuur 4) toont drie fasen. Terwijl geen fluorescentie in de eerste fase werd waargenomen, de fluorescentie-intensiteit exponentieel toe met toenemende antilichaamconcentratie in de tweede fase. Na het verzadigingspunt (derde fase), verhogen van de concentratie van het antilichaam heeft geen effect op de relatieve fluorescentie intensity (RFI) van FITC. Het anti-HA FITC-geconjugeerd antilichaam verzadigingspunt vastgesteld op 5 ug / ml, waardoor de concentratie van de geconjugeerde antilichaam de MFI niet beperkend tijdens de experimenten.
De tag Ca V α2δ1was uitgedrukt in TSA-201cells en flowcytometrie werden uitgevoerd in de aanwezigheid van de FITC-geconjugeerde anti-HA in niet-gepermeabiliseerde cellen (figuur 5) uitgevoerd. Passende controles (tabel 1) werden geanalyseerd op de stromingscytometer die xy waarden toekent aan elke cel die door de laserstraal. De verdeling cel wordt gevisualiseerd op puntdiagrammen (figuur 5A). FCS / SSC dot plots bevestigen dat de bereiding van celmonsters verschaft een enkele celsuspensie met een hoge levensvatbaarheid (Figuur 5Ba). De geselecteerde poort voor levende cellen (P1) vertegenwoordigt 75% van het totale aantal geanalyseerde cellen. De totale eiwitexpressie of Ca V α2δ1 in TSA-201 cellen werd geacht evenredig met de mCherry fluorescentie zijn. Zoals te zien in de mCherry versus FITC contour plots en histogrammen (figuur 5Bb - Bc), 47 2% TSA-201 cellen die met pmCherry-Ca V α2δ1-HA bleken significant te uiten mCherry fluorescentie, alsmede blijkt significant FITC fluorescentie te wijten aan de binding aan de externe HA-aanhangsel van Ca V α2δ1 in niet-gepermeabiliseerde cellen. Negatieve controle-experimenten zonder antilichaam of het isotype uitgevoerd geven aan dat de FITC bindt voornamelijk of alleen aan de positief getransfecteerde cellen.
Dit protocol werd gebruikt om de rol van N-glycosylatie kenmerken over totale celoppervlak expressie van Ca V α2δ1 in TSA-201cells 23. Experimenten werden uitgevoerd in niet-gepermeabiliseerde cellen overgedragen naar het celoppervlak expressievrijheiden gepermeabiliseerde cellen om de totale eiwitexpressie en evalueren bevestiging van de toegankelijkheid van het HA-epitoop. Relatieve expressie van Ca V α2δ1 werd uitgegaan van een MFI per fluorofoor (mCherry of FITC) geschat. ΔMFI waarden voor de mutanten werden genormaliseerd tot de maximale waarde gemeten op dezelfde dag mCherry-Ca α2δ1 V-WT HA tot expressie gebracht onder dezelfde omstandigheden. Dit is belangrijk om van variaties in de tijd de absolute fluorescentie-intensiteit van de anti-HA FITC geconjugeerd antilichaam. Zoals blijkt uit figuur 6A, de ΔMFI voor FITC in niet-gepermeabiliseerde cellen was sterk voor de WT en de 4xNQ construeren maar dicht bij de achtergrondfluorescentie niveau de 16xNQ construct aangeeft dat de proteïne nagenoeg afwezig in de plasmamembraan. Assays uitgevoerd nadat cel permeabilisatie, toonde aan dat de expressie van het eiwit 16xNQ construct was ook significant verminderd of hetwerd afgeleid uit de FITC fluorescentie in gepermeabiliseerde cellen of de constitutieve mCherry fluorescentie gemeten in niet-gepermeabiliseerde en in gepermeabiliseerde cellen (Figuur 6C - D). Zoals blijkt uit figuur 6B, de cellulaire autofluorescentie niveaus toegenomen na permeabilisatie cel, die vergelijking van de absolute fluorescentiewaarden tussen intacte en gepermeabiliseerde niet- gepermeabiliseerde cellen voorkomt. De ΔMFI fluorescentie gemeten mCherry was gelijk voor zowel niet-gepermeabiliseerde en gepermeabiliseerde cellen betekent dat de permeabilisatie oplossing de relatieve fluorescentie-signaal van mCherry niet wijzigt. Mutaties van de N-glycosyleringsplaatsen werd geassocieerd met een afname in de fluorescentie intensiteit mCherry ondersteunen de gepubliceerde waarneming dat het eiwit biogenese / stabiliteit was verminderd 23. In deze reeks experimenten werd het relatieve fluorescentie signaal voor FITC gemeten in gepermeabiliseerde cellen bleek be nog kleiner dan de relatieve signaal voor mCherry suggereren dat het N-type glycosylering status van het eiwit de fluorescentie-intensiteit gedetecteerd met FITC-geconjugeerd anti-HA antilichaam in het extracellulaire domein kunnen beïnvloeden. Geheel de veranderingen in de relatieve fluorescentie van FITC before after cel permeabilisatie een betrouwbare statistiek om eiwitexpressie te kwantificeren.
Figuur 3: FITC en mCherry vormen een geschikt paar fluorochromen voor twee-kleuren cytometry assays Excitatie (leeg curves) en emissiespectra (gevulde curves) voor FITC enthousiast met 488 nm blauwe laser (Aa) en mCherry enthousiast met 561 nm geel-. groene laser (Ab). FITC en mCherry fluorescentie werden verzameld met een 530/30 nm en 610/20 nm bandpass filtert respectievelijk. De golflengte van de verschillende lasers (gekleurde verticale lijnen) en de filters (gekleurde rechthoeken) worden gekozen voor een optimale lichtproductie en minimale overlapping. (B) Schematische weergave van mCherry-Ca V α2δ1-HA-eiwit. Ca V α2δ1 werd dubbel gelabeld aan een extracellulaire niet-fluorescerende epitoop HA die door een anti-HA FITC-geconjugeerd antilichaam en een constitutieve fluorescerende intracellulaire mCherry fluorochroom kan worden gedetecteerd uit te drukken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Titratie van anti-HA FITC-geconjugeerd monoklonaal antilichaam bindt aan Ca V α2δ1 TSA-201 cellen werden tijdelijk getransfecteerd met pmCherry-Ca V & # 945; 2δ1-HA en geïncubeerd met verschillende anti-HA FITC-geconjugeerde antilichamen of isotype. Alleen de FITC signaal wordt geanalyseerd in dit paneel. (A) Single-parameter histogrammen tonen het relatieve aantal cellen op de y-as en de FITC fluorescentie-intensiteit op de x-as voor de anti-HA FITC-geconjugeerd antilichaam concentratiegebied (0,01-20 ug / ml). (B) semi-log grafiek van de anti-HA FITC-geconjugeerd antilichaam als functie van de MFI van FITC. De titratie curve was uitgerust met behulp van een site Binding vergelijking met een trendlijn waarde R 2 = 0,99561. Titratie uitgevoerd met als isotype antilichaam toonde geen fluorescentie zoals verwacht. De concentraties ,001-,01 ug / ml zijn niet te onderscheiden van de achtergrondruis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve flowcytometrie analyse van niet-gepermeabiliseerde TSA-201cells getransfecteerd met pmCherry-Ca V α2δ1-HA (A) Schematische weergave van gating strategie gebruikt flowcytometrie analyse monster.. De gegevens werden geanalyseerd na de overname met de juiste software. De eerste gating strategie maakt gebruik van een voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) dot complot om een poort (P1) rond levende cellen vuil, dode cellen, of aggregaten die verschillende voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing dan levende cellen hebben weer te geven en te elimineren . Twee parameters contourgrafieken van de mCherry (y-as) versus FITC (x-as) fluorescentie-intensiteit werden weergegeven P1 populatie. Rechthoekige poorten waren aan de rand van de autofluorescentie van cellen geplaatst om de positieve populatie P2 (FITC en mCherry) en de negatieve populatie P3 selecteren. Het fluorescentieniveau voor tHij cellen in het gebied P2 en P3 werden gevisualiseerd door vervolgens celtelling versus FITC of mCherry fluorescentie-intensiteit één parameter histogrammen. Een verandering in de fluorescentie-intensiteit van de y- en x-as een betrouwbare index van het totale en membraan expressie van Ca V α2δ1 respectievelijk. De intensiteit van het fluorescentiesignaal toeneemt als functie van het aantal moleculen fluorochroom. (Ba) Vertegenwoordiger FCS / SSC dot percelen voor elke voorwaarde zoals vermeld. Een totaal van 10.000 evenementen werden verworven voor analyse. De ellips poort (P1) wordt getrokken door de gaten in de buurt van levende cellen met uitzondering van gebeurtenissen met een lage FSC (dode cellen) of hoge SSC (aggregaten). (Bb) Representatieve twee parameters contourgrafieken van de mCherry (y-as) versus FITC (x-as) fluorescentie-intensiteit. Gates geplaatst aan de rand van autofluorescentie van de cellen om populaties van FITC-mCherry positieve cellen scheiden (P2 gate ) en negatieve fluorescerende cellen (P3). (Bc) Single-paparameter histogrammen van relatieve count (of% van max) cellen versus fluorescentie-intensiteit (FITC of mCherry). De verdeling van de fluorescentie-intensiteit gemeten op cellen in de P2 poort (fluorescentie positieve cellen) worden grijs weergegeven, en de verdeling van de fluorescentie-intensiteit van cellen aanwezig in de P3 gate (fluorescentie-negatieve cellen) wordt weergegeven als overlay in een transparant grijs plot. Zoals te zien is, de fluorescentie-intensiteit was sterk voor zowel mCherry en FITC aangeeft dat Ca V α2δ1 goed wordt uitgedrukt en duidelijk in het celmembraan aanwezig. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Gelijktijdige mutaties van N -glycosylation plaatsen verstoord celoppervlak expression Ca V α2δ1. Stabiele TSA-201 Ca V β3 cellen werden transiënt gelijktijdig getransfecteerd met pCMV-Ca 1,2 V WT en pmCherry-Ca V α2δ1 HA-WT en mutanten. Niet-gepermeabiliseerd (A) en gepermeabiliseerde cellen (B) werden gekleurd met anti-HA FITC-geconjugeerd antilichaam zoals hierboven beschreven. Representatieve twee parameters contourdiagrammen mCherry versus FITC fluorescentie (linker panelen) en histogram plots van de verdeling van de fluorescentie-intensiteit voor de anti-HA FITC geconjugeerd antilichaam kleuring (rechter panelen) getoond voor N -glycosylation mutanten (NQ) na verstoring van de vier locaties (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) en 16 sites (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q / N986Q) in intacte niet-gepermeabiliseerde of NP-cellen (A) en gepermeabiliseerde cellen of P (B). de distribution van de fluorescentie-intensiteit gemeten op cellen in de P2 poort (fluorescentie positieve cellen) worden grijs weergegeven, en de verdeling van de fluorescentie-intensiteit van cellen aanwezig in de P3 gate (fluorescentie-negatieve cellen) wordt weergegeven als overlay op transparante grijs plot. Zoals getoond in (B), de autofluorescentie niveaus toegenomen na cel permeabilisatie. De fluorescentie-intensiteit van FITC gemeten voor alle getransfecteerde cellen gepermeabiliseerd verhoogd (als een direct-verschuiving op de x-as) dat aangeeft dat alle getransfecteerde HA-gelabeld Ca V α2δ1 eiwitten werden gekleurd en gedetecteerd door het anti-HA antilichaam FITC. (C) Staafdiagram toont de genormaliseerde MFI gemeten bij aanwezigheid van FITC in intacte niet-gepermeabiliseerde (oppervlakte-expressie) of gepermeabiliseerde cellen (totaal expressie). De relatieve fluorescentie dichtheid werd gemeten in triplo voor elke omstandigheid (30.000 cellen) en in drie verschillende celbatches transfected gedurende 1 maand dus de gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM voor 90.000 cellen voor elke conditie. De piek fluorescentie-intensiteit werd bereikt tussen 24 en 36 uur na transfectie. De ΔMFI waarden voor FITC gemeten in intacte niet- gepermeabiliseerde cellen werd gebruikt als een index van de celoppervlak expressie van Ca V α2δ1-HA en ΔMFI waarden voor FITC gemeten gepermeabiliseerde cellen de totale eiwitexpressie (celoppervlak en intracellulaire eiwitexpressie ). ΔMFI voor FITC werd berekend door de FITC fluorescentie-intensiteit van FITC negatieve cellen (P3) van de fluorescentie-intensiteit van FITC-positieve cellen (P2). Dezelfde methode werd gebruikt om de ΔMFI voor mCherry berekenen. MFI-waarden werden genormaliseerd tot de maximale waarde gemeten op dezelfde dag mCherry-Ca α2δ1 V-WT HA. (D) Bar grafiek toont de genormaliseerde ΔMFI mCherry gemeten in niet-gepermeabiliseerde of gepermeabiliseerde cellen (total expressie). De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit flowcytometrie gebaseerde bepaling werd met succes toegepast op de meting van de relatieve totale en celoppervlak niveaus van fluorescentie-gemerkt porie-vormende en geassocieerde subeenheden van spanningsafhankelijke calciumkanalen 14,22,26. Het is het beste gebruikt bij het onderzoek naar de effecten van genetische mutaties en vereist dus dat de intrinsieke fluorescentie-intensiteit van de fluorescentie-gemerkt gelabeld wildtype construct ten minste 10 tot 100 maal groter dan de fluorescentie-intensiteit van de fluorescentie-gemerkte untagged construct . In dit specifieke geval, de mCherry-Ca V α2δ1 HA-construct hierin beschreven leverde een grotere signaal-ruisverhouding en een groter dynamisch bereik dan gemeten voor de eerder gepubliceerde Ca V 1,2-HA en Ca V 2,3-HA-constructen. Er zijn vele denkbare redenen voor. Er kan worden gespeculeerd dat de lokale omgeving van de HA epitoop in het extracellulaire domein van de Ca V &# 945; 2δ1 eiwit maximaliseert de signaal-ruisverhouding van het FITC-geconjugeerde anti-HA antilichaam.
Bovendien is het belangrijk om in gedachten te houden dat deze methode een absolute waarde van het aantal eiwitten op het celoppervlak niet verstrekt. De relatieve expressie van het construct hebben moeten functionele kanaal expressie bekomen kan echter bepaald worden door naast elkaar patch-clamp en flowcytometrie-experimenten onder dezelfde omstandigheden als getoond in Figuur 7 van referentie 22. Uit deze gegevens kan worden geschat dat de piek stroomdichtheid, een globale maat van ionkanaal activiteit in het algemeen toe als functie van de oppervlakte-expressie van de gemerkte Ca V α2δ1 subeenheid. De belangrijkste beperking van deze stroom celoppervlakexpressie assay blijft deze niet bij de bestudering van endogene ionenkanalen kunnen worden toegepast op dit moment. Dit komt door het feit dat weinig commercieel verkrijgbare antilichamenHet is bekend dat specifiek aan voorspelde externe domeinen van ionenkanalen. Het vereist dus genetische manipulatie van de primaire sequentie van het eiwit te bestuderen uitgedrukt in een ongedifferentieerde recombinante cellijn zoals TSA-201 cellen.
Kritische stappen in de optimalisatie van de assay: De identificatie van de geschikte paar fluoroforen, de keuze van de externe epitoop en de lokalisatie van de insertieplaats cruciaal voor het succes van deze methode, omdat het inbrengen van de epitoop niet mag staan eiwit functie. Fluorofoor verschillende combinaties werden getest. Twee externe epitopen: het hemagglutinine (HA) epitoop (YPYDVPDYA) en de bungarotoxin bindingsplaats epitoop (WRYYESSLEPYPD) 27 en drie ondoordringbare fluorescent geconjugeerde antilichamen werden geëvalueerd, namelijk FITC (fluoresceïne isothiocyanaat) -, R-fycoerythrine - en de PE-Cy7- geconjugeerde antilichamen. Bovendien, meer dan 10 verschillende insertielocaties voor de externe HA-epitoop werden getest binnen Ca V α2δ1. Met betrekking tot het inbrengen van de epitoop die plaatsgerichte mutagenese en recombinant DNA technieken vereist, wordt geadviseerd minimaal drie primersets ontwerpen binnen dezelfde regio. Met 9 residuen, de HA epitoop een van de kleinere epitopen waarvoor bestaat handel verkrijgbaar fluorescent geconjugeerde antilichamen maar het succes van het inbrengen 27 nucleotiden lager dan puntmutatie. Tetracysteine motieven (residuen Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys) zijn 2-residu kleiner dan de HA epitoop maar fluoresceïne arseen- haarspeld bindmiddel membraan doordringende en niet geschikt voor de analyse van membraangebonden eiwitten 28. Voorlopige experimenten werden uitgevoerd met twee intracellulaire fluoroforen mCherry en Green Fluorescent Protein (GFP). Drie criteria werden gebruikt om de succesvolle paar fluoroforen met ionenkanalen onderscheiden: 1) emissiespectra van de fluoroforen behoeftenniet overlappen (zie referenties 20,21 voor meer informatie); 2) de expressie van het gelabelde construct genereert functionele ionkanalen in recombinante cellen zoals bevestigd met standaard elektrofysiologische werkwijzen; en 3) de expressie van het controle construct levert een robuust de fluorescentie. Als een van deze criteria niet wordt voldaan, bijvoorbeeld indien de insertie van het label of de fluorofoor verstoort kanaalfunctie, men terug naar af en ofwel de plaats van insertie van de externe epitoop en / of de insertieplaats wijzigen van de fluorofoor. Een linker van 5-glutamine residuen tussen de C-terminus van het eiwit en de fluorofoor kan helpen om de eiwitfunctie te verbeteren. Bovendien kan het helpen om de externe epitoop in grote lussen die niet bekend is dat een cruciale rol in eiwitfunctie en / eiwit glycosylatiepatronen automatisch wordt weergegeven. Men moet ook bewust zijn van kleine technische aspecten.
Het slagingspercentage van liposoom-gemedieerde transfectie in TSA-201 cellen kan worden verminderd na het inbrengen van de twee epitopen binnen Ca V α2δ1. Daarom wordt voorgesteld om de transfectie-efficiëntie met de nieuwe DNA-constructen herijken. Dit gebeurt omdat het inbrengen van een 30 kDa eiwit verandert het molecuulgewicht van het DNA. 2-1:: Men kan de DNA liposomen verhouding wijzigen 1 3 eventueel of incuberen van de cellen bij 37 ° C gedurende langere tijd (24-72 uur). Het is belangrijk om de juiste formulering kiezen permeabiliseren de cellen. De meeste zelfgemaakte oplossingen getaxeerd voor dit project bleek te zorgen dat de cellen te aggregeren en verstoppen de flowcytometer.
Terugdringen van blootstelling aan licht terwijl kleuren van de cel met de fluorofoor geconjugeerd antilichaam essentieel fotobleken en signaalverlies beperken. Fluorescerende achtergrond te minimaliseren, is het belangrijk om de overmaat van geconjugeerd antilichaam centrifuge voor gebruik. Tenslotte is het van het uiterste belang t analyserenhij cellen op de flowcytometer zo spoedig mogelijk en uiterlijk 24 uur na. Het houden van de gekleurde cellen overnacht bij 4 ° C zal waarschijnlijk verminderen het signaal en afbreuk celoverleving. Variaties in de intrinsieke fluorescentie van de fluorofoor geconjugeerde antilichaam van partij tot partij dicteren dat de fluorescentie-intensiteit van de testconstruct moeten worden gerapporteerd als functie van de fluorescentie-intensiteit van de controle construct tot expressie gebracht onder dezelfde experimentele omstandigheden.
Een algemene goede signaal-ruisverhouding te bereiken, is het raadzaam om mobiele pipetteren minimaliseren celdood te verminderen en voorzichtig resuspendeer de cellen zodat een 3 x 10 6 cellen / ml worden geïnjecteerd in de flowcytometer. Pas op dat een hogere concentratie cel de cel stroom zal verminderen en kon de flowcytometer verstoppen. Aan de andere kant zal een lagere celconcentratie langere verwerkingstijd vraagt. Men kan dus moeten de concentratie afhankelijk van het ty aanpassenpe cellen te analyseren.
Alternatieve assays toevoeg methoden ingezet om de aanwezigheid van ionenkanalen aan het celoppervlak plasmamembraan tot documenten in vier grote categorieën: 1) Confocale beeldvorming gebruikmakend van de hoge-affiniteit interactie tussen het fluorofoor-geconjugeerde antilichamen en het doeleiwit; 2) eiwit chemische technieken die op de covalente modificatie van het doeleiwit door biotinylatie reagens; 3) Elektrofysiologische maatregelen van niet-stationaire ruis analyse; en 4) foto-affiniteit labeling van het doeleiwit met radioactieve probes. Bij het spanningsgevoelige calciumkanaal, affiniteit labeling met getritieerd (±) - [3 H] PN 200-100, een hoge affiniteit ligand van de dihydropyridine familie werd intensief gebruikt in de jaren 1980 31. Het blijft een zeer gevoelige test, maar het gaat de manipulatie van radioactief materiaal 31, die uit de mode is ontstaan wegens de komstvan zeer gevoelige fluorescentie en luminescentie sondes vooral bij jongere onderzoekers. Bovendien is het onmogelijk om ionkanaal activiteit te meten in de aanwezigheid van de antagonist, zodat de correlatie tussen de oppervlakte-expressie en functie valt buiten het bestek van deze aanpak. Aan het andere einde van de experimentele continuüm, niet-stationaire ruis van ionenkanalen zijn hoogwaardi- gigaseal patch-clamp met stabiele basislijn voor minuten durende opnamen. Met deze benadering kan men het aantal geopende ionkanalen extract in een enkele cel uit de helling van de grafiek uitzetten van de ruisvariantie als functie van de gemiddelde gemeten stroom op een bepaald potentiaal 32-34. Het toont dezelfde attributen van standaard elektrofysiologische benaderingen. Het is een arbeidsintensief en low-throughput methode vereist bovendien zeer vertrouwd met spectrumanalyse 32-34, geen hoofdbestanddeel van cel biologen. Bovendien is dit type analysis wordt het aantal actieve ionkanalen (in geopende toestand) dat anders is dan het totale aantal eiwitten op de membraan kan zijn. Labeling van celoppervlakte-eiwitten met biotine reagens is een betrekkelijk efficiënt middel om eiwitten aanwezig op het plasmamembraan identificeren. Deze methode maakt de covalente modificatie van membraaneiwitten door biotine en andere hoge affiniteit en hoge specificiteit niet-covalente binding van biotine-membraan impermeant streptavidine of avidine moleculen. Deze aanpak is kwalitatief betrouwbaar, maar wordt gehinderd of beperkt door kwantificering kwesties regelmatig in verband met het openbaren van eiwitten met behulp van de western blot-techniek. Confocale beeldvorming en zijn derivaten worden wijd gebruikt om de co-lokalisatie van membraaneiwitten met het celoppervlak 35 documenteren. Kwalitatieve plasmamembraan isolatie mogelijk blijft met gebruikmaking van differentiële centrifugatie technieken met of zonder sucrose gradiënt 36. Zoals in de bovenbeschreven flowcytometrie assay Het vertrouwt op de zeer specifieke interactie tussen het doeleiwit en een fluorofoor geconjugeerd antilichaam. Totale interne reflectie fluorescentie beeldvorming in het bijzonder, is een krachtige aanpak die de verdeling en moleculaire gedrag van enkelvoudige ionenkanalen in het membraanoppervlak 37,38 kunnen melden. De uitlezing is zeker in het oog springende, maar blijft een low-throughput small-volume aanpak. Al deze assays hebben hun wetenschappelijke waarde. De high-throughput flowcytometrie gebaseerde bepaling superieur qua uitlezing reproduceerbaarheid en meetbare metrics maar vereist eenvoudige multi-laser flowcytometrie celsorteerders die deel uitmaken van kernfaciliteiten in grote instellingen. Fluorescentie gebaseerde plaatlezers goedkoper en toegankelijker maar de signaal-ruisverhouding verkregen gemeten met dezelfde constructen onder dezelfde experimentele omstandigheden was significant lager grotendeels het gevolg van een hogere fluorescentie achtergrond. Kosten van de fluorofoor geconjugeerd eentibodies kan terzijde worden in het bijzonder door het aantal passende controle-experimenten die moeten worden verwerkt met de testconstructen. Variaties op hetzelfde thema omvatten het veranderen van de fluorescente kleurstof-geconjugeerd antilichaam aan kosteneffectieve mierikswortelperoxidase of alkalische fosfatase-enzym reporter antilichamen die enzymactiviteit kan worden getest door chemiluminescentie 29,30.
Conclusie: Twee-kleuren fluorescentie assays werden ontwikkeld om de relatieve celoppervlak expressie van recombinante eiwitten tot expressie gebracht in gekweekte cellen met behulp flowcytometers schatten. Hoewel slechts twee fluorescerende parameters werden gebruikt in de huidige assay, stromingscytometrie vatbaar is voor de gelijktijdige detectie van meer dan 30 fluorescente probes op een enkele cel, waaruit de hoge flexibiliteit van deze aanpak. Deze high-throughput ultragevoelige test kan worden aangepast om het effect van genetische mutaties 22,26 of posttranslationele gewijzigd engineering onderzoekenons 23, en het bestuderen van de farmacologisch profiel van chaperones de handel oppervlak van membraaneiwitten technieken 39. De impuls achter dit protocol is ontstaan uit de noodzaak te evalueren afzonderlijk de invloed van genetische mutaties op de expressie van membraan ionenkanalen in recombinante cellen. Het is echter belangrijk op te merken dat de ernst van mutant dysfunctie in model cellijnen niet altijd correleert met de ernst van de klinische symptomen in gendragers 5 deels vanwege een combinatie van mutaties in verschillende allelen nodig zijn om plotselinge hartdood 40 activeren , 41. In dit verband kan deze test worden beschouwd als het verschaffen van een snelle eerste-stap benadering bestuderen één of meerdere mutaties in een enkel gen geassocieerd met verlies-van-functie mutaties 22. Het is echter aannemelijk voor te stellen in de toekomst de-virus gemedieerde expressie van dezelfde constructen in gedifferentieerde cellen van cardiomyocyte afstamming. Overall, in vergelijking met andere beeldvormende of luminescente technieken flow cytometer sorteerders met levend cellen in suspensie en verslag fluorescentie-intensiteit van een homogene celpopulatie. Dit proces wordt uitgevoerd zonder dat fixatie met paraformaldehyde, een proces dat lokale plasmamembraan permeabilisatie induceert, zelfs onder milde omstandigheden 42. De test is snel, specifiek en gemakkelijk via de analyse van tot enkele honderden monsters per werkdag. Naast analyses, kunnen de cellen uiteindelijk gesorteerd door flow cytometrie van de functionele mogelijkheden van cellen die hogere of lagere niveaus van dezelfde membraaneiwit beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523). |
| Tubes 1.5 ml | Sarstedt | 72-690-001 | |
| Tubes 15 ml | Sarstedt | 62-554-002 | |
| Disposable graduated Tranfer Pipets | VWR | 160001-192 | |
| 100 mm culture dish | Corning | 430167 | For standard culture of HEKT cells. |
| 35 mm culture dish | Falcon | 353001 | For standard culture of HEKT cells. |
| Serological pipette 1 ml | Sarstedt | 86.1251.001 | |
| Serological pipette 5 ml | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serological pipette 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Serological pipette 25 ml | Sarstedt | 86.1285.001 | |
| Dulbecco's high-glucose medium | Life Technologies | 12100-046 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin | Life Technologies | 16140-071 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red | Life Technologies | 25300-062 | |
| 1.5 ml microtubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher | BP661-10 | Can be "home-made". |
| Anti-HA FITC conjugated antibody | Sigma | H7411 | |
| IgG1−FITC Isotype Control antibody | Sigma | F6397 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C. |
| Hemacytometer | Fisher | 49105161 | |
| Trypan Blue | Fisher | 15250061 | To access cell viability. |
| Refrigerated Microcentrifuge, 5430R | Eppendorf | A14H172200 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Fisher | 370 | |
| Laboratory Platform Rocker | Fisher | 545034 | |
| Water Bath | VWR | 89032-216 | |
| BD FACSARIA III | BD Biosciences | 648282 | Flow cytometer. |
| FlowJo Software v10 | FlowJo | FlowJo v10 Dongle | For data analysis. |
References
- Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
- Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
- Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
- Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
- Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
- Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
- Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
- Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
- Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
- Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
- Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
- Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
- Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
- Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
- Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982 (2014).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
- Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
- Rothe, G. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. , Karger. Basel. 53-88 (2009).
- Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
- Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
- Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
- Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
- Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
- Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
- Cockcroft, C. J. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).
- Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
- Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
- Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
- Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
- Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
- Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
- Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
- Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
- Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
- Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. , (2016).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).
