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Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

Published: September 28, 2016 doi: 10.3791/54732
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Département de Physiologie Moléculaire et Intégrative, Montreal Heart Institute Research Centre, 2Département de Microbiologie, Infectiologie, Immunologie, Centre de recherche de l'Hôpital Maisonneuve-Rosemont

Summary

aritmie cardiache ereditarie sono spesso causate da mutazioni che alterano la consegna di superficie di uno o più canali ionici. Qui, ci adattiamo citometria a flusso saggi di fornire una quantificazione della espressione proteica totale e superficie cellulare relativa dei canali ionici ricombinanti espressi in TSA-201 cellule.

Introduction

Questo documento fornisce un test affidabile per segnalare il relativo espressione superficie cellulare di proteine ​​di membrana, quali canali ionici espressi in cellule ricombinanti utilizzando la tecnologia di citometria a flusso esistente. I canali ionici sono proteine ​​di membrana che formano pori che sono responsabili del controllo segnali elettrici dal gating il flusso di ioni attraverso la membrana cellulare. Essi sono classificati dal meccanismo di attivazione, la natura e la selettività di specie ioniche in transito attraverso il poro dove sono localizzate. A livello cellulare e dei tessuti, i flussi ionici macroscopici attraverso i canali ionici sono il prodotto di proprietà 1 biofisica (gating e permeazione), biochimici (fosforilazione), e biogenesi (sintesi, glicosilazione, il traffico, e la degradazione). Ciascuno di questi processi è unico per ogni tipo di canali ionici ed è ottimizzato per svolgere il ruolo fisiologico del canale ionico. Di conseguenza, alterazioni in nessuno di questi processi di precisione La attraverso unereditaria o una modificazione genetica, spesso definito come "canalopatia", può essere dannoso per l'omeostasi cellulare. È importante sottolineare che fornire l'importo "diritto" di canali ionici sulla superficie cellulare è fondamentale per l'omeostasi cellulare. Anche piccoli incrementi (guadagno-di-funzione) e lievi diminuzioni (perdita-di-funzione) in attività di canale ionico hanno il potenziale di causare una grave patologia nel corso della vita. Difetti nella consegna superficie cellulare dei canali ionici maturo è un importante determinante in numerosi canalopatie, come la fibrosi cistica (CFTR canale ionico) 2 e aritmie cardiache della forma lunga sindrome del QT (canali del potassio cardiaci) 3.

Canalopatie sono associati con cardiaca improvvisa morte 4. L'attuale diffusione a livello mondiale di tutti i canalopatie cardiache è pensato per essere di almeno 1: 2,000-1: 3.000 per individuo 5 e sono responsabili di circa la metà di improvvisa aritmica ca morte cardiacases 6. Disfunzione cardiaca voltaggio-dipendenti sodio, potassio, calcio-e canali ionici selettivi sono noti per svolgere un ruolo chiave in questo processo. Il 1.2 canali del calcio voltaggio-dipendenti L-tipo Ca V è tenuta ad avviare sincronizzato cuore la contrazione muscolare. Il cardiaca L-tipo Ca V 1.2 canali è un complesso proteico multi-subunità composto principale pore-forming Ca V α1 subunità e Ca V ß e Ca V α2δ1 subunità ausiliari 7-12. Si noti che la serie completa di subunità ausiliari è necessaria per produrre funzionali Ca V 1.2 canali a livello della membrana plasmatica e le interazioni dinamiche tra queste subunità sono essenziali per sostenere la funzione elettrica normale del cuore 13. Ca V ß promuove la superficie espressione cellulare di Ca V 1.2 canali attraverso un non-covalente nanomolari interazione idrofobica 14. Co-espressione del Ca V α2δ1 subunità wi° Ca V ß-bound V α1 Ca stimola l'espressione corrente di picco (da 5 a 10 volte) e promuove attivazione del canale a tensioni più negativi. Guadagno-di-funzione mutazioni della subunità pore-forming Ca V 1.2 sono stati associati con una forma di aritmia ventricolare chiamato la sindrome del QT lungo 15, mentre una serie di mutazioni puntiformi nelle tre principali subunità che formano il L-tipo Ca V 1.2 canali sono stati identificati nei soggetti affetti da aritmie del breve QT modulo sindrome di 16,17. I canali ionici sono proteine ​​di membrana che possono essere studiati da un punto di vista biochimico (chimica delle proteine) o utilizzando gli strumenti di elettrofisiologia (macchine generatori di corrente) e spesso utilizzano questi approcci complementari. Elettrofisiologia, in particolare whole-cell patch-bloccaggio, è un approccio adatto per chiarire la funzione dei canali ionici 15, ma non è in grado di risolvere le modifiche nel traffico di proteine da cambiamenti nella loro biofisicaproprietà. Proteina chimica ha, tuttavia, spesso uso limitato a causa della relativamente bassa espressione di grandi proteine ​​di membrana relativi alle proteine ​​solubili piccoli. Robusti metodi high-throughput utilizzando la fluorescenza di lettura devono essere sviluppate al fine di affrontare specificamente i difetti di biogenesi di proteine ​​che causano cambiamenti nell'espressione superficie cellulare dei canali ionici.

Citometria a flusso è una tecnologia impiegata in biofisica conteggio delle cellule, l'ordinamento, la rilevazione biomarker, e ingegneria proteica 18. Quando una soluzione campione di cellule vive o particelle viene iniettato in un citometro di flusso, le cellule sono ordinate in un unico flusso che può essere controllato di sistema di rilevamento della macchina (figura 1). Il primo citofluorimetro atto prodotto nel 1956 19 rilevato un solo parametro, ma moderni citofluorimetri avere più laser e rilevatori di fluorescenza che consentono il rilevamento di più di 30 parametri fluorescenti 20,21.Filtri e specchi (ottica di emissione) dirigono la diffusione luminosa o luce fluorescente di cellule ad una rete elettronica (fotodiodo e rilevatori) che convertono la luce in proporzione alla sua intensità. I dati digitali vengono analizzati utilizzando software specializzati e l'uscita principale viene visualizzato come un diagramma a punti 21.

Figura 1
Figura 1:. Principi biofisici di citometria a flusso ordinamento celle singole sono spinti attraverso un ugello ad alta pressione all'interno di un flusso di liquido guaina che li muove attraverso uno o più punti di interrogatorio laser. Il fascio di luce viene deviato da cellule di passaggio e la luce raccolta in direzione avanti (Forward Scatter, FCS) viene inviata ad un fotodiodo che converte la luce in un segnale proporzionale alla dimensione della cella. La luce viene raccolta anche ad un angolo di 90 ° rispetto alla traiettoria laser e inviato ai rivelatori (chiamati anche fotomoltiplicatori (PMT)).Questa luce viene instradato attraverso specchi dicroici che permettono la rilevazione del segnale side scatter (SSC), che riflette la granularità all'interno delle cellule, e le emissioni fluorescenti se fluorocromi eccitati sono presenti nella cellula. Tre rivelatori (verde, giallo e rosso) sono rappresentati con diversi filtri passa-banda di lunghezza d'onda, permettendo la rilevazione simultanea di diversi fluorocromi. I diversi segnali vengono digitalizzati da un computer esterno e convertiti in dati che verranno analizzati per quantificare le caratteristiche delle cellule. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

La capacità high-throughput di citometri a flusso è stata sfruttata per quantificare l'espressione di membrana relativo di ricombinante wild-type e la tratta con deficit di voltaggio-dipendenti di tipo L Ca V 1.2 canali e subunità associati in cellule vive. cDNA costruisce coding per le proteine ​​erano doppiamente etichettato avere simultaneamente un epitopo non fluorescente extracellulare che può essere rilevata da un anticorpo coniugato fluorescente impermeabile e un fluoroforo intracellulare che è costitutivamente fluorescente. Sia l'epitopo extracellulare, inserito in un loop extracellulare della proteina, e il fluoroforo intracellulare, inserito dopo il C-terminale, sono tradotti con la proteina. In questa serie di esperimenti, la proteina Ca V α2δ1 è stato progettato per esprimere un emoagglutinina extracellulare (HA) epitopo (YPYDVPDYA) rilevata da un impermeabile FITC (fluoresceina isotiocianato) coniugata anti-HA e mCherry come fluoroforo intracellulare intrinseca. Per determinare il relativo livello di espressione della superficie delle cellule del V α2δ1 mCherry-Ca proteina HA-tag, le cellule ricombinanti che esprimono la proteina di fusione sono state raccolte dopo la transfezione, e colorati con la FITC-coniugato topo monoclonale anti-HA tag epitopo gli anticorpiy (Figura 2). FITC è un composto fluorescente organico che è considerevolmente inferiore rispetto reporter enzimi e quindi improbabile interferire con la funzione biologica. mCherry- Ca V α2δ1-HA sovraespresso in Tsa-201cells, produce un significativo aumento di 3 log in fluorescenza FITC e mCherry fluorescenza appezzamenti bidimensionali 22. Dato che l'epitopo HA si trova nella porzione extracellulare della proteina, l'intensità di fluorescenza per FITC ottenuta in presenza di cellule intatte riflettono l'indice relativa della superficie cellulare espressione di proteine ​​HA-tag. L'accessibilità del epitopo HA nei costrutti è sistematicamente convalidata misurando il segnale FITC dopo permeabilizzazione cellulare. Questa misura serve anche a corroborare l'espressione della proteina totale normalizzato dal momento che le intensità di fluorescenza relative per FITC stimati in cellule permeabilizzate sono qualitativamente paragonabili ai valori di fluorescenza relativi FOR mCherry misurato in condizioni permeabilizzate e non permeabilizzate 22,23. È importante notare che lo spettro di fluorescenza intrinseca è spostato verso valori più elevati dopo permeabilizzazione ma che l'unico valore di essere rilevato è la variazione di intensità di fluorescenza rispetto al costrutto controllo. variazioni relative l'intensità di fluorescenza per i costrutti di prova sono stimate utilizzando la Intensity ΔMean fluorescenza (ΔMFI) i valori per ciascun fluoroforo (mCherry o FITC). Gli esperimenti sono progettati per misurare l'intensità di fluorescenza della prova costrutto relativa all'intensità di fluorescenza del costrutto di controllo espressa nelle stesse condizioni sperimentali per limitare le variazioni nella fluorescenza intrinseca dell'anticorpo fluoroforo-coniugato. Due proteine di membrana sono stati studiati con successo utilizzando questo test: la subunità pore-forming del canale del calcio voltaggio-dipendenti di tipo L Ca V 1.2 14,22 e in una diversa serie diesperimenti, il extracellulare ausiliario Ca V α2δ1 subunità 22,23. Il seguente protocollo è stato utilizzato per determinare l'espressione superficie cellulare del Ca V α2δ1 subunità del cardiaca L-tipo Ca V 1.2 canale in condizioni di controllo e dopo mutazioni colpendo la modifica post-traslazionale del canale ionico. In condizioni sperimentali standardizzate, la fluorescenza superficie cellulare di FITC aumenta quasi linearmente con l'espressione di cDNA codificanti per le proteine α2δ1-HA mCherry-Ca V (Figura 5 dal riferimento 22).

figura 2
Figura 2:. Rappresentazione schematica di etichettatura totale e membrana in citometria a flusso protocollo sperimentale Lo schema illustra alcuni dei principali passi necessari per quantificare l'espressione relativa totale e superficie cellulare dei canali ionici ricombinanti di flOW citometria. Le cellule sono trasfettate con la costruzione doppia marcatura mCherry-Ca V α2δ1-HA in TSA-201 celle (1) e colorate prima o dopo permeabilizzazione (2). Dati multiparametrica vengono acquisiti in un citofluorimetro (3) per l'analisi multivariata (4). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Protocol

1. costrutti Doppiamente Tagged DNA

  1. Inserire l'epitopo HA (YPYDVPDYA) nel linker extracellulare di Ca V α2δ1 tra D676 e R677 per mutagenesi sito-specifica (figura 3B) 20. Utilizzare gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC Forward primer e Reverse acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC primer.
  2. Subclone la sequenza cDNA della targhetta V α2δ1 HA Ca nel vettore di espressione di mammifero pmCherry-N1 progettato per esprimere la proteina fusa all'N-terminale di mCherry tra i siti SacI e Sali (Figura 3B) 20.
    NOTA: La funzione di canale appropriato deve essere testato con il costrutto di controllo utilizzando metodi elettrofisiologici standard di 24.

2. trasfezione transiente liposomi-mediata (30 min, tutti i passaggi vengono eseguite sotto flusso laminare Hood)

  1. Giorno 1: Piastra mezzo milione di TSA-201 cellule (o HEKT) a35 piatti della cultura mm con 2 ml di Dulbecco di mezzo essenziale minimo di alta glucosio (DMEM-HG) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e l'1% di media (PS) cultura di penicillina-streptomicina. Contare le cellule utilizzando un emocitometro standard. Valutare vitalità cellulare da una frazione del campione cella utilizzando Trypan Blue. Piatto abbastanza cellule per raggiungere il 90% di confluenza al momento della transfezione.
  2. 2 ° giorno: Modifica terreno di coltura con 2 ml di (37 ° C) mezzo fresco pre-riscaldato cultura senza PS.
  3. Per ogni campione trasfezione, preparare due provette da 1,5 ml. Nel tubo 1, diluire 4 mg di DNA in 250 ml di media siero ridotto. Nel tubo 2, miscelare 10 ml di reagente trasfezione liposomi-mediata con 250 microlitri terreno di coltura siero ridotto. Mescolare delicatamente il reagente di trasfezione prima dell'uso.
  4. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Unire il contenuto della provetta 1 e il tubo 2, mescolare delicatamente e incubare almeno 20 minuti a temperatura ambiente.
  6. Aggiungere i liposomi / DNA complessi alle cellule in coltura e delicatamente roccia piatto cultura per mescolare.
  7. Incubare a 37 ° C sotto 5% CO 2 ambiente per 24 ore.

3. colorazione delle cellule di citometria a flusso (3 ore)

  1. Preparazione campioni di cellule
    1. Giorno 3: Rimuovere media dal piatto cultura accuratamente e lavare le cellule con 400 ml di pre-riscaldato (37 ° C) 0,05% tripsina-EDTA 1x (acido etilendiamminotetraacetico).
    2. Aggiungere 400 ml di tripsina-EDTA e incubare il piatto a 37 ° C sotto 5% CO 2 ambiente per 5 min per permettere alle cellule di staccarsi dal piatto.
    3. Fermare la digestione enzimatica con l'aggiunta di 1 ml di terreno di coltura freddo senza PS e lavare tutte le cellule dalla superficie pipettando delicatamente 4-5 volte. Evitare un eccesso di digestione e over-pipettaggio per ridurre la morte cellulare.
    4. Raccogliere le cellule in provette da 1,5 ml e mettere immediatamente in ghiaccio. Utilizzare soluzioni fredde di ghiaccio e mantenere le cellule a 4 ° C per evitare l'internalizzazionedi superficie antigeni. Ridurre l'illuminazione per limitare photobleaching del segnale fluorescente.
    5. Tubi centrifugare a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Con attenzione aspirare e scartare il surnatante.
    6. Risospendere il pellet in 1 ml di 1x PBS (PBS) per preparare una sospensione singola cella.
    7. Brevemente vortice i tubi molto delicatamente e ripetere i punti 3.1.5 e 3.1.6 per rimuovere completamente terreno di coltura.
    8. Risospendere il pellet in 600 ml di PBS 1x e regolare la concentrazione cellulare a un minimo di 3 x 10 6 cellule / ml.
    9. Dividere le celle in due nuove provette da 1,5 ml per la colorazione extracellulare e intracellulare. Includere controlli appropriati per discriminare colorazione specifica colorazione aspecifica.
      NOTA: L'anticorpo controllo isotipico aiuta a valutare il livello di colorazione di fondo e idealmente dovrebbe corrispondere ogni anticorpo primario specie ospite, isotipo e fluoroforo. Utilizzare il controllo isotipo e anticorpo coniugato allo stessoconcentrazione proteica.

Tabella 1
Tabella 1: Flow-citometria a campioni di controllo esperimento per non permeabilizzate e permeabilizzate cellule Ogni esperimento deve includere i seguenti controlli negativi:. (1) le cellule Nontransfected (senza anticorpi, con l'isotipo o con l'anticorpo coniugato). (2) Le cellule trasfettate con la proteina di interesse subclonato in un plasmide senza costitutiva fluorocromo intracellulare fluorescente (pCMV- Ca V α2δ1-HA) o con la costruzione doppiamente tag (pmCherry-Ca V α2δ1 e incubate senza anticorpi, con isotipo o con l'anticorpo coniugato). controlli del colore singoli vengono utilizzati per la compensazione delle emissioni di sovrapposizione fluorocromo. Gli stessi controlli vengono eseguiti per non permeabilizzate e condizioni permeabilizzate in ogni serie di esperimenti.

  1. La colorazione delle cellule della superficie di Intactcellule vive
    1. Aliquota 1 x 10 6 cellule / ml 100 in provette da 1,5 ml.
    2. Aggiungere l'anticorpo monoclonale anti-HA FITC-coniugato a 5 ug / ml e, vortex prima incubando le cellule su una piattaforma bilanciere (200 rpm) al buio a 4 ° C per 45 min.
      NOTA: La concentrazione ottimale di anticorpi è stata determinata in esperimenti preliminari titolazione (Figura 4).
    3. Rimuovere le cellule dal buio e aggiungere 900 ml di PBS 1x / tubo. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    4. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di PBS 1x, vortex e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    5. Ripetere il lavaggio (fase 3.2.4) due volte per rimuovere qualsiasi anticorpo non legato. Se viene utilizzato un anticorpo primario non coniugato, incubare con l'anticorpo secondario appropriato.
    6. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in 500 ml di PBS 1x e trasferire la sospensione cellulare singolo in 5 ml citometria a flusso tubi. Tenere il cellulares al buio a 4 ° C fino ad ottenere il campione.
    7. Eseguire i campioni su un citometro di flusso. Per ottenere risultati ottimali, analizzare le cellule sul citometro appena possibile e non oltre 24 ore dopo.
  2. Colorazione intracellulare: fissazione, permeabilizzazione, e la colorazione
    1. Aliquotare 1 x 10 6 cellule / 100 ml in provette da 1,5 ml e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    2. Eliminare le cellule surnatante e risospendere in 100 ml di soluzione di fissaggio-permeabilizzazione direttamente dal magazzino.
    3. Incubare al buio a 4 ° C per 20 min.
    4. Aggiungere 100 ml di tampone 1x permeabilizzazione-lavaggio preparati al momento (diluire 10x tampone permeabilizzazione-lavaggio in acqua distillata H 2 O). cellule Vortex e sedimenti utilizzando una centrifuga tavolo a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    5. Aspirare e scartare il surnatante.
    6. Ripetere i punti 3.3.4 e 3.3.5.
    7. Aggiungere FITC-coniugato anticorpo monoclonale anti-HA a 5ug / ml in 100 ml di 1x tampone permeabilizzazione lavaggio e, vortex prima incubando le cellule al buio a 4 ° C per 30 min.
      NOTA: La colorazione intracellulare viene eseguita seguendo la stessa procedura come quella utilizzata per la colorazione della superficie cellulare. Saponina-mediata permeabilizzazione cella è tuttavia un processo rapido reversibile, quindi è importante sostituire PBS 1x con 1x tampone Perm / Wash per mantenere le cellule in presenza costante di saponina durante la colorazione intracellulare.
    8. Rimuovere le cellule dal buio e aggiungere 100 microlitri di buffer permeabilizzazione-lavaggio. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    9. Aspirare con attenzione il surnatante e risospendere il pellet in 100 microlitri di buffer permeabilizzazione-lavaggio, vortex e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    10. Ripetere il lavaggio (fase 3.3.9) ancora una volta per rimuovere l'anticorpo non legato.
    11. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in 500 ml di PBS 1x e trasferire il peccatosospensione cellulare GLE a 5 ml flusso citometria a tubi. Mantenere le cellule al buio a 4 ° C fino iniettando il campione nella citofluorimetro.
    12. Eseguire i campioni su un citometro di flusso. Eseguire i campioni fissi sul citometro nel più breve tempo possibile, e comunque non oltre 1 settimana dopo la colorazione. Eseguire le cellule non permeabilizzate e permeabilizzate nello stesso giorno.

4. Citometria a Flusso

  1. Citofluorimetro cellulare Sorter giornaliera Setup
    1. Accendere il software di citometria a flusso. Prima di sperimentare, calibrare e impostare il citofluorimetro cell sorter per garantire prestazioni ottimali dello strumento (ad esempio il laser e ottica sta eseguendo le specifiche, il laser e il flusso delle cellule sono allineati correttamente) utilizzando perline di impostazione dello strumento.
    2. Utilizzare l'ugello 100 micron con 20 psi pressione guaina.
      NOTA: L'ugello non deve essere modificato su una panchina citometro a flusso.
    3. Impostare la portata del citometro secondo il manufacturspecificazione ER. Estremamente alte portate diminuirà sensibilità nella rilevazione di variazioni nella fluorescenza.
    4. Selezionare blu (488 nm per eccitare fluoresceina Isothiocayanate o FITC) e di colore giallo-verde (561 nm per eccitare mCherry) laser. Raccogliere FITC e mCherry livelli di fluorescenza con un nm 530/30 e 610/20 con un filtro passa-banda nm rispettivamente.
    5. Acquisire la dispersione in avanti (FCS) rispetto a lato scatter (SSC) diagramma a punti per le cellule non colorate con scala lineare. Regolare l'amplificazione di ogni rivelatore di visualizzare le cellule nel quadrante in basso a sinistra del grafico dot.
  2. Esempio di lettura di cellule intatte non permeabilizzate
    1. Impostare la P1gate per cellule non permeabilizzate vivi delineando una forma libera attorno alle cellule da analizzare escluse detriti cellulari e aggregati di cellule, limitando così il segnale di fluorescenza di cellule intatte.
      Nota: Live / coloranti di esclusione morti possono essere utilizzati per facilitare il posizionamento cancello a cellule vive. Impostare 10.000 eventi da registrarenel P1 porta arresto. Impostare questo a un maggior numero di eventi se necessario.
    2. Acquisire mCherry contro FITC trama di contorno a due parametri per rilevare autofluorescenza basale delle cellule non colorate. Utilizzare scala bi-logaritmica per mostrare valori negativi e migliorare la risoluzione tra le popolazioni 25. Regolare la tensione di ciascun sensore per impostare le cellule negative non colorate nella porzione inferiore delle prime dieci unità di piazzole intensità log fluorescenza.
    3. Acquisire tutti i campioni intatti non permeabilizzate utilizzando le impostazioni stabilite in 4.1.5 e 4.1.6 e raccogliere FSC, SSC e segnali nei rivelatori di fluorescenza.
    4. salvare i file * .fcs Export e da utilizzare per l'analisi mediante citometria a flusso software di analisi.
  3. Esempio di lettura di celle permeabilizzate
    1. Spostare il cancello P1 per selezionare cellule vive nei campioni permeabilizzate e regolare FSC e la tensione SSC come indicato in 4.1.5 e 4.1.6.
    2. Acquisire tutti i campioni permeabilizzate e raccogliere FSC, SSC unasegnali ND nei rivelatori di fluorescenza.
    3. salvare i file * .fcs Export e da utilizzare per l'analisi mediante citometria a flusso software di analisi.
  4. Analisi dei dati
    1. Avviare la citometria a flusso file del software di analisi e di importazione * .fcs salvati in 4.2.4 e 4.3.3.
    2. Fare clic sul primo campione elencato nella finestra di lavoro. Una nuova finestra prende il nome dal numero di ID tubo si apre automaticamente. Avviare il processo di gating nella trama di SSC contro FSC. Disegnare una porta (P1) utilizzando l'icona Ellisse intorno cellule vive ed eliminare tutti i residui, le cellule morte, o aggregati che hanno diversi scatter in avanti e scatter laterale di cellule vive
    3. Per disegnare la trama di contorno a due parametri del mCherry (asse y) rispetto FITC (asse x) intensità di fluorescenza delle cellule vive, clicca prima sul ascisse e scegliere la FITC-un canale e poi clicca sul y -axis e scegliere la PE-mCherry-Un canale. Clicca sull'icona "Quad" per posizionare l'indicatore quadrante sul bordo di uncellule utofluorescent in ogni canale di fluorescenza.
      NOTA: Il cancello impostare intorno alle cellule positive FITC e mCherry è la porta P2. La popolazione cellulare negativa fluorescenza viene indicato come la porta P3. Vedere la Figura 5 per il metodo di gating rappresentante utilizzato in questo articolo.
    4. Selezionare P2 e P3 porte e cliccare sull'icona "Aggiungi Statistica" nella finestra di lavoro originale. Clicca su "Count" (numero di cellule positive) e cliccare su "media" (Media di Fluorescenza intensità di ogni fluorocromo) o "mediano" (mediana fluorescenza intensità di ogni fluorocromo) statistiche tra l'elenco delle opzioni. Fare clic sull'icona "Aggiungi statistiche" di nuovo. Tutti questi valori vengono trasferiti automaticamente alla finestra di lavoro originale.
      NOTA: La "media" è usato solo se l'intensità di fluorescenza segue una distribuzione normale. In ogni altro caso, fare clic sulla scheda "mediana". MFI quindi potrebbe riferirsi a fluorescenza media intesitày o mediana intensità di fluorescenza.
      NOTA: Il passo successivo è quello di applicare i parametri e le statistiche dei cancelli 'a tutti i campioni rilevati dal citometro.
    5. Nella finestra di lavoro, utilizzare il mouse per trascinare e rilasciare i parametri cancelli e statistiche sulla linea marcata tutti i campioni.
    6. Genera un rapporto lotto di trame bidimensionali di contorno (mCherry vs FITC) e istogrammi (conta delle cellule contro intensità di fluorescenza) per le cellule non permeabilizzate e permeabilizzate (figure 6A - B).
    7. Dalle statistiche generate in fase 4.4.4, calcolare l'intensità di fluorescenza media (MFI) per ogni fluorocromo per le cellule colorate. Da questo valore, sottrarre il valore di MFI ottenuto da cellule non colorate per quantificare la superficie e l'espressione totale della proteina di interesse.
    8. Riportare i valori ΔMFI per ogni fluoroforo (mCherry e FITC) (Figura 6C - D). Normalizzare il ΔMFI misurato per il Ca NOTA: Il valore assoluto dell'intensità della fluorescenza può variare notevolmente a seconda del lotto di anticorpi e le capacità tecniche di ogni laboratorio lavoratore, da qui la necessità di normalizzare l'intensità di fluorescenza del costrutto mutante utilizzando il costrutto WT.

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Representative Results

Questo articolo descrive un protocollo affidabile per quantificare la superficie totale e delle cellule dei canali ionici ricombinanti espressi in TSA-201cells da un flusso a due colori citometria a test. Come esempio, la superficie di cella relativa e l'espressione di proteine totali è stata quantificata per il V α2δ1subunit Ca. Per eseguire il flusso a due colori citometria assay, Ca V α2δ1 stato doppiamente etichettato esprimere un HA epitopo non fluorescente extracellulare che può essere rilevata da un anticorpo anti-HA FITC-coniugato e un fluorescente fluoroforo mCherry intracellulare costitutiva. Gli spettri di eccitazione ed emissione per FITC e mCherry mostrano che FITC viene eccitato con efficienza 88% dal laser 488 nm ma efficienza tende a 0% con il laser 561 nm. Il mCherry mostra 63,9% della sua fluorescenza massima quando eccitato con il laser 561 nm ma solo il 7,6% con il laser 488 nm (Figura 3). L'eccitazione ed emissione spectra per entrambi i fluorofori esporre raccolta della luce ottimale e sovrapposizione minima con i diversi laser e filtri selezionati. Citometria a flusso saggi potrebbero fornire informazioni quantitative sulla relativa espressione di proteine di membrana da una grande popolazione di cellule finché la MFI per il dato fluorocromo è direttamente proporzionale alla espressione della proteina di Ca V α2δ1 su ogni cella piuttosto che il numero di cellule fluorescenti. Ciò comporta l'uso di una concentrazione di anticorpo fluorescenza coniugato là saturazione. La curva di titolazione per l'anticorpo anti-HA FITC-coniugato legame Ca V α2δ1 (figura 4) mostra tre fasi. Mentre nessuna fluorescenza è stato rilevato nella prima fase, l'intensità di fluorescenza aumentata esponenzialmente con l'aumentare della concentrazione di anticorpo nella seconda fase. Dopo il punto di saturazione (terza fase), aumentando la concentrazione dell'anticorpo non ha alcun effetto sulla fluorescenza relativa intensità (RFI) di FITC. Il punto di saturazione anticorpo anti-HA FITC-coniugato è stato stabilito a 5 ug / ml, assicurando così che la concentrazione del coniugato-anticorpo non limiti MFI durante gli esperimenti.

Il Ca V etichettato α2δ1was espresso in TSA-201cells e citometria a flusso test sono stati effettuati in presenza del FITC-coniugato anti-HA in cellule non permeabilizzate (Figura 5). Controlli adeguati (Tabella 1) sono stati analizzati sul citometro di flusso che attribuisce valori xy ad ogni cella che passa attraverso il fascio laser. La distribuzione delle celle viene visualizzato su dot plots (Figura 5A). FCS / SSC dot plots confermano che la preparazione dei campioni di cellule fornisce una sospensione singola cella con alta vitalità (Figura 5ba). Il cancello selezionato per le cellule vive (P1) rappresenta il 75% del numero totale di cellule analizzate. Il totale espressione della proteina of Ca V α2δ1 in TSA-201 cellule è stato considerato proporzionale alla fluorescenza mCherry. Come si è visto nelle mCherry rispetto FITC grafici di contorno e istogrammi (Figura 5BB - AC), 47 2% TSA-201 cellule trasfettate con pmCherry-Ca V α2δ1-HA sono stati trovati ad esprimere in modo significativo mCherry fluorescenza oltre a mostrare notevole fluorescenza FITC causa il legame con la variabile esterna HA di Ca V α2δ1 in cellule non permeabilizzate. esperimenti di controllo negativo eseguiti senza anticorpo o con isotipo indicano che il FITC lega solo o principalmente alle cellule trasfettate positivamente.

Questo protocollo è stato utilizzato per caratterizzare il ruolo di N-glicosilazione sull'espressione totale e superficie cellulare di Ca V α2δ1 in tsA-201cells 23. Gli esperimenti sono stati condotti in cellule non permeabilizzate per valutare l'espressione superficie cellulareed in cellule permeabilizzate per valutare l'espressione di proteine ​​totali oltre a confermare l'accessibilità del epitopo HA. Espressione relativa di Ca V α2δ1 è stato calcolato sulla base delle IFM stimata per ogni fluoroforo (mCherry o FITC). Valori ΔMFI per i mutanti sono stati normalizzati al valore massimo misurato lo stesso giorno per mCherry-Ca V α2δ1-HA WT espresse nelle stesse condizioni. Questo è importante per tenere conto delle variazioni nel tempo dell'intensità di fluorescenza assoluta dell'anticorpo coniugato anti-HA FITC. Come visto in Figura 6A, il ΔMFI per FITC in cellule non permeabilizzate era forte per il WT e 4xNQ costruiscono ma vicino al livello di fluorescenza di sfondo per il costrutto 16xNQ indicando che la proteina è quasi assente dalla membrana plasmatica. Saggi condotti dopo permeabilizzazione delle cellule, ha mostrato che l'espressione di proteine ​​totali del costrutto 16xNQ è stato inoltre ridotto significativamente sia che si trattiè stata dedotta dalla fluorescenza FITC in cellule permeabilizzate o dalla fluorescenza mCherry costitutiva misurata non permeabilizzate e in cellule permeabilizzate (Figura 6C - D). Come si vede nella figura 6B, i livelli di autofluorescenza cellulari aumentati dopo permeabilizzazione cellulare, che impedisce confronto dei valori di fluorescenza assolute tra cellule intatte non permeabilizzate e permeabilizzate. La fluorescenza ΔMFI misurato per mCherry era simile per entrambi i cellule non permeabilizzate e permeabilizzate significare che la soluzione permeabilizzazione non altera il segnale di fluorescenza relativa dei mCherry. Mutazioni dei siti di N-glicosilazione è stato associato con una diminuzione dell'intensità di fluorescenza per mCherry sostegno all'osservazione pubblicata che la proteina biogenesi / stabilità è stato ridotto 23. In questa serie di esperimenti, il segnale di fluorescenza relativa per FITC misurata in cellule permeabilizzate rivelato be ancora più piccola rispetto al segnale relativo per mCherry suggerendo che lo stato di glicosilazione di tipo N della proteina potrebbe influenzare l'intensità di fluorescenza rilevato dal anticorpi FITC-coniugato anti-HA nel dominio extracellulare. Complessivamente i cambiamenti nel relativo fluorescenza del FITC prima dopo permeabilizzazione delle cellule forniscono un affidabile metrico per quantificare l'espressione della proteina.

Figura 3
Figura 3: FITC e mCherry formano una coppia adatta di fluorocromi per saggi citometria a due colori di eccitazione (curve vuote) e spettri di emissione (le curve piene) per FITC eccitato con 488 nm laser blu (Aa) e mCherry eccitato con 561 nm giallo-. laser verde (Ab). FITC e mCherry fluorescenza sono stati raccolti con un 530/30 nm e un 610/20 nm bandpass filtri rispettivamente. La lunghezza d'onda dei laser diversi (linee verticali colorate) ei filtri (rettangoli colorati) sono scelti per la raccolta della luce ottimale e sovrapposizione minima. (B) Rappresentazione schematica di mCherry-Ca V proteina α2δ1-HA. Ca V α2δ1 è stato doppiamente etichettata di esprimere un epitopo HA non fluorescente extracellulare che può essere rilevata da un anticorpo anti-HA FITC-coniugato e un fluorescente fluorocromo mCherry intracellulare costitutiva. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:. Titolazione di anti-HA FITC-anticorpo monoclonale coniugato legandosi a Ca V α2δ1 TSA-201 cellule sono state transitoriamente trasfettate con pmCherry-Ca V & # 945; 2δ1-HA e incubate con una serie di anticorpi anti-HA FITC-coniugati o isotipo. Solo il segnale FITC viene analizzato in questo pannello. (A) solo parametro istogrammi mostrano il numero relativo di celle y e l'intensità di fluorescenza FITC sul asse x per la gamma anti-HA FITC-coniugato anticorpale di concentrazioni (0,01-20 mg / ml). (B) il grafico semi-log per l'anticorpo anti-HA FITC-coniugato in funzione del MFI di FITC. La curva di titolazione è stato montato utilizzando un sito di legame equazione con un valore di linea di tendenza R 2 = 0,99,561 mila. Titolazione eseguita per l'isotipo mostrato alcuna fluorescenza come previsto. Le concentrazioni da 0,001 a 0,01 mg / ml sono indistinguibili dal rumore di fondo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1 "> Figura 5
Figura 5: flusso rappresentante analisi di citometria di non permeabilizzate TSA-201cells trasfettate con pmCherry-Ca V α2δ1-HA (A) Rappresentazione schematica della strategia di gating utilizzato in citometria a flusso campione di analisi.. I dati sono stati analizzati dopo l'acquisizione con il software appropriato. La prima strategia di gating sfrutta un forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) dot plot per visualizzare un cancello (P1) intorno cellule vive ed eliminare tutti i residui, le cellule morte, o aggregati che hanno diversi scatter in avanti e scatter laterale di cellule vive . Due parametri grafici di contorno della mCherry (asse y) rispetto FITC (asse x) intensità di fluorescenza sono stati esposti per la popolazione P1. cancelli rettangolari sono stati collocati sul bordo della autofluorescenza di cellule per selezionare la P2 positiva popolazione (FITC e mCherry) e P3 popolazione negativa. Il livello di fluorescenza per tegli cellule all'interno della regione P2 e P3 sono stati visualizzati utilizzando il conteggio delle cellule successiva contro intensità di fluorescenza istogrammi singolo parametro FITC o mCherry. Un cambiamento nell'intensità di fluorescenza sul ye asse x fornisce un indice affidabile della espressione totale e di membrana di Ca V α2δ1 rispettivamente. L'intensità del segnale di fluorescenza aumenta in funzione del numero di molecole fluorocromi. (Ba) Rappresentante FCS / dot plots SSC per ogni condizione di come si è detto. Un totale di 10.000 eventi sono stati acquisiti per l'analisi. Il cancello ellisse (P1) è disegnato da occhio intorno alle cellule vivi, esclusi gli eventi con bassa FSC (cellule morte) o alte SSC (aggregati). (Bb) rappresentativi di due parametri grafici di contorno del mCherry (asse y) rispetto FITC (asse x) intensità di fluorescenza. Gates sono stati collocati ai margini della autofluorescenza delle cellule per separare popolazioni di cellule positive FITC-mCherry (porta P2 ) e le cellule fluorescenti negativi (P3). (Bc) Single-papara- istogrammi di conteggio relativo (o% max), le cellule rispetto intensità di fluorescenza (FITC o mCherry). La distribuzione dell'intensità di fluorescenza misurata per le cellule all'interno della porta P2 (cellule fluorescenza-positive) sono mostrati in grigio, e la distribuzione di intensità di fluorescenza per cellule presenti nel cancello P3 (cellule fluorescenza-negativo) viene visualizzata come sovrapposizione in un trama grigio trasparente. Come si è visto, l'intensità di fluorescenza è stata forte sia per mCherry e FITC indicando che Ca V α2δ1 è ben espressa e chiaramente presenti alla membrana cellulare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: simultanea mutazioni dei siti -glycosylation N interrotto superficie cellulare expressione di Ca V α2δ1. Stabile cellule TSA-201 Ca V β3 sono state trasfettate in contemporanea con pCMV-Ca V 1.2 WT e pmCherry-Ca V α2δ1-HA WT o mutanti. Non permeabilizzate (A) e le cellule permeabilizzate (B) sono state colorate con anticorpo anti-HA FITC-coniugato come descritto sopra. Rappresentante due parametri grafici di contorno di mCherry rispetto FITC fluorescenza (pannelli a sinistra) e l'istogramma trame della distribuzione dell'intensità di fluorescenza per l'anti-HA FITC colorazione anticorpo coniugato (pannelli di destra) sono indicati per i mutanti -glycosylation N (NQ) dopo la interruzione di quattro siti (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) e 16 siti (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q / N986Q) in cellule non permeabilizzate o NP intatte (a) ed in cellule permeabilizzate o P (B). la distribution dell'intensità di fluorescenza misurata per le cellule all'interno della porta P2 (cellule fluorescenza-positive) sono mostrati in grigio, e la distribuzione di intensità di fluorescenza per cellule presenti nel cancello P3 (cellule fluorescenza-negativo) viene visualizzata come sovrapposizione in modo trasparente trama grigio. Come si è visto in (B), i livelli di autofluorescenza aumentati dopo permeabilizzazione cellulare. L'intensità della fluorescenza per FITC misurato per tutte le cellule transfettate permeabilizzate aumento (visto come un diritto-shift sul asse x) che indica che tutte le proteine V α2δ1 Ca HA-tag trasfettate sono state colorate e rilevati dal anticorpo anti-HA FITC. Grafico (C) Bar mostra la normalizzata MFI misurata in presenza di CIC a (espressione di superficie) intatta non permeabilizzate o cellule permeabilizzate (espressione totale). La densità relativa di fluorescenza è stata misurata in triplicato per ogni condizione (30.000 cellule) e in tre diversi lotti di cellule transfecta per un periodo di 1 mese quindi i dati sono mostrati come media ± SEM per 90.000 cellule per ciascuna condizione. Il picco di intensità di fluorescenza è stato raggiunto tra il 24 e 36 ore dopo la trasfezione. I valori ΔMFI per FITC misurati in cellule non permeabilizzate intatto è stato utilizzato come indice dell'espressione superficie cellulare di Ca V α2δ1-HA, e valori ΔMFI per FITC misurati in cellule permeabilizzate riflettono l'espressione delle proteine totali (superficie cellulare e l'espressione della proteina intracellulare ). ΔMFI per FITC stato calcolato sottraendo l'intensità di fluorescenza FITC del FITC cellule negative (P3) per l'intensità di fluorescenza delle cellule positive FITC (P2). Lo stesso metodo è stato utilizzato per calcolare il ΔMFI per mCherry. I valori delle IFM sono stati normalizzati al valore massimo misurato lo stesso giorno per mCherry-Ca V α2δ1-HA WT. (D) grafico a barre mostra la normalizzata ΔMFI mCherry misurata in non-permeabilizzate o cellule permeabilizzate (totAl espressione). I risultati sono espressi come media ± SEM prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo test citometria a base di flusso è stato applicato con successo per la misurazione dei livelli relativi totale e superficie cellulare di subunità fluorescenza marcata formano pori e associati dei canali del calcio voltaggio-dipendenti 14,22,26. Si è utilizzato al meglio quando si indaga l'impatto di mutazioni genetiche e richiede quindi che l'intensità di fluorescenza intrinseca del wild-type costrutto fluorescenza marcata tag essere di almeno 10 a 100 volte più grande per l'intensità di fluorescenza del costrutto senza tag fluorescenza marcata . In questo caso particolare, il V α2δ1-HA costrutto mCherry-Ca qui descritto ha prodotto un segnale più grande per rumore ed una gamma dinamica più grande di quello che è stato misurato per il Ca V precedentemente pubblicati 1,2-HA e Ca V 2.3-HA costrutti. Ci sono molte ragioni possibili per questo. Si può ipotizzare che l'ambiente locale del epitopo HA nel dominio extracellulare del Ca V &# 945; 2δ1 proteine ​​massimizza il rapporto segnale-rumore dell'anticorpo coniugato con FITC anti-HA.

Inoltre, è importante tenere presente che questo metodo non fornisce un valore assoluto del numero di proteine ​​sulla superficie cellulare. L'espressione relativa del costrutto etichettato necessaria per ottenere canale espressione funzionale può essere ottenuta eseguendo comunque affiancati patch-clamp e citometria a flusso esperimenti alle stesse condizioni come mostrato in figura 7 riferimento 22. Da questi dati, si può stimare che la densità di corrente di picco, una misura globale di attività del canale ionico, generalmente aumenta in funzione della superficie espressione della targhetta Ca V α2δ1 subunità. La maggiore limitazione di questo saggio superficie cellulare espressione corrente rimane che non può essere applicato in questo momento per lo studio dei canali ionici endogeni. Ciò è dovuto al fatto che alcuni anticorpi disponibili in commerciosono noti per legarsi in modo specifico a domini esterni previsti dei canali ionici. Si richiede pertanto manipolazione genetica della sequenza primaria della proteina da studiare espresso in una linea cellulare ricombinante indifferenziata come tsA-201 cellule.

Passaggi critici nella ottimizzazione del dosaggio: L'identificazione della coppia di fluorofori caso, la scelta dell'epitopo esterna, e la localizzazione del sito di inserzione sono cruciali per il successo di questo metodo perché l'inserimento dell'epitopo non dovrebbe interferire con la funzione delle proteine. Diverse combinazioni fluoroforo sono stati testati. Due epitopi esterni: l'emoagglutinina (HA) epitopo (YPYDVPDYA) e il bungarotoxin vincolante loco epitopo (WRYYESSLEPYPD) 27 e tre anticorpi coniugati fluorescenti impermeabili sono stati valutati, vale a dire il FITC (fluoresceina isotiocianato) -, la R-ficoeritrina -, e il PE-Cy7- coniugati anticorpi. Inoltre, più di 10 differenti inserimentositi per l'HA epitopo esterno sono stati testati all'interno di Ca V α2δ1. In materia di inserimento dell'epitopo che richiede mutagenesi sito-diretta e tecniche di DNA ricombinante, è consigliabile progettare un minimo di tre serie di primer all'interno della stessa regione. Con 9 residui, l'epitopo HA è uno degli epitopi più piccoli per i quali esiste anticorpi fluorescenti coniugati disponibili in commercio, ma il tasso di successo di inserimento di 27 nucleotidi è inferiore a quello per la mutazione puntiforme. Motivi Tetracysteine (residui Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys) sono 2-residuo inferiore al epitopo HA ma la fluoresceina arsenicale tornante legante è membrana permeabile e non adatto per l'analisi delle proteine di membrana 28. Esperimenti preliminari sono stati condotti con due fluorofori intracellulari mCherry e Green Fluorescent Protein (GFP). Tre criteri sono stati utilizzati per discriminare la coppia di successo di fluorofori con canali ionici: 1) spettri di emissione delle esigenze fluoroforiper non sovrapporsi (vedi riferimenti 20,21 per maggiori dettagli); 2) l'espressione del costrutto etichettato genera canale ionico funzionale in cellule ricombinanti come convalidata con metodi elettrofisiologici standard; e 3) l'espressione del costrutto controllo produce una lettura fluorescente robusta. Se uno di questi criteri non è soddisfatto, per esempio se l'inserimento del tag o il fluoroforo interferisce con la funzione del canale, si deve tornare al punto di partenza e modificare sia il sito di inserimento della epitopo esterna e / o il sito di inserzione del fluoroforo. Un linker di residui di 5-glutammina tra il C-terminale della proteina e il fluoroforo potrebbe contribuire a migliorare la funzione delle proteine. Inoltre, potrebbe essere utile inserire l'epitopo esterno in grandi cicli che non sono noti a svolgere un ruolo critico nella funzione delle proteine ​​e / glicosilazione delle proteine. Uno ha bisogno anche di essere a conoscenza degli aspetti tecnici minori.

Il tasso di successo di trasf liposomi-mediataezione in tsA-201 cellule potrebbe essere diminuita dopo l'inserimento dei due epitopi all'interno Ca V α2δ1. Quindi si suggerisce di ricalibrare l'efficienza di trasfezione con il romanzo costrutti di DNA. Ciò accade perché l'inserimento di una proteina di 30 kDa cambia il peso molecolare del DNA. Si potrebbe modificare il DNA rapporto liposomi a 1: 2 a 1: 3 se necessario o incubare le cellule a 37 ° C per un periodo di tempo più lungo (24-72 ore). È importante scegliere la formulazione giusta per permeabilizzante cellule. La maggior parte delle soluzioni fatte in casa valutati per questo progetto si è rivelato causare le cellule di aggregare e intasare il citofluorimetro.

Frenare esposizione alla luce mentre colorazione della cella con l'anticorpo coniugato fluoroforo è indispensabile limitare photobleaching e perdita di segnale. Per minimizzare sfondo fluorescente, è importante centrifugare l'eccesso di anticorpo coniugato prima dell'uso. Infine, è della uttermost importante analizzare tlui cellule sul citometro a flusso il più presto possibile, come e entro 24 ore dopo. Mantenendo le cellule colorate notte a 4 ° C probabilmente ridurrà il segnale e mettere in pericolo la sopravvivenza cellulare. Variazioni nella fluorescenza intrinseca dell'anticorpo fluoroforo coniugato da lotto a lotto impongono che l'intensità di fluorescenza del costrutto test deve essere segnalato come funzione dell'intensità di fluorescenza del costrutto di controllo espressa in condizioni sperimentali identiche.

Per ottenere un buon segnale complessiva di rumore, si raccomanda di minimizzare pipettamento cella per ridurre la morte cellulare e risospendere delicatamente le cellule in modo che una 3 x 10 6 cellule / ml vengono iniettati nel citometro a flusso. Attenzione che una concentrazione di cellule più elevata riduce il flusso delle cellule e potrebbe intasare il citofluorimetro. D'altra parte, una concentrazione cellulare minore richiede un tempo di lavorazione maggiore. Si può avere quindi regolare la concentrazione a seconda della type di cellule da analizzare.

test alternativi: metodologie supplementari dispiegati per documentare la presenza di canali ionici alla caduta membrana plasmatica superficie delle cellule in quattro grandi categorie: 1) metodi di imaging confocale che sfruttano l'interazione ad alta affinità tra gli anticorpi coniugati fluoroforo e la proteina bersaglio; 2) le tecniche di Chimica delle Proteine ​​di riposo sulla modifica covalente della proteina bersaglio da reagenti biotinilazione; 3) misure elettrofisiologiche di analisi del rumore non stazionario; e 4) etichettatura Photoaffinity della proteina bersaglio con sonde radioattive. Nel caso del canale del calcio voltaggio-dipendenti, l'etichettatura photoaffinity con triziata (±) - [3 H] PN 200-100, un ligando ad alta affinità della famiglia diidropiridinico è stato utilizzato ampiamente nel 1980 31. Resta un saggio altamente sensibile, ma comporta la manipolazione di materiale radioattivo 31, che è caduta di moda dopo l'avventofluorescenza e luminescenza sonde di altamente sensibili in particolare con gli investigatori più giovani. Inoltre, è impossibile misurare l'attività del canale ionico in presenza dell'antagonista, tale che la correlazione tra espressione di superficie e la funzione non rientra nell'ambito di questo approccio. All'altra estremità del continuum sperimentale, non stazionaria analisi del rumore di canali ionici richiede registrazioni gigaseal patch-clamp alta qualità con linea di base stabile per le registrazioni minute a lungo. Con questo approccio si può estrarre il numero di canali ionici aperti in una singola cella dalla pendenza del grafico riportando la varianza del rumore in funzione della corrente media misurata in un dato potenziale 32-34. Esso mostra le stesse trappole della approcci elettrofisiologici standard. Si tratta di un metodo di impiego di manodopera e bassa produttività che richiede inoltre una buona dimestichezza con analisi spettrale 32-34, non un fiocco di biologi cellulari. Inoltre, questo tipo di analisi des identifica il numero di canali ionici attivi (in stato aperto) che potrebbe essere diverso dal numero di proteine ​​totali di membrana. Labeling di proteine ​​di superficie cellulare con reagenti biotina è uno strumento relativamente efficiente per identificare le proteine ​​presenti sulla membrana plasmatica. Questo metodo sfrutta la modificazione covalente delle proteine ​​di membrana da biotina e in seguito ad alta affinità e alta specificità di legame di biotina a streptavidina membrana impermeant o molecole avidina non-covalente. Questo approccio è qualitativamente affidabile, ma è ostacolata o limitata da problemi di quantificazione regolarmente associati a rivelare le proteine ​​con la tecnica Western Blot. Confocale ed i suoi derivati sono ampiamente utilizzati per documentare la co-localizzazione delle proteine di membrana con la superficie cellulare 35. Qualitativa isolamento membrana plasmatica resta possibile utilizzando tecniche di centrifugazione differenziale con o senza gradiente di saccarosio 36. Come nel sopra descritto citofluorimetria assay, si basa sulla interazione altamente specifica tra la proteina bersaglio e un anticorpo coniugato fluoroforo. Total Imaging riflessione fluorescenza interna in particolare, è un approccio potente che potrebbe riferire la distribuzione e comportamento molecolare dei canali ionici singoli sulla superficie della membrana 37,38. La lettura è decisamente accattivante ma rimane un approccio piccolo volume a bassa produttività. Tutti questi test hanno il loro valore scientifico. Il saggio di citometria a flusso basato su high-throughput è superiore in termini di lettura riproducibilità e metriche quantificabili, ma richiede un facile accesso al flusso multi-laser citometria selezionatori di cellule che fanno parte delle strutture di base in grandi istituzioni. lettori di piastre fluorescenza-based sono più economici e più accessibili, ma il rapporto segnale-rumore ottenuti misurati con gli stessi costrutti alle stesse condizioni sperimentali era significativamente più bassa dovuto in gran parte ad una fluorescenza di fondo più alto. Costo del un fluoroforo-coniugatotibodies possono anche essere presi in particolare a causa del numero di esperimenti di controllo appropriate che devono essere trasformate con i costrutti di prova. Variazioni sullo stesso tema includono cambiare l'anticorpo colorante coniugato fluorescente per rapporto costo-efficacia di anticorpi giornalista perossidasi o fosfatasi alcalina enzimi rafano che enzima attività può essere dosati con chemiluminescenza 29,30.

Conclusione: saggi fluorescenza a due colori sono stati sviluppati per stimare la relativa superficie cellulare espressione di proteine ​​ricombinanti espresse in cellule coltivate usando citometri a flusso. Anche se solo due parametri fluorescenti sono stati usati in questo saggio corrente, citometria a flusso è riconducibile alla rilevazione simultanea di più di 30 sonde fluorescenti su una singola cella, dimostrando l'elevata flessibilità di questo approccio. Questo test ultrasensibile high-throughput può essere adattato per studiare l'impatto di mutazioni genetiche 22,26 o Modificati post-traduzionalions 23, oltre a studiare il profilo farmacologico di accompagnatori per il traffico di superficie della membrana proteine tecniche 39. L'impulso dietro questo protocollo nasce dalla necessità di valutare isolatamente l'impatto di mutazioni genetiche sulla espressione di membrana dei canali ionici in cellule ricombinanti. È tuttavia importante notare che la gravità della disfunzione canale mutante in linee cellulari modello non sempre correla con la gravità dei sintomi clinici in portatori di mutazioni 5 in parte a causa di una combinazione di mutazioni in differenti alleli potrebbe essere necessaria per innescare improvvisa morte cardiaca 40 , 41. In questo contesto, questo saggio può essere visto come fornire un rapido prima approssimazione passo di studiare mutazioni singole o multiple in un singolo gene associato a perdita di funzione mutazioni 22. E 'tuttavia plausibile immaginare in futuro l'espressione virus-mediata degli stessi costrutti in cellule differenziate di cardiomyocyTE lignaggio. Nel complesso, rispetto ad altre tecniche di imaging o luminescenti, citofluorimetro sorter gestire cellule vive in sospensione e la relazione intensità di fluorescenza di una popolazione di cellule omogenee. Questo processo avviene senza la necessità di fissazione con paraformaldeide, un processo che induce permeabilizzazione della membrana plasmatica locale, anche in condizioni blande 42. Il saggio è rapido, preciso e conveniente con l'analisi fino a diverse centinaia di campioni al giorno lavorativo. Oltre all'analisi, le cellule possono eventualmente essere ordinati mediante citometria di flusso per valutare il potenziale funzionale delle cellule esprimenti livelli superiori o inferiori della stessa proteina di membrana.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 ml Sarstedt 72-690-001
Tubes 15 ml  Sarstedt  62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets  VWR 160001-192 
100 mm culture dish Corning 430167 For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dish Falcon 353001 For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 ml Sarstedt 86.1251.001
Serological pipette 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Serological pipette 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Serological pipette 25 ml Sarstedt 86.1285.001
Dulbecco's high-glucose medium Life Technologies 12100-046 Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin Life Technologies 16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Lipofectamine 2000  Life Technologies 11668-019 For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red Life Technologies 25300-062
1.5 ml microtubes Sarstedt 72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1x Fisher BP661-10 Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibody Sigma H7411
IgG1−FITC Isotype Control antibody Sigma F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
Hemacytometer Fisher 49105161
Trypan Blue Fisher 15250061 To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430R Eppendorf  A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator Fisher 370
Laboratory Platform Rocker Fisher 545034
Water Bath VWR 89032-216
BD FACSARIA III  BD Biosciences 648282 Flow cytometer.
FlowJo Software v10 FlowJo FlowJo v10 Dongle For data analysis.

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References

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Bourdin, B., Segura, E., Tétreault, M. P., Lesage, S., Parent, L. Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (115), e54732, doi:10.3791/54732 (2016).

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