Summary
Ärvda hjärtarytmier ofta orsakas av mutationer som förändrar ytan leverans av en eller flera jonkanaler. Här anpassar vi flödescytometri analyser för att ge en kvantifiering av den relativa totala och cellyteprotein uttryck av rekombinanta jonkanaler som uttrycks i TSA-201-celler.
Introduction
I detta dokument ges en tillförlitlig analys för att rapportera den relativa cellytan uttryck av membranproteiner såsom jonkanaler som uttrycks i rekombinanta celler med användning av den befintliga flödescytometri teknik. Jonkanaler är porbildande membranproteiner som är ansvariga för styrning av elektriska signaler genom grind flödet av joner genom cellmembranet. De klassificeras av aktiveringsmekanismen, natur, och selektivitet jonslag transit genom poren där de är lokaliserade. Vid de cellulära och vävnadsnivåer, de makroskopiska jonflöden genom jonkanaler är en produkt av biofysiska (gating och permeation), biokemiska (fosforylering), och biogenes (syntes, glykosylering, trafficking, och nedbrytning) egenskaper 1. Var och en av dessa processer är unik för varje typ av jonkanaler och är optimerad för att uppfylla den fysiologiska rollen för jonkanalen. Följaktligen förändringar i någon av dessa finjusterade processer genom enärftlig eller genetisk modifiering, ofta kallad "channelopathy", kan vara skadliga för cell homeostas. Det är viktigt att betona att leverera "rätt" mängd av jonkanaler vid cellytan är kritisk för cell homeostas. Även små ökningar (vinst-of-funktion) och små minskningar (förlust-of-funktion) i jonkanalaktiviteten har potential att orsaka en allvarlig patologi under en livstid. Defekter i cellytan leverans av mogna jonkanaler är en viktig determinant i talrika channelopathy, såsom cystisk fibros (CFTR jonkanalen) 2 och hjärtarytmier av långt QT-syndrom form (hjärtkaliumkanaler) 3.
Channelopathy förknippas med hjärt plötslig död 4. Den nuvarande globala förekomsten av alla hjärt channelopathy tros vara åtminstone 1: 2,000-1: 3000 per individ 5 och svarar för ungefär hälften av plötslig arytmier hjärtdöd caSES 6. Dysfunktion i hjärtspänningskänsliga natrium-, kalium- och kalcium- selektiva jonkanaler är kända för att spela en nyckelroll i denna process. L-typ Ca V 1,2 spänningsstyrda kalciumkanal krävs för att initiera synkroniserad hjärtmuskeln sammandragning. Hjärt L-typ Ca V 1,2-kanal är en multi-subenhet proteinkomplex bestående av huvud porbildande Ca V α1 subenheten och Ca V ß och Ca V α2δ1 hjälp subenheter 7-12. Observera att full uppsättning av hjälp subenheter krävs för att producera funktionella Ca V 1.2 kanaler på plasmamembranet och dynamiska samspelet mellan dessa subenheter är nödvändiga för att stödja den normala elektriska funktionen av hjärtat 13. Ca V ß befrämjar cellytan uttryck av ca V 1.2 kanaler genom en icke-kovalent nanomolära hydrofob växelverkan 14. Samexpression av Ca V α2δ1 subenhet with Ca V ß bundna Ca V α1 stimulerar toppström uttryck (5-10-faldigt) och främjar kanalaktivering på mer negativa spänningar. Få-of-funktion mutationer av porbildande subenhet Ca V 1,2 har förknippats med en form av ventrikulära arytmier kallas långt QT-syndrom 15 medan en mängd punktmutationer i de tre huvudenheterna bildar L-typ Ca V 1,2 kanal har identifierats hos patienter som lider av arytmier av kort QT-syndrom blankett 16,17. Jonkanaler är membranproteiner som kan undersökas ur en biokemisk perspektiv (proteinkemi) eller med hjälp av elektrofysiologiska verktyg (strömgenererande maskiner) och ofta använder dessa kompletterande metoder. Elektrofysiologi, särskilt hel-cell patch-fastspänning, är en lämplig metod för att belysa funktionen av jonkanaler 15 men kan inte lösa modifikationer i proteinhandeln från förändringar i deras biofysiskaegenskaper. Proteinkemi har dock ofta begränsad användning på grund av den relativt låga uttrycket av stora membranproteiner i förhållande till mindre lösliga proteiner. Robusta hög genomströmning metoder med hjälp av fluorescens avläsning måste utvecklas för att specifikt behandla defekter i protein biogenes orsakar förändringar i cellytan uttryck av jonkanaler.
Flödescytometri är en biofysisk teknik som används i cellräkning, sortering, biomarkör upptäckt, och protein 18. När en provlösning av levande celler eller partiklar injiceras i en flödescytometer är cellerna ordnade till en enda ström som kan sonderas av maskinens detektionssystem (figur 1). Den första flödescytometer instrument som produceras i 1956 19 upptäckt bara en parameter men moderna flödescytometrar har flera lasrar och fluorescensdetektorer som medger detektering av mer än 30 fluorescerande parametrar 20,21.Filter och speglar (utsläpps optik) rikta ljusspridning eller fluorescerande ljus av celler till ett elektroniskt nätverk (fotodiod och detektorer) som omvandlar ljuset i förhållande till dess intensitet. Digitala data analyseras med användning av specialiserad mjukvara och primärutgången visas som ett punktdiagram 21.
Figur 1:. Biophysical principerna för flödescytometri sortering Enstaka celler skjuts genom ett munstycke under högt tryck i en ström av omslutande vätska som förflyttar dem över en eller flera laserfrågepunkter. Ljusstrålen avlänkas av de passerande celler och ljuset uppsamlas i framåtriktningen (framåtspridning, FCS) sänds till en fotodiod som omvandlar ljuset till en signal som är proportionell mot storleken på cellen. Ljuset samlas också in vid en 90 ° vinkel i förhållande till laserbanan och sänds till detektorer (även kallade fotomultiplikatorer (PMT)).Detta ljus leds genom dikroiska speglar som tillåter detektering av sidospridningssignalen (SSC), vilket återspeglar den granularitet i cellerna, och de fluorescerande utsläppen om excite fluorokromer är närvarande i cellen. Tre detektorer (grön, gul och röd) är representerade med olika våglängd bandpassfilter, vilket gör att samtidig detektion av olika fluorokromer. De olika signalerna digitaliseras av en extern dator och omvandlas till data som kommer att analyseras för att kvantifiera egenskaper hos cellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Hög kapacitet på flödescytometrar utnyttjades för att kvantifiera den relativa membran uttryck av rekombinant vildtyp och handel fattiga spänningskänsliga L-typ Ca V 1.2 kanaler och tillhörande subenheter i levande celler. cDNA konstruktioner coding för proteinerna dubbelt taggade att samtidigt ha en extracellulär icke-fluorescerande epitop som kan detekteras av en ogenomtränglig fluorescerande konjugerad antikropp och en intracellulär fluorofor som är konstitutivt fluorescerande. Både den extracellulära epitopen, insatt i en extracellulär slinga av proteinet, och den intracellulära fluorofor, införas efter C-terminalen, omräknas med proteinet. I denna serie av experiment, var Ca V α2δ1 protein konstruerad för att uttrycka ett extracellulärt hemagglutinin (HA) epitop (YPYDVPDYA) detekteras av en ogenomtränglig FITC (Fluoresceinisotiocyanat) -konjugerad anti-HA och mCherry som inneboende intracellulära fluoroforen. Att bestämma den relativa cellytan uttrycksnivån för mCherry-Ca V α2δ1 HA-märkt protein, rekombinanta celler som uttrycker fusionsproteinet skördas efter transfektion, och färgades med FITC-konjugerad monoklonal mus-anti-HA-epitop-taggen Antibody (Figur 2). FITC är en organisk fluorescerande förening som är betydligt mindre än enzym reportrar och därför inte så troligt att störa biologisk funktion. mCherry- Ca V α2δ1-HA överuttryckt i TSA-201cells, producerar en betydande 3-log ökning av FITC-fluorescens och mCherry fluorescens på tvådimensionella tomter 22. Med tanke på att HA-epitopen är belägen i den extracellulära delen av proteinet, fluorescensintensiteten för FITC erhölls i närvaro av intakta celler återspeglar den relativa index för cellytan uttryck av HA-märkt protein. Tillgängligheten till HA-epitopen i konstruktionerna systematiskt valideras genom mätning av FITC-signalen efter cell permeabilization. Denna åtgärd tjänar också till att bekräfta den normaliserade totala proteinuttryck eftersom de relativa fluorescensintensiteter för FITC beräknas i permeabiliserade celler är kvalitativt jämförbar med de relativa fluorescensvärdena for mCherry mätt under permeabiliserade och icke-permeabiliserade förhållanden 22,23. Det är viktigt att notera att den inneboende fluorescensspektrum skiftas mot högre värden efter permeabilisering men att det enda värde som rapporteras är den förändring i fluorescensintensitet jämfört med kontrollkonstruktionen. Relativa förändringar i fluorescensintensiteten för test konstruktioner uppskattas med hjälp av ΔMean Fluorescence Intensity (ΔMFI) värden för varje fluoroforen (mCherry eller FITC). Experiment har utformats för att mäta fluorescensintensiteten hos test konstruktionen i förhållande till fluorescensintensiteten hos kontroll konstruktet uttrycks under samma betingelser för att begränsa experimentella variationer i den inneboende fluorescensen av fluoroforen-konjugerade antikroppen. Två membranproteiner styrde studerades med användning av denna analys: det porbildande underenheten av L-typ spänningsstyrda kalciumkanal Ca V 1,2 14,22 och i en annan serie avexperiment, den extracellulära hjälp Ca V α2δ1 subenhet 22,23. Följande protokoll användes för att bestämma cellytan uttryck av Ca V α2δ1 subenheten av hjärt L-typ Ca V 1,2-kanal under kontrollbetingelser och efter mutationer som påverkar den posttranslationella modifieringen av jonkanalen. Under standardiserade experimentella betingelser, ökar cellytan fluorescens av FITC kvasi-linjärt med uttryck av cDNA som kodar för de mCherry-Ca V α2δ1-HA-proteiner (Figur 5 från referens 22).
Figur 2:. Schematisk bild av den totala och membranmärkning i flödescytometri experimentella protokollet Systemet beskrivs några av de viktigaste stegen som krävs för att kvantifiera relativa totala och cellytan uttryck av rekombinanta jonkanaler från flow cytometry. Celler transfekteras med den dubbelmärkas konstruktion mCherry-Ca V α2δ1-HA i TSA-201-celler (1) och färgades före eller efter permeabilisering (2). FLERA uppgifter förvärvas i en flödescytometer (3) för multivariat analys (4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dubbelt Märkta DNA-konstruktioner
- Infoga HA-epitopen (YPYDVPDYA) i den extracellulära linker med Ca V α2δ1 mellan D676 och R677 genom riktad mutagenes (Figur 3B) 20. Använd Framåt primer gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC och Omvänd primer acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC.
- Subklona cDNA-sekvensen för den taggade HA Ca V α2δ1 i däggdjurs pmCherry-N1 expressionsvektor utformad för att uttrycka proteinet sammansmält med N-terminalen av mCherry mellan SacI- och Sall-ställen (figur 3B) 20.
OBS: Lämplig kanal funktion måste testas med kontrollkonstruktionen med hjälp av standardelektrofysiologiska metoder 24.
2. liposommedierad Transient transfektion (30 min, är alla steg utförs under laminärt flöde huva)
- Dag 1: Plate en halv miljon av TSA-201-celler (eller HEKT) i35 mm odlingsskålar med 2 ml Dulbeccos hög glukosminimalt essentiellt medium (DMEM-HG), kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin (PS) odlingsmedium. Räkna celler med en vanlig hemacytometer. Bedöma cellviabilitet från en fraktion av provcellen med användning av Trypan Blue. Platt tillräckligt med celler för att nå 90% konfluens vid tidpunkten för transfektion.
- Dag 2: Ändra odlingsmedium med 2 ml färsk förvärmd (37 ° C) odlingsmedium utan PS.
- För varje transfektion prov, förbereda två 1,5 ml rör. I rör 1, späd 4 ng DNA i 250 | il av reducerat serummedium. I rör 2, blanda 10 | il av den liposom-medierad transfektion reagenset med 250 | j, l serumreducerade odlingsmedium. Blanda försiktigt transfektionsreagens före användning.
- Inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
- Kombinera innehållet i röret 1 och röret 2, blanda försiktigt och inkubera vid minst 20 min vid rumstemperatur.
- Lägg liposomerna / DNEn komplex till de odlade cellerna och försiktigt vagga kulturen skålen för att blanda.
- Inkubera vid 37 ° C under 5% CO2 atmosfär under 24 h.
3. Färgning av celler för flödescytometri (3 h)
- Framställning av cellprover
- Dag 3: Ta medium från odlingsskålen noggrant och tvätta cellerna med 400 pl förvärmd (37 ° C) 0,05% trypsin-1x EDTA (etylendiamintetraättiksyra).
- Tillsätt 400 pl av trypsin-EDTA och inkubera skålen vid 37 ° C under 5% CO2 atmosfär under 5 min för att tillåta cellerna att lossna från skålen.
- Stoppa enzymet matsmältningen genom att tillsätta 1 ml kallt odlingsmedium utan PS och tvätta ur alla celler från ytan genom att pipettera försiktigt 4-5 gånger. Undvik över matsmältningen och över pipettering för att minska celldöd.
- Samla in celler i 1,5 ml rör och placera omedelbart på is. Använda iskalla lösningar och hålla cellerna vid 4 ° C för att förhindra internaav ytantigener. Minska belysning för att begränsa fotoblekning av fluorescenssignalen.
- Centrifugera rören vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C. Försiktigt aspirera och kasta supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml fosfatbuffrad koksaltlösning 1x (PBS) för att framställa en enkelcellsuspension.
- virvel kort rören mycket försiktigt och upprepa steg 3.1.5 och 3.1.6 för att helt ta bort odlingsmedium.
- Återsuspendera pelleten i 600 | il 1 x PBS och justera cellkoncentrationen till ett minimum av 3 x 10 6 celler / ml.
- Dela celler i två nya 1,5 ml rör för extracellulära och intracellulära färgning. Inkludera lämpliga kontroller för att diskriminera specifik färgning från icke-specifik färgning.
OBS! Isotypkontrollantikropp hjälper bedöma nivån på bakgrundsfärgning och bör helst matcha varje primär antikropp är värdarter, isotyp och fluorofor. Använd isotypkontroll och antikropp vid sammaproteinkoncentration.
Tabell 1: flödescytometri experiment kontrollprover för icke-permeabiliserade och permeabiliserade celler Varje försök måste innehålla följande negativa kontroller:. (1) icke-transfekterade celler (utan antikropp, med isotyp eller med den konjugerade antikroppen). (2) Transfekterade celler med proteinet av intresse subklonades i en plasmid utan konstitutiv fluorescerande intracellulära fluorokrom (pCMV- Ca V α2δ1-HA) eller med den dubbelt märkta konstruktionen (pmCherry-Ca V α2δ1 och inkuberades utan antikropp, med isotyp eller med den konjugerade antikroppen). Enfärgade kontroller används för ersättning av fluorokrom överlappning utsläpp. Samma kontroller körs för icke-permeabiliserad och permeabiliserades villkor i varje serie av experiment.
- Cellytan Färgning av Intaktlevande celler
- Alikvotera 1 x 10 6 celler / 100 | il i 1,5 ml rör.
- Tillsätt FITC-konjugerad monoklonal anti-HA-antikropp vid 5 | ig / ml och, vortex innan inkubering av cellerna på en rocker plattform (200 varv per minut) i mörker vid 4 ° C under 45 min.
OBS: Den optimala koncentrationen av antikropp bestämdes i preliminära titreringsexperiment (Figur 4). - Avlägsna cellerna från den mörka och tillsätt 900 pl 1 x PBS / rör. Centrifugera vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml 1 x PBS, virvel och centrifugera vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Upprepa tvätt (steg 3.2.4) två gånger för att avlägsna eventuell obunden antikropp. Om en icke-konjugerad primär antikropp används, inkubera med lämplig sekundär antikropp.
- Efter den slutliga tvätten, resuspendera cellerna i 500 ^ il 1 x PBS och överför enda cellsuspension i 5 ml flödescytometri rör. Håll cellens i mörker vid 4 ° C tills att köra provet.
- Köra proverna på en flödescytometer. För bästa resultat, analysera celler på flödescytometern så snart som möjligt och senast 24 timmar efter.
- Intracellulär färgning: Fixering, Permeabilization och färgning
- Alikvot 1 x 10 6 celler / 100 | j, l i 1,5 ml rör och centrifugera vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 pl fixering-permeabilization lösning direkt från lager.
- Inkubera i mörker vid 4 ° C under 20 minuter.
- Tillsätt 100 pl nyframställd 1x permeabilization-tvättbuffert (späd 10x permeabilization-tvättbuffert i destillerat H2O). Vortex och sediment celler med användning av en bordscentrifug vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Aspirera och kassera supernatanten.
- Upprepa steg 3.3.4 och 3.3.5.
- Lägg FITC-konjugerad monoklonal anti-HA-antikropp vid 5| ig / ml i 100 pl 1x permeabilization-tvättbuffert och, vortex före inkubering celler i mörker vid 4 ° C under 30 min.
OBS: intracellulär färgning utförs genom att följa samma förfarande som det som användes för cellytan färgning. Saponin-medierad cell permeabilization är dock en snabbt reversibel process, därför är det viktigt att ersätta 1x PBS med 1x Perm / tvättbuffert för att hålla cellerna i den ständiga närvaron av saponin under intracellulär färgning. - Avlägsna cellerna från den mörka och tillsätt 100 l permeabilization-tvättbuffert. Centrifugera vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Aspirera noggrant supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 | il permeabilization-tvättbuffert, vortex och centrifugera vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Upprepa tvätt (steg 3.3.9) en gång för att avlägsna eventuell obunden antikropp.
- Efter den slutliga tvätten, resuspendera cellerna i 500 ^ il 1 x PBS och överföra syndGLE cellsuspensionen till 5 ml flödescytometri rör. Hålla cellerna i mörker vid 4 ° C tills att injicera provet i flödescytometern.
- Köra proverna på en flödescytometer. Kör de fasta proverna på cytometern så snart som möjligt, dock senast en vecka efter färgning. Köra icke-permeabiliserade och permeabiliserade cellerna på samma dag.
4. Flödescytometri
- Flödescytometer Cell Sorter Daily Setup
- Slå på flödescytometri programvara. Före experimentera, kalibrera och ställa in flödescytometern cellsorterare för att säkerställa optimal instrumentprestanda (dvs. laser och optik presterar specifikation, laser och flödescellen är korrekt inriktade) med hjälp av instrument inställnings pärlor.
- Använd 100 um munstycke med 20 psi slida tryck.
OBS: Munstycket måste inte ändras på en bänk flödescytometer. - Ställa cytometern s liten flödeshastighet enligt den manufacturer specifikation. Mycket höga flödeshastigheter kommer att minska känsligheten vid detektion av variationer i fluorescens.
- Välj blå (488 nm för att excitera fluorescein Isothiocayanate eller FITC) och gul-grön (561 nm för att excitera mCherry) lasrar. Samla FITC och mCherry fluorescens nivåer med en 530/30 nm och med en 610/20 nm bandpassfilter respektive.
- Förvärva framåtspridning (FCS) mot sidospridning (SSC) plot för ofärgade celler med hjälp av linjär skala. Justera varje detektors amplifiering för att visualisera celler i den nedre vänstra kvadranten av punktdiagram.
- Prov Läsning av intakta icke-permeabiliserade celler
- Ställa in P1gate för levande icke-permeabiliserade celler genom avgränsar en fri form runt cellerna som skall analyseras exklusive celldebris och cellaggregat, vilket begränsar fluorescenssignalen till intakta celler.
Obs: Live / döda uteslutnings färgämnen kan användas för att underlätta gate placering på levande celler. Ställ 10.000 händelser att spelai stopp porten P1. Ställ in den här till ett större antal händelser vid behov. - Förvärva mCherry kontra FITC två parametrar konturdiagram för att upptäcka baslinjen autofluorescens av ofärgade celler. Använd bi-logaritmisk skala för att visa negativa värden och förbättra upplösningen mellan populationer 25. Justera varje detektors spänning för att ställa in de ofärgade negativa celler inom den nedre delen av de första tio enheter av log fluorescensintensitets tomter.
- Förvärva samtliga intakta icke-permeabiliserade prover med inställningar som är etablerade i 4.1.5 och 4.1.6 och samla FSC, SSC och signaler i fluorescensdetektorer.
- Export och spara * .fcs filer som ska användas för analys med hjälp av flödescytometri analysprogram.
- Ställa in P1gate för levande icke-permeabiliserade celler genom avgränsar en fri form runt cellerna som skall analyseras exklusive celldebris och cellaggregat, vilket begränsar fluorescenssignalen till intakta celler.
- Prov Läsning av Permeabilized celler
- Flytta P1 grinden att välja levande celler i permeabiliserade prover och justera FSC och SSC spänning som visas i 4.1.5 och 4.1.6.
- Förvärva samtliga permeabiliserade prover och samla FSC, SSC ennd signaler i fluorescensdetektorer.
- Export och spara * .fcs filer som ska användas för analys med hjälp av flödescytometri analysprogram.
- Dataanalys
- Starta flödescytometrianalys programvara och import * .fcs filer som sparats i 4.2.4 och 4.3.3.
- Klicka på det första provet som anges i arbetsytan fönstret. Ett nytt fönster uppkallad efter röret ID-numret öppnas automatiskt. Starta grindprocessen i handlingen i SSC kontra FSC. Rita en grind (P1) med Ellipse ikonen runt levande celler och eliminera alla skräp, döda celler, eller aggregat som har olika framåtspridning och sidospridning än levande celler
- Att dra två parametrar konturdiagram av mCherry (y-axel) kontra FITC (x-axeln) fluorescensintensiteten hos levande celler, klicka först på x-axeln och välj FITC-A-kanalen och klicka sedan på y -axel och välj PE-mCherry-A-kanalen. Klicka på ikonen "Quad" att placera kvadrant markören vid kanten av enutofluorescent celler i varje fluorescenskanalen.
OBS: Porten ligger runt FITC och mCherry-positiva celler är P2 grind. Fluorescensen negativ cellpopulation benämns P3 grind. Se figur 5 för den representativa grind metod som används i den här artikeln. - Välj P2 och P3 grindar och klicka på "Lägg till statistik" -ikonen i den ursprungliga arbetsytan fönstret. Klicka på "Count" (antal positiva celler) och klicka på "Mean" (Medel Fluorescens Intensiteten av varje fluorokrom) eller "Median" (Median fluorescensintensiteten för varje fluorokrom) statistik bland listan över alternativ. Klicka på ikonen "Lägg Statistik" igen. Alla dessa värden överförs automatiskt till den ursprungliga arbetsytan fönstret.
OBS: "betyder" används endast om fluorescensintensiteten följer en normalfördelning. I alla andra fall, klicka på "Median" -fliken. MFI därmed skulle kunna hänvisa till medelfluorescens Intensity eller Median fluorescensintensitet.
OBS: Nästa steg är att tillämpa Gates parametrar och statistik för alla prover sonderade av cytometern. - I arbetsytan fönstret, använda musen för att dra och släppa grindar och statistik parametrar på linjen markerade alla prover.
- Generera en batch rapport tvådimensionella konturdiagram (mCherry vs FITC) och histogram (kroppar jämfört med fluorescensintensitet) för icke-permeabiliserade och permeabiliserade celler (figurerna 6A - B).
- Från den framtagna statistiken i steg 4.4.4, beräkna den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) för varje fluorokrom för de färgade cellerna. Från detta värde, subtrahera MFI värde som erhölls från ofärgade celler att kvantifiera ytan och total expression av proteinet av intresse.
- Rapportera ΔMFI värden för varje fluoroforen (mCherry och FITC) (Figur 6C - D). Normalisera ΔMFI uppmättes för Ca
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den här artikeln beskriver en tillförlitlig protokoll att kvantifiera total och cellytan av rekombinanta jonkanaler som uttrycks i TSA-201cells av en tvåfärgad flödescytometri analys. Som ett exempel, var den relativa cellytan och totalt protein expression kvantifieras för Ca V α2δ1subunit. För att utföra två färger flödescytometri analys, var Ca V α2δ1 dubbelt märkt att uttrycka ett extracellulärt icke-fluorescerande epitop HA som kan detekteras av en anti-HA FITC-konjugerad antikropp och en konstitutiv fluorescerande intracellulär mCherry fluorofor. Excitations- och emissionsspektra för FITC och mCherry visar att FITC exciteras med 88% effektivitet vid 488 nm laser men effektiviteten minskar till 0% med 561 nm laser. Den mCherry visar 63,9% av dess maximala fluorescens när den exciteras med 561 nm laser, men endast 7,6% med 488 nm laser (Figur 3). Excitationen och emissions spectra för båda fluoroforema uppvisar optimal ljusinsamling och minimal överlappning med de olika lasrar och filter valda. Flödescytometri assays skulle kunna tillhandahålla kvantitativ information om den relativa expressionen av membranproteiner från en stor cellpopulation, så länge som MFI för den givna fluorokrom är direkt proportionell mot proteinuttryck av Ca V α2δ1 på varje cell snarare än antalet fluorescerande celler. Detta innebär att man använder en koncentration av fluorescens-konjugerad antikropp bortom mättnad. Titreringskurvan för den anti-HA FITC-konjugerad antikropp som binder till Ca V α2δ1 (figur 4) visar tre faser. Medan ingen fluorescens detekterades i den första fasen, ökade fluorescensintensiteten exponentiellt med ökande antikroppskoncentrationen i den andra fasen. Efter den punkt där mättnad (tredje fasen), en ökning av koncentrationen av antikroppen inte har någon effekt på den relativa fluorescens intensitet (RFI) av FITC. Den anti-HA-FITC-konjugerad antikropp mättnadspunkten fastställdes till 5 | ig / ml, på så sätt säkerställa att koncentrationen av den konjugerade-antikroppen inte är begränsande MFI under experimenten.
Den märkta Ca V α2δ1was uttryckt i TSA-201cells och flödescytometri analyser utfördes i närvaro av FITC-konjugerat anti-HA i icke-permeabiliserade celler (Figur 5). Lämpliga kontroller (tabell 1) analyserades på flödescytometern som attribut xy värden till varje cell passerar genom laserstrålen. Cellfördelningen visualiseras på punktdiagrammen (figur 5A). FCS / SSC punktdiagram bekräftar att framställningen av cellprover ger en enkelcellsuspension med hög viabilitet (fig 5Ba). Den valda porten för levande celler (P1) representerar 75% av det totala antalet analyserade celler. Den totala proteinexpressions of Ca V α2δ1 i TSA-201-celler ansågs vara proportionell mot mCherry fluorescens. Som framgår av mCherry kontra FITC kontur tomter och histogram (figur 5Bb - BC), 47 2% TSA-201-celler transfekterade med pmCherry-Ca V α2δ1-HA befanns signifikant uttrycka mCherry fluorescens samt visar betydande FITC fluorescens på grund av bindningen till den externa HA-markör av Ca V α2δ1 i icke-permeabiliserade celler. Negativa kontrollexperiment utförda utan antikropp eller med isotyp indikerar att FITC endast eller huvudsakligen binder till de positivt transfekterade celler.
Detta protokoll användes för att karaktärisera rollen av N-glykosylering på total och cellyteexpression av Ca V α2δ1 i TSA-201cells 23. Experiment utfördes i icke-permeabiliserade celler för att bedöma cellyteexpressionenoch i permeabiliserade celler för att utvärdera den totala proteinuttryck samt bekräfta tillgängligheten till HA-epitopen. Relativ uttryck av Ca V α2δ1 beräknades baserat på MFI uppskattas för varje fluoroforen (mCherry eller FITC). ΔMFI värden för mutanterna normaliserades till det maximala värdet som uppmätts samma dag för mCherry-Ca V α2δ1-HA WT uttryckas under samma betingelser. Detta är viktigt att ta hänsyn till variationer över tid i den absoluta fluorescensintensiteten av anti-HA-FITC-konjugerad antikropp. Som ses i figur 6A, var den ΔMFI för FITC i icke-permeabiliserade celler stark för WT och 4xNQ konstruera men nära bakgrundsfluorescensnivån för 16xNQ konstrukt vilket indikerar att proteinet är nästan frånvarande från plasmamembranet. Analyser genomfördes efter cell permeabilization, visade att den totala proteinuttryck av 16xNQ konstruktionen minskade också signifikant om detvar slutsatsen från FITC fluorescens i permeabiliserade celler eller från den konstitutiva mCherry fluorescens mätt i icke-permeabiliserade och permeabiliserade celler (Figur 6C - D). Såsom framgår av fig 6B, ökade de cellulära autofluorescens nivåer efter cell permeabilization, vilket förhindrar jämförelse av de absoluta fluorescensvärdena mellan intakta icke-permeabiliserade och permeabiliserade celler. Den ΔMFI fluorescens mättes för mCherry var likartad för både icke-permeabiliserade och permeabiliserade celler som anger att permeabilization lösningen inte ändra den relativa fluorescenssignalen av mCherry. Mutationer av de N-glykosyleringsställen var associerad med en minskning i fluorescensintensiteten för mCherry stödja den publicerade observationen att proteinet biogenes / stabilitet reducerades 23. I denna serie av experiment, den relativa fluorescenssignalen för FITC mätt i permeabiliserade celler visade sig till be ännu mindre än den relativa signal för mCherry vilket tyder på att N-typ glykosylering status av proteinet skulle kunna påverka fluorescensintensitet som detekteras av FITC-konjugerat anti-HA antikropp i den extracellulära domänen. Helt och hållet de förändringar i den relativa fluorescensen av FITC före efter cell permeabilization ge en tillförlitlig statistik för att kvantifiera proteinuttryck.
Figur 3: FITC och mCherry bilda en lämplig par fluorokromer för tvåfärgad cytometry analyser Excitation (tom kurvor) och emissionsspektra (fyllda kurvor) för FITC exciteras med 488 nm blå laser (Aa) och mCherry glada med 561 nm gul-. grön laser (Ab). FITC och mCherry fluorescens samlades med en 530/30 nm och 610/20 nm bandpass filter respektive. Våglängden hos de olika lasrarna (färgade vertikala linjer) och filtren (färgade rektanglar) är valda för optimal ljusinsamling och minimal överlappning. (B) Schematisk bild av mCherry-Ca V α2δ1-HA-proteinet. Ca V α2δ1 var dubbelt märkt att uttrycka ett extracellulärt icke-fluorescerande epitop HA som kan detekteras av en anti-HA FITC-konjugerad antikropp och en konstitutiv fluorescerande intracellulär mCherry fluorokrom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Titrering av anti-HA FITC-konjugerad monoklonal antikropp som binder till Ca V α2δ1 TSA-201-celler transfekterades transient med pmCherry-Ca V & # 945; 2δ1-HA och inkuberades med en rad anti-HA FITC-konjugerade eller isotyp-antikroppar. Endast FITC signalen analyseras i denna panel. (A) Single-parameter histogram visar det relativa antalet celler på y-axeln och FITC fluorescensintensiteten på x-axeln för den anti-HA FITC-konjugerad antikropp intervall av koncentrationer (0,01-20 | j, g / ml). (B) semi-log-grafen för anti-HA-FITC-konjugerad antikropp som en funktion av den MFI av FITC. Titrerkurvan försågs med hjälp av en webbplats Bindande ekvation med en trendlinje värde R2 = 0,99561. Titrering utförs för isotyp antikropp uppvisade ingen fluorescens som förväntat. Halterna från 0,001 till 0,01 pg / ml är omöjlig att skilja från bakgrundsljud. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representant flödescytometrianalys av icke-permeabiliserade TSA-201cells transfekterade med pmCherry-Ca V α2δ1-HA (A) Schematisk bild av grind strategi som används i flödescytometri provanalys.. Data analyserades efter förvärvet med lämplig mjukvara. Den första grind strategi utnyttjar en framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) punktdiagram för att visa en grind (P1) runt levande celler och eliminera alla skräp, döda celler, eller aggregat som har olika framåtspridning och sidospridning än levande celler . Två-parameterkonturdiagram av mCherry (y-axel) mot FITC (x-axeln) fluorescensintensiteten visades för P1 populationen. Rektangulära portar placerades vid kanten av autofluorescens av celler för att välja den positiva befolknings P2 (FITC och mCherry) och den negativa befolknings P3. Fluorescensnivån för than celler i regionen P2 och P3 visualiserades med hjälp av efterföljande celltal kontra FITC eller mCherry fluorescens intensitet enda parameter histogram. En förändring i fluorescensintensitet på y- och x-axeln ger en tillförlitlig index för den totala och membran uttryck för Ca V α2δ1 respektive. Intensiteten hos den fluorescenssignal ökar som en funktion av antalet fluorokroma molekyler. (Ba) representant FCS / SSC punktdiagram för varje tillstånd som anges. Totalt 10.000 händelser förvärvades för analys. Ellipsen gate (P1) dras med ögat runt levande celler utom händelser med låg FSC (döda celler) eller höga SSC (aggregat). (Bb) Representativa två-parameterkonturdiagram av mCherry (y-axel) mot FITC (x-axeln) fluorescensintensitet. Gates placerades vid kanten av autofluorescens hos cellerna att segregera populationer av FITC-mCherry-positiva celler (P2 grind ) och negativa fluorescerande celler (P3). (Bc) Single-parameter histogram av relativ count (eller% av max) celler kontra fluorescensintensitet (FITC eller mCherry). Fördelningen av fluorescensintensiteten mättes för celler inom P2 grind (fluorescenspositiva celler) visas i grått, och fördelningen av fluorescensintensiteten för celler som är närvarande i P3 grind (fluorescens-negativa celler) visas som ett överlägg i ett transparent grå tomt. Som framgår, var stark för både mCherry och FITC indikerar att Ca V α2δ1 är väl uttrycks och tydligt närvarande på cellmembranet. Fluorescensintensiteten Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Samtidig mutationer av N -glycosylation platser störde cellytan expres av Ca V α2δ1. Stabila TSA-201 Ca V P3-celler transfekterades samtidigt med pCMV-Ca V 1,2 WT och pmCherry-Ca V α2δ1-HA WT eller mutanter. Icke-permeabiliserade (A) och permeabiliserade celler (B) färgades med anti-HA FITC-konjugerad antikropp som beskrivits ovan. Representativa två-parameterkonturdiagram av mCherry kontra FITC (vänster paneler) och histogram plottar av fördelningen av fluorescensintensiteten för anti-HA FITC konjugerad färgning antikropp (höger sida) visas för N -glycosylation mutanter (NQ) efter avbrott i fyra platser (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) och 16 platser (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q / N986Q) i intakta icke-permeabiliserade eller NP-celler (A) och i permeabiliserade eller P-celler (B). den distribution av fluorescensintensiteten mättes för celler inom P2 grind (fluorescenspositiva celler) visas i grått, och fördelningen av fluorescensintensiteten för celler som är närvarande i P3 grind (fluorescens-negativa celler) visas som ett överlägg på ett öppet grå tomt. Såsom ses i (B), ökade de autofluorescens nivåer efter cell permeabilization. Fluorescensintensiteten för FITC uppmätts för alla transfekterade permeabiliserade celler ökade (ses som en högerskift på x-axeln) anger att alla transfekterade HA-märkta Ca V α2δ1 proteiner färgades och detekteras av anti-HA FITC antikropp. (C) Stapeldiagram visar den normaliserade MFI mättes i närvaro av FITC i intakt icke-permeabiliserade (ytexpression) eller permeabiliserade celler (totala expressions). Den relativa fluorescensdensiteten mättes i triplikat för varje tillstånd (30.000 celler) och i tre olika satser av celler transfected under en period av en månad framåt de data visas som medelvärde ± SEM för 90.000 celler för varje tillstånd. Toppfluorescensintensitet nåddes mellan 24 och 36 timmar efter transfektion. De ΔMFI värden för FITC uppmätta i intakta icke-permeabiliserade celler användes som ett index på cellytan uttryck av Ca V α2δ1-HA, och ΔMFI värden för FITC mätt i permeabiliserade celler återspeglar den totala proteinuttryck (cellytan och intracellulärt proteinuttryck ). ΔMFI för FITC beräknades genom att subtrahera FITC fluorescensintensiteten av FITC-negativa celler (P3) från fluorescensintensiteten hos de FITC-positiva celler (P2). Samma metod användes för att beräkna ΔMFI för mCherry. MFI-värden normaliserades till den högsta uppmätta värdet samma dag för mCherry-Ca V α2δ1-HA WT. (D) Stapeldiagram visar den normaliserade ΔMFI mCherry mätt i icke-permeabiliserade eller permeabiliserade celler (total uttryck). Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna flödescytometri-baserad analys har framgångsrikt tillämpats på mätning av relativa totala och cellyte nivåer av fluorescensmärkt porbildande och tillhörande subenheterna av spänningskänsliga kalciumkanaler 14,22,26. Det är bäst används när man undersöker effekterna av genetiska mutationer och kräver därför att den inneboende fluorescensintensiteten hos fluorescensmärkt taggade vildtyp konstruktionen vara minst 10 till 100 gånger större än för fluorescensintensiteten hos den fluorescensmärkta omärkt konstruktion . I just det här fallet, det mCherry-Ca V α2δ1-HA-konstruktion som beskrivs häri gav en större signalbrusförhållande och ett större dynamiskt omfång än vad som uppmättes för det tidigare publicerade Ca V 1,2-HA och Ca V 2.3-HA konstruktioner. Det finns många tänkbara orsaker till detta. Det kan spekuleras i att den lokala miljön av HA-epitopen i den extracellulära domänen av Ca V &# 945; 2δ1 protein maximerar signal-brusförhållandet för FITC-konjugerat anti-HA-antikropp.
Dessutom är det viktigt att hålla i minnet att denna metod inte ger ett absolut värde av antalet proteiner vid cellytan. Den relativa expressionen av den taggade konstruktet krävs för att erhålla funktionskanalen uttryck kan erhållas ändå genom att utföra sida vid sida patch-clamp och flödescytometri experiment under samma betingelser såsom visas i figur 7 av referens 22. Från dessa data kan man beräkna att den maximala strömtäthet, en global mått på jonkanalaktivitet, ökar i allmänhet som en funktion av ytan uttryck av den taggade Ca V α2δ1 subenhet. Den huvudsakliga begränsningen av denna ström cellyteuttryck assay kvarstår att den inte kan tillämpas vid denna tid till studien av endogena jonkanaler. Detta beror på det faktum att få kommersiellt tillgängliga antikropparär kända för att specifikt binda till förutsagda externa domäner av jonkanaler. Det kräver således genetisk manipulation av den primära sekvensen av proteinet som skall studeras uttryckas i en odifferentierad rekombinant cellinje, såsom TSA-201-celler.
Kritiska steg i optimering av analysen: Identifieringen av den lämpliga paret av fluoroforer, valet av den externa epitopen, och lokalisering av införingsstället är avgörande för framgången för denna metod eftersom insättningen av epitopen inte borde interferera med proteinfunktion. Olika fluoroforen kombinationer testades. Två externa epitoper: hemagglutinin (HA) epitop (YPYDVPDYA) och bungarotoxin-bindning-site epitop (WRYYESSLEPYPD) 27 och tre ogenomträngliga fluorescerande konjugerade antikroppar utvärderades, nämligen FITC (fluorescein-isotiocyanat) -, R-fykoerytrin -, och de PE-Cy7- konjugerade-antikroppar. Dessutom, mer än 10 olika insättningsplatser för externa HA-epitopen testades i Ca V α2δ1. I beaktande av insättningen av epitopen som kräver platsriktad mutagenes och rekombinant DNA-tekniker, är det tillrådligt att utforma ett minimum av tre uppsättningar av primrar inom samma region. Med 9 rester, är HA-epitopen en av de mindre epitoper som föreligger kommersiellt tillgängliga fluorescerande-konjugerade antikroppar, men andelen framgångsrika infoga 27 nukleotider är lägre än för punktmutation. Tetracysteine motiv (resterna Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys) är 2-rest mindre än HA-epitopen men fluorescein arsenik hårnål bindemedlet är membrangenomträngande och inte lämpar sig för analys av membranbundna proteiner 28. Preliminära experiment genomfördes med två intracellulära fluoroforer mCherry och grönt fluorescerande protein (GFP). Tre kriterier användes för att diskriminera framgångsrika paret fluoroforer med jonkanaler: 1) emissionsspektra av fluoroforema behovinte överlappar (se referenser 20,21 för detaljer); 2) ett uttryck för den märkta konstruktionen genererar funktionell jonkanalen i rekombinanta celler som godkänts av standardelektrofysiologiska metoder; och 3) expressionen av styrkonstruktionen producerar en robust fluorescerande avläsning. Om ett av dessa kriterier inte är uppfyllda, exempelvis om införandet av etiketten eller fluoroforen stör kanal funktion, måste man gå tillbaka till ruta ett och modifiera antingen platsen för insättning av den externa epitopen och / eller införingsstället av fluoroforen. En linker av fem-glutaminrester mellan C-terminalen hos proteinet och fluoroforen kan bidra till att förbättra proteinfunktionen. Dessutom kan det hjälpa att sätta in den externa epitopen i stora slingor som inte är kända för att spela en kritisk roll i proteinfunktionen och / protein glykosylering. Man måste också vara medveten om mindre tekniska aspekter.
Andelen framgångsrika liposommedierad transfektion i tsa-201-celler skulle kunna minskas efter insättningen av de två epitoper inom Ca V α2δ1. Därför föreslås det att kalibrera transfektionseffektiviteten med de nya DNA-konstruktioner. Detta händer eftersom insättningen av ett protein 30 kDa förändrar molekylvikten av DNA: t. Man kunde modifiera DNA till liposomer förhållandet till 1: 2 till 1: 3, om så är nödvändigt eller inkubera cellerna vid 37 ° C under en längre tidsperiod (24-72 h). Det är viktigt att välja rätt formulering för permeabilisering av cellerna. De flesta hemgjorda lösningar värderade för detta projekt visade sig få cellerna att aggregera och täppa flödescytometern.
Stävja ljusexponering medan färgning cellen med fluoroforen konjugerad antikropp är viktigt att begränsa fotoblekning och signalförlust. För att minimera fluorescerande bakgrund är det viktigt att centrifugera överskottet av konjugerade antikroppen före användning. Slutligen, är det av yttersta vikt att analysera than celler på flödescytometern så snart som möjligt som dock senast 24 timmar efter. Hålla de färgade cellerna över natten vid 4 ° C kommer sannolikt minska signalen och försämrar cellöverlevnad. Variationer i den inneboende fluorescens av fluoroforen-konjugerade antikroppen från parti till parti diktera att fluorescensintensiteten hos test konstruktionen måste rapporteras som en funktion av fluorescensintensiteten hos kontroll konstruktionen uttryckte under identiska experimentella betingelser.
För att uppnå en övergripande bra signal-brusförhållande, är det rekommenderat att minimera cell pipettering för att minska celldöd och försiktigt resuspendera cellerna så att en 3 x 10 6 celler / ml injiceras i flödescytometern. Se upp så att en högre koncentration cell kommer att minska cellflödet och kunde täppa flödescytometern. Å andra sidan kommer en lägre cellkoncentration kräver en längre behandlingstid. Man kan således ha att justera koncentrationen beroende på type av celler som skall analyseras.
Alternativa analyser: Ytterligare metoder utplacerade för att dokumentera förekomsten av jonkanaler på cellytan plasmamembranet nedgång i fyra stora kategorier: 1) Confocal avbildningsmetoder som utnyttjar hög affinitet interaktion mellan fluoroforen-konjugerade antikroppar och målproteinet; 2) Proteinkemitekniker vilar på den kovalenta modifieringen av målproteinet genom biotinylering reagens; 3) Elektro åtgärder för icke-stationärt buller analys; och 4) fotoaffinitetsmärkning av målproteinet med radioaktiva prober. I fallet med den spänningsstyrda kalciumantagonister, fotoaffinitetsmärkning med tritierad (±) - [3 H] PN 200-100, en hög affinitetsligand av dihydropyridin familjen användes i stor utsträckning under 1980-talet 31. Det är fortfarande en mycket känslig analys men involverar manipulation av radioaktivt material 31, som har fallit ur modet efter tillkomstenmycket känsliga fluorescens och luminiscens sonder särskilt med yngre forskare. Dessutom är det omöjligt att mäta jonkanalaktiviteten i närvaro av antagonisten, så att korrelationen mellan ytan uttryck och funktion är utanför ramen för detta tillvägagångssätt. I andra änden av den experimentella kontinuum, icke-stationärt buller analys av jonkanaler kräver hög kvalitet gigatätning patch-clamp inspelningar med stabil grund för minut långa inspelningar. Med detta tillvägagångssätt en kan extrahera antalet öppna jonkanaler i en enda cell från lutningen på den grafiska plottning av brusvariationen som en funktion av den genomsnittliga uppmätta strömmen vid varje given potential 32-34. Den visar samma fällor av standardelektrofysiologiska metoder. Det är en arbetsintensiv och låg genomströmning metod som kräver dessutom en god kännedom spektralanalys 32-34, inte en stapelvara i cellbiologer. Vidare är denna typ av analysis identifierar antalet aktiva jonkanaler (i öppet läge) som kan vara annorlunda än det totala antalet proteiner i membranet. Märkning av cellytproteiner med biotin reagens är ett relativt effektivt verktyg för att identifiera proteiner som är närvarande vid plasmamembranet. Denna metod utnyttjar kovalent modifiering av membranproteiner av biotin och ytterligare hög affinitet och hög specificitet icke-kovalent bindning av biotin till membran ogenomtränglig streptavidin eller avidin molekyler. Detta tillvägagångssätt är kvalitativt tillförlitlig men hindras eller begränsas av kvantifiering frågor regelbundet i samband med att avslöja proteiner med hjälp av western blot-teknik. Konfokal avbildning och dess derivat används i stor utsträckning för att dokumentera samlokaliseringen av membranproteiner med cellytan 35. Kvalitativ plasmamembranet isolering fortfarande är möjlig med hjälp av differentialcentrifugeringstekniker med eller utan sackarosgradient 36. Liksom i den ovan beskrivna flödescytometri assay, förlitar sig på den starkt specifika interaktionen mellan målproteinet och en fluorofor-konjugerad antikropp. Total inre reflektion fluorescens avbildning i synnerhet, är en kraftfull metod som kunde rapportera distribution och molekylära beteende av enstaka jonkanaler på membranytan 37,38. Avläsningen är definitivt iögonfallande men är fortfarande en låg genomströmning små volymer strategi. Alla dessa analyser har sin vetenskapliga meriter. Den höga genomströmning flödescytometri-baserad analys är överlägsen när det gäller avläsning reproducerbarhet och kvantifierbara mått men kräver enkel tillgång till flera laser flödescytometri cellsorterare som är en del av kärnanläggningar i stora institutioner. Fluorescensbaserade plattläsare är billigare och mer tillgängliga men signal-brusförhållandet erhålls mäts med samma konstruktioner under samma försöksbetingelser var betydligt lägre beror till stor del på en högre fluorescensbakgrund. Kostnad för fluoroforen-konjugerade entibodies kan dessutom ta hänsyn till i synnerhet på grund av antalet av lämpliga kontrollexperiment som måste bearbetas med testkonstruktioner. Variationer på samma tema är att ändra det fluorescerande färgämnet-konjugerad antikropp till kostnadseffektiva pepparrotsperoxidas eller alkaliskt fosfatas enzym reporter antikroppar som enzymaktiviteten kan analyseras genom kemiluminiscens 29,30.
Slutsats: Två-färgfluorescensanalyser utvecklades för att uppskatta den relativa cellytan uttryck av rekombinanta proteiner som uttrycks i odlade celler med användning av flödescytometrar. Även om endast två fluorescerande parametrar användes i denna nuvarande analys, flödescytometri är mottaglig för den samtidiga detekteringen av mer än 30 fluorescerande prober på en enda cell, vilket visar den höga flexibiliteten hos detta tillvägagångssätt. Denna höga kapacitet ultra analys kan anpassas för att undersöka effekterna av genetiska mutationer 22,26 eller posttranslationella modifications 23, samt studera den farmakologiska profilen av följeslagare för ytan handel med membranproteiner tekniker 39. Drivkraften bakom detta protokoll föddes ur behovet i isolering för att utvärdera effekten av genetiska mutationer på membranet uttryck för jonkanaler i rekombinanta celler. Det är dock viktigt att notera att graden av mutant kanal dysfunktion i modellcellinjer inte alltid korrelerar med svårighetsgraden av kliniska symptom hos mutationsbärare 5 delvis på grund av en kombination av mutationer i olika alleler kan krävas för att utlösa plötslig hjärtdöd 40 , 41. I detta sammanhang kan denna analys betraktas som tillhandahållande av en snabb första-steg approximation av studera enkla eller multipla mutationer i en enda gen är associerad med förlust-av-funktion-mutationer 22. Det är dock rimligt att föreställa sig i framtiden viruset-medierad uttryckning av samma konstruktioner i differentierade celler av cardiomyocyte härstamning. Övergripande, i jämförelse med andra avbildnings eller luminescerande tekniker, flödescytometer sorterare hanterar levande celler i suspension och rapport fluorescensintensiteten hos en homogen cellpopulation. Denna process sker utan behov av fixering med paraformaldehyd, en process som inducerar lokal plasmamembranet permeabilization, även under milda betingelser 42. Analysen är snabb, specifik och bekvämt med en analys av upp till flera hundra prover per arbetsdag. Förutom analys, kan cellerna så småningom sorteras genom flödescytometri för att bedöma den funktionella potentialen hos celler som uttrycker högre eller lägre nivåer av samma membranproteinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523). |
| Tubes 1.5 ml | Sarstedt | 72-690-001 | |
| Tubes 15 ml | Sarstedt | 62-554-002 | |
| Disposable graduated Tranfer Pipets | VWR | 160001-192 | |
| 100 mm culture dish | Corning | 430167 | For standard culture of HEKT cells. |
| 35 mm culture dish | Falcon | 353001 | For standard culture of HEKT cells. |
| Serological pipette 1 ml | Sarstedt | 86.1251.001 | |
| Serological pipette 5 ml | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serological pipette 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Serological pipette 25 ml | Sarstedt | 86.1285.001 | |
| Dulbecco's high-glucose medium | Life Technologies | 12100-046 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin | Life Technologies | 16140-071 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red | Life Technologies | 25300-062 | |
| 1.5 ml microtubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher | BP661-10 | Can be "home-made". |
| Anti-HA FITC conjugated antibody | Sigma | H7411 | |
| IgG1−FITC Isotype Control antibody | Sigma | F6397 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C. |
| Hemacytometer | Fisher | 49105161 | |
| Trypan Blue | Fisher | 15250061 | To access cell viability. |
| Refrigerated Microcentrifuge, 5430R | Eppendorf | A14H172200 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Fisher | 370 | |
| Laboratory Platform Rocker | Fisher | 545034 | |
| Water Bath | VWR | 89032-216 | |
| BD FACSARIA III | BD Biosciences | 648282 | Flow cytometer. |
| FlowJo Software v10 | FlowJo | FlowJo v10 Dongle | For data analysis. |
References
- Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
- Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
- Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
- Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
- Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
- Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
- Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
- Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
- Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
- Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
- Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
- Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
- Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
- Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
- Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982 (2014).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
- Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
- Rothe, G. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. , Karger. Basel. 53-88 (2009).
- Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
- Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
- Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
- Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
- Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
- Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
- Cockcroft, C. J. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).
- Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
- Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
- Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
- Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
- Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
- Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
- Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
- Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
- Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
- Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. , (2016).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).
